CN112516337A - 近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，将DPP‑BT‑S溶于四氢呋喃后，加入到含F127和DSPE‑PEG‑FA的超纯水中，向混合溶液中通入氮气除去四氢呋喃，得到具有靶向功能的DPP‑BT‑S纳米颗粒水溶液。本发明的有机共轭聚合物荧光探针，利用具有肿瘤靶向功能的分子以及具有亲水和疏水性能的两亲性分子将DPP‑BT‑S通过自组装包裹起来，通过纳米共沉淀方法制备得到具有良好水溶性、生物相容性及靶向性的纳米颗粒，该纳米颗粒具有优良的近红外二区荧光成像、光声成像、光动力以及光热转换的性能，可以实现近红外二区荧光成像/光声成像指导下的肿瘤靶向光热/光动力联合治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
当今世界，癌症已成为威胁人类生命的头号杀手，因此发展新型有效的用于肿瘤诊断的治疗试剂具有重要意义。就诊断模式而言，不同的成像模式有各自的优缺点。当前，对于肿瘤的常规成像诊断方法包括X-射线检查、超声波检查、计算机断层成像(CT)以及磁共振成像(MRI)等。随着研究的不断深入以及仪器的不断精密，这些手段都发挥了较好的效果，但是这些方法仍然存在一定的缺陷。如果不能对早期肿瘤进行准确监测，或不能精准判断出肿瘤部位，导致现有治疗手段对病人产生一定的副作用，或易发生恶性肿瘤的复发和转移，进而导致不能从根本上治疗肿瘤。因此，寻求新型高效诊疗试剂至关重要。
近红外二区(NIR-II)荧光成像技术具有较高的空间分辨率、较深的穿透深度、较低的光吸收和对生物基质的散射，且具有最小的组织自荧光性，在生命科学领域具有极其重要的应用价值。另外，光声成像是一种将光激发和超声波检测结合起来的混合生物成像方式，结合了光学成像和超声成像的特点，它能够克服光扩散阈值以及通常有限的成像和穿透深度，在实时医学成像领域有着巨大的应用前景。
目前，有许多研究已经着力于开发肿瘤联合治疗技术，可以应用于NIR-II荧光/光声指导下的联合治疗。比起单一的治疗方法，这种联合治疗方法具有协同或者叠加效应，能够相互补充，减少毒副作用，更加有效的解决肿瘤的复杂机理和变化带来的问题，为将来癌症的诊断和治疗提供了一个新的平台。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法及其应用，用于近红外二区荧光成像/光声成像指导下的肿瘤靶向光热/光动力联合治疗。
为解决上述技术问题，本发明提供一种近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，将吡咯并吡咯二酮类衍生物DPP-BT-S溶于四氢呋喃后，加入到含两亲性三嵌段共聚物F127和磷脂-聚乙二醇-叶酸DSPE-PEG-FA的超纯水中，向混合溶液中通入氮气除去四氢呋喃，得到具有靶向功能的DPP-BT-S纳米颗粒水溶液。
进一步地，所述DPP-BT-S的结构式如下：
进一步地，所述DPP-BT-S的制备方法包括：
A1、将2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮和7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑加入无水甲苯中，在氮气氛围下加入催化剂四(三苯基膦)钯，加热搅拌，除去溶剂，柱色谱分离后得DPP-BT；
A2、将DPP-BT和二硫代草酰胺加入无水二甲基甲酰胺(DMF)中，加热搅拌，沉降后得DPP-BT-S。
进一步地，所述2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮和7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑的摩尔比为1：2.2。
进一步地，所述2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮和7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑的加热搅拌条件为110℃、24h。
进一步地，所述DPP-BT和二硫代草酰胺的摩尔比为1：1.3。
进一步地，所述DPP-BT和二硫代草酰胺的加热搅拌条件为150℃、4h。
进一步地，所述DPP-BT-S水溶液的最大吸收波长为710nm。
进一步地，所述DPP-BT-S水溶液的最大荧光发射波长为1090nm。
本发明还提供上述的方法制备得到的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针在作为肿瘤靶向近红外二窗荧光成像/光声成像造影剂中的应用。
B1、近红外二窗荧光成像方法：配制浓度为0.1mg/ml的上述DPP-BT-S水溶液4ml，放置于小离心管中，在近红外二窗荧光成像仪下，用波长为808nm的激光激发，得到近红外二窗荧光成像。
B2、光声成像方法：配制浓度为1.0mg/ml的DPP-BT-S水溶液于小试管中，然后用光声成像仪进行成像。
本发明还提供上述的方法制备得到的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针在作为肿瘤治疗的光热治疗试剂及光动力治疗试剂中的应用。
作为光热治疗试剂的测试方法包括：
C1、将含有去离子水的小离心管(空白样)和含有不同浓度(0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml和0.1mg/ml)的DPP-BT-S纳米粒子水溶液的小离心管用一定的光功率密度的激光器(808nm，1.5W/cm2)照射，用红外温敏相机记录离心管中的溶液温度随时间变化的趋势；
C2、将含有相同浓度的DPP-BT-S纳米粒子水溶液的小离心管用不同光功率密度的激光器(808nm，0.25W/cm2、0.5W/cm2、0.75W/cm2、1W/cm2及1.5W/cm2)照射，用红外温敏相机记录离心管中的溶液温度随时间变化的趋势；
C3、进行光热循环稳定性的测试。
DPP-BT-S纳米粒子水溶液(0.1mg/ml)用一定的光功率密度的激光器(808nm，1.5W/cm2)照射，当溶液温度上升到最大温度时关闭激光器，使溶液自然冷却，冷却到室温再继续光照，循环往复5次。
作为光动力治疗试剂的测试方法包括：
D1、在比色皿中加入一定浓度的DPP-BT-S纳米粒子水溶液，再滴加入1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)的乙醇溶液，用不同功率的激光(808nm)间断光照，并检测在414nm处的紫外吸收峰的变化；
D2、按照D1的方法，更换不同功率密度的光照，得到不同功率下414nm处紫外吸收峰的变化曲线。
本发明所达到的有益效果：
本发明的有机共轭聚合物荧光探针，利用具有肿瘤靶向功能的分子以及具有亲水和疏水性能的两亲性分子将DPP-BT-S通过自组装包裹起来，通过纳米共沉淀方法制备得到具有良好水溶性、生物相容性及靶向性的纳米颗粒，该纳米颗粒具有优良的近红外二区荧光成像、光声成像、光动力以及光热转换的性能，实现近红外二区荧光成像/光声成像指导下的肿瘤靶向光热/光动力联合治疗。
本发明的有机共轭聚合物荧光探针成像优异、疗效显著。作为新型成像探针，其多模态成像指导的肿瘤靶向联合治疗为未来炎症及肿瘤治疗带来了希望。
附图说明
图1为近红外二区有机共轭聚合物荧光探针制备的流程示意图；
图2为DPP-BT-S水溶性纳米粒子的紫外谱图；
图3为DPP-BT-S水溶性纳米粒子的荧光谱图；
图4为DPP-BT-S水溶液近红外二窗荧光成像图；
图5为DPP-BT-S水溶液光声成像图；
图6为不同浓度DPP-BT-S纳米粒子在相同光功率密度下(808nm，1.5W/cm2)光热温度随时间变化图；
图7为相同浓度(0.1mg/ml)DPP-BT-S纳米粒子在不同光功率密度下光热温度随时间变化图；
图8为浓度0.1mg/ml的DPP-BT-S纳米粒子水溶液在光功率密度为1.5W/cm2的808nm激光照射下的光热循环图；
图9为相同浓度DPP-BT-S纳米粒子与DPBF混合在不同光功率密度的激光光照后414nm处紫外吸收强度变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明的实施例所使用的试剂皆为市购，所使用的仪器分别为：
近红外二窗荧光成像仪：NIRvana 640-Princeton instrument；
光声成像仪：Endra Nexus 128；
红外热成像仪：TESTO869；
激光器：MDL-IH-808-1.5W-PSU-II-LED。
部分化学试剂名称的缩写为：
DSPE-PEG-FA：磷脂-聚乙二醇-叶酸；
DMF：二甲基甲酰胺。
1、DPP-BT-S的合成路线：
DPP-BT-S
具体合成步骤如下：
A1、DPP-BT合成：将7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑(0.1138g，2.2mmol)和2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮(0.2525g，1mmol)溶于20mL无水甲苯中，在氮气氛围下加入催化剂四(三苯基膦)钯，加热搅拌(110℃，24h)，除去溶剂，柱色谱分离后得DPP-BT(0.1355g，37％)。
A2、DPP-BT-S合成：将产物DPP-BT(0.1g，1mmol)和二硫代草酰胺(0.0132g，1.3mmol)溶解于10ml无水DMF，在氮气保护下，加热搅拌(150℃，4h)，缓慢加热到150℃，加热搅拌反应4h，将反应液旋干，提纯得到DPP-BT-S(0.086g，产率：76％)。
2、具有靶向功能的DPP-BT-S水溶液纳米粒子的制备：
如图1所示，称取DPP-BT-S药品1mg溶于1ml四氢呋喃，然后将上述溶液缓慢加入含F-127(20mg)和DSPE-PEG-FA(20mg)的5ml超纯水中，边超声边加入，继续超声2分钟，然后通N2除去四氢呋喃，最后用截留分子量30KD的超滤离心管对溶液进行离心去除部分水，最后得到浓度为1mg/ml的DPP-BT-S水溶液，其紫外如图2所示，荧光光谱图如图3所示。
3、近红外二窗荧光成像/光声成像：
(1)近红外二窗荧光成像
配制浓度为0.1mg/ml的上述DPP-BT-S水溶液4ml，放置于小离心管中，在近红外二窗荧光成像仪下，用波长为808nm的激光激发，得到近红外二窗荧光成像，如图4所示。
(2)光声成像
配制浓度为1.0mg/ml的DPP-BT-S水溶液200μl于小试管中，然后用光声成像仪进行成像，如图5所示。
4、水溶性纳米粒子在光热/光动力在肿瘤治疗中的应用：
(1)光热性能的测试：
研究不同溶液浓度及不同光照功率密度对DPP-BT-S纳米粒子水溶液的光热转换效果。
在250μL的小离心管中加入200μL的去离子水(空白样)、浓度分别为0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml和0.1mg/ml的DPP-BT-S纳米粒子水溶液，并用激光(808nm，1.5W/cm2)照射，由红外温敏相机记录溶液温度随时间变化的趋势，如图6所示，相同的激光功率照射，DPP-BT-S纳米粒子浓度越大水溶液温度上升的越高，表明该DPP-BT-S纳米粒子具有良好的光热性能。
然后，在250μL的小离心管中加入200μL浓度为0.1mg/ml的DPP-BT-S纳米粒子水溶液，分别用功率密度为0.25W/cm2、0.5W/cm2、0.75W/cm2、1W/cm2及1.5W/cm2的激光(808nm)照射，并检测溶液温度随时间变化曲线，由红外温敏相机记录溶液温度随时间变化的趋势，如图7所示，结果表明随着激光功率密度增加，纳米粒子溶液温度增加越明显。
最后，测试纳米粒子的光热循环稳定性，用光功率密度为1.5W/cm2的808nm激光照射浓度为0.1mg/ml的DPP-BT-S纳米粒子水溶液，当溶液温度上升到最大温度时关闭激光器，使溶液自然冷却，冷却到室温再继续光照，循环往复5次，得到光热循环图，如图8所示，结果表明该纳米粒子具有良好的光热稳定性。
(2)光动力性能的测试：
在小离心管中加入DPP-BT-S纳米粒子水溶液(2mg/ml,20μL)，加入800μL水稀释，再滴加入5μL浓度为1mM的DPBF的乙醇溶液，分别用光功率密度为0、0.1W/cm2、0.25W/cm2、0.5W/cm2及1W/cm2的激光(808nm)间断照射，每次光照30秒，并监测在DPBF特征峰414nm处的紫外吸收峰的变化，DPBF在414nm处的吸收峰随着光的不断照射有明显降低，从而反映光照过程产生了单线态氧。另外随着光功率密度越大，DPBF在414nm处的吸收峰下降的幅度越大，如图9所示，表明该DPP-BT-S纳米粒子具有良好的光动力性能。
该纳米粒子具有良好的水溶性、生物相容性以及靶向性，在近红外光照射下，该纳米颗粒具有优良的近红外二区荧光成像、光声成像、光动力以及光热转换的性能，可用于近红外二区荧光成像/光声成像指导下的肿瘤靶向光热/光动力联合治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，将吡咯并吡咯二酮类衍生物DPP-BT-S溶于四氢呋喃后，加入到含两亲性三嵌段共聚物F127和磷脂-聚乙二醇-叶酸DSPE-PEG-FA的超纯水中，向混合溶液中通入氮气除去四氢呋喃，得到具有靶向功能的DPP-BT-S纳米颗粒水溶液。
2.根据权利要求1所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DPP-BT-S的结构式如下：
3.根据权利要求1所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DPP-BT-S的制备方法包括：
将2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮和7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑加入无水甲苯中，在氮气氛围下加入催化剂四(三苯基膦)钯，加热搅拌，除去溶剂，柱色谱分离后得DPP-BT；
将DPP-BT和二硫代草酰胺加入无水二甲基甲酰胺中，加热搅拌，沉降后得DPP-BT-S。
4.根据权利要求3所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮和7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑的摩尔比为1：2.2。
5.根据权利要求3所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2,5-二(2-辛基十二烷基)-3,6-二(5-三甲基锡)-吡咯并吡咯二酮和7-溴-4-醛基苯并[c][1,2,5]噻二唑的加热搅拌条件为110℃、24h。
6.根据权利要求3所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DPP-BT和二硫代草酰胺的摩尔比为1：1.3。
7.根据权利要求3所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DPP-BT和二硫代草酰胺的加热搅拌条件为150℃、4h。
8.根据权利要求1所述的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针的制备方法，其特征在于，所述DPP-BT-S水溶液的最大吸收波长为710nm；所述DPP-BT-S水溶液的最大荧光发射波长为1090nm。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针在作为肿瘤靶向近红外二窗荧光成像/光声成像造影剂中的应用。
10.根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的近红外二区有机共轭聚合物荧光探针在作为肿瘤治疗的光热治疗试剂及光动力治疗试剂中的应用。
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