CN112512548A - Pic1在动物模型中对髓过氧化物酶氧化活性的抑制 - Google Patents
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Abstract
提供了一种治疗受试者的系统性红斑狼疮的方法，其中向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。还提供了一种治疗输注相关的急性肺损伤的方法，其中向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。PIC1可以调节受试者的补体系统的免疫复合物激活和NET形成。PIC1还可以抑制受试者的髓过氧化物酶(MPO)活性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月9日提交的美国临时申请62/615,183、2018年6月6日提交的美国临时申请62/681,458和2018年10月17日提交的美国临时申请62/746,649的优先权，每个申请的公开内容通过引用全部并入本文。
序列表
本申请包含序列表，以ASCII格式电子提交，并且通过引用全部并入本文。所述ASCII副本于2019年1月7日创建，命名为Seqlist.txt，大小为16,143字节。
背景技术
NET是中性粒细胞通过将自身转变成饰有抗微生物分子的DNA网来控制感染的手段。NET已被证明会导致广泛炎性和自身免疫性疾病的发病机理，例如系统性红斑狼疮(SLE)和输注相关的急性肺损伤(TRALI)。
SLE的发病机理非常复杂，但是两个主要因素是免疫复合物引发的补体激活和NET形成。引发经典途径补体激活从而导致C4和C3消耗的免疫复合物早已被人们认识并导致狼疮性肾炎[1-3]。然而，NET最近更多地被认为会导致SLE发病机理[4-6]。
TRALI是与输血相关的发病率和死亡率的主要原因。TRALI被定义为在接受同种异体血液制品输注后6小时内发生的急性肺损伤。TRALI通常以呼吸困难、发烧、低血压、低氧血症和肺水肿为特征，并且实验室检查显现短暂性白细胞减少症、血小板减少症和X线胸片显示双侧浸润。死亡率为5-10％，大多数患者(70-90％)需要机械通气和血流动力学支持。在没有有效药理干预的情况下，当前的护理标准仅限于支持疗法。
TRALI的病理生理学是复杂的。在临床上，据信供血制品中的针对人类白细胞抗原或人类中性粒细胞同种异体抗原的抗体会导致大多数TRALI病例。通常在血小板或红细胞输注后产生的非抗体介导的或非免疫的TRALI占病例的11-39％。已经建立了许多动物模型来研究抗体介导的和非抗体介导的TRALI的病理生理学。尽管中性粒细胞在抗体介导的TRALI的发病机理中起着关键作用，但临床报告和动物模型数据表明，视所涉及抗体的类别而定，单核细胞、淋巴细胞、血小板以及内皮细胞可以导致TRALI。在多种抗体介导的动物模型中TRALI的发生也需要补体激活，并且补体激活有助于临床TRALI病例的病理过程。
动物模型已经证明，宿主中性粒细胞的抗体介导的激活诱导肺毛细血管中的螯合，从而导致组织损伤。这些被激活的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱(NET)，这导致小鼠模型中TRALI发病机理。在从TRALI患者收集的血清中检测到NET生物标志物，例如髓过氧化物酶(MPO)、核小体和DNA。
髓过氧化物酶(MPO)是在中性粒细胞中发现的血红素类过氧化物酶。MPO是中性粒细胞中存在的主要酶，占细胞干重的30％。MPO的主要功能是产生次氯酸，以帮助中性粒细胞杀死微生物入侵者。但是，MPO生成次氯酸也会导致宿主组织受损，并已被证明直接导致许多炎性疾病中的实质损伤。例如，MPO导致囊性纤维化中的实质肺损伤。除了直接的抗微生物活性，MPO还被证明在创建中性粒细胞胞外陷阱(NET)的重要途径中起作用。
附图说明
图1A-1C示出了通过补体效应物测定的PA-dPEG24对热聚集的IgG免疫复合物引发的补体激活的抑制。图1A示出了PA-dPEG24抑制了用热聚集的IgG(Agg-IgG)免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中C5a的产生。所示数据是独立实验(n＝5)的平均值以及平均值的标准误差(SEM)。图1B示出了PA-dPEG24对用热聚集IgG(Agg-IgG)免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中iC3b生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。图1C示出了PA-dPEG24对用热聚集的IgG(Agg-IgG)免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中SC5b-9生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝6)的平均值以及平均值的标准误差(SEM)。
图2A-2C示出了通过补体效应物测定的PA-dPEG24对卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物引发的补体激活的抑制。图2A示出了PA-dPEG24对用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中C5a生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。图2B示出了PA-dPEG24对用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中iC3b产生的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值和平均值标准误差(SEM)。图2C示出了PA-dPEG24对用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中SC5b-9生成的抑制。在2mM PA-dPEG24下，测得的SC5b-9处于检测下限。所示数据是独立实验(n＝3)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图3A-3C示出了通过补体效应物测定的PA-dPEG24对C1-抗C1q免疫复合物引发的补体激活的抑制。图3A示出了PA-dPEG24对用C1-抗C1q免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中C5a生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。图3B示出了PA-dPEG24对用C1-抗C1q免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中iC3b生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值±SEM。图3C示出了PA-dPEG24对用C1-抗C1q免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中SC5b-9生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图4示出了通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中PMA引发的NET形成的抑制，以及对游离DNA的PicoGreen定量。第一行示出了未刺激的中性粒细胞，第二行示出了用PMA和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞，第三行示出了在5mMPA-dPEG24(PIC1)存在下用PMA+H2O2刺激的中性粒细胞。第一列示出了用DAPI探测以可视化DNA的载玻片，第二列示出了用抗MPO抗体探测的载玻片。所述图示出了通过PicoGreen测定的PA-dPEG24(5mM)对用PMA+H2O2刺激的人类中性粒细胞NET生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝3)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图5示出了针对DNA(DAPI)、中性粒细胞弹性蛋白酶(抗NE抗体)和组蛋白H3(抗组蛋白H3抗体)，通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中PMA引发的NET形成的抑制。第一行示出了未刺激的中性粒细胞，第二行示出了用PMA和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞，第三行示出了在5mM PA-dPEG24(PIC1)存在下用PMA+H2O2刺激的中性粒细胞。第一列示出了用DAPI探测以可视化DNA的载玻片，第二列示出了用抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体探测的载玻片，第三行示出了用抗组蛋白H3抗体探测的载玻片。示出了代表性图像。
图6示出了通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中MPO引发的NET形成的抑制，以及对游离DNA的PicoGreen定量。第一行示出了未刺激的中性粒细胞，第二行示出了用MPO和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞，第三行示出了在PA-dPEG24(PIC1)存在下用MPO+H2O2刺激的中性粒细胞，第四行示出了仅用PA-dPEG24(PIC1)孵育的中性粒细胞。第一列示出了用DAPI探测以可视化DNA的载玻片。第二列示出了用抗MPO抗体探测的载玻片。所述图示出了通过PicoGreen测定的PA-dPEG24对用MPO+过氧化氢刺激的人类中性粒细胞NET生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝3)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图7A-7C示出了通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中免疫复合物激活的血清引发的NET形成的抑制，以及对游离DNA的PicoGreen定量。图7A示出了由单独孵育(未处理)的、用正常人血清(NHS)、单独免疫复合物(IC)或免疫复合物激活的血清(ICsera)孵育的PMN诱发的NET形成。图7B示出了通过PicoGreen测定的PA-dPEG24对用免疫复合物激活的血清(ICsera)刺激的人类中性粒细胞NET生成的抑制。所示数据是独立实验(n＝4)的平均值和平均值的标准误差(SEM)。在图7C中，第一行示出了未刺激的中性粒细胞，第二行示出了用免疫复合物激活的人血清(ICsera)和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞，第三行示出了在PA-dPEG24(PIC1)存在下用ICsera+H2O2刺激的中性粒细胞。第一列示出了用DAPI探测以可视化DNA的载玻片，第二列示出了用抗MPO抗体探测的载玻片。
图8A和8B示出了优化人RBC输注至大鼠的结果。在图8A中，通过分光光度法测量在输注之前(0)或在15％(◆，n＝3)、30％(▲，n＝3)或45％(■，n＝3)输注人RBC之后的0.5、5、20、60、120或360分钟收集的大鼠血浆中存在的游离血红蛋白。还分析了一组假处理动物(●，n＝3)。在图8B中，通过流式细胞仪测量，在输注后0.5、5、20、60、120和360分钟，使用FITC偶联的抗人CD235a(血型糖蛋白A)单克隆抗体检测了来自15％(●，n＝3)、30％(■，n＝3)或45％(▲，n＝3)输注人RBC的存活人RBC的百分比。清除动力学标准化在基线(0分钟)时注入的RBC。所示数据是平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图9A-9D示出了输注诱发的肺损伤需要LPS“第一次命中”。示出了来自假处理大鼠(图9A)、在不存在LPS下接受30％(图9B)、45％输注错配RBC(图9C)的大鼠和在LPS施用后接受30％输注的大鼠(图9D)的肺的代表性组织学(苏木精和曙红)染色。如在假处理的动物中所见，在不存在LPS下接受输注的动物表现出正常的肺部结构，而在30％输注前接受LPS的的动物表现出严重的中性粒细胞浸润和肺泡细胞壁增厚。条代表100μm。在室温下用显微镜(BX50，Olympus)以20X的放大率观察组织。用数码相机(DP70，Olympus)获取图像。
图10A-10C示出了LPS“第一次命中”诱发白细胞减少症。在未接受LPS预处理或在LPS预处理(输注前，n＝22)下输注30％错配RBC之前，从大鼠中收集血液。输注后四小时，再次从无LPS(仅输注，n＝5)下输注或有LPS(输注+LPS，n＝3)下输注的大鼠中收集血液。报道了WBC和中性粒细胞(图10A)、单核细胞(图10B)和淋巴细胞(图10C)的水平。所示数据是平均值和平均值的标准偏差。
图11A-11D示出了预防性施用的PIC1减轻了急性肺损伤。图11A示出了针对假处理动物(n＝7)、用媒剂(n＝5)或PIC1(n＝8)预防性处理的动物的总肺重。所示数据是平均值和平均值的标准误差(SEM)。示出了来自假处理大鼠(图11B)、接受媒剂的大鼠(图11C)和接受PIC1的大鼠(图11D)的肺的代表性组织学(苏木精和曙红)染色。如在假处理的动物中所见，接受PIC1的动物表现出正常的肺部结构，而接受媒剂的动物表现出肺泡空间的巩固和肺泡细胞壁的增厚。条代表100μm。在室温下用显微镜(BX50，Olympus)以20X的放大率观察组织。用数码相机(DP70，Olympus)获取图像。
图12A-12B示出了PIC1减少中性粒细胞介导的肺损伤和肺中MPO活性。在图12A中，对接受媒剂(n＝7)的动物和接受PIC1(n＝9)的动物的中性粒细胞浸润和细胞壁增厚的H&E切片进行了盲式评分，评分范围为0-4：0＝正常肺，1＝轻微肺部受累，2＝中度肺部受累，3＝严重肺部受累，4＝重度肺部受累。方框示出了四分位数，晶须为25％，实线为平均值。在图12B中，通过抗体捕获从均质化的肺组织中分离出MPO以测量MPO活性。将样品与过氧化氢和ADHP溶液组合，并立即在酶标仪中每25秒从0到10分钟在535nm的激发波长和590nm的发射波长下读取。分析了MPO(阳性对照，+CTR，n＝3)和PBS(阴性对照，-CTR，n＝3)以及接受媒剂(n＝2)和接受PIC1(n＝3)的动物的样品。一式三份地对每个样品进行评估。所示数据是平均值和平均值的标准偏差。为简单起见，仅示出了5分钟和10分钟的时间点。
图13A-13D示出了PIC1减少白细胞减少症。从接受媒剂(n＝5)或PIC1(n＝8)的大鼠收集血液。报道了WBC(图13A)、淋巴细胞(图13B)、中性粒细胞(图13C)和单核细胞(图13D)的水平。所示数据是平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图14示出了PIC1降低循环中游离DNA水平。将来自接受媒剂(n＝3)或PIC1(n＝3)的动物的血浆样品与PicoGreen孵育。在酶标仪中以485nm的激发波长和520nm的发射波长读取荧光。一式三份对每只动物进行所有游离DNA测量。所示数据是平均值和平均值的标准误差(SEM)。
图15示出了PIC1对TRALI的抑制的模型。在这种动物模型中，LPS第一次命中、随后30％人RBC输注导致TRALI样表型，该TRALI样表型由中性粒细胞螯合和激活介导的肺损伤组成，该肺损伤导致MPO介导的活性氧(ROS)生成和NETosis。来自补体介导的溶血的游离血红素也有助于ROS的形成。PIC1可以抑制补体介导的溶血、C3a和C5a生成、ROS形成以及MPO介导的NETosis和ROS形成，从而抑制TRALI。补体过敏毒素C3a和C5a示出为点画箭头，因为在此模型中它们在中性粒细胞激活中的直接作用尚不清楚。
图16示出了对于MPO浓度增加，PIC1对MPO介导的TMB氧化的剂量反应性抑制。
图17示出了通过IP注射的增加剂量的纯化的MPO显示出在腹膜洗涤样品中TMB过氧化增加的图。IP注射增加量的纯化的MPO，一小时后，对动物进行放血、安乐死和腹膜洗涤。测量了腹膜洗涤上清液的TMB氧化(n＝4)。所示数据是独立动物的平均值±SEM。
图18示出了增加剂量的纯化的MPO IP表现出腹膜洗涤样品中游离DNA增加。IP注射增加量的纯化的MPO，一小时后，对动物进行放血、安乐死和腹膜洗涤。腹膜洗涤上清液中的游离DNA通过PicoGreen测定法测量(n＝4)。所示数据是独立动物的平均值±SEM。
图19示出了腹膜内MPO时程实验结果。IP注射纯化的MPO(0.1mg)，并以递增的间隔对动物进行放血、安乐死和腹膜洗涤。测量了腹膜洗涤上清液的TMB氧化(n＝4)。所示数据是独立动物的平均值±SEM。
图20示出了腹膜内MPO时程实验结果。IP注射纯化的MPO(0.1mg)，并以递增的间隔对动物进行放血、安乐死和腹膜洗涤。腹膜洗涤上清液中的游离DNA通过PicoGreen测定法测定(n＝4)。所示数据是独立动物的平均值±SEM。
图21-23示出了在增加剂量的PIC1下腹膜内MPO。IP注射纯化的MPO(0.1mg)，然后立即以递增剂量进行PIC1的IP注射。IP注射后两(2)小时，对动物进行放血、安乐死和腹膜洗涤。图21示出了腹膜洗涤上清液的TMB氧化(n＝4)。图22示出了通过PicoGreen测定法测得的腹膜洗涤上清液的游离DNA(n＝4)。图23示出了通过PicoGreen测定法测量的血浆游离DNA(n＝4)。在图21-23中，所示数据是独立动物的平均值±SEM。
发明内容
一方面，提供了一种治疗受试者的系统性红斑狼疮(SLE)的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。
在一些实施方案中，在对受试者施用输血之前、在对受试者施用输血之后和/或在输血期间，施用PIC1。在一些实施方案中，所述方法有效地调节受试者中补体系统的免疫复合物激活和NET形成。在一些实施方案中，所述方法有效地抑制受试者中NET介导的炎性组织损伤。在一些实施方案中，NET形成由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种所刺激。
在上述方面的多个实施方案中，PIC1抑制受试者的髓过氧化物酶(MPO)活性。在多种实施方案中，PIC1被肠胃外施用。在多个实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，PIC1是包含一个或多个PEG部分的肽。在某些实施方案中，PIC1是PA-dPEG24。在某些实施方案中，PA-dPEG24包含IALILEPICCQERAA-dPEG24的序列(SEQ IDNO:19)。
在另一方面，提供了一种治疗受试者中输注相关的急性肺损伤(TRALI)的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的PIC1。
在一些实施方案中，在受对受试者施用输血之前、在对受试者施用输血之后和/或在输血期间，施用PIC1。在一些实施方案中，所述方法有效地调节受试者中补体系统的免疫复合物激活和NET形成。在一些实施方案中，所述方法有效地抑制受试者中NET介导的炎性组织损伤。在一些实施方案中，NET形成由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种所刺激。
在上述方面的多个实施方案中，PIC1抑制受试者的髓过氧化物酶(MPO)活性。在多种实施方案中，PIC1被肠胃外施用。在多个实施方案中，受试者是人类。在某些实施方案中，PIC1是包含一个或多个PEG部分的肽。在某些实施方案中，PIC1是PA-dPEG24。在某些实施方案中，PA-dPEG24包含IALILEPICCQERAA-dPEG24的序列(SEQ IDNO:19)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。
术语“抑制”是指降低酶、蛋白质、肽、因子、副产物或其衍生物的生物学功能，无论是单独的还是复合的；减少体内或体外生物蛋白、肽或其衍生物的量；或中断已知包含一系列相关生物或化学反应的事件、级联或途径的生物链。因此，可以使用术语“抑制”来例如描述与对照样品相比补体级联的单个组分的量的减少；一个组分或组分复合物的形成速率或总量的减少；或导致诸如以下的结果的复杂过程或一系列生物反应的整体活性降低：细胞裂解、转化酶的形成、补体来源的膜攻击复合物的形成、炎症或炎性疾病。在体外测定中，术语“抑制”可以指某些生物或化学事件的可测量的减少，但是本领域普通技术人员将理解，可测量的减少不必全部是“抑制的”。
术语“PIC1”是指包含IALILEPICCQERAA的极性分类子(PA)序列(SEQ ID NO:1)的肽，以及包含相同氨基酸序列但具有修饰诸如PEG化的肽。术语“PIC1变体”是指包含与IALILEPICCQERAA的PA序列(SEQ ID NO:1)至少85％相同，或至少90％相同，或至少95％相同，或至少99％相同，但不100％相同的序列的肽。PIC1变体可包含PA序列中有至少一个氨基酸缺失的肽。PIC1变体可包含在PA序列中插入氨基酸的肽。PIC1变体可以包含PA序列的至少一个氨基酸被另一个氨基酸诸如丙氨酸、修饰的氨基酸或氨基酸衍生物诸如肌氨酸(Sar)取代的肽。
如本文所用，术语“受试者”是指期望对其进行诊断、预后或治疗的任何受试者。例如，受试者可以是哺乳动物，例如人类或非人类灵长类动物(诸如猿、猴、猩猩或黑猩猩)、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛或奶牛。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以显示出有意义的患者益处的每种活性成分的总量。肽化合物的治疗有效量取决于几个因素而不同，诸如所治疗的病况、病况的严重程度、施用时间、施用途径、所用化合物的排泄速率、治疗持续时间、所涉及的联合疗法以及受试者的年龄、性别、体重和病况等。本领域普通技术人员可以确定治疗有效量。因此，本领域普通技术人员可需要滴定剂量并改变施用途径以获得最大的治疗效果。
如本文所用，“治疗”是指以有效改善病症(例如本文所述的病症)或其症状，或预防或减缓病症(例如本文所述的病症)或其症状的进展的量、方式(例如，施用时间表)和/或模式(例如，施用途径)施用疗法。这可以通过例如与病症或其症状相关的参数的改善，例如统计学上显著的程度或本领域技术人员可检测的程度来证明。有效量、方式或模式可以根据受试者而变化，并且可以针对受试者量身定制。通过预防或减缓病症或其症状的进展，治疗可以预防或减缓在患病或诊断受试者中由病症或其症状导致的恶化。
一方面，提供了一种抑制受试者炎症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的PIC1或PIC1变体。在另一方面，提供了一种治疗受试者的炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的PIC1或PIC1变体。
在相关方面，提供了一种用于治疗和/或预防受试者炎症的方法中的PIC1或PIC1变体。所述方法包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的PIC1或PIC1变体的组合物。
PIC1和PIC1变体的实例包括但不限于表1中列出的肽。
表1.
在一些实施方案中，PIC1包含一个或多个PEG部分。PEG部分可通过PEG化连接至N端、C端或N端和C端两者。在一个或多个实施方案中，24个PEG部分连接至N端。在一个或多个实施方案中，24个PEG部分连接至C端。在一个或多个实施方案中，24个PEG部分连接至N端和C端。在一个或多个实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个PEG部分连接至N端。在一个或多个实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个PEG部分连接至C端。在一个或多个实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个PEG部分连接至N端和C端。
PIC1肽可以是合成肽。体外制备合成肽。可以根据本领域已知的各种方法来制备合成肽。例如，可以通过依次偶联各个氨基酸以形成肽来制备合成肽。在一些实施方案中，各个氨基酸的羧基顺序地偶联至正在生长的肽链的氨基末端。保护基可用于防止在偶联过程中发生不希望的副反应。肽合成可以在液相或固相中进行。
示例性的PIC1肽包括但不限于PA-dPEG24(在C端包含极性分类子(PA)序列和24个PEG部分的肽)、PA-dPEG20(在C端包含20个PEG部分)、PA-dPEG16(在C端包含16个PEG部分)、PA-dPEGl2(在C端包含12个PEG部分)、PA-dPEG08(在C端包含8个PEG部分)、PA-dPEG06(在C端包含6个PEG部分)、PA-dPEG04(在C端包含4个PEG部分)、PA-dPEG03(在C端包含3个PEG部分)和PA-dPEG02(在C端包含2个PEG部分)。
PIC1肽可以通过结合和阻断级联的起始组分C1的激活来抑制补体的经典途径[19,20]。PA-dPEG24是PIC1家族中的一种15氨基酸的PEG化肽。PA-dPEG24可以抑制免疫复合物引发的补体激活以及抑制NET的形成。PA-dPEG24可以通过各种免疫复合物持续抑制补体激活，还可以抑制由多种刺激引发的NET形成。
在一些实施方案中，PIC1有效抑制受试者的NETosis。在一些实施方案中，所施用的PIC1抑制受试者中的MPO活性。在各个实施方案中，受试者是人类。NETosis是中性粒细胞通过释放其染色体DNA作为中性粒细胞胞外陷阱(NET)而经历细胞死亡的过程。NET是网状的，包括染色质原纤维和抗菌分子。在一些实施方案中，NETosis由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种所刺激。
PIC1抑制MPO介导的氧化，如图16所示。PA-dPEG24可以抑制离体临床CF痰样品中的MPO的过氧化物酶作用以及体外纯化的MPO的过氧化物酶作用。PA-dPEG24在体外还抑制其他基于血红素的过氧化物酶，包括血红蛋白和肌红蛋白的过氧化物酶活性。PA-dPEG24可以在体外抑制NET形成，诸如由佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、纯化的MPO和免疫复合物激活的人血清中的任何一种刺激的NET形成。
可以向受试者施用PIC1肽以调节疾病中补体系统的免疫复合物激活和NET形成。示例性疾病包括但不限于狼疮性肾炎、血清病、迟发型超敏反应(III型超敏反应)、感染性心内膜炎、自身免疫性肾小球肾炎、冷球蛋白血症、干燥综合征、小血管血管炎、ANCA相关性血管炎、硬皮病和其他炎性或自身免疫性血管炎疾病包括肾小球肾病、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、输注相关的急性肺损伤、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、1型糖尿病、2型糖尿病、抗磷脂抗体综合征、痛风、克罗恩病、溃疡性结肠炎、横纹肌溶解症、肥胖/代谢综合征、韦格纳肉芽肿病(WG)、血栓形成、全身性炎症反应综合征(SIRS)、败血症、早产儿视网膜病变(ROP)、子痫、牙周炎、新生儿慢性肺病(CLD)、坏死性小肠结肠炎(NEC)、流感引起的肺炎、炎性肺病(ILD)、炎性肠病(IBD)、癌症发炎或支气管肺发育不良(BPD)。
在某些实施方案中，PIC1(例如，PA-dPEG24)基本上抑制NET形成和/或NETosis。在其他实施方案中，PIC1(例如PA-dPEG24)抑制或基本上抑制NET介导的炎性组织损伤。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的系统性红斑狼疮(SLE)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。
在相关方面，提供了一种用于治疗和/或预防受试者的SLE的方法的PIC1或PIC1变体。所述方法包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的PIC1或PIC1变体的组合物。
可以治疗性靶向的SLE发病机理的两个主要方面是免疫复合物引发的补体激活和中性粒细胞形成中性粒细胞胞外陷阱(NET)。不希望受到理论的束缚，抗C1q抗体在SLE患者血液中的作用是一个活跃的研究领域，大量数据的积累证明抗C1q抗体的存在与狼疮性肾炎之间存在密切联系[7,8]。研究人员还显示，在ELISA型测定中，结合在表面的来自SLE患者的抗C1q抗体可以激活经典途径和凝集素途径[9]。因此，抗C1q抗体可在发病机理和SLE样免疫复合物的形成中起作用。
免疫复合物可以激活与人类中性粒细胞相互作用并刺激人类中性粒细胞的补体激活效应的补体产生效应物(例如，C5a，亚溶解浓度的膜攻击复合物等)[10-13]。然而，描述免疫复合物可以诱导中性粒细胞生成NET的文章集中于Fc受体在此过程中的作用[14-17]。如果文章显示免疫复合物与NET之间的联系，那么补体激活在此过程中的贡献仍不清楚。Akong-Moore等[18]提出，NET形成的主要途径可以通过MPO发生，其主要功能是从过氧化氢和氯离子生成次氯酸。可以通过使用MPO抑制剂来阻止NET的形成。
在一些实施方案中，PIC1有效抑制受试者的NETosis。在一些实施方案中，NETosis由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种所刺激。可以施用PIC1来调节免疫复合物的补体激活和NET的形成。在一个实施方案中，PIC1是PA-dPEG24。在一个实施方案中，PIC1可用于调节C1-抗C1q免疫复合物。在一个实施方案中，PIC1可用于抑制免疫复合物激活和NET形成。在某些实施方案中，PIC1可用于限制促炎性补体效应子的产生。在一个实施方案中，PIC1可用于限制C5a和sC5b-9的产生。在某些实施方案中，PIC1抑制由PMA刺激的人类中性粒细胞的NET形成。
在一些实施方案中，所施用的PIC1抑制受试者中的MPO活性。PIC1可用于抑制MPO刺激的人类中性粒细胞的NET形成。根据某些方面，PIC1可用于抑制由免疫复合物激活的血清刺激的人类中性粒细胞的NET形成。根据某些方面，PIC1是肠胃外递送的。在各个实施方案中，受试者是人类。
根据某些方面，PIC1可用于调节免疫复合物补体激活和中性粒细胞形成，以治疗SLE、狼疮性肾炎、血清病、迟发型超敏反应(III型超敏反应)、感染性心内膜炎、自身免疫性肾小球肾炎、冷球蛋白血症、干燥综合征、小血管血管炎、ANCA相关性血管炎、硬皮病和其他炎性或自身免疫性血管炎疾病、肾小球肾病、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、输注相关的急性肺损伤、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、1型糖尿病、2型糖尿病、抗磷脂抗体综合症、痛风、克罗恩病、溃疡性结肠炎、横纹肌溶解症和肥胖/代谢综合征。
实施例1的实验证明，PA-dPEG24可以抑制免疫复合物引发的补体激活和促炎性补体效应子的产生。这表明，补体抑制肽可以缓解补体系统的免疫复合物激活起着至关重要的作用的疾病的发病机理的多方面，所述疾病诸如SLE、狼疮性肾炎、血清病、迟发型超敏反应(III型超敏反应)、感染性心内膜炎、自身免疫性肾小球肾炎、冷球蛋白血症、干燥综合征、小血管血管炎、ANCA相关性血管炎、硬皮病和其他炎性或自身免疫性血管炎疾病、肾小球肾病、急性呼吸窘迫综合征、急性肺损伤、输注相关的急性肺损伤、囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、1型糖尿病、2型糖尿病、抗磷脂抗体综合症、痛风、克罗恩病、溃疡性结肠炎、横纹肌溶解症和肥胖/代谢综合征。此外，C1和抗C1q抗体可用于新型免疫复合物中，以模拟一种类型的免疫复合物，所述免疫复合物可被预测在具有抗C1q抗体的SLE患者血浆中形成。PA-dPEG24还阻断了C1-抗C1q免疫复合物的补体激活，这与测试的其他免疫复合物类型一致。
免疫复合物引发的补体激活的人血清可以引发NET形成，例如，如实施例1所示。结果令人惊讶，与先前的观察结果相反，免疫复合物本身可以通过Fc受体引发NET形成[14-17]。在实施例1的实验条件下，免疫复合物引发的补体激活对NET形成的贡献远大于单独免疫复合物的贡献。不希望受到理论的束缚，鉴于活性SLE疾病中存在免疫复合物，免疫复合物引发的补体激活可以是SLE中NET形成的重要机制。
实施例1中的实验还表明，PA-dPEG24可以抑制由PMA、MPO或免疫复合物引发的补体激活的人血清引发的人类中性粒细胞的NET形成。不受理论的束缚，PA-dPEG24至少基于PMA通过MPO介导的途径刺激NET形成的能力以及本文所述的利用纯化MPO的结果，通过抑制MPO介导的途径来阻断NET的形成[18]。人类血清免疫复合物激活后，PA-dPEG24能够抑制NET形成表明，NET的形成可通过阻断MPO介导的途径而发生。PA-dPEG24肽既可以阻断经典途径的补体激活，又可以抑制NETosis。PA-dPEG24和其他PIC1蛋白可用于通过作用于SLE发病机理的两个当前未靶向的方面来治疗SLE的方法中。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的输注相关的急性肺损伤(TRALI)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。
在相关方面，提供了一种用于治疗和/或预防受试者的TRALI的方法的PIC1或PIC1变体。所述方法包括向有需要的受试者施用包含治疗有效量的PIC1或PIC1变体的组合物。
输注相关的急性肺损伤(TRALI)是由输血引起的呼吸窘迫疾病和输注相关的死亡的主要原因。本文描述的是一种使用错配的红细胞的新型的TRALI“两次命中”大鼠模型，所述错配的红细胞引起肺实质的中性粒细胞浸润。在这种新的TRALI模型中，两次命中的大鼠模型允许评估补体C1肽抑制剂(PIC1)在减轻肺损伤中的作用。
本文描述了TRALI的新型模型，其数据显示PIC1在此模型中减轻TRALI介导的疾病的能力。许多“两次命中”模型已在文献中以多种物种发表，所述模型使用LPS作为“第一次命中”，以及抗体依赖性(例如H2Kd、HLA等)或抗体非依赖性(例如老化的RBC、lysoPC、RBC上清液等)刺激物作为“第二次命中”。本文所述的模型的独特之处在于，与使用同源红细胞的RBC输注不同，它使用抗体引发的补体介导的输注红细胞溶血作为“第二次命中”。拥有人类RBC的A抗原预先存在抗体的Wistar大鼠可以引发经典补体激活，这可导致A型或AB型人红细胞输注后剧烈的血管内溶血。
PIC1是多功能分子。在AIHTR模型中，PIC1可以通过抑制经典补体途径激活和膜攻击复合物(MAC)的RBC裂解来抑制输注的错配RBC的溶血。PIC1可以在体外充当抗氧化剂分子，以抑制游离血红素、血红蛋白和肌红蛋白的过氧化物酶活性以及MPO的过氧化物酶活性。
在一些实施方案中，在受试者被施用输血之前、在受试者被施用输血之后和/或输血期间施用PIC1。
在一些实施方案中，PIC1有效抑制受试者的NETosis。在各个实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，NETosis由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种所刺激。
在一些实施方案中，所施用的PIC1抑制受试者中的MPO活性。此外，PIC1可以抑制MPO介导的NETosis。不希望受到理论的束缚，PIC1可通过抑制补体激活并通过MAC介导的溶血作用防止过敏毒素C3a和C5a的产生以及血红蛋白血症而减少中性粒细胞向肺组织的大量浸润，并可减轻TRALI(图15)。PIC1可以在体外减弱来自游离血红蛋白和MPO的过氧化物酶生成的ROS活性以及NETosis。
目前，尚无采用由机械通气和血液动力学支持组成的现行护理标准治疗TRALI的药理干预措施。本文描述的动物模型可以模拟创伤样临床情况，其中患者需要导致TRALI的大量包装的RBC输注。PIC1通过抑制经典途径补体激活、MPO介导的ROS形成以及NETosis来阻断LPS注入和随后错配RBC所致的TRALI样发病机理的能力表明，PIC1可具有作为减轻TRALI发病机理的多个方面的药理学试剂的潜力。
鼻内施用DNase减轻动物模型中TRALI的症状，这表明抑制NET的形成可以是一种有用的治疗策略。NET形成的主要途径可以由中性粒细胞生成的MPO介导，其主要作用是从氯离子和过氧化氢以及MPO衍生的活性氧产生次氯酸。MPO抑制剂ABAH可以在体外抑制佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)刺激的NET形成，从而揭示了抑制NET形成的另一种潜在机制。
在利用错配红细胞输注的急性血管内溶血性输注反应(AIHTR)的大鼠模型中，大鼠物种具有针对人红细胞A抗原的预先存在的抗体，导致在从A型或AB型供体输注人红细胞后产生稳健(robust)的AITHR。此AIHTR模型可以引起抗体引发的经典补体途径激活，从而导致急性肾损伤和高度炎性全身反应。抗体引发的补体激活和中性粒细胞动员的致病性方面表明，如果炎性反应针对肺部，那么此模型可适应产生TRALI表型。
抗体介导的补体系统激活是由经典补体途径引导的，其中起始复合物C1与IgM或多个IgG结合，触发激活和下游效应子功能(即C3a、C5a和膜攻击复合物形成)。经典补体途径的PIC1肽抑制剂可以结合C1复合物的识别分子C1q，以防止抗体介导的激活。已证明将PIC1衍生物PA-dPEG24(IALILEPICCQERAA-dPEG24(SEQ ID NO:19))在血管内施用于大鼠时可在体外和体内两者抑制经典途径的激活，在大鼠中可实现>90％的全身抑制补体激活30秒。尽管先前已显示PIC1衍生物在体外抑制经典补体途径介导的ABO错配溶血，但在输注错配红细胞之前或之后立即施用时，PIC1可以在AIHTR大鼠模型中抑制抗体引发的补体介导的溶血。此外，已经显示PIC1在体外也能抑制MPO的过氧化物酶活性和NETosis。已开发出一种独特的、基于错配红细胞的‘两次命中’TRALI模型，所述模型证明了预防性施用PIC1减轻急性肺损伤和此呼吸综合征的其他特征。
实施例
还通过以下实施例描述和证明了本发明。然而，在说明书中任何地方使用所述实施例和其他实施例仅是示例性的，绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于这里描述的任何特定的优选实施方案。实际上，在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以进行这种变化。因此，本发明仅由所附权利要求的条款以及那些权利要求所赋予的等同物的全部范围来限制。
实施例1
此实施例描述了在人血清中免疫复合物介导的补体激活的体外测定中和人类中性粒细胞NET形成的测定中对补体C1的肽抑制剂(PIC1)的测试。
获得了来自健康供体的血液。PA-dPEG24(IALILEPICCQERAA-dPEG24(SEQ ID NO:19))是由PolyPeptide Group(San Diego，CA)生产的，纯度≥95％，并通过HPLC和质谱分析证实。将冻干的PA-dPEG24溶于0.01M Na2HPO4缓冲液的生理盐水中至37.5mM。纯化的MPO购自Lee Biosolutions(Maryland Heights，MO)。静脉免疫球蛋白购自Baxter HealthcareCorporation(Westlake Village，CA)，卵白蛋白购自Sigma Aldrich(St Louis，MO)，抗卵白蛋白抗体购自Abeam(Cambridge，MA)。山羊抗C1q和人类C1购自Complement Technology(Tyler TX)。PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)和过氧化氢购自Fisher Scientific(Hampton，NH)。
补体允许的GVBS++缓冲液是含0.1％明胶、0.15M CaCl2和1mM MgCl2的veronal缓冲生理盐水[29]。补体抑制缓冲液GVBS--是含0.1％明胶和10mM EDTA的veronal缓冲生理盐水。如先前所述制备汇集的正常人血清(NHS)[29]。
NHS的免疫复合物激活如下进行。用三种不同类型的免疫复合物(IC)刺激NHS以诱发补体激活。通过在63℃孵育50mg/ml的静脉免疫球蛋白30分钟可产生热聚集的IgG[26]。卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物的制备方法是：将0.01ml抗卵白蛋白抗体与等体积的卵白蛋白(0.25mg/nil)在37℃下孵育30分钟，然后在4℃下保存过夜。通过将0.02ml抗C1q山羊血清与5μl的C1以200μg/ml在30℃孵育30分钟，然后置于冰水浴中来形成C1免疫复合物。对于C5a和C5b-9测定，通过在室温下将5％NHS与滴定浓度的PA-dPEG24在0.3ml GVBS++缓冲液中预孵育30分钟，来激活NHS。然后在37℃下在混合物中加入2ml热聚集的IVIg或卵白蛋白IC或5μl C1-抗C1q IC，持续30分钟。加入等体积的GVBS--终止此反应。对于iC3b检测，使用1％NHS，其余方案保持不变。
ELISA如下进行。使用C5a、iC3b和SC5b-9ELISA测定样品。按照制造商的说明使用C5a ELISA试剂盒(R&D Systems)。如前所述[30]进行了iC3b和SC5b-9的ELISA。在iC3bELISA中，使用山羊抗人C3抗体(Complement Technology，Tyler TX)进行捕获，使用小鼠抗人iC3b抗体(Quidel，San Diego CA)进行探测，使用山羊抗小鼠HRP抗体进行检测。在SC5b-9ELISA中，使用兔抗人SC5b-9抗体(Complement Technology)进行捕获，使用小鼠抗人SC5b-9单克隆抗体(Quidel)进行探测，并使用鸡抗小鼠HRP抗体进行检测。用TMB进行比色检测，用H2SO4终止，并在BioTek Synergy HT读板仪上于450nm读取。
如前所述[31]，通过Hypaque-Ficoll步骤梯度离心、葡聚糖沉降和低渗裂解从肝素化的血液中纯化健康志愿者血液中的中性粒细胞。
如下在微量滴定板中进行中性粒细胞胞外陷阱测定。NET的形成是通过在96孔组织培养板中用单独RPMI培养基或添加0.05％H2O2或12nM PMA或8μg/ml MPO或不同浓度的PA-dPEG24孵育2.0×105个中性粒细胞诱发的。对于免疫复合物血清诱导的NET形成，通过在0.3ml GVBS++的5％NHS中添加5μl卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物来制备激活的血清。将此组合在37℃下孵育30分钟，然后将0.05ml加入到RPMI中的中性粒细胞中。然后将细胞在5％CO2孵育箱中于37℃孵育1.5小时。
NET的形成如下定量测定。通过PicoGreen测量从NET微量滴定板孔测定中回收的上清液中的游离DNA[18]。将500单位的单球菌核酸酶(Fisher)加入到每个孔中，以允许在37℃的孵育箱中消化释放的细胞外DNA 10分钟。然后将制剂等分到相邻的孔中，并与制备的PICO绿色试剂(Fisher)1:1混合。然后在BioTek酶标仪上在激发485nm/发射528nm下对荧光进行定量。
通过荧光显微镜测定NET的形成。如下在载玻片上测定纯化的人类中性粒细胞。将细胞与RPMI培养基和上述指定的刺激物在试管中合并，然后等分到载有疏水性玻片标记物的载玻片上。将载玻片在37℃下于5％CO2孵育箱中于37度孵育1.5小时。将载玻片在4℃用4％多聚甲醛固定过夜。
对于所有染色，使用以下条件。将载玻片在PBS中洗涤并在封闭溶液(PBS中的2％正常山羊血清+2％牛血清白蛋白)中于室温孵育1小时。然后将载玻片与1:300的一级抗体在2％BSA的PBS溶液中于室温孵育1小时。将载玻片在PBS中洗涤3次，并在荧光标记的二级抗体中以1:1000或DAPI(Southern Biotech)以0.25pg/ml的终浓度在2％BSA的PBS溶液中于室温孵育1小时。然后将载玻片在PBS中洗涤3次并成像。使用安装在BX50，Olympus显微镜上的DP70数码相机(Olympus Center，Valley Forge，PA)对细胞进行可视化。使用的染色抗体对是兔抗MPO(Thermo Scientific)和兔抗组蛋白H3(Abeam)，以及二级山羊抗兔AlexaFluor 488(Novus Biologicals)。另外，将小鼠抗弹性蛋白酶(Invitrogen)与二级山羊抗小鼠Alexa Fluor 568(Novus Biologicals)一起使用。
统计分析如下进行。使用Excel(Microsoft，Redmond，WA)对定量数据进行分析，以确定平均值、标准误差(SEM)和学生t检验[32]。
显示PA-dPEG24抑制免疫复合物引发的补体激活。为了评估PA-dPEG24抑制免疫复合物引发的补体激活的能力，将热聚集IgG的原型免疫复合物刺激物[25,26]用于汇集的正常人血清(NHS)中。测定了由补体激活产生的三个重要效应子：主要的促炎性过敏毒素C5a、C3激活的裂解产物iC3b和膜攻击复合物C5b-9。数据示于图1A-1C。图1A示出了PA-dPEG24抑制了用热聚集的IgG(Agg-IgG)免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中C5a的产生。进行了五个独立的实验，显示了SEM。图1B示出了PA-dPEG24对用热聚集IgG(Agg-IgG)免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中iC3b生成的抑制。进行了四个独立的实验，显示了SEM。图1C示出了PA-dPEG24对用热聚集的IgG(Agg-IgG)免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中SC5b-9生成的抑制。进行了六个独立的实验，显示了SEM。
对于每种测定，与无抑制剂相比，在用热聚集的IgG刺激后，PA-dPEG24剂量依赖性地抑制了效应子的精化(elaboration)。在每种测定中，在≥0.5mM PA-dPEG24下均达到了统计学上显著的抑制作用(P<0.05)。对于C5a，与无抑制剂的热聚集IgG相比，1mM PA-dPEG24导致61％降低(P＝0.002)。这些结果表明PA-dPEG24可以抑制人血清中免疫复合物引发的补体激活。
为了用热聚集的IgG提供结果的证实，然后测试了补体激活动物模型中最常使用的抗原-抗体免疫复合物、卵白蛋白和抗卵白蛋白[27,28]。使用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激NHS中的补体激活，并测量了相同的三个效应子C5a、iC3b和C5b-9。与单独的卵白蛋白-抗卵白蛋白相比，PA-dPEG24剂量依赖性地抑制每种补体效应子的产生，在≥0.25mM的PA-dPEG24下具有统计学上显著的抑制作用(P<0.03)。数据示于图2A-2C。图2A示出了PA-dPEG24对用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中C5a生成的抑制。进行了四个独立的实验，显示了SEM。图2B示出了PA-dPEG24对用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中iC3b产生的抑制。进行了四个独立的实验，显示了SEM。图2C示出了PA-dPEG24对用卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中SC5b-9生成的抑制。在2mM PA-dPEG24下，测得的SC5b-9处于检测下限。进行了三个独立的实验，显示了SEM。这些结果提供了另外的信心，即PA-dPEG24可以抑制人血清中免疫复合物引发的补体激活。
由于抗-C1q抗体在一部分(subset)SLE患者中的重要性，因此产生了具有人C1和抗C1q抗体(山羊)的免疫复合物。这些免疫复合物激活了NHS，导致稳健生成C5a、iC3b和SC5b-9。数据示于图3A-3C。
图3A示出了PA-dPEG24对用C1-抗C1q免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中C5a生成的抑制。进行了四个独立的实验，显示了SEM。图3B示出了PA-dPEG24对用C1-抗C1q免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中iC3b生成的抑制。进行了四个独立的实验，显示了SEM。图3C示出了PA-dPEG24对用C1-抗C1q免疫复合物刺激的正常人血清(NHS)中SC5b-9生成的抑制。进行了四个独立的实验，显示了SEM。
在每种浓度下，PA-dPEG24剂量依赖性地抑制NHS中C5a的C1-抗C1q生成(P<0.03)。iC3b的C1-抗C1q生成被2mM PA-dPEG24抑制(P<0.02)至类似于NHS基线的水平。当浓度≥0.13mM时，PA-dPEG24剂量依赖性抑制SC5b-9的C1-抗C1q生成(P<0.03)。这些结果表明PA-dPEG24可以抑制人血清中C1-抗C1q免疫复合物引发的补体激活。
显示PA-dPEG24抑制人类中性粒细胞中PMA引发的NET的形成。为了评估PA-dPEG24是否可以抑制中性粒细胞胞外陷阱(NET)，采用类似于Akong-Moore等[18]所述的方法，使用了纯化的人类中性粒细胞和常用的刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)。用DNA和抗MPO抗体分别可视化细胞外DNA和髓过氧化物酶(NET的两个主要组分)。
用PMA和过氧化氢刺激的人类中性粒细胞产生许多NET，通过细胞外DNA和细胞外MPO的荧光显微镜可视化所述NET。图4示出了通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中PMA引发的NET形成的抑制，以及对游离DNA的PicoGreen定量。第一行示出了未刺激的中性粒细胞，第二行示出了用PMA和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞，第三行示出了在5mM PA-dPEG24(PIC1)存在下用PMA+H2O2刺激的中性粒细胞。第一列为用DAPI探测以可视化DNA的载玻片，第二列为用抗MPO抗体探测的载玻片。所述图示出了通过PicoGreen测定的PA-dPEG24(5mM)对用PMA+H2O2刺激的人类中性粒细胞NET生成的抑制。进行了三个独立的实验，显示了SEM。
在5mM PA-dPEG24存在下，PMA和过氧化氢不产生可通过荧光显微镜鉴定的NET。然后，通过在基于PicoGreen的测定中测量微量滴定板孔中刺激的人类中性粒细胞上清液中的游离DNA，对NET的形成进行定量。与没有抑制剂的情况相比，在存在PMA和过氧化氢下，PA-dPEG24(5mM)能够将游离DNA的精化抑制2.6倍(P＝0.01)(图4)。PA-dPEG24的此降低水平与没有PMA的基线相似。
还利用相同的实验条件进行了荧光显微镜检查，但是探测了其他NET成分细胞外中性粒细胞弹性蛋白酶和组蛋白H3。图5示出了针对DNA(DAPI)、中性粒细胞弹性蛋白酶(αNE)和组蛋白H3(α组蛋白)，通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中PMA引发的NET形成的抑制。第一行示出了未刺激的中性粒细胞，第二行示出了用PMA和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞，第三行示出了在5mM PA-dPEG24(PIC1)存在下用PMA+H2O2刺激的中性粒细胞。第一列示出了用DAPI探测以可视化DNA的载玻片，第二列示出了用抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体探测的载玻片，第三行示出了用抗组蛋白H3抗体探测的载玻片。示出了代表性图像。
以上显示了用PMA和过氧化氢刺激导致大量的NET形成，在PA-dPEG24(5mM)存在下被抑制。这些结果表明PA-dPEG24可以抑制人类中性粒细胞中PMA刺激的NET的形成。
显示PA-dPEG24抑制人类中性粒细胞中MPO引发的NET形成。Akong-Moore等[18]提出MPO是PMA刺激的NET形成的关键介体，然而从未使用纯化的MPO对其进行测试。重复上述用纯化的人类中性粒细胞进行的实验，但是用纯化的MPO代替PMA作为NET形成的刺激物。纯化的MPO和过氧化氢对中性粒细胞的刺激导致广泛的NET形成，通过DAPI染色和抗MPO染色可视化所述NET形成。图6示出了通过荧光显微镜测定的PA-dPEG24对人类中性粒细胞(PMN)中MPO引发的NET形成的抑制，以及对游离DNA的PicoGreen定量。第一行示出了未刺激的中性粒细胞。第二行示出了用MPO和过氧化氢(H2O2)刺激的中性粒细胞。第三行示出了在PA-dPEG24(PIC1)存在下用MPO+H2O2刺激的中性粒细胞，第四行示出了仅用PA-dPEG24(PIC1)孵育的中性粒细胞。第一列示出了用DAPI探测以可视化DNA的载玻片。第二列示出了用抗MPO抗体探测的载玻片。所述图示出了通过PicoGreen测定的PA-dPEG24对用MPO+过氧化氢刺激的人类中性粒细胞NET生成的抑制。进行了三个独立的实验，显示了SEM。
在MPO和过氧化氢存在下的NET形成被PA-dPEG24(5mM)阻断。单独用PA-dPEG24孵育的中性粒细胞通过荧光显微镜检查显示正常。当通过PicoGreen测量对NET的形成进行定量时，与MPO刺激、但没有抑制剂相比，1.1mM的PA-dPEG24导致游离DNA减少30％(P＝0.02)，4.5mM的PA-dPEG24导致游离DNA减少3.7倍(P＝0.001)(图6)。在MPO加4.5mM PA-dPEG24存在下，测得的游离DNA与未刺激的中性粒细胞在统计学上没有差异。这些结果表明，PA-dPEG24通过MPO介导的途径抑制NET的形成。
PA-dPEG24抑制人类中性粒细胞中免疫复合物引发的NET的形成。评估了免疫复合物引发的补体激活的人类血清与人类中性粒细胞NET形成之间的潜在关系。正常人血清中的补体被卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物激活，如图2中的实验所示。然后将免疫复合物引发的补体激活的人血清与纯化的人类中性粒细胞孵育，导致NET形成，通过用PicoGreen测量游离DNA来进行定量。免疫复合物的相对贡献最初是由自身与免疫复合物引发的补体激活的人类血清进行NET生成比较来评估的。与单独的中性粒细胞相比，免疫复合物本身的存在并没有显著(P＝0.39)增加NET的形成(图7A)。然而，减去背景后，与单独的免疫复合物相比，血清中补体的免疫复合物激活增加了NET的形成>20倍(P＝0.009)。这些结果首次证明免疫复合物引发的补体激活的血清是NET形成的强大刺激物。
测试过氧化氢以确定其是否通过免疫复合物激活的血清进一步增强了NET的形成，其中过氧化氢使信号大约加倍(图7B)。在已经允许通过免疫复合物血清的补体激活发生之后，添加PA-dPEG24进行PA-dPEG24对NETosis抑制的测试。因此，PA-dPEG24对NETosis的任何影响都发生在补体激活的下游。在存在免疫复合物激活的血清和过氧化氢下，与无抑制剂下相比，2.2mM PA-dPEG24使游离DNA降低23％(P＝0.037)，而4.5mM PA-dPEG24使游离DNA降低3倍(P<0.001)(图7B)。这些状况也通过荧光显微镜可视化(图7C)。在存在PA-dPEG24(5mM)和免疫复合物引发的补体激活的血清下，没有通过荧光显微镜鉴定到NET。
这些发现表明免疫复合物激活的人血清可以刺激人类中性粒细胞形成NET，并且可以被PA-dPEG24抑制。PA-dPEG24对NETosis的抑制是一个令人惊讶的发现，因为对NET形成的抑制是在血清中发生补体激活后发生的，因此引发的刺激物不受影响。这些结果表明了新的想法，即免疫复合物引发的补体激活的血清可通过MPO介导的途径引起NETosis，所述途径被PA-dPEG24阻断。综上所述，这些实验始终表明，PA-dPEG24可以抑制由各种刺激物引发的人类中性粒细胞的NET形成。
总之，PIC1前导衍生物PA-dPEG24(IALILEPICCQERAA-dPEG24(SEQ ID NO:19))能够剂量依赖性地抑制由多种类型的免疫复合物(包括C1-抗C1q免疫复合物)引发的补体激活，限制了促炎性补体效应子(包括C5a和膜攻击复合物(sC5b-9))的产生。PA-dPEG24还能够剂量依赖性地抑制佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、髓过氧化物酶(MPO)或免疫复合物激活的人血清刺激的人类中性粒细胞的NET形成。这些结果表明，PA-dPEG24对NET的抑制作用是通过阻断NET形成的MPO途径而发生的。这些结果共同表明，PA-dPEG24可以抑制补体系统的免疫复合物激活和NET的形成，表明PIC1肽可以用作调节SLE发病机理的这两个关键方面的治疗方法，而当前的药物治疗尚不能解决这一问题。
实施例2
在此实施例中，用脂多糖对Wistar大鼠进行灌注，然后30％输注错配红细胞，大鼠具有预先存在的针对错配红细胞的抗体。假处理动物和媒剂动物用作对照，亚组(subgroup)动物在输注前两分钟接受PIC1。在4小时时，分离血液以进行全血细胞计数。用苏木精和曙红对分离的肺组织进行染色，并在功能测定中定量肺组织中的髓过氧化物酶(MPO)活性。通过PicoGreen染色检测血浆中的游离DNA。
这种利用红细胞输注的新型“两次命中”模型产生了稳健的TRALI表型。与媒剂对照相比，用PIC1处理的动物的肺显示出减少的肺损伤、中性粒细胞浸润和肺组织中的MPO活性。此外，接受PIC1的大鼠表明血液中的游离DNA减少，提示以前与TRALI有关的中性粒细胞胞外陷阱形成减弱。下面显示的结果证明，PIC1在TRALI的新型动物模型中减轻了急性肺损伤。
青春期雄性Wistar大鼠(200-250g)从Hilltop Lab Animals购买，带有留置的颈静脉导管，并在东弗吉尼亚医学院(EVMS)IACUC(机构动物护理和使用委员会)批准的规程下使用。
在根据EVMS批准的机构审查委员会协议(EVMS IRB#02-06-EX0216)的书面知情同意后，获得了健康的人类志愿者捐献的AB血液，用于产生纯化的人类红细胞(RBC)。如前所述处理动物实验早晨获得的人红细胞。通过离心以Histopaque梯度纯化人血。然后将RBC与白细胞和血小板分离，并重悬于生理盐水中。大鼠(200g)的标称循环血容量为14mL，标称血细胞比容为40％。对于输注，输注约2mL的血细胞比容为80％的人RBC，导致向大鼠输注约30％。
如前所述，使用分光光度法分析了由上述实验产生的血浆中的游离血红蛋白。用水使供体红细胞溶血以产生标准曲线，根据所述曲线可计算出每个样品中相对于游离血红蛋白测量值而言的溶血红细胞量。
使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)，以DXP 8 Color 488/637/407升级版(Cytek Development，Freemont，CA，USA)进行流式细胞术。使用Cytek FlowJo CE版本7.5.110.6获取数据。每个样品分别收集约1×105个为红细胞选择的事件，以进行单标记流。使用FlowJo X版本10.0.7r2(FlowJo LLC)分析数据。
对于单标记流，将分离血浆后收集的细胞洗涤、稀释并用FITC-偶联的抗人CD235a(血型糖蛋白A，eBioscience)在GVBS(具有0.1％明胶、0.01mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的veronal缓冲生理盐水(VBS))中以1:200染色20分钟，在室温下振摇以最小化聚集。抗体对照由1:200的小鼠IgG2b Iso对照FITC组成(eBioscience)。
由对实验组不知情的临床医生分析了用H&E染色的肺组织(仅煤剂和经PIC1处理的动物)。中性粒细胞浸润和细胞壁增厚的评分为0-4：0＝正常肺，1＝轻微肺受累，2＝中度肺受累，3＝严重肺受累，4＝重度肺受累。
髓过氧化物酶(MPO)活性测定如下进行。将冷冻的肺组织切成小方块，并在冰上的50mM磷酸钾中均质化，在10,000RPM下于4℃离心15分钟，然后弃去上清液。为了从肺组织中性粒细胞中溶解MPO，将沉淀物重悬于500ml 50mM十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)中，通过超声处理均质化并在液氮中速冻。将此过程重复两次，然后将样品在10,000RPM下于4℃离心10分钟，并收集上清液。
如前所述，在从样品中捕获MPO抗体后，使用10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪(ADHP，Amplex Red)测量这些样品中的过氧化物酶活性。以25秒的间隔从0到600秒读取荧光，使用BioTek酶标仪在535nm的激发波长和590nm的发射波长下每孔提供25个数据点。纯化的MPO用作阳性对照，磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)用作阴性对照。一式三份进行所有活性测定。
如先前所述，通过PicoGreen测量大鼠血浆中的游离DNA。简而言之，将血浆样品在10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 8.0(TE)缓冲液中以1:10稀释，并将50μL的每种样品与50μL的1:200的PicoGreen(Life Technologies)稀释液一起添加到孔中并在室温避光孵育10分钟。在TE缓冲液中制备DNA标准曲线。然后使用BioTek酶标仪在485nm的激发波长和520nm的发射波长下读取荧光。一式三份进行所有游离DNA测量。
通过独立实验计算平均值和标准误差，并使用学生t检验(Microsoft Excel XP)进行统计比较。
在急性血管内溶血性输注反应(AIHTR)的大鼠模型中，输注15％错配RBC导致血管内溶血和急性肾损伤。在此模型中，Wistar大鼠中的自然循环抗A抗体引发经典补体激活和输注红细胞的溶血。为了确定AIHTR模型是否可以适应模仿TRALI表型，最初对递增剂量(15％、30％或45％)的错配RBC输注进行了测试，确定了30％输注产生的补体介导的溶血量接近最大(图8A)。在45％输注时饱和表明，可能已经超过了结合红细胞并具有足够簇集以引发补体激活的抗体量。如通过流式细胞术测定，与15％和45％输注相比，30％输注产生了RBC存活的中间表型(图8B)。输注后4小时，即使在45％输注时也没有发生组织学肺损伤(图9A-9C)。
与输注前的细胞计数相比，在30％输注后，观察到血液中白细胞(WBC)(P＝1.08×10-6)、中性粒细胞(P＝2.70×10-13)和单核细胞(P＝2.59×10-7)的显著增加。白细胞动员了，但没有定位于肺(图10A-10B)。有趣的是，30％输注后，血液中的淋巴细胞显著减少(P＝0.015)(图10C)。
TRALI的其他动物模型通常利用将炎性反应引导至肺的“两次命中”模型(在参考文献中进行了综述)。诱发“第一次命中”的一种方法是输注LPS，在静脉内输注之后，LPS最初会遇到肺毛细血管床，可能会触发“第二次命中”对它们的明显损害。在输注30％错配红细胞的“第二次命中”前30分钟以“第一次命中”的方式给予2mg/kg LPSIV注射，导致输注后4小时出现严重的肺损伤，并大量中性粒细胞浸润肺组织(图9D)。还观察到血管内白细胞水平的相应变化，其中与在不存在LPS“第一次命中”下接受30％输注的动物相比，血流中的WBC(P＝9.8×10-5)、中性粒细胞(P＝4.5×10-4)、单核细胞(P＝0.004)显著降低，而淋巴细胞进一步降低(P＝0.006)(图10A-10C)。此模型中循环白细胞的减少模仿了TRALI患者中报道的短暂性白细胞减少症。总之，这些结果表明，这种具有补体激活的输注引发模型导致重度的中性粒细胞介导的肺部疾病，与TRALI的许多方面一致。
鉴于在此模型中观察到的血管内溶血的炎性性质，测试了增加的输注人RBC的百分比以确定在不存在LPS“第一次命中”下是否会在肺中诱发TRALI样表型。在不存在LPS“第一次命中”下，输注15-45％的人类RBC不会导致急性肺损伤。当添加LPS“第一次命中”时，通过组织学观察TRALI样的发病机理，并检测中性粒细胞介导的肺损伤的其他标志，例如重度肺实质中性粒细胞浸润和白细胞减少症。在这种模型中，需要将LPS作为诱发TRALI的“第一次命中”至关重要，这与文献中报道的众多TRALI的“两次命中”大鼠、小鼠、绵羊和猪模型一致。
为了建立“两次命中”TRALI模型，首先将一定量的人RBC(15％、30％或45％)输注到大鼠中以优化Wistar大鼠模型。对于所有程序，在整个实验过程中均用氯胺酮和乙酰丙嗪对大鼠镇静，并监测生命体征。各组大鼠通过留置的颈静脉导管在血管内输注人RBC。在输注之前，然后在输注后0.5、5、20、60、120和360分钟，将动物的血液样品收集到EDTA微型管(Becton Dickinson)中。将这些样品以2,655×g离心5分钟，以分离出血浆并使细胞沉降。将血浆等分，并如下所述分别处理细胞沉淀。基于具有不同量的人RBC(15-45％)的先导实验，30％的人RBC输注在3小时内产生了稳健的补体介导的溶血，并被选为TRALI模型(图8A和8B)。
对于“两次命中”模型，将大鼠如上镇静，并通过留置的颈静脉导管在血管内施用脂多糖(LPS，来自肠炎沙门氏菌血清型肠炎，2mg/kg[Millipore-Sigma])作为“第一次命中”，类似于其他TRALI模型(在参考文献中进行了概述)。30分钟后，进行30％错配RBC输注作为“第二次命中”。在LPS施用之前和RBC输注后4小时，收集血液样品以分析血液化学成分(SuperChem和CBC，Antech Diagnostics)。最后一次抽血完成后，使用异芴和断头台将动物安乐死。尸检完成以收集器官以进行组织病理学检查。称重从每只动物获得的肺，然后在福尔马林中储存或在-70℃下冷冻。对福尔马林固定组织的苏木精和曙红(H&E)染色切片进行了盲法检查。
为了确定PIC1的预防性施用是否会减弱TRALI的发病机理，利用了这种基于输注的抗体引发的补体介导的TRALI模型。IV输注LPS后28分钟，IV施用160mg/kg PIC1或煤剂对照，然后输注30％错配RBC。对于接受PIC1的动物，在人类RBC输注前2分钟施用约0.05M组氨酸[pH 6.0]、0.15M NaCl中的160mg/kg聚乙二醇化衍生物PA-dPEG24(PolyPeptideGroup)。如先前报道，在血管内溶血Wistar大鼠模型中确定了160mg/kg PIC1剂量的选择。还包括一组仅接受媒剂的动物和假处理动物。
输注后四小时，收集血液并收集肺组织。通过组织学和肺重量、肺组织中性粒细胞浸润、白细胞隔离以及中性粒细胞激活(通过MPO活性和血液中的游离DNA定量)评估，发现PIC1减轻急性肺损伤。除了在不存在PIC1下在这些动物中诱发的TRALI样损伤外，还通过总体形态、器官重量以及血肌酐、BUN/肌酐和肝酶AST(SGOT)(数据未显示)的血液水平升高进行评估，观察到了严重的急性肾损伤(AKI)，与先前在AIHTR模型中报道的AKI一致，可归因于15％输注的人RBC溶血释放的游离血红蛋白。在抗体介导的TRALI的小鼠模型中也已经报道了这种对肾脏的终末器官损害。当与接受煤剂的动物相比时，用PIC1处理的动物已经减轻了肾脏重量，肌酐、BUN/肌酐和AST的血液水平降低(数据未显示)。因此，即使在存在LPS预处理下进行30％输注，PIC1也可以保护肾脏免受损伤，这与PIC1在AIHTR模型中的保护作用一致。
实施例3
此实施例表明，PIC1的预防性施用减少了急性肺损伤。在AIHTR模型中，在输注人RBC之前或之后立即IV施用PIC1缓解了溶血和肾损伤两者。为了确定PIC1是否可以在新型“两次命中”模型中减弱TRALI，对大鼠施用2mg/kg LPS IV作为第一次命中。28分钟后，大鼠接受160mg/kg PIC1或仅煤剂，然后2分钟后进行30％IV输注错配RBC作为第二次命中。基于其在AIHTR模型中的功效，使用了160mg/kg剂量的PIC1。输注后四小时，处死动物，确定肺重量，并通过组织学评估肺组织。
与假处理动物相比，来自媒剂对照动物的肺表现出体重的显著增加(p＝0.006)，与肺中细胞增多的现象一致(图11A)。相反，与媒剂对照动物相比，来自PIC1处理组的肺显示出肺重量显著降低(p＝0.001)，与假处理动物相比没有显著差异(p＝0.432)(图11A)。苏木精和曙红(H&E)染色的切片显示，与表现出正常肺部组织学的假处理动物相比(图11B)，经媒剂处理的动物表现出明显的肺泡间隙巩固和肺泡细胞壁增厚以及中性粒细胞浸润变重，这是预期的(图11C)。相反，用PIC1预防性处理的动物对肺结构的损伤减少(图11D)。
实施例4
此实施例显示了PIC1减少中性粒细胞介导的肺损伤、髓过氧化物酶(MPO)活性和白细胞减少症。为了评估该模型中PIC1在减轻中性粒细胞介导的肺损伤中的作用，对媒剂和PIC1处理过的动物的H&E切片进行了中性粒细胞浸润和细胞壁增厚的盲法分级。中性粒细胞浸润和细胞壁增厚的评分为0-4，评分为0表示肺正常，评分为4表示重度肺损伤。与减轻肺重量和组织学分析一致，与媒剂对照动物相比，接受PIC1的动物的肺损伤评分显著提高(p＝0.003)(图12A)。相比于PIC1处理的动物(平均为1.5，在25和75四分位数处分布更紧密)，煤剂对照动物表现出更高的损伤程度，平均为2.0，分布更广。
为了进一步评估中性粒细胞在此TRALI模型中的致病作用，评估了PIC1通过髓过氧化物酶(MPO)对中性粒细胞介导的肺损伤的作用。MPO是中性粒细胞颗粒中的主要过氧化物酶，通过在许多肺部疾病中形成次氯酸和其他活性氧以及中性粒细胞胞外陷阱(NET)，导致炎性肺损伤。为了确定是否可以在TRALI肺组织中检测到MPO活性，通过抗体捕获方法从接受PIC1的动物或煤剂对照动物的组织匀浆中分离出细胞外MPO，随后在过氧化氢存在下，进行MPO介导的Amplex Red氧化为荧光试卤灵。每25秒从0到10分钟读取荧光。与接受媒剂的动物相比，用PIC1处理的动物在5(p＝0.005)和10分钟(p＝0.002)时的MPO活性水平明显降低(图12B)。
暂时性白细胞减少症可由于肺组织中的中性粒细胞隔离引起的，并且已经在TRALI的动物模型以及TRALI患者中观察到。另请参见图10中的数据。为了确定煤剂与PIC1处理的动物中免疫细胞的循环水平，在安乐死之前先采血。与接受媒剂的动物相比，用PIC1处理的动物的白细胞(p＝0.043)和淋巴细胞(p＝0.048)的血液水平显著增加(图13A和13B)。此外，与接受媒剂的动物相比，循环中性粒细胞和单核细胞也显示出PIC1处理的动物的血流中量呈增加趋势，但未达到统计学显著性(中性粒细胞，p＝0.101；单核细胞，p＝0.229)(分别为图13C和13D)。
实施例5
此实施例显示了PIC1降低了循环中中性粒细胞胞外陷阱(NET)生物标志物的水平。在TRALI的鼠模型中，激活的中性粒细胞可以释放导致急性肺损伤的NET，并且TRALI患者血液中NET生物标志物游离DNA升高。为了确定PIC1是否对循环中的游离DNA水平有影响，在PicoGreen测定中对接受PIC1或煤剂的动物血浆中的DNA水平进行了定量。与接受煤剂的动物相比，从经PIC1处理的动物分离的血浆中的游离DNA水平显著降低(p＝0.02)(图14)。综上所述，通过组织学评估，中性粒细胞介导的肺损伤的减少、肺组织中MPO活性的降低、白细胞减少症的缺乏和循环中游离DNA的减少证明PIC1减少了新型TRALI动物模型中免疫细胞介导的急性肺损伤。
实施例6
此实施例描述了实验以测试PA-dPEG24可以在体内抑制MPO活性和NET形成的程度。利用腹膜内(IP)注射的纯化MPO建立了大鼠炎性腹膜炎模型。
将人类中性粒细胞MPO(Lee Biosolutions)在无菌生理盐水中稀释至每个实验所需的各自剂量。将PA-dPEG24形式的PIC1(PolyPeptide Group)溶解并稀释在0.5M组氨酸缓冲液中，调节至pH 6.5，然后稀释至用于每个实验的各自剂量。
在根据东弗吉尼亚医学院IRB批准的方案(#17-008)进行的实验中，给Wistar大鼠镇静并给其IP注射纯化的MPO。在这些实验中使用16周龄的雄性Wistar大鼠，体重约200g。在所有操作之前，大鼠用氯胺酮和乙酰丙嗪接受镇静。然后，它们接受1ml IP注射的生理盐水中的MPO。在指定的时间间隔后，在K2EDTA Microtainer(BD)中进行尾静脉放血，以获取250mcl的血液。然后将动物用FatalPlus IV安乐死。然后通过IV注射，用20ml冰冷PBS进行腹膜洗涤，然后按摩，并用钝针和注射器从腹膜上的小孔中提取。
沉降细胞，并测试上清液中TMB的MPO过氧化，样品处理如下。将腹膜洗涤液以1500×g离心5分钟以沉降细胞和其他碎片。将所得的腹膜洗涤液上清液等分并冷冻以用于进一步分析。用生理盐水将细胞沉淀重悬至原始体积，并在血细胞计数器上计数细胞。离心淡紫色顶部血液收集管后收集血浆。
MPO活性测定如下进行。将腹膜液和纯MPO一起绘制标准曲线，在96孔板中以0.1ml顺序滴定，然后添加0.1ml的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(Fisher)。一分钟后，添加0.1ml的2.5M H2SO4以终止反应，并在450nm下读取板。使用标准曲线的线性回归，计算每个样品的MPO活性。
MPO介导的腹膜炎剂量响应实验如下进行。进行剂量响应试验实验以确定纯化的MPO的剂量，所述剂量将证明MPO介导的过氧化物酶活性和NET形成。将纯化的MPO以0.01、0.03和0.1mg的剂量IP注射到大鼠中。一小时后，将大鼠安乐死，并进行腹膜灌洗。结果显示在图17中。随着MPO剂量增加至0.1mg，通过基于TMB的测定法测量的腹膜灌洗液中过氧化物酶活性呈增加趋势(P＝0.12)。
在腹膜洗涤液上清液中，通过PicoGreen测定法测量游离DNA作为NETosis的标志物。将腹膜液或血浆以及DNA(Invitrogen)制成标准曲线，在96孔板中以0.1ml顺序滴定，用于Quant-iT PicoGreen(Fisher)测定。按照试剂盒说明的指示将PicoGreen溶液稀释并添加到样品中，将其在黑暗中孵育10分钟，然后在荧光酶标仪上于480nm激发/520nm发射下读取。使用标准曲线的线性回归，对每个样品的DNA浓度进行定量。
结果显示在图18中。随着剂量增加到0.1mg MPO剂量(P＝0.19)，注意到了游离DNA增加的趋势。这些实验的结果表明了剂量-响应关系，其中MPO的最高剂量，即0.1mg，比较低的测试剂量更有可能显示出更多的活性。
总而言之，在大鼠中IP注射的MPO导致腹膜中过氧化活性的增加(图17)和表明NETosis的自由DNA的增加(图18)。
然后进行MPO介导的腹膜炎时程实验。进行了时程实验，以评估此模型中腹膜中纯化MPO的最佳停留时间。以较高0.1mg剂量IP施用MPO，在MPO注射后1、2和4小时安乐死后进行腹膜洗涤。如图19所示，注射后2小时MPO过氧化物酶活性增加了10倍(P＝0.005)，而4小时后没有进一步增加。如图20所示，注射后2小时的游离DNA增加了8倍(P＝0.03)。这些结果表明，IP注射的纯化的MPO在注射后2小时增加了腹膜洗涤液中的过氧化物酶活性和NETosis。
然后测定了PIC1，特别是PA-dPEG24，对MPO介导的腹膜炎中MPO和NETosis的抑制作用。立即，即在接种纯化的MPO后一分钟IP注射一系列增加剂量的PA-dPEG24(1mg、5mg和20mg)至腹膜，随后2小时后进行静脉切开、安乐死和腹膜洗涤。在没有施用PA-dPEG24的情况下使用对照。对于0mg、1mg、5mg和20mgPA-dPEG24剂量中的每一个，进行根据上述方法的MPO活性测定法和游离DNA测定法。
MPO活性测定的结果显示在图21中，而游离DNA测定的结果(在腹膜洗涤上清液中的游离DNA中)显示在图22中。在此模型中，IP注射的PIC1显示出腹膜中的过氧化活性降低(图21)，并显示出减少NETosis的趋势(图22)。特别地，与MPO注射后没有PA-dPEG24相比，20mg剂量(100mg/kg)的PA-dPEG24下的TMB的过氧化物酶活性降低了5倍(P＝0.015)。对于5mg(25mg/kg)和1mg(5mg/kg)的PA-dPEG24剂量，MPO活性也有统计学上的显著下降(P<0.019)。与没有PA-dPEG24的情况相比，以20mg(100mg/kg)剂量的PA-dPEG24观察到腹膜液中游离DNA的减少趋势(P＝0.11)。
还测量了血浆中的游离DNA，结果如图23所示。发现了类似的趋势，其中与MPO注射后无PIC1相比，游离DNA在最高剂量的PA-dPEG24下最低(P＝0.22)。这些结果证明，在此纯化的MPO腹膜炎模型中，PA-dPEG24可以降低体内MPO介导的过氧化物酶活性。结果还表明PA-dPEG24可能够减少体内MPO介导的NETosis。
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本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均以引用的方式并入本文，其程度如同每个参考文献被单独地且具体地指示为通过引用并入本文并在此完整阐述。
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Ile Xaa Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 肌氨酸
<400> 4
Ile Ala Xaa Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 肌氨酸
<400> 5
Ile Ala Leu Xaa Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 肌氨酸
<400> 6
Ile Ala Leu Ile Xaa Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 肌氨酸
<400> 7
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<400> 8
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 肌氨酸
<400> 9
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Xaa Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 10
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 肌氨酸
<400> 11
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Xaa Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 肌氨酸
<400> 12
Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 肌氨酸
<400> 13
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Xaa Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 14
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 15
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 肌氨酸
<400> 16
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Xaa
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> N端dPEG24
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<400> 17
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> N端dPEG24
<400> 18
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<400> 19
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG20
<400> 20
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG16
<400> 21
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG12
<400> 22
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG08
<400> 23
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG06
<400> 24
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG04
<400> 25
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG03
<400> 26
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG02
<400> 27
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 28
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Ala Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 29
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 30
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 肌氨酸
<400> 31
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 肌氨酸
<400> 32
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 33
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 34
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(7)
<223> 肌氨酸
<400> 35
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 36
Ile Ala Leu Ile Leu Xaa Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 肌氨酸
<400> 37
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 肌氨酸
<400> 38
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Xaa Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 39
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 肌氨酸
<400> 40
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Xaa Ala Ala
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 41
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Xaa Ile Cys Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 肌氨酸
<400> 42
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Xaa Cys Gln Glu Arg Xaa Ala
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C端dPEG24
<400> 43
Ile Ala Leu Ile Leu Ala Pro Ile Cys Cys Gln Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 肌氨酸
<400> 44
Ile Ala Leu Ile Leu Ala Pro Ile Xaa Cys Gln Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 肌氨酸
<400> 45
Ile Ala Leu Ile Leu Ala Xaa Ile Cys Cys Gln Ala Arg Ala Ala
1 5 10 15
Claims (12)
1.一种治疗受试者的系统性红斑狼疮(SLE)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。
2.一种治疗受试者的输注相关的急性肺损伤(TRALI)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的PIC1。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述受试者被施用输血之前、在所述受试者被施用输血之后和/或在所述输血期间施用所述PIC1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法有效地调节所述受试者的补体系统的免疫复合物激活和NET形成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法有效地抑制所述受试者的NET介导的炎性组织损伤。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述NET形成由细菌、真菌、寄生虫或病毒中的至少一种所刺激。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述PIC1抑制所述受试者的髓过氧化物酶(MPO)活性。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述PIC1经肠胃外施用。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述PIC1是包含一个或多个PEG部分的肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述PIC1是PA-dPEG24。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述PA-dPEG24包含IALILEPICCQERAA-dPEG24的序列(SEQ ID NO:19)。
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