KR20220104268A - 동물 모델에서의 미엘로퍼옥시다제 산화 활성의 pic1 억제 - Google Patents
동물 모델에서의 미엘로퍼옥시다제 산화 활성의 pic1 억제 Download PDFInfo
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Abstract
치료 유효량의 PIC1을 대상체에게 투여하는, 대상체에서 전신 홍반성 루푸스를 치료하는 방법이 제공된다. 치료 유효량의 PIC1을 대상체에게 투여하는, 수혈-관련 급성 폐 손상을 치료하는 방법이 또한 제공된다. PIC1은 대상체에서 보체 시스템 및 NET 형성의 면역 복합체 활성화를 조정할 수 있다. PIC1은 또한 대상체에서 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성을 억제할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 1월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/615,183, 2018년 6월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/681,458, 및 2018년 10월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/746,649를 우선권으로 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2019년 1월 7일에 작성된 상기 ASCII 카피는 Seqlist.txt로 명명되며 크기는 16,143 바이트이다.
NET는 호중구가 자신을 항균성 분자로 장식된 DNA의 웹이 되도록 함으로써 감염을 함유하는 수단이다. NET는 광범위한 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI)에서 발병기전의 원인이 되는 것으로 제시된 바 있다.
SLE의 발병기전은 매우 복잡하나, 두 가지 주요 원인제공자는 면역 복합체-개시된 보체 활성화 및 NET 형성이다. C4 및 C3의 소비를 야기하는 전통적인 경로 보체 활성화를 개시하는 면역 복합체가 오랫동안 인식되어 왔고 루푸스 신장염의 원인이 된다 [1-3]. 그러나, NET는 최근에 SLE 발병기전의 원인이 되는 것으로서 인식된다 [4-6].
TRALI는 혈액 수혈과 연관된 이환율 및 사망률의 주요 원인이다. TRALI는 동종 혈액 생성물 수혈을 받은 지 6시간 이내에 발생하는 급성 폐 손상으로서 정의된다. TRALI는 통상적으로 일시적인 백혈구감소증 및 혈소판감소증 및 흉부 X-선에 의한 양측 침윤물을 나타내는 실험실 시험으로 호흡곤란, 발열, 저혈압, 저산소혈증 및 폐 부종을 특징으로 한다. 사망률은 5-10%이며, 대부분의 환자 (70-90%)는 기계적 인공호흡 및 혈류역학적 지원을 필요로 한다. 효과적인 약리학적 개입의 부재 하에, 현재의 치료 표준은 전적으로 지지 요법으로 제한된다.
TRALI의 병리생리학은 복잡하다. 임상적으로, 공여자 혈액 생성물에서 인간 백혈구 항원 또는 인간 호중구 동종항원에 대한 항체는 대부분의 TRALI 사례를 유발하는 것으로 여겨진다. 대개, 혈소판 또는 적혈구 수혈 후 초래되는, 비-항체 매개 또는 비-면역 TRALI는 사례의 11-39%를 차지한다. 항체-매개 및 비-항체 매개 TRALI 둘 다의 병리생리학을 조사하기 위해 다수의 동물 모델이 확립되었다. 호중구가 항체-매개 TRALI의 발병기전에서 핵심 역할을 하지만, 임상 보고서 및 동물 모델 데이터는 관여하는 항체의 부류에 따라, 단핵구, 림프구, 혈소판 뿐만 아니라 내피 세포가 TRALI의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 보체 활성화는 또한 다양한 항체-매개 동물 모델에서 TRALI의 발달에 필요하며, 임상 TRALI 사례에서 병리학적 과정에 기여한다.
동물 모델은 숙주 호중구의 항체-매개 활성화가 폐 모세혈관에서의 분리를 유도하여 조직 손상을 야기한다는 것을 입증하였다. 이들 활성화된 호중구는 마우스 모델에서 TRALI 발병기전의 원인이 되는 호중구 세포외 트랩 (NET)을 방출한다. TRALI 환자로부터 수집된 혈청에서 NET 바이오마커, 예를 들어, 미엘로퍼옥시다제 (MPO), 뉴클레오솜 및 DNA가 검출되었다.
미엘로퍼옥시다제 (MPO)는 호중구에서 발견되는 헴-기반 퍼옥시다제이다. MPO는 호중구에 존재하는 주요 효소로, 세포의 건조 중량의 30%를 차지한다. MPO의 주요 기능은 차아염소산을 생성하여 호중구가 미생물 침입자를 사멸하는 것을 돕는 것이다. 그러나, MPO에 의한 차아염소산의 생성은 또한 숙주 조직의 손상을 야기할 수 있으며 많은 염증성 질환에서 직접적으로 실질 손상의 원인이 되는 것으로 제시된 바 있다. 예를 들어, MPO는 낭포성 섬유증에서 실질 폐 손상의 원인이 된다. 직접적인 항균 활성에 더하여, MPO는 또한 호중구 세포외 트랩 (NET)을 생성하는 중요한 경로에서 작용하는 것으로 나타났다.
도 1a-1c는 보체 이펙터에 의해 검정된 열-응집된 IgG 면역 복합체-개시된 보체 활성화의 PA-dPEG24 억제를 제시하는 그래프이다. 도 1a는 열-응집된 IgG (Agg-IgG) 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 PA-dPEG24 억제된 C5a 생성을 제시한다. 제시된 데이터는 (n=5) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 1b는 열-응집된 IgG (Agg-IgG) 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 1c는 열-응집된 IgG (Agg-IgG) 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=6) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 2a-2c는 보체 이펙터에 의해 검정된 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체-개시된 보체 활성화의 PA-dPEG24 억제를 제시하는 그래프이다. 도 2a는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 C5a 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 2b는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 2c는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 2 mM PA-dPEG24에서 측정된 SC5b-9는 검출의 하한에 있었다. 제시된 데이터는 (n=3) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 3a-3c는 보체 이펙터에 의해 검정된 C1-항C1q 면역 복합체-개시된 보체 활성화의 PA-dPEG24 억제를 제시하는 그래프이다. 도 3a는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 C5a 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 3b는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 ± SEM이다. 도 3c는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 4는 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 PMA-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 PMA 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 5 mM PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 PMA+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 그래프는 피코그린에 의해 검정된 PMA+H2O2로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 (5 mM) 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=3) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 5는 DNA (DAPI), 호중구 엘라스타제 (항-NE 항체), 및 히스톤 H3 (항-히스톤 H3 항체)에 대한 형광 현미경검사에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 PMA-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 PMA 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 5 mM PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 PMA+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제2 열은 항-호중구 엘라스타제 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제3 행은 항-히스톤 H3 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 대표적 영상이 제시되어 있다.
도 6은 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 MPO-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 MPO 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 MPO+H2O2로 자극된 호중구를 제시하고, 제4 행은 단지 PA-dPEG24 (PIC1)와 함께 인큐베이션된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 그래프는 피코그린에 의해 검정된 MPO + 과산화수소로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=3) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 7a-7c는 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 면역 복합체-활성화된 혈청-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 도 7a는 단독 (비처리), 정상 인간 혈청 (NHS), 면역 복합체 단독 (IC) 또는 면역 복합체-활성화된 혈청 (IC혈청)과 함께 인큐베이션된 PMN에 의해 유도된 NET 형성을 제시한다. 도 7b는 피코그린에 의해 검정된 면역 복합체-활성화된 혈청 (IC혈청)으로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 7c에서, 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 면역 복합체-활성화된 인간 혈청 (IC혈청) 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 IC혈청+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다.
도 8a 및 8b는 래트에 인간 RBC 수혈의 최적화 결과를 제시한다. 도 8a에서, 인간 RBC의 수혈 전 (0) 또는 15 (◆, n=3), 30 (▲, n=3) 또는 45% (■, n=3) 수혈 후 0.5, 5, 20, 60, 120 또는 360분에 수집된 래트 혈장에 존재하는 유리 헤모글로빈을 분광광도법에 의해 측정하였다. 한 군의 모의 동물 (●, n=3)을 또한 분석하였다. 도 8b에서, 인간 RBC의 15 (●, n=3), 30 (■, n=3) 또는 45% (▲, n=3) 수혈로부터 생존한 인간 RBC의 퍼센트를 유세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이 수혈 후 0.5, 5, 20 60, 120 및 360분에 FITC-접합된 항-인간 CD235a (글리코포린 A) 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 클리어런스 동역학을 기준선 (0분)에서 주사된 RBC로 표준화하였다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 9a-9d는 수혈로 인한 폐 손상을 위해 LPS "제1 히트"가 필요함을 제시한다. 대표적인 조직학 (헤마톡실린 및 에오신) 얼룩은 모의 래트 (도 9a), LPS의 부재 하에 미스매치된 RBC의 30% (도 9b), 45% 수혈을 받은 래트 (도 9c) 및 LPS 투여 후 30% 수혈을 받은 래트 (도 9d)로부터의 폐를 나타낸다. LPS의 부재 하에 수혈을 받은 동물은 모의 처리된 동물에서 보여지는 바와 같이 정상 폐 구조를 나타냈으며 한편 30% 수혈 이전에 LPS를 받은 동물은 중증 호중구 침윤 및 폐포 세포벽의 비후를 나타냈다. 바는 100 μm를 나타낸다. 조직을 실온에서 20X 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스(Olympus))으로 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다.
도 10a-10c는 LPS "제1 히트"가 백혈구감소증을 유도한다는 것을 제시하는 그래프이다. LPS 사전-처리를 받지 않거나 또는 LPS 사전-처리 (수혈전, n=22)와 함께 30% 미스매치된 RBC의 주입 전에 래트로부터 혈액을 수집하였다. 수혈 후 4시간에, LPS 없이 (수혈 단독, n=5) 또는 LPS와 함께 (수혈+LPS, n=3) 수혈된 래트로부터 혈액을 다시 수집하였다. WBC 및 호중구 (도 10a), 단핵구 (도 10b) 및 림프구 (도 10c)의 수준이 보고되어 있다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 편차이다.
도 11a-11d는 예방적으로 투여된 PIC1이 급성 폐 손상을 약화시킨다는 것을 제시한다. 도 11a는 모의 동물 (n=7), 비히클 (n=5) 또는 PIC1 (n=8)로 예방적으로 처리된 동물에 대해 측정된 총 폐 중량을 제시한다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 대표적인 조직학 (헤마톡실린 및 에오신) 염색은 모의 래트 (도 11b), 비히클을 받은 래트 (도 11c) 및 PIC1을 받은 래트 (도 11d)로부터의 폐에 대해 나타냈다. PIC1을 받은 동물은 모의 처리된 동물에서 보여지는 바와 같이 정상 폐 구조를 나타냈으며, 한편 비히클을 받은 동물은 폐포 공간의 경화 및 폐포 세포벽의 비후를 나타냈다. 바는 100 μm를 나타낸다. 조직을 실온에서 20× 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스)으로 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다.
도 12a-12b는 PIC1이 폐에서 호중구-매개 폐 손상 및 MPO 활성을 감소시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 도 12a에서, 호중구 침윤 및 세포벽 비후 형태의 비히클 (n=7) 및 PIC1 (n=9)을 받은 동물에 대한 H&E 섹션의 맹검 등급화를 0 내지 4의 척도: 0 = 정상 폐, 1 = 경미한 폐 침범, 2 = 중등도 폐 침범, 3 = 심각한 폐 침범, 4 = 중증 폐 침범으로 점수를 매겼다. 박스는 사분위수를 제시하고, 세선은 25번째 백분위수이고, 실선은 평균이다. 도 12b에서, MPO 활성을 측정하기 위해 항체 포획에 의해 균질화된 폐 조직으로부터 MPO를 분리하였다. 샘플을 과산화수소 및 ADHP 용액과 합하고, 25초마다 0 내지 10분으로 마이크로플레이트 판독기에서 535 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장에서 즉시 판독하였다. MPO (양성 대조군, +CTR, n=3) 및 PBS (음성 대조군, -CTR, n=3)를 비히클을 받은 동물 (n=2) 및 PIC1을 받은 동물 (n=3)로부터의 샘플과 함께 분석하였다. 각각의 샘플을 삼중으로 평가하였다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 편차이다. 간단히 하기 위해, 5분 및 10분 시점만이 제시되어 있다.
도 13a-13d는 PIC1이 백혈구감소증을 감소시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 비히클 (n=5) 또는 PIC1 (n=8)을 받은 래트로부터 혈액을 수집하였다. WBC (도 13a), 림프구 (도 13b), 호중구 (도 13c) 및 단핵구 (도 13d)의 수준이 보고되어 있다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 14는 PIC1이 순환에서 유리 DNA의 수준을 감소시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 비히클 (n=3) 또는 PIC1 (n=3)을 받은 동물로부터의 혈장 샘플을 피코그린과 함께 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기에서 485 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장에서 형광을 판독하였다. 각각의 동물에 대한 모든 유리 DNA 측정을 삼중으로 행하였다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 15는 TRALI의 PIC1 억제 모델을 도시한다. 이 동물 모델에서, LPS의 제1 히트에 뒤이어 30% 인간 RBC 수혈은 호중구 분리 및 활성화에 의해 매개되는 폐 손상으로 이루어진 TRALI-유사 표현형을 초래하며 이는 MPO-매개 반응성 산소 종 (ROS) 생성 및 네토시스(NETosis)로 이어진다. 보체-매개 용혈로부터의 유리 헴 이 또한 ROS 형성의 원인이 된다. PIC1은 보체-매개 용혈, C3a 및 C5a 생성, ROS 형성 뿐만 아니라 MPO-매개 네토시스 및 ROS 형성을 억제하여 TRALI를 억제할 수 있다. 보체 아나필라톡신 C3a 및 C5a는 이 모델에서 호중구 활성화에서 그들의 직접적인 역할이 알려지지 않았기 때문에 점상 화살표로서 제시되어 있다.
도 16은 MPO의 증가하는 농도에 대한 TMB의 MPO-매개 산화의 PIC1 용량-반응 억제를 제시하는 그래프이다.
도 17은 IP에 의해 주사된 정제된 MPO의 증가하는 용량이 복막 세척 샘플에서 증가된 TMB 과산화를 제시하는 그래프이다. 증가하는 양의 정제된 MPO를 IP 주사하고 1시간 후에, 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. TMB의 복막 세척 상청액 산화 (n = 4)를 측정하였다. 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 18은 IP 정제된 MPO의 증가하는 용량이 복막 세척 샘플에서 증가된 유리 DNA를 제시하는 그래프이다. 증가하는 양의 정제된 MPO를 IP 주사하고 1시간 후에, 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. 복막 세척 상청액 유리 DNA를 피코그린 검정을 통해 측정하였다 (n = 4). 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 19는 복강내 MPO 시간 경과 실험의 결과를 제시하는 그래프이다. 정제된 MPO (0.1 mg)를 IP 주사하고, 증가하는 간격으로 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. TMB의 복막 세척 상청액 산화 (n = 4)를 측정하였다. 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 20은 복강내 MPO 시간 경과 실험의 결과를 제시하는 그래프이다. 정제된 MPO (0.1 mg)를 IP 주사하고, 증가하는 간격으로 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. 복막 세척 상청액 유리 DNA를 피코그린 검정을 통해 측정하였다 (n = 4). 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 21-23은 증가하는 용량의 PIC1을 사용한 복강내 MPO를 제시하는 그래프이다. 정제된 MPO (0.1 mg)를 IP 주사한 직후 증가하는 용량으로 PIC1를 IP 주사하였다. IP 주사 후 2시간 후에, 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. 도 21은 TMB의 복막 세척 상청액 산화를 제시한다 (n = 4). 도 22는 피코그린 검정을 통해 측정된 복막 세척 상청액 유리 DNA를 제시한다 (n = 4). 도 23은 피코그린 검정을 통해 측정된 혈장 유리 DNA를 제시한다 (n = 4). 도 21 내지 도 23에서, 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 2a-2c는 보체 이펙터에 의해 검정된 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체-개시된 보체 활성화의 PA-dPEG24 억제를 제시하는 그래프이다. 도 2a는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 C5a 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 2b는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 2c는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 2 mM PA-dPEG24에서 측정된 SC5b-9는 검출의 하한에 있었다. 제시된 데이터는 (n=3) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 3a-3c는 보체 이펙터에 의해 검정된 C1-항C1q 면역 복합체-개시된 보체 활성화의 PA-dPEG24 억제를 제시하는 그래프이다. 도 3a는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 C5a 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 3b는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 ± SEM이다. 도 3c는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 4는 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 PMA-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 PMA 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 5 mM PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 PMA+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 그래프는 피코그린에 의해 검정된 PMA+H2O2로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 (5 mM) 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=3) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 5는 DNA (DAPI), 호중구 엘라스타제 (항-NE 항체), 및 히스톤 H3 (항-히스톤 H3 항체)에 대한 형광 현미경검사에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 PMA-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 PMA 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 5 mM PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 PMA+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제2 열은 항-호중구 엘라스타제 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제3 행은 항-히스톤 H3 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 대표적 영상이 제시되어 있다.
도 6은 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 MPO-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 MPO 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 MPO+H2O2로 자극된 호중구를 제시하고, 제4 행은 단지 PA-dPEG24 (PIC1)와 함께 인큐베이션된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 그래프는 피코그린에 의해 검정된 MPO + 과산화수소로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=3) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 7a-7c는 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 면역 복합체-활성화된 혈청-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 도 7a는 단독 (비처리), 정상 인간 혈청 (NHS), 면역 복합체 단독 (IC) 또는 면역 복합체-활성화된 혈청 (IC혈청)과 함께 인큐베이션된 PMN에 의해 유도된 NET 형성을 제시한다. 도 7b는 피코그린에 의해 검정된 면역 복합체-활성화된 혈청 (IC혈청)으로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제시된 데이터는 (n=4) 독립 실험의 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 도 7c에서, 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 면역 복합체-활성화된 인간 혈청 (IC혈청) 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 IC혈청+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하고, 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다.
도 8a 및 8b는 래트에 인간 RBC 수혈의 최적화 결과를 제시한다. 도 8a에서, 인간 RBC의 수혈 전 (0) 또는 15 (◆, n=3), 30 (▲, n=3) 또는 45% (■, n=3) 수혈 후 0.5, 5, 20, 60, 120 또는 360분에 수집된 래트 혈장에 존재하는 유리 헤모글로빈을 분광광도법에 의해 측정하였다. 한 군의 모의 동물 (●, n=3)을 또한 분석하였다. 도 8b에서, 인간 RBC의 15 (●, n=3), 30 (■, n=3) 또는 45% (▲, n=3) 수혈로부터 생존한 인간 RBC의 퍼센트를 유세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이 수혈 후 0.5, 5, 20 60, 120 및 360분에 FITC-접합된 항-인간 CD235a (글리코포린 A) 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 클리어런스 동역학을 기준선 (0분)에서 주사된 RBC로 표준화하였다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 9a-9d는 수혈로 인한 폐 손상을 위해 LPS "제1 히트"가 필요함을 제시한다. 대표적인 조직학 (헤마톡실린 및 에오신) 얼룩은 모의 래트 (도 9a), LPS의 부재 하에 미스매치된 RBC의 30% (도 9b), 45% 수혈을 받은 래트 (도 9c) 및 LPS 투여 후 30% 수혈을 받은 래트 (도 9d)로부터의 폐를 나타낸다. LPS의 부재 하에 수혈을 받은 동물은 모의 처리된 동물에서 보여지는 바와 같이 정상 폐 구조를 나타냈으며 한편 30% 수혈 이전에 LPS를 받은 동물은 중증 호중구 침윤 및 폐포 세포벽의 비후를 나타냈다. 바는 100 μm를 나타낸다. 조직을 실온에서 20X 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스(Olympus))으로 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다.
도 10a-10c는 LPS "제1 히트"가 백혈구감소증을 유도한다는 것을 제시하는 그래프이다. LPS 사전-처리를 받지 않거나 또는 LPS 사전-처리 (수혈전, n=22)와 함께 30% 미스매치된 RBC의 주입 전에 래트로부터 혈액을 수집하였다. 수혈 후 4시간에, LPS 없이 (수혈 단독, n=5) 또는 LPS와 함께 (수혈+LPS, n=3) 수혈된 래트로부터 혈액을 다시 수집하였다. WBC 및 호중구 (도 10a), 단핵구 (도 10b) 및 림프구 (도 10c)의 수준이 보고되어 있다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 편차이다.
도 11a-11d는 예방적으로 투여된 PIC1이 급성 폐 손상을 약화시킨다는 것을 제시한다. 도 11a는 모의 동물 (n=7), 비히클 (n=5) 또는 PIC1 (n=8)로 예방적으로 처리된 동물에 대해 측정된 총 폐 중량을 제시한다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다. 대표적인 조직학 (헤마톡실린 및 에오신) 염색은 모의 래트 (도 11b), 비히클을 받은 래트 (도 11c) 및 PIC1을 받은 래트 (도 11d)로부터의 폐에 대해 나타냈다. PIC1을 받은 동물은 모의 처리된 동물에서 보여지는 바와 같이 정상 폐 구조를 나타냈으며, 한편 비히클을 받은 동물은 폐포 공간의 경화 및 폐포 세포벽의 비후를 나타냈다. 바는 100 μm를 나타낸다. 조직을 실온에서 20× 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스)으로 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다.
도 12a-12b는 PIC1이 폐에서 호중구-매개 폐 손상 및 MPO 활성을 감소시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 도 12a에서, 호중구 침윤 및 세포벽 비후 형태의 비히클 (n=7) 및 PIC1 (n=9)을 받은 동물에 대한 H&E 섹션의 맹검 등급화를 0 내지 4의 척도: 0 = 정상 폐, 1 = 경미한 폐 침범, 2 = 중등도 폐 침범, 3 = 심각한 폐 침범, 4 = 중증 폐 침범으로 점수를 매겼다. 박스는 사분위수를 제시하고, 세선은 25번째 백분위수이고, 실선은 평균이다. 도 12b에서, MPO 활성을 측정하기 위해 항체 포획에 의해 균질화된 폐 조직으로부터 MPO를 분리하였다. 샘플을 과산화수소 및 ADHP 용액과 합하고, 25초마다 0 내지 10분으로 마이크로플레이트 판독기에서 535 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장에서 즉시 판독하였다. MPO (양성 대조군, +CTR, n=3) 및 PBS (음성 대조군, -CTR, n=3)를 비히클을 받은 동물 (n=2) 및 PIC1을 받은 동물 (n=3)로부터의 샘플과 함께 분석하였다. 각각의 샘플을 삼중으로 평가하였다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 편차이다. 간단히 하기 위해, 5분 및 10분 시점만이 제시되어 있다.
도 13a-13d는 PIC1이 백혈구감소증을 감소시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 비히클 (n=5) 또는 PIC1 (n=8)을 받은 래트로부터 혈액을 수집하였다. WBC (도 13a), 림프구 (도 13b), 호중구 (도 13c) 및 단핵구 (도 13d)의 수준이 보고되어 있다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 14는 PIC1이 순환에서 유리 DNA의 수준을 감소시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 비히클 (n=3) 또는 PIC1 (n=3)을 받은 동물로부터의 혈장 샘플을 피코그린과 함께 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트 판독기에서 485 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장에서 형광을 판독하였다. 각각의 동물에 대한 모든 유리 DNA 측정을 삼중으로 행하였다. 제시된 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 15는 TRALI의 PIC1 억제 모델을 도시한다. 이 동물 모델에서, LPS의 제1 히트에 뒤이어 30% 인간 RBC 수혈은 호중구 분리 및 활성화에 의해 매개되는 폐 손상으로 이루어진 TRALI-유사 표현형을 초래하며 이는 MPO-매개 반응성 산소 종 (ROS) 생성 및 네토시스(NETosis)로 이어진다. 보체-매개 용혈로부터의 유리 헴 이 또한 ROS 형성의 원인이 된다. PIC1은 보체-매개 용혈, C3a 및 C5a 생성, ROS 형성 뿐만 아니라 MPO-매개 네토시스 및 ROS 형성을 억제하여 TRALI를 억제할 수 있다. 보체 아나필라톡신 C3a 및 C5a는 이 모델에서 호중구 활성화에서 그들의 직접적인 역할이 알려지지 않았기 때문에 점상 화살표로서 제시되어 있다.
도 16은 MPO의 증가하는 농도에 대한 TMB의 MPO-매개 산화의 PIC1 용량-반응 억제를 제시하는 그래프이다.
도 17은 IP에 의해 주사된 정제된 MPO의 증가하는 용량이 복막 세척 샘플에서 증가된 TMB 과산화를 제시하는 그래프이다. 증가하는 양의 정제된 MPO를 IP 주사하고 1시간 후에, 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. TMB의 복막 세척 상청액 산화 (n = 4)를 측정하였다. 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 18은 IP 정제된 MPO의 증가하는 용량이 복막 세척 샘플에서 증가된 유리 DNA를 제시하는 그래프이다. 증가하는 양의 정제된 MPO를 IP 주사하고 1시간 후에, 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. 복막 세척 상청액 유리 DNA를 피코그린 검정을 통해 측정하였다 (n = 4). 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 19는 복강내 MPO 시간 경과 실험의 결과를 제시하는 그래프이다. 정제된 MPO (0.1 mg)를 IP 주사하고, 증가하는 간격으로 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. TMB의 복막 세척 상청액 산화 (n = 4)를 측정하였다. 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 20은 복강내 MPO 시간 경과 실험의 결과를 제시하는 그래프이다. 정제된 MPO (0.1 mg)를 IP 주사하고, 증가하는 간격으로 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. 복막 세척 상청액 유리 DNA를 피코그린 검정을 통해 측정하였다 (n = 4). 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
도 21-23은 증가하는 용량의 PIC1을 사용한 복강내 MPO를 제시하는 그래프이다. 정제된 MPO (0.1 mg)를 IP 주사한 직후 증가하는 용량으로 PIC1를 IP 주사하였다. IP 주사 후 2시간 후에, 동물에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 실시하였다. 도 21은 TMB의 복막 세척 상청액 산화를 제시한다 (n = 4). 도 22는 피코그린 검정을 통해 측정된 복막 세척 상청액 유리 DNA를 제시한다 (n = 4). 도 23은 피코그린 검정을 통해 측정된 혈장 유리 DNA를 제시한다 (n = 4). 도 21 내지 도 23에서, 제시된 데이터는 독립 동물의 평균 ± SEM이다.
발명의 개요
한 측면에서, 대상체에서 전신 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 치료 유효량의 PIC1을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, PIC1은 대상체가 혈액 수혈을 투여받기 전에, 대상체가 혈액 수혈을 투여받은 후에, 및/또는 혈액 수혈 동안에 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 보체 시스템의 면역 복합체 활성화 및 NET 형성을 조정하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 NET-매개 염증성 조직 손상을 억제하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, NET 형성은 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 중 적어도 하나에 의해 자극된다.
상기 측면의 다양한 실시양태에서, PIC1은 대상체에서 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성을 억제한다. 다양한 실시양태에서, PIC1은 비경구 투여된다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, PIC1은 1개 이상의 PEG 모이어티를 포함하는 펩티드이다. 특정 실시양태에서, PIC1은 PA-dPEG24이다. 특정 실시양태에서, PA-dPEG24는 IALILEPICCQERAA-dPEG24 (서열식별번호: 19)의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI)을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 치료 유효량의 PIC1을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, PIC1은 대상체가 혈액 수혈을 투여받기 전에, 대상체가 혈액 수혈을 투여받은 후에, 및/또는 혈액 수혈 동안에 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 보체 시스템의 면역 복합체 활성화 및 NET 형성을 조정하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서 NET-매개 염증성 조직 손상을 억제하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, NET 형성은 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 중 적어도 하나에 의해 자극된다.
상기 측면의 다양한 실시양태에서, PIC1은 대상체에서 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성을 억제한다. 다양한 실시양태에서, PIC1은 비경구 투여된다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, PIC1은 1개 이상의 PEG 모이어티를 포함하는 펩티드이다. 특정 실시양태에서, PIC1은 PA-dPEG24이다. 특정 실시양태에서, PA-dPEG24는 IALILEPICCQERAA-dPEG24 (서열식별번호: 19)의 서열을 포함한다.
발명의 상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있긴 하지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다.
용어 "억제"는 개별적으로 또는 복합체로 효소, 단백질, 펩티드, 인자, 부산물, 또는 그의 유도체의 생물학적 기능의 감소; 생체내이든 또는 시험관내든 생물학적 단백질, 펩티드, 또는 그의 유도체의 양의 감소; 또는 관련 일련의 생물학적 또는 화학적 반응을 포함하는 것으로 공지된 사건, 캐스케이드, 또는 경로의 생물학적 쇄의 중단을 지칭한다. 따라서, 용어 "억제"는, 예를 들어, 대조군 샘플과 비교하여 보체 캐스케이드의 단일 성분의 양의 감소, 성분 또는 성분의 복합체의 형성 속도 또는 총량의 감소, 또는 세포 용해, 전환효소 효소의 형성, 보체-유래 막 공격 복합체의 형성, 염증, 또는 염증성 질환과 같은 결과를 야기하는 복잡한 과정 또는 일련의 생물학적 반응의 전반적인 활성의 감소를 기재하기 위해 사용될 수 있다. 시험관내 검정에서, 용어 "억제"는 일부 생물학적 또는 화학적 사건의 측정가능한 감소를 지칭할 수 있으나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 측정가능한 감소가 완전히 "억제성"일 필요는 없다는 것을 인식할 것이다.
용어 "PIC1"은 IALILEPICCQERAA (서열식별번호: 1)의 극성 어소턴트 (PA: polar assortant) 서열을 포함하는 펩티드, 뿐만 아니라 동일한 아미노산 서열을 포함하나, PEG화와 같은 변형을 가진 펩티드를 지칭한다. 용어 "PIC1 변이체"는 IALILEPICCQERAA (서열식별번호: 1)의 PA 서열과, 적어도 85% 동일하거나, 적어도 90% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 99% 동일하나, 100% 동일하지는 않은 서열을 포함하는 펩티드를 지칭한다. PIC1 변이체는 결실된 PA 서열의 아미노산 중 적어도 하나를 가진 펩티드를 포함할 수 있다. PIC1 변이체는 PA 서열에 삽입된 아미노산을 가진 펩티드를 포함할 수 있다. PIC1 변이체는 또 다른 아미노산, 예컨대 알라닌, 변형된 아미노산 또는 아미노산 유도체, 예컨대 사르코신 (Sar)으로 치환된 PA 서열의 아미노산 중 적어도 하나를 가진 펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 진단, 예후, 또는 요법이 요구되는 임의의 대상체를 의미한다. 예를 들어, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간 또는 비-인간 영장류 (예컨대 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 또는 침팬지), 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 또는 암소일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료 유효량"은 의미있는 환자 이익을 나타내기에 충분한 각각의 활성 성분의 총량을 지칭한다. 펩티드 화합물의 치료 유효량은 몇몇 인자, 예컨대 치료되는 병태, 병태의 중증도, 투여 시간, 투여 경로, 이용된 화합물의 배설 속도, 치료 지속기간, 관여하는 공동-요법, 및 대상체의 연령, 성별, 체중, 및 병태 등에 따라 다르다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 치료 유효량을 결정할 수 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 최대 치료 효과를 수득하기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 필요가 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"는 장애 (예를 들어, 본원에 기재된 장애) 또는 그의 증상을 개선시키거나, 장애 (예를 들어, 본원에 기재된 장애) 또는 그의 증상의 진행을 예방하거나 둔화시키는데 효과적인, 양, 방식 (예를 들어, 투여 일정), 및/또는 양식 (예를 들어, 투여 경로)으로 요법을 투여하는 것을 지칭한다. 이는, 예를 들어, 장애 또는 그의 증상과 연관된 파라미터가, 예를 들어 통계적으로 유의한 정도로 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 검출가능한 정도로 개선됨에 의해 입증될 수 있다. 유효량, 방식, 또는 양식은 대상체에 따라 다를 수 있으며 대상체에 맞춰질 수 있다. 장애 또는 그의 증상의 진행을 예방하거나 둔화시킴으로써, 치료는 이환된 또는 진단된 대상체에서 장애 또는 그의 증상으로부터 초래된 악화를 예방하거나 둔화시킬 수 있다.
한 측면에서, 치료 유효량의 PIC1, 또는 PIC1 변이체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 염증을 억제하는 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 치료 유효량의 PIC1, 또는 PIC1 변이체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
관련 측면에서, 대상체에서 염증을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 PIC1 또는 PIC1 변이체가 제공된다. 방법은 염증의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 PIC1 또는 PIC1 변이체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
PIC1 및 PIC1 변이체의 예는 표 1에 열거된 펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표 1.
일부 실시양태에서, PIC1은 1개 이상의 PEG 모이어티를 포함한다. PEG 모이어티는 PEG화에 의해 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 둘 다에 부착될 수 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 24개의 PEG 모이어티가 N-말단에 부착된다. 하나 이상의 실시양태에서, 24개의 PEG 모이어티가 C-말단에 부착된다. 하나 이상의 실시양태에서, 24개의 PEG 모이어티가 N-말단 및 C-말단에 부착된다. 하나 이상의 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 PEG 모이어티가 N-말단에 부착된다. 하나 이상의 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 PEG 모이어티가 C-말단에 부착된다. 하나 이상의 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 PEG 모이어티가 N-말단 및 C-말단 둘 다에 부착된다.
PIC1 펩티드는 합성 펩티드일 수 있다. 합성 펩티드는 시험관내에서 제조된다. 합성 펩티드는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 합성 펩티드는 개별 아미노산을 순차적으로 커플링하여 펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개별 아미노산의 카르복실 기는 성장하는 펩티드 쇄의 아미노 말단에 순차적으로 커플링된다. 보호기를 사용하여 커플링 과정 동안에 원하지 않는 부반응이 발생하는 것을 방지할 수 있다. 펩티드 합성은 액상 또는 고상에서 일어날 수 있다.
예시적인 PIC1 펩티드는 PA-dPEG24 (극성 어소턴트 (PA) 서열 및 C-말단에 24개의 PEG 모이어티를 포함하는 펩티드), PA-dPEG20 (C-말단에 20개의 PEG 모이어티를 포함함), PA-dPEG16 (C-말단에 16개의 PEG 모이어티를 포함함), PA-dPEG12 (C-말단에 12개의 PEG 모이어티를 포함함), PA-dPEG08 (C-말단에 8개의 PEG 모이어티를 포함함), PA-dPEG06 (C-말단에 6개의 PEG 모이어티를 포함함), PA-dPEG04 (C-말단에 4개의 PEG 모이어티를 포함함), PA-dPEG03 (C-말단에 3개의 PEG 모이어티를 포함함), 및 PA-dPEG02 (C-말단에 2개의 PEG 모이어티를 포함함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
PIC1 펩티드는 캐스케이드, C1의 개시 성분의 활성화를 결합 및 차단함으로써 보체의 전통적인 경로를 억제할 수 있다 [19, 20]. PA-dPEG24는 PIC1 패밀리에서 15-아미노산 PEG화된 펩티드이다. PA-dPEG24는 면역 복합체-개시된 보체 활성화를 억제할 뿐만 아니라 NET 형성을 억제할 수 있다. PA-dPEG24는 여러 가지의 면역 복합체에 의한 보체 활성화를 일관되게 억제할 수 있고, 또한 몇몇 자극에 의해 개시되는 NET 형성을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, PIC1은 대상체에서 네토시스를 억제하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 투여된 PIC1은 대상체에서 MPO 활성을 억제한다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 네토시스는 호중구가 호중구 세포외 트랩 (NET)으로 그의 염색체 DNA를 방출함으로써 세포 사멸을 겪는 과정이다. NET는 웹-형상이고 크로마틴 피브릴과 항균성 분자로 구성되어 있다. 일부 실시양태에서, 네토시스는 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 중 적어도 하나에 의해 자극된다.
PIC1은 도 16에 제시된 바와 같이, MPO-매개 산화를 억제한다. PA-dPEG24는 생체외 임상 CF 가래 샘플에서 뿐만 아니라 시험관내에서 정제된 MPO에 대해 MPO의 퍼옥시다제 효과를 억제할 수 있다. PA-dPEG24는 또한 시험관내에서 헤모글로빈 및 미오글로빈을 포함한 다른 헴-기반 퍼옥시다제의 퍼옥시다제 활성을 억제한다. PA-dPEG24는 시험관내 NET 형성, 예컨대 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA), 정제된 MPO, 및 면역 복합체-활성화된 인간 혈청 중 임의의 것에 의해 자극된 NET 형성을 억제할 수 있다.
PIC1 펩티드는 대상체에게 투여되어 질환에서 보체 시스템의 면역 복합체 활성화 및 NET 형성을 조정할 수 있다. 예시적인 질환은 루푸스 신장염, 혈청병, 지연형 과민증 (제III형 과민증) 반응, 감염성 심내막염, 자가-면역 사구체신염, 한냉글로불린혈증, 쇼그렌 증후군, 소혈관 혈관염, ANCA-연관 혈관염, 피부경화증 및 다른 염증성 또는 자가면역 혈관염 질환, 예를 들어 혈관염 사구체신병증, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 폐 손상, 수혈 관련 급성 폐 손상, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 류마티스 관절염, 동맥경화증, 알츠하이머병, 건선, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 항인지질 항체 증후군, 통풍, 크론병, 궤양성 결장염, 횡문근융해증, 비만/대사 증후군, 베게너 육아종증 (WG), 혈전증, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 패혈증, 미숙아 망막병증 (ROP), 전자간증, 치주염, 신생아 만성 폐 질환 (CLD), 괴사성 장염 (NEC), 인플루엔자-유발 폐렴, 염증성 폐 질환 (ILD), 염증성 장 질환 (IBD), 암의 염증, 또는 기관지폐 이형성증 (BPD)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, PIC1 (예를 들어, PA-dPEG24)은 NET 형성 및/또는 네토시스를 실질적으로 억제한다. 다른 실시양태에서, PIC1 (예를 들어, PA-dPEG24)은 NET-매개 염증성 조직 손상을 억제하거나 또는 실질적으로 억제한다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 PIC1을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 전신 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하는 방법이 제공된다.
관련 측면에서, 대상체에서 SLE를 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 PIC1 또는 PIC1 변이체가 제공된다. 방법은 SLE의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 PIC1 또는 PIC1 변이체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
치료적으로 표적화될 수 있는 SLE 발병기전의 두 가지 주요 측면은 호중구에 의한 면역 복합체-개시된 보체 활성화 및 호중구 세포외 트랩 (NET) 형성이다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, SLE 환자의 혈액에서 항-C1q 항체의 역할은 항-C1q 항체의 존재와 루푸스 신장염 사이의 강한 연관성을 입증하기 위해 상당한 데이터가 축적된 활발한 연구 영역이다 [7, 8]. 연구자들은 또한 ELISA-유형 검정에서 표면에 결합된 SLE 환자로부터의 항-C1q 항체가 전통적인 및 렉틴 경로를 활성화시킬 수 있음을 제시한 바 있다 [9]. 따라서, 항-C1q 항체는 발병기전 및 SLE-유사 면역 복합체의 형성에 역할을 할 수 있다.
면역 복합체는 인간 호중구와 상호작용하고 이를 자극할 수 있는 보체 활성화의 보체 생성 이펙터 (예를 들어, C5a, 막 공격 복합체의 용해 농도 미만 등)를 활성화시킬 수 있다 [10-13]. 그러나, 면역 복합체가 호중구가 NET를 생성하도록 유도할 수 있다고 기재하고 있는 논문은 이 과정에서 Fc 수용체의 역할에 초점을 맞추고 있다 [14-17]. 논문이 면역 복합체와 NET 사이의 연결을 제시한 경우, 이 과정에서 보체 활성화의 기여는 불분명하다. 아콩-무어(Akong-Moore) 등의 문헌 [18]은 MPO와 과산화수소와 클로라이드 이온으로부터 차아염소산을 생성하는 그의 주요 기능을 통해 NET 형성의 주요 경로가 발생할 수 있음을 시사하였다. NET 형성은 MPO 억제제를 이용함으로써 차단될 수 있다.
일부 실시양태에서, PIC1은 대상체에서 네토시스를 억제하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 네토시스는, 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 중 적어도 하나에 의해 자극된다. PIC1을 투여하여 면역 복합체 보체 활성화 및 NET 형성을 조정할 수 있다. 한 실시양태에서, PIC1은 PA-dPEG24이다. 한 실시양태에서, PIC1은 C1-항C1q 면역 복합체를 조정하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, PIC1은 면역 복합체 활성화 및 NET 형성을 억제하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, PIC1은 염증유발성 보체 이펙터의 생성을 제한하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, PIC1은 C5a 및 sC5b-9의 생성을 제한하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, PIC1은 PMA에 의해 자극된 인간 호중구에 의한 NET 형성을 억제한다.
일부 실시양태에서, 투여된 PIC1은 대상체에서 MPO 활성을 억제한다. PIC1은 MPO에 의해 자극된 인간 호중구에 의한 NET 형성을 억제하는데 사용될 수 있다. 특정 측면에 따르면, PIC1은 면역 복합체 활성화된 혈청에 의해 자극된 인간 호중구에 의한 NET 형성을 억제하는데 사용될 수 있다. 특정 측면에 따르면, PIC1은 비경구로 전달된다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 측면에 따르면, PIC1은 면역 복합체 보체 활성화 및 호중구 형성을 조정하여 SLE, 루푸스 신장염, 혈청 질병, 지연형 과민증 (제III형 과민증) 반응, 감염성 심내막염, 자가-면역 사구체신염, 한냉글로불린혈증, 쇼그렌 증후군, 소혈관 혈관염, ANCA-연관 혈관염, 피부경화증 및 다른 염증성 또는 자가면역 혈관염 질환, 사구체신병증, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 폐 손상, 수혈 관련 급성 폐 손상, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 류마티스 관절염, 동맥경화증, 알츠하이머병, 건선, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 항인지질 항체 증후군, 통풍, 크론병, 궤양성 결장염, 횡문근융해증, 및 비만/대사 증후군을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 1의 실험은 PA-dPEG24가 면역 복합체-개시된 보체 활성화 및 염증유발성 보체 이펙터의 생성을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 이것은 보체 억제 펩티드가 보체 시스템의 면역 복합체 활성화가 중요한 역할을 하는 질환, 예컨대 SLE, 루푸스 신장염, 혈청 질병, 지연형 과민증 (제III형 과민증) 반응, 감염성 심내막염, 자가-면역 사구체신염, 한냉글로불린혈증, 쇼그렌 증후군, 소혈관 혈관염, ANCA-연관 혈관염, 피부경화증 및 다른 염증성 또는 자가면역 혈관염 질환, 사구체신병증, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 폐 손상, 수혈 관련 급성 폐 손상, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 류마티스 관절염, 동맥경화증, 알츠하이머병, 건선, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 항인지질 항체 증후군, 통풍, 크론병, 궤양성 결장염, 횡문근융해증, 및 비만/대사 증후군에서 발병기전의 측면을 완화시킬 수 있을 것임을 시사한다. 게다가, C1 및 항-C1q 항체는 항-C1q 항체를 가진 SLE 환자의 혈장에서 형성될 것으로 예측될 수 있는 면역 복합체의 유형을 모델링하기 위해 신규한 면역 복합체에서 이용될 수 있다. PA-dPEG24는 또한 시험된 다른 면역 복합체 유형과 일치하는, C1-항C1q 면역 복합체에 의한 보체 활성화를 차단하였다.
면역 복합체-개시된 보체-활성화된 인간 혈청은, 예를 들어, 실시예 1에서 입증된 바와 같이 NET 형성을 개시할 수 있다. 결과는 놀랍고 면역 복합체 자체가 Fc 수용체를 통해 NET 형성을 개시할 수 있다는 이전의 관찰과는 대조가 된다 [14-17]. 실시예 1의 실험 조건 하에 NET 형성에 대한 면역 복합체-개시된 보체 활성화의 기여는 면역 복합체 단독의 것보다 훨씬 더 컸다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 면역 복합체-개시된 보체 활성화는 활성 SLE 질환에서 면역 복합체의 존재를 고려해 볼 때 SLE에서 NET 형성의 중요한 메커니즘일 수 있다.
실시예 1에서의 실험은 또한 PA-dPEG24가 PMA, MPO 또는 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 인간 혈청에 의해 개시된 인간 호중구에 의한 NET 형성을 억제할 수 있음을 제시한다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, PA-dPEG24는 적어도 MPO-매개 경로를 통한 NET 형성을 자극하는 PMA의 능력에 기초하는 MPO-매개 경로를 억제함으로써 NET 형성을 차단하고 [18] 본원에 기재된 결과는 정제된 MPO를 이용한다. 인간 혈청의 면역 복합체 활성화가 발생한 후 NET 형성을 억제하는 PA-dPEG24의 능력은 MPO-매개 경로를 차단함으로써 NET 형성이 발생할 수 있음을 시사한다. PA-dPEG24 펩티드는 전통적인 경로 보체 활성화 둘 다를 차단하고 네토시스를 억제할 수 있다. PA-dPEG24 및 다른 PIC1 단백질은 SLE 발병기전의 2 가지의 현재 표적화되지 않은 측면에 작용함으로써 SLE를 치료하는 방법에서 유용할 수 있을 것이다.
또 다른 측면에서, 치료 유효량의 PIC1을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI)을 치료하는 방법이 제공된다.
관련 측면에서, 대상체에서 TRALI를 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 PIC1 또는 PIC1 변이체가 제공된다. 방법은 TRALI의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 PIC1 또는 PIC1 변이체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
수혈-관련 급성 폐 손상 (TRALI)은 혈액 수혈 및 수혈-관련 사망의 주요 원인에 의해 개시되는 호흡 곤란의 질환이다. 폐 실질의 호중구 침윤을 유발하는 미스매치된 적혈구를 이용하는 TRALI의 신규한 '2-히트' 래트 모델이 본원에 기재된다. 2-히트 래트 모델은 이 신규한 TRALI 모델에서 폐 손상을 약화시키는 보체 C1의 펩티드 억제제 (PIC1)의 역할을 평가할 수 있게 한다.
TRALI의 신규한 모델이, 이 모델에서 TRALI-매개 질환을 약화시키는 PIC1의 능력을 제시하는 데이터와 함께 본원에 기재된다. LPS를 '제1 히트'로서 이용하고 항체-의존적 (예를 들어 H2Kd, HLA 등) 또는 항체-독립적 (예를 들어 노화된 RBC, lysoPCs, RBC 상청액 등) 자극을 '제2 히트'로서 이용하는, 다수의 '2-히트' 모델이 여러 가지의 종으로 문헌에 발표되어 있다. 본원에 기재된 모델은 동계 적혈구를 사용하는 RBC의 수혈과 대조적으로, 수혈된 적혈구의 항체-개시된 보체-매개 용혈을 '제2 히트'로서 사용한다는 점에서 독특하다. 인간 RBC의 A 항원에 대한 기존의 항체를 보유하는 위스타(Wistar) 래트는 A형 또는 AB형 인간 적혈구의 수혈 후 활발한 혈관내 용혈을 야기할 수 있는 전통적인 보체 활성화를 개시할 수 있다.
PIC1은 다기능성 분자이다. AIHTR 모델에서, PIC1은 막 공격 복합체 (MAC)에 의한 RBC 용해 및 전통적인 보체 경로 활성화를 억제함으로써 수혈 미스매치된 RBC의 용혈을 억제할 수 있다. PIC1은 시험관내에서 항산화 분자로서 작용하여 유리 헴, 헤모글로빈 및 미오글로빈의 퍼옥시다제 활성 뿐만 아니라 MPO의 퍼옥시다제 활성을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, PIC1은 대상체가 혈액 수혈을 투여받기 전에, 대상체가 혈액 수혈을 투여받은 후에, 및/또는 혈액 수혈 동안에 투여된다.
일부 실시양태에서, PIC1은 대상체에서 네토시스를 억제하는데 효과적이다. 다양한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 네토시스는 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 중 적어도 하나에 의해 자극된다.
일부 실시양태에서, 투여된 PIC1은 대상체에서 MPO 활성을 억제한다. 더욱이, PIC1은 MPO에 의해 매개되는 네토시스를 억제할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, PIC1은 폐 조직으로의 호중구의 대량 침윤을 감소시킬 수 있으며 보체 활성화를 억제하고 아나팔로톡신 C3a 및 C5a 뿐만 아니라 MAC-매개 혈액용혈을 통한 혈색소혈증의 생성을 방지함으로써 TRALI를 약화시킬 수 있다 (도 15). PIC1은 시험관내의 네토시스 뿐만 아니라 유리 헤모글로빈 및 MPO로부터의 퍼옥시다제-생성 ROS 활성을 약화시킬 수 있다.
기계적 인공호흡 및 혈류역학적 지원으로 이루어진 현재 치료 표준으로 TRALI를 치료하기 위한 약리학적 개입은 없다. 본원에 기재된 동물 모델은 환자가 TRALI를 야기하는 패킹된 RBC의 대규모 수혈을 필요로 하는 외상-유사 임상 시나리오를 모델링할 수 있다. LPS 주입으로부터 TRALI-유사 발병기전에 뒤이어 전통적인 경로 보체 활성화, MPO-매개 ROS 형성 뿐만 아니라 네토시스를 억제함으로써 미스매치된 RBC를 차단하는 PIC1의 능력은 PIC1이 TRALI 발병기전의 여러 측면을 완화하기 위한 약리학적 작용제로서 잠재력을 가질 수 있음을 시사한다.
DNase의 비강내 투여는 동물 모델에서 TRALI의 증상을 감소시켰으며, 이는 NET 형성의 억제가 유용한 치료 전략일 수 있을 것임을 시사한다. NET 형성의 주요 경로는 MPO-유래된 반응성 산소 종 뿐만 아니라 클로라이드 이온 및 과산화수소로부터 차아염소산을 생성하는데 있어서 그의 주요 역할을 통해 호중구-생성 MPO에 의해 매개될 수 있다. 포르볼 12-미스테이트 13-아세테이트 (PMA)-자극된 NET 형성은 시험관내에서 MPO 억제제 ABAH에 의해 억제되어 NET 형성을 억제하는 또 다른 잠재적 메커니즘을 드러낼 수 있다.
미스매치된 적혈구의 수혈을 이용하는 급성 혈관내 용혈 수혈 반응 (AIHTR)의 래트 모델에서, 래트 종은 인간 적혈구의 A 항원에 대한 기존의 항체를 가지고 있어, A형 또는 AB형 공여자로부터의 인간 적혈구의 수혈 후 강력한 AITHR을 초래한다. 이 AIHTR 모델은 급성 신장 손상 및 고도 염증성 전신 반응을 초래하는 항체-개시된 전통적인 보체 경로 활성화를 유발할 수 있다. 호중구의 항체-개시된 보체 활성화 및 동원의 병원성 측면은 염증 반응이 폐를 지향한 경우, 이 모델이 TRALI 표현형을 산출하도록 적합화될 수 있음을 시사한다.
보체 시스템의 항체-매개 활성화는 개시 복합체 C1이 IgM 또는 다수의 IgG에 결합되어 활성화 및 하류 이펙터 기능 (즉, C3a, C5a 및 막 공격 복합체 형성)을 촉발하는 전통적인 보체 경로에 의해 지향된다. 전통적인 보체 경로의 PIC1 펩티드 억제제는 C1 복합체의 인식 분자인 C1q에 결합하여, 항체-매개 활성화를 방지할 수 있다. PIC1 유도체 PA-dPEG24 (IALILEPICCQERAA-dPEG24 (서열식별번호: 19))는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 래트 내로 혈관내 투여시 전통적인 경로 활성화를 억제하는 것으로 입증되었으며, 여기서 30초로 보체 활성화의 >90% 전신 억제를 달성할 수 있다. PIC1 유도체가 시험관내에서 전통적인 보체 경로-매개 ABO-미스매치된 용혈을 억제하는 것으로 이전에 제시된 바 있지만, PIC1은 미스매치된 적혈구의 수혈 직전 또는 직후에 투여시 AIHTR의 래트 모델에서 항체-개시된 보체-매개 용혈을 억제할 수 있다. 게다가, PIC1은 또한 시험관내에서 MPO의 퍼옥시다제 활성 및 네토시스를 억제하는 것으로 제시된 바 있다. 독특한, 미스매치된 적혈구-기반의 '2-히트' TRALI 모델이 개발되어 PIC1의 예방적 투여가 급성 폐 손상 및 이 호흡기 증후군의 다른 특징을 완화시킨다는 것을 입증하였다.
실시예
본 발명은 또한 하기 실시예에 의해 기재되고 설명된다. 그러나, 본 명세서의 어느 곳에서나 본 실시예 및 다른 실시예의 사용은 단지 예시적인 것이며 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범주 및 의미를 결코 제한하는 것은 아니다. 마찬가지로, 본 발명은 여기에 기재된 임의의 특정한 바람직한 실시예로 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서를 읽으면 본 발명의 많은 수정 및 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 수 있으며, 이러한 변형은 본 발명을 취지 또는 범주에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 용어와 함께 그 청구범위와 등가물의 자격이 있는 전체 범주에 의해서만 제한되어야 한다.
실시예 1
이 실시예는 인간 혈청에서 면역 복합체-매개 보체 활성화의 시험관내 검정 및 인간 호중구에 의한 NET 형성에 대한 검정에서 보체 C1의 펩티드 억제제 (PIC1)의 시험을 기재한다.
건강한 공여자로부터 혈액을 수득하였다. PA-dPEG24 (IALILEPICCQERAA-dPEG24 (서열식별번호: 19))는 폴리펩티드 그룹(PolyPeptide Group) (캘리포니아주 샌디에고)에 의해 HPLC 및 질량 분석법 분석에 의해 확인된 ≥ 95% 순도로 제조하였다. 동결건조된 PA-dPEG24를 0.01 M Na2HPO4 완충제를 가진 정상 염수에서 37.5 mM로 가용화시켰다. 정제된 MPO를 리 바이오솔루션즈(Lee Biosolutions) (미주리주 메릴랜드 하이츠)로부터 구매하였다. 정맥내 면역 글로불린을 백스터 헬쓰케어 코퍼레이션(Baxter Healthcare Corporation) (캘리포니아주 웨스트레이크 빌리지)으로부터 구매하고, 오브알부민을 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)로부터 구매하고, 항-오브알부민 항체를 압캠(Abcam) (매사추세츠주 케임브리지)으로부터 구매하였다. 염소 항-C1q 및 인간 C1을 컴플리먼트 테크놀로지(Complement Technology) (텍사스주 타일러)로부터 구매하였다. PMA (포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트) 및 과산화수소를 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) (뉴햄프셔주 햄프턴)으로부터 구매하였다.
보체 허용 GVBS++ 완충제는 0.1% 젤라틴, 0.15 M CaC12, 및 1 mM MgCl2를 가진 베로날-완충 염수였다 [29]. 보체 억제 완충제 GVBS--는 0.1% 젤라틴 및 10 mM EDTA를 가진 베로날-완충 염수였다. 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)을 전술한 바와 같이 제조하였다 [29].
NHS의 면역 복합체 활성화를 다음과 같이 수행하였다. 보체 활성화를 유도하기 위해 3 가지 상이한 유형의 면역 복합체 (IC)로 NHS를 자극하였다. 정맥내 면역 글로불린을 63℃에서 30분 동안 50 mg/ml로 인큐베이션함으로써 열-응집된 IgG를 생성하였다 [26]. 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체는 0.01 ml 항-오브알부민 항체를 동일한 부피의 오브알부민과 함께, 0.25 mg/ml에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음에, 4℃에서 밤새 저장함으로써 제조하였다. C1 면역 복합체는 0.02 ml 항-C1q 염소 혈청을 5 μl의 C1과, 200 μg/ml에서 30℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음에 빙수조에 넣음으로써 형성시켰다. C5a 및 C5b-9 검정의 경우, NHS의 활성화는 5% NHS를 적정 농도의 PA-dPEG24와 함께 0.3 ml의 GVBS++ 완충제에서 실온에서 30분 동안 미리 인큐베이션함으로써 수행하였다. 이어서, 2 ml의 열-응집된 IVIg, 또는 오브알부민 IC, 또는 5 μl의 C1-항C1q IC를 37℃에서 30분 동안 혼합물에 첨가하였다. 이 반응은 동일한 부피의 GVBS--를 첨가하여 중단시켰다. iC3b 검출을 위해, 1% NHS를 사용하였고 프로토콜의 나머지는 동일하게 유지되었다.
ELISA를 다음과 같이 수행하였다. C5a, iC3b, 및 SC5b-9 ELISA를 사용하여 샘플을 검정하였다. C5a ELISA 키트 (알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. iC3b 및 SC5b-9에 대한 ELISA는 전술한 바와 같이 수행하였다 [30]. iC3b ELISA에서, 염소 항-인간 C3 항체 (컴플리먼트 테크놀로지, 텍사스주 타일러)를 포획에, 마우스 항-인간 iC3b 항체 (퀴델, 캘리포니아주 샌디에고)를 프로빙에, 그리고 염소 항-마우스 HRP 항체를 검출에 사용하였다. SC5b-9 ELISA에서, 토끼 항-인간 SC5b-9 항체 (컴플리먼트 테크놀로지)를 포획에, 마우스 항-인간 SC5b-9 모노클로날 항체 (퀴델)를 프로빙에, 닭 항-마우스 HRP 항체를 검출에 사용하였다. 비색 검출을 TMB로 수행하고, H2SO4로 중단하고 450 nm에서 바이오텍 시너지(BioTek Synergy) HT 플레이트 판독기에서 판독하였다.
건강한 지원자의 혈액으로부터의 호중구는 전술한 바와 같이 [31], 하이파크-피콜(Hypaque-Ficoll) 단계 구배 원심분리, 덱스트란 침강, 및 저장성 용해에 의해 헤파린화 혈액으로부터 정제하였다.
호중구 세포외 트랩 검정을 다음과 같이 미세역가 플레이트에서 수행하였다. NET의 형성은 96 웰 조직 배양 플레이트에서 2.0 x 105개 호중구를 RPMI 배지 단독으로 인큐베이션하거나, 다양한 농도에서 0.05%의 H2O2, 또는 12 nM PMA, 또는 8 μg/ml MPO, 또는 PA-dPEG24를 첨가함으로써 유도하였다. 면역 복합체 혈청 유도된 NET 형성을 위해, 활성화된 혈청은 5 μl의 오브알부민-항-오브알부민 면역 복합체를 0.3 ml의 GVBS++에서 5% NHS에 첨가함으로써 제조하였다. 이 조합을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음에, 0.05 ml를 RPMI에서 호중구에 첨가하였다. 이어서 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다.
NET 형성을 다음과 같이 정량적으로 검정하였다. 유리 DNA는 NET 미세역가 플레이트 웰 검정으로부터 회수된 상청액에서 피코그린에 의해 측정하였다 [18]. 500개 단위의 단구균 뉴클레아제 (피셔)를 각각의 웰에 첨가하여 방출된 세포외 DNA를 37℃ 인큐베이터에서 10분 동안 소화시켰다. 이어서, 제제를 인접한 웰에 분취하고 제조된 피코 그린 시약 (피셔)과 1:1 혼합하였다. 이어서 형광을 여기 485 nm/방출 528 nm에서 바이오텍 마이크로플레이트 판독기에서 정량화하였다.
NET 형성을 형광 현미경검사에 의해 검정하였다. 정제된 인간 호중구를 유리 슬라이드 상에서 다음과 같이 검정하였다. 세포를 튜브에서 상기 언급된 바와 같은 명시된 자극 및 RPMI 배지와 합한 다음에, 소수성 슬라이드 마커로 동그라미 표시된 유리 슬라이드 상에 분취하였다. 슬라이드를 37도에서 1.5시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 1.5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 4℃에서 4% 파라포름알데히드로 슬라이드를 밤새 고정시켰다.
모든 염색에 대해, 다음 조건을 사용하였다. 슬라이드를 PBS에서 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단 용액 (PBS 중 2% 정상 염소 혈청 + 2% 소 혈청 알부민)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 PBS 중 2% BSA 중 1:300에서 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS에서 3회 세척하고 1:1000에서 형광-표지된 2차 항체 또는 DAPI (써던 바이오테크(Southern Biotech))에서 실온에서 1시간 동안 PBS 중 2% BSA 0.25 pg/ml 최종으로 인큐베이션하였다. 이어서 슬라이드를 PBS에서 3회 세척하고 영상화하였다. 세포를 BX50, 올림푸스 현미경에 탑재된 DP70 디지털 카메라 (올림푸스 센터(Olympus Center), 펜실베이니아주 밸리 포지)를 사용하여 가시화하였다. 사용된 염색 항체 쌍은 토끼 항-MPO (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 및 토끼 항-히스톤 H3 (압캠)과 2차 염소 항-토끼 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 (노부스 바이올로지컬즈(Novus Biologicals))이었다. 또한, 마우스 항-엘라스타제 (인비트로겐(Invitrogen))를 2차 염소 항-마우스 알렉사 플루오르 568 (노부스 바이올로지컬즈)과 함께 사용하였다.
통계 분석을 다음과 같이 수행하였다. 정량적 데이터는 엑셀 (마이크로소프트(Microsoft), 워싱턴주 레드먼드)을 사용하여 평균, 표준 오차 (SEM), 및 스튜던트 t-검정 [32]을 결정하여 분석하였다.
PA-dPEG24는 면역 복합체-개시된 보체 활성화를 억제하는 것으로 나타났다. 면역 복합체-개시된 보체 활성화를 억제하는 PA-dPEG24의 능력을 평가하기 위해, 열-응집된 IgG의 전형적인 면역 복합체 자극제 [25, 26]를 풀링된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 이용하였다. 보체 활성화로부터 초래된 3 가지 중요한 이펙터를 검정하였다: 주요 염증유발성 아나필라톡신, C5a, C3 활성화의 절단 생성물, iC3b, 및 막 공격 복합체 C5b-9. 데이터는 도 1a-1c에 나타냈다. 도 1a는 열-응집된 IgG (Agg-IgG) 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 PA-dPEG24가 C5a 생성을 억제한다는 것을 제시한다. 5회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 도 1b는 열-응집된 IgG (Agg-IgG) 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 4회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 도 1c는 열-응집된 IgG (Agg-IgG) 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 6회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다.
각각의 검정의 경우, PA-dPEG24는 억제제가 없는 경우와 비교하여 열-응집된 IgG로 자극한 후 이펙터의 정교함을 용량-의존적으로 억제하였다. 각각의 검정에서 ≥ 0.5 mM PA-dPEG24에서 통계적으로 유의한 억제가 달성되었다 (P < 0.05). C5a의 경우, 1 mM PA-dPEG24는 억제제가 없는 열-응집된 IgG와 비교하여 61% 감소 (P = 0.002)를 야기하였다. 이들 결과는 PA-dPEG24가 인간 혈청에서 면역 복합체-개시된 보체 활성화를 억제할 수 있음을 시사한다.
열-응집된 IgG로 결과의 확인을 제공하기 위해, 보체 활성화, 오브알부민 및 항오브알부민의 동물 모델에서 가장 흔히 이용되는 항원-항체 면역 복합체 [27, 28]를 시험하였다. 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체를 사용하여 NHS에서 보체 활성화를 자극하고 동일한 3개의 이펙터, C5a, iC3b 및 C5b-9를 측정하였다. PA-dPEG24는 오브알부민-항오브알부민 단독과 비교하여 ≥ 0.25 mM PA-dPEG24에서 달성된 통계적으로 유의한 억제로 각각의 보체 이펙터의 생성을 용량 의존적으로 억제하였다 (P < 0.03). 데이터는 도 2a-2c에 제시되어 있다. 도 2a는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 C5a 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 4회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 도 2b는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 4회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 도 2c는 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 2 mM PA-dPEG24에서 측정된 SC5b-9는 검출의 하한에 있었다. 3회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 이들 결과는 PA-dPEG24가 인간 혈청에서 면역 복합체-개시된 보체 활성화를 억제할 수 있다는 추가의 확신을 제공한다.
SLE를 가진 환자의 서브세트에서 항-C1q 항체의 중요성으로 인해, 인간 C1 및 항-C1q 항체 (염소)와의 면역 복합체가 생성되었다. 이들 면역 복합체는 NHS를 활성화시켜 C5a, iC3b 및 SC5b-9의 강력한 생성을 야기한다. 데이터는 도 3a-3c에 제시되어 있다.
도 3a는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 C5a 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 4회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 도 3b는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 iC3b 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 4회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다. 도 3c는 C1-항C1q 면역 복합체로 자극된 정상 인간 혈청 (NHS)에서 SC5b-9 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 4회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다.
PA-dPEG24는 각각의 농도에서 NHS에서 C5a의 C1-항C1q 생성을 용량-의존적으로 억제하였다 (P ≤ 0.03). iC3b의 C1-항C1q 생성은 2 mM PA-dPEG24 (P < 0.02)에 의해 NHS 기준선과 유사한 수준으로 억제되었다. PA-dPEG24는 ≥ 0.13 mM의 농도의 경우 SC5b-9의 C1-항C1q 생성을 용량-의존적으로 억제하였다 (P < 0.03). 이들 결과는 PA-dPEG24가 인간 혈청에서 C1-항C1q 면역 복합체-개시된 보체 활성화를 억제할 수 있음을 제시한다.
PA-dPEG24는 인간 호중구에 의한 PMA-개시된 NET 형성을 억제하는 것으로 나타났다. PA-dPEG24가 호중구 세포외 트랩 (NET)을 억제할 수 있는지를 평가하기 위해, 정제된 인간 호중구 및 통상적으로 이용되는 자극 포르볼 12-미스테이트 13-아세테이트 (PMA)를 아콩-무어 등의 문헌 [18]에 의해 기재된 방법과 유사한 방식으로 사용하였다. 세포외 DNA 및 미엘로퍼옥시다제 (NET의 2 가지 주요 성분)를 각각 DNA 및 항-MPO 항체로 가시화하였다.
PMA 및 과산화수소로 자극된 인간 호중구는 세포외 DNA 및 세포외 MPO의 형광 현미경검사에 의해 가시화된 많은 NET를 생성하였다. 도 4는 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)로 PMA-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 PMA 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 5 mM PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 PMA+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시하며 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 그래프는 피코그린에 의해 검정된 PMA+H2O2로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 (5 mM) 억제를 제시한다. 3회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다.
5 mM PA-dPEG24의 존재 하에, PMA 및 과산화수소는 형광 현미경검사에 의해 확인될 수 있는 NET을 생성하지 않았다. 이어서, 미세역가 플레이트 웰에서 자극된 인간 호중구의 상청액으로부터 피코그린-기반 검정에서 유리 DNA를 측정함으로써 NET 형성을 정량화하였다. PA-dPEG24 (5 mM)는 PMA 및 과산화수소의 존재 하에 억제제가 없는 경우와 비교하여 유리 DNA 정교를 2.6배 (P = 0.01) 억제할 수 있었다 (도 4). PA-dPEG24에 대한 이러한 감소는 PMA가 없는 기준선과 유사한 수준까지였다.
동일한 실험 조건을 이용하여 형광 현미경검사를 또한 수행하였으나, 대신에 세포외 호중구 엘라스타제 및 히스톤 H3의 추가 NET 성분을 프로빙하였다. 도 5는 DNA (DAPI), 호중구 엘라스타제 (αNE), 및 히스톤 H3 (α히스톤)에 대한 형광 현미경검사에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)에 의한 PMA-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시하고, 제2 행은 PMA 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시하고, 제3 행은 5 mM PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 PMA+H2O2로 자극된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드이고, 제2 열은 항-호중구 엘라스타제 항체로 프로빙된 슬라이드이고, 제3 행은 항-히스톤 H3 항체로 프로빙된다. 대표적 영상이 제시되어 있다.
상기는 PMA 및 과산화수소에 의한 자극이 방대한 NET 형성을 초래하였으며, 이는 PA-dPEG24 (5 mM)의 존재 하에 억제되었음을 제시한다. 이들 결과는 PA-dPEG24가 인간 호중구에 의한 PMA-자극된 NET 형성을 억제할 수 있음을 시사한다.
PA-dPEG24는 인간 호중구에 의한 MPO-개시된 NET 형성을 억제하는 것으로 나타났다. 아콩-무어 등의 문헌 [18]은 MPO가 PMA-자극된 NET 형성에서 중요한 매개자임을 시사하나, 이는 정제된 MPO를 사용하여 결코 시험되지 않았다. 정제된 인간 호중구를 사용한 상기 실험을 반복하였으나 NET 형성에 대한 자극으로서 PMA를 대체하여 정제된 MPO로 반복하였다. 정제된 MPO 및 과산화수소에 의한 호중구 자극은 DAPI 염색 및 항-MPO 염색에 의해 가시화된 광범위한 NET 형성을 유발하였다. 도 6은 형광 현미경검사 및 유리 DNA의 피코그린 정량화에 의해 검정된 인간 호중구 (PMN)에 의한 MPO-개시된 NET 형성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 제1 행은 자극되지 않은 호중구를 제시한다. 제2 행은 MPO 및 과산화수소 (H2O2)로 자극된 호중구를 제시한다. 제3 행은 PA-dPEG24 (PIC1)의 존재 하에 MPO+H2O2로 자극된 호중구를 제시하고, 제4 행은 단지 PA-dPEG24 (PIC1)와 함께 인큐베이션된 호중구를 제시한다. 제1 열은 DNA를 가시화하기 위해 DAPI로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 제2 열은 항-MPO 항체로 프로빙된 슬라이드를 제시한다. 그래프는 피코그린에 의해 검정된 MPO + 과산화수소로 자극된 인간 호중구에 의한 NET 생성의 PA-dPEG24 억제를 제시한다. 3회 독립 실험을 수행하였고, SEM을 나타냈다.
MPO 및 과산화수소의 존재 하에 NET 형성은 PA-dPEG24 (5 mM)로 차단하였다. PA-dPEG24 단독과 함께 인큐베이션된 호중구는 형광 현미경검사에 의해 정상으로 보였다. NET 형성이 피코그린 측정에 의해 정량화된 경우, 1.1 mM의 PA-dPEG24는, MPO를 사용하였으나, 억제제가 없는 자극과 비교하여, 유리 DNA에서 30% (P = 0.02) 감소를 야기하였고 4.5 mM의 PA-dPEG24는 유리 DNA에서 3.7배 (P = 0.001) 감소를 초래하였다 (도 6). MPO + 4.5 mM PA-dPEG24의 존재 하에, 측정된 유리 DNA는 자극되지 않은 호중구와 통계적으로 상이하지 않았다. 이들 결과는 PA-dPEG24가 MPO-매개 경로를 통한 NET 형성을 억제함을 시사한다.
PA-dPEG24는 인간 호중구에 의한 면역 복합체-개시된 NET 형성을 억제한다. 인간 호중구에 의한 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 인간 혈청 및 NET 형성 사이의 잠재적 관계를 평가하였다. 정상 인간 혈청에서의 보체는 도 2의 실험에서 수행된 바와 같이, 오브알부민-항오브알부민 면역 복합체로 활성화되었다. 이어서 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 인간 혈청을 정제된 인간 호중구와 함께 인큐베이션하여 피코그린과 함께 유리 DNA 측정에 의해 NET 형성을 정량화하였다. 면역 복합체의 상대적 기여는 NET 생성을 위한 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 인간 혈청과 비교하여 초기에 자체적으로 평가하였다. 면역 복합체의 존재는 호중구 단독과 비교하여 NET 형성을 유의하게 증가시키지 않았다 (P = 0.39) (도 7a). 그러나, 혈청에서 보체의 면역 복합체 활성화는 배경을 뺀 후 면역 복합체 단독과 비교하여 NET 형성을 > 20배 (P = 0.009) 증가시켰다. 이들 결과는 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 혈청이 NET 형성에 대한 강한 자극이라는 것을 처음으로 입증한다.
과산화수소는 그것이 면역 복합체-활성화된 혈청에 의해 NET 형성을 추가로 향상시키는지를 결정하기 위해 시험되었으며, 여기서 과산화수소는 신호를 대략 두배로 만든다 (도 7b). 면역 복합체에 의한 혈청의 보체 활성화가 이미 발생한 후 첨가된 PA-dPEG24로 네토시스의 PA-dPEG24 억제의 시험을 수행하였다. 따라서, 네토시스에 대한 PA-dPEG24의 임의의 효과는 보체 활성화의 하류에서 발생하였다. 면역 복합체-활성화된 혈청 및 과산화수소의 존재 하에, 억제제가 없는 경우와 비교하여, 2.2 mM PA-dPEG24는 유리 DNA를 23% 만큼 감소시켰고 (P = 0.037), 4.5 mM PA-dPEG24는 유리 DNA를 3배 감소시켰다 (P < 0.001) (도 7b). 이들 조건은 또한 형광 현미경검사에 의해 가시화하였다 (도 7c). PA-dPEG24 (5 mM) 및 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 혈청의 존재 하에, 형광 현미경검사에 의해 어떠한 NET도 확인되지 않았다.
이들 연구결과는 면역 복합체 활성화된 인간 혈청이 인간 호중구를 자극하여 NET을 형성할 수 있고 이것이 PA-dPEG24로 억제될 수 있음을 시사한다. PA-dPEG24에 의한 네토시스의 억제는 혈청에서 보체 활성화가 발생한 후 NET 형성의 억제가 발생하여 개시 자극이 영향을 받지 않았다는 점을 고려해 볼 때 놀라운 발견이었다. 이들 결과는 면역 복합체-개시된 보체-활성화된 혈청이 PA-dPEG24로 차단된, MPO-매개 경로를 통해 네토시스를 유발할 수 있다는 신규한 아이디어를 시사한다. 종합하면, 이들 실험은 PA-dPEG24가 여러 가지의 자극제에 의해 개시된 인간 호중구에 의한 NET 형성을 억제할 수 있다는 것을 일관되게 제시한다.
결론적으로, 리드 PIC1 유도체, PA-dPEG24 (IALILEPICCQERAA-dPEG24 (서열식별번호: 19))는, C1-항C1q 면역 복합체를 포함하여 여러 유형의 면역 복합체에 의해 개시되는 보체 활성화를 용량-의존적으로 억제하는 것이 가능하여, C5a 및 막 공격 복합체 (sC5b-9)를 포함한 염증유발성 보체 이펙터의 생성을 제한한다. PA-dPEG24는 또한 포르볼 12-미스테이트 13-아세테이트 (PMA), 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 또는 면역 복합체 활성화된 인간 혈청에 의해 자극된 인간 호중구에 의한 NET 형성을 용량-의존적으로 억제하는 것이 가능하였다. 이들 결과는 NET의 PA-dPEG24 억제가 NET 형성의 MPO 경로를 차단함으로써 발생함을 시사한다. 함께 이들 결과는 PA-dPEG24가 보체 시스템 및 NET 형성의 면역 복합체 활성화를 억제할 수 있다는 것을 입증하는 데, 이는 PIC1 펩티드가 현재 약리학적 치료에 의해 해결되지 않은 SLE 발병기전의 이들 두 가지 중요한 측면을 조정하는 치료 접근법으로서 사용될 수 있을 것임을 시사한다
실시예 2
본 실시예에서, 위스타 래트는 리포폴리사카라이드로 프라이밍되고 뒤이어 미스매치된 적혈구의 30% 수혈이 이루어졌으며, 이에 대해 래트는 기존의 항체를 가졌다. 모의 및 비히클 동물을 수혈 2분 전에 PIC1을 받은 동물의 서브군과 함께 대조군으로서 사용하였다. 4시간 째에, 완전한 혈액 계수를 위해 혈액을 단리하였다. 단리된 폐 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 폐 조직에서의 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성을 기능 검정으로서 정량화하였다. 혈장내 유리 DNA를 피코그린 염색에 의해 검출하였다.
적혈구 수혈을 이용한 이러한 신규한 '2-히트' 모델은 강력한 TRALI 표현형을 산출하였다. 비히클 대조군과 비교하여, PIC1 처리된 동물의 폐는 폐 조직에서 감소된 폐 손상, 호중구 침습 및 MPO 활성을 나타냈다. 게다가, PIC1을 받은 래트는 혈액 중 유리 DNA의 감소가 TRALI와 이전에 연관된 약화된 호중구 세포외 트랩 형성을 시사한다는 것을 입증하였다. 하기에 제시된 결과는 PIC1이 TRALI의 신규한 동물 모델에서 급성 폐 손상을 약화시킨다는 것을 입증한다.
청소년기 수컷 위스타 래트 (200-250 g)를 유치 경정맥 카테터와 함께 힐탑 랩 애니멀즈(Hilltop Lab Animals)로부터 구매하였으며 이스턴 버지니아 메디컬 스쿨(Eastern Virginia Medical School) (EVMS) IACUC (동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)) 승인 프로토콜 하에 사용하였다.
EVMS 승인 임상연구 심의 위원회(Institutional Review Board) 프로토콜 (EVMS IRB #02-06-EX 0216) 하에 고지에 입각한 서면 동의 후, 정제된 인간 적혈구 (RBC)를 생성하기 위해 사용된 건강한 인간 자원자 기증된 AB 혈액을 수득하였다. 동물 실험의 아침에 획득한 인간 RBC를 전술한 바와 같이 처리하였다. 인간 혈액을 원심분리에 의해 히스토파크(Histopaque) 구배 상에서 정제하였다. 이어서, RBC를 백혈구 및 혈소판으로부터 분리하고 염수에 재현탁시켰다. 래트 (200 g)는 공칭 40% 헤마토크릿을 가진 14 mL의 공칭 순환 혈액 부피를 갖는다. 수혈을 위해, 80% 헤마토크릿에서 대략 2 mL의 인간 RBC를 수혈하여, 래트에 대략 30% 수혈을 초래한다.
상기 실험으로부터 생성된 혈장을 전술한 바와 같이, 분광광도법을 사용하여 유리 헤모글로빈에 대해 분석하였다. 공여자 적혈구를 물로 용혈시켜 각각의 샘플에서 용혈된 적혈구의 양을 유리 헤모글로빈 측정에 대해 계산하는 표준 곡선을 생성하였다.
DXP 8 컬러(Color) 488/637/407 업그레이드 (시텍 디벨롭먼트(Cytek Development), 미국 캘리포니아주 프리몬트)와 함께 팩스칼리버(FACSCalibur) 유세포 분석기 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 시텍 플로우조(FlowJo) CE 버전 7.5.110.6을 사용하여 데이터를 획득하였다. 샘플당 적혈구에 대해 선택된 대략 1x105개 사건을 각각 단일 표지된 유동에 대해 수집하였다. 플로우조 X 버전 10.0.7r2 (플로우조 엘엘씨(FlowJo LLC))를 사용하여 데이터를 분석하였다.
단일 표지된 유동의 경우, 혈장 분리 후 수집된 세포를 세척하고, 희석하고, GVBS (0.1% 젤라틴을 가진 베로날-완충 염수 (VBS), 0.01 mol/L EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)) 중 1:200에서 FITC-접합된 항-인간 CD235a (글리코포린 A, 이바이오사이언스(eBioscience))로, 실온에서 진탕하여 응집을 최소화하면서, 20분 동안 염색하였다. 항체 대조군은 1:200에서 마우스 IgG2b 이소(Iso)-대조군 FITC (이바이오사이언스)로 이루어졌다.
H&E로 염색된 폐 조직을 실험군 (단지 비히클 및 PIC1-처리 동물)에 대해 맹검인 임상의에 의해 분석하였다. 호중구 침윤 및 세포벽 비후는 0 내지 4의 척도: 0 = 정상 폐, 1 = 경미한 폐 침범, 2 = 중등도 폐 침범, 3 = 심각한 폐 침범, 4 = 중증 폐 침범으로 점수를 매겼다.
미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성 검정을 다음과 같이 수행하였다. 동결 폐 조직을 다이싱하고 50 mM 인산칼륨의 얼음 위에서 균질화하고, 15분 동안 4℃에서 10,000 RPM으로 원심분리한 후 상청액을 폐기하였다. 폐 조직 중의 호중구로부터 MPO를 가용화하기 위해, 펠렛을 500 ml 50 mM 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (HTAB)에 재현탁시키고, 초음파처리에 의해 균질화하고 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 이 과정을 2회 반복한 다음에, 샘플을 10분 동안 4℃에서 10,000 RPM으로 원심분리하고 상청액을 수집하였다.
이들 샘플에서의 퍼옥시다제 활성을, 전술한 바와 같이, 샘플로부터 MPO 항체 포획 후 10-아세틸-3,7-디히드록시페녹사진 (ADHP, 앰플렉스 레드(Amplex Red))을 사용하여 측정하였다. 형광을 25초 간격으로 0 내지 600 초로 판독하였고 이는 바이오텍 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 535 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방출 파장에서 웰당 25개의 데이터 포인트를 제공하였다. 정제된 MPO를 양성 대조군으로 사용하고 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 활성 검정을 삼중으로 수행하였다.
유리 DNA를 전술한 바와 같이 래트 혈장에서 피코그린에 의해 측정하였다. 간단히 말하자면, 혈장 샘플을 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE) 완충제에서 1:10으로 희석하고 50 uL의 각각의 샘플을 50 uL의 1:200 희석의 피코그린 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))과 함께 웰에 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호하였다. TE 완충제에서 DNA 표준 곡선을 제조하였다. 이어서, 바이오텍 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 485 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장에서 형광을 판독하였다. 모든 유리 DNA 측정을 삼중으로 행하였다.
평균 및 표준 오차를 독립 실험으로부터 계산하고 스튜던트 t 검정을 사용하여 통계적으로 비교하였다 (마이크로소프트 엑셀 XP).
급성 혈관내 용혈 수혈 반응 (AIHTR)의 래트 모델에서, 15% 미스매치된 RBC의 수혈은 혈관내 용혈 및 급성 신장 손상을 초래하였다. 이 모델에서, 위스타 래트에서 자연적 순환 항-A 항체는 수혈된 적혈구의 전통적인 보체 활성화 및 용혈을 개시한다. AIHTR 모델이 TRALI 표현형을 모방하도록 적합화될 수 있는지를 확인하기 위해, 미스매치된 RBC 수혈의 상승 용량 (15, 30 또는 45%)을 초기에 시험하였고 30% 수혈은 거의 최대량의 보체-매개 용혈을 생성하는 것으로 결정되었다 (도 8a). 45% 수혈에서의 포화는 개시 보체 활성화에 충분한 클러스터링으로 적혈구에 결합하는 항체의 양이 초과되었을 가능성이 있음을 시사한다. 30% 수혈은 유세포 분석에 의해 평가된 바와 같이 15 및 45% 수혈과 비교하여 RBC 생존의 중간 표현형을 생성하였다 (도 8b). 수혈 후 4시간에, 45% 수혈에서도, 어떠한 조직학적 폐 손상도 발생하지 않았다 (도 9a-9c).
혈액 중 백혈구 (WBC) (P = 1.08x10-6), 호중구 (P = 2.70x10-13) 및 단핵구 (P = 2.59x10-7)의 유의한 증가가 수혈 전 세포 수와 비교하여, 30% 수혈 후 관찰되었다. 백혈구는 동원되었으나, 폐로 국소화되지 않았다 (도 10a-10b). 흥미롭게도, 30% 수혈 후 혈류에서 림프구의 유의한 감소가 있다 (P = 0.015) (도 10c).
TRALI의 다른 동물 모델은 전형적으로 폐에 염증 반응을 지시하는 '2-히트)' 모델을 이용한다 (참고문헌에서 검토됨). '제1 히트'를 유도하는 한 방법은 LPS를 주입하고 이는 정맥 주입 후 처음에 '제2 히트'에 의한 명시적인 손상을 위해 이들을 프라이밍할 가능성이 있는 폐의 모세혈관 상과 마주칠 것이다. 30% 미스매치된 적혈구의 수혈로 '제2 히트' 30분 전에 '제1 히트'로서 제공된 2 mg/kg LPS IV 주사는 폐 조직의 대규모 호중구 침윤으로 수혈 후 4시간에 극적인 폐 손상을 초래하였다 (도 9d). LPS '제1 히트'의 부재 하에 30% 수혈을 받은 동물과 비교하여 혈류 중 WBC (P = 9.8x10-5), 호중구 (P = 4.5x10-4), 단핵구 (P = 0.004)의 유의한 감소 및 림프구의 추가 감소 (P = 0.006)로 혈관내 백혈구 수준의 상응하는 변화가 관찰되었다 (도 10a-10c). 이 모델에서 순환 백혈구의 감소는 TRALI 환자에서 보고된 일시적 백혈구감소증을 모방한다. 함께, 이들 결과는 보체 활성화와 이 수혈-개시된 모델이 TRALI의 많은 측면과 일치하는 중증 호중구-매개 폐 질환을 초래한다는 것을을 입증한다.
이 모델에서 관찰된 혈관내 용혈의 염증 특성을 고려해 볼 때, 수혈된 인간 RBC의 백분율을 증가시키는 것이 LPS '제1 히트'의 부재 하에 폐에서 TRALI-유사 표현형을 유도하는지를 결정하기 위해 시험되었다. 15-45%의 인간 RBC의 수혈은 LPS '제1 히트'의 부재 하에 급성 폐 손상을 초래하지 않았다. LPS '제1 히트'가 추가된 경우, TRALI-유사 발병기전이 조직학에 의해 관찰되었으며, 호중구 매개 폐 손상의 다른 특징 예컨대 폐 실질의 중증 호중구 침윤 및 백혈구감소증이 검출되었다. 이 모델에서 TRALI를 유도하기 위한 '제1 히트'로서 LPS의 필요성은 필수적이며, 문헌에 보고된 TRALI의 수많은 '2-히트' 래트, 마우스, 양 및 돼지 모델과 일치한다.
'2-히트' TRALI 모델을 확립하기 위해, 위스타 래트 모델을 최적화하기 위해 인간 RBC (15, 30 또는 45%)의 양을 래트에 처음에 수혈하였다. 모든 절차의 경우, 생체 신호의 모니터링을 통해 실험 과정 전반에 걸쳐 래트를 케타민 및 아세프로마진으로 진정시켰다. 래트의 군은 유치 경정맥 카테터를 통해 혈관내로 인간 RBC의 수혈을 받았다. 수혈 전에 그리고 이어서 수혈 후 0.5, 5, 20, 60, 120 및 360분에 동물로부터 EDTA 마이크로테이너(microtainer) 튜브 (벡톤 디킨슨) 내로 혈액 샘플을 수집하였다. 이들 샘플을 2,655 × g에서 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 세포를 침강시켰다. 혈장을 분취하고 세포 펠렛을 하기 기재된 바와 같이 개별적으로 처리하였다. 다양한 양의 인간 RBC (15-45%)를 사용한 파일럿 실험에 기초하여, 30% 인간 RBC 수혈은 3시간에 걸쳐 강력한 보체-매개 용혈을 초래하고 TRALI 모델을 위해 선택되었다 (도 8a 및 도 8b).
'2-히트' 모델의 경우, 래트를 상기와 같이 진정시키고, 리포폴리사카라이드 (LPS, 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 장염으로부터, 2 mg/kg [밀리포어-시그마(Millipore-Sigma)])를 다른 TRALI 모델 (참고문헌에서 검토됨)과 유사한 '제1 히트'로서 유치 경정맥 카테터를 통해 혈관내 투여하였다. 이에 뒤이어 30분 후에 '제2 히트"로서 30% 미스매치된 RBC 수혈을 행하였다. 혈액 화학 (슈퍼켐(SuperChem) 및 CBC, 안텍 다이아그노스틱스(Antech Diagnostics))의 분석을 위해 LPS 투여 전에 및 RBC 수혈 후 4시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 최종 혈액 채취의 완료시, 이소플루오렌 및 단두대를 사용하여 동물을 안락사시켰다. 조직병리학을 위한 장기를 수집하기 위해 부검을 완료하였다. 각각의 동물로부터 획득한 폐를 칭량한 다음에 포르말린에 보관하거나 또는 -70℃에서 동결시켰다. 포르말린 고정 조직의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색된 섹션을 맹검 방식으로 검토하였다.
PIC1의 예방적 투여가 TRALI 발병기전을 약화시킬 것인지를 결정하기 위해,이 수혈-기반 항체-개시된 보체-매개 TRALI 모델을 이용하였다. IV LPS 주입 후 28분에, 160 mg/kg PIC1 또는 비히클 대조군에 IV를 투여한 후 30% 미스매치된 RBC 수혈을 행하였다. 대략 0.05 M 히스티딘 [pH 6.0]에서 PIC1, 160 mg/kg의 peg화된 유도체 PA-dPEG24 (폴리펩티드 그룹)를 받은 동물의 경우, 인간 RBC 수혈 2분 전에 0.15 M NaCl을 투여하였다. 160 mg/kg PIC1 용량의 선택은 이전에 보고된 바와 같이 혈관내 용혈 위스타 래트 모델에서 확립되었다. 비히클 단독 및 모의 동물을 받은 동물 군을 또한 포함시켰다.
수혈 후 4시간에, 혈액을 수집하고 폐 조직을 수확하였다. PIC1은 조직학 및 폐 중량, 폐 조직의 호중구 침윤, 백혈구 분리, 뿐만 아니라 MPO 활성에 의해 정량화된 호중구 활성화 및 혈류 중 유리 DNA에 의해 평가되는 바와 같은 급성 폐 손상을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. PIC1의 부재 하에 이들 동물에서 유발된 TRALI-유사 손상 이외에, 전체 모폴로지, 기관 중량 및 크레아티닌, BUN/크레아티닌 및 간 효소 AST (SGOT) (데이터는 제시되지 않음)의 증가된 혈중 수준에 의해 평가된 바와 같이 상당한 급성 신장 손상 (AKI)을 관찰하였으며, 이는 15% 수혈된 인간 RBC의 용혈에 의해 방출된 유리 헤모글로빈에 기인한 AIHTR 모델에서 이전에 보고된 AKI와 일치한다. 신장에 대한 이러한 유형의 말기-기관 손상은 또한 항체-매개 TRALI의 마우스 모델에서 보고되었다. 비히클을 받은 동물과 비교시, PIC1-처리 동물은 신장 중량이 감소하였으며 크레아티닌, BUN/크레아티닌 및 AST의 혈중 수준이 감소하였다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, LPS 사전-처리의 존재 하에 30% 수혈에서도, PIC1은 AIHTR 모델에서 PIC1의 보호 효과와 일치하는 손상으로부터 신장을 보호한다.
실시예 3
이 실시예는 PIC1의 예방적 투여가 급성 폐 손상을 감소시킨다는 것을 제시한다. 인간 RBC의 수혈 직전 또는 직후의 PIC1의 IV 투여는 AIHTR 모델에서 용혈 및 신장 손상 둘 다를 완화시켰다. PIC1이 신규한 '2-히트' 모델에서 TRALI를 약화시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 래트에게 제1 히트로서 2 mg/kg LPS를 IV 투여하였다. 28분 후에, 래트는 160 mg/kg PIC1 또는 비히클만을 받은 후, 2분 후에 제2 히트로서 미스매치된 RBC의 30% IV 수혈이 이어졌다. 160 mg/kg 용량의 PIC1은 AIHTR 모델에서의 그의 효능에 기초하여 이용하였다. 수혈 후 4시간에, 동물을 희생시키고, 폐 중량을 측정하고, 폐 조직을 조직학에 의해 평가하였다.
비히클 대조군 동물로부터의 폐는 폐에서의 세포성의 증가와 일치하는 모의 동물과 비교하여 체중의 유의한 증가를 나타냈다 (p = 0.006) (도 11a). 대조적으로, PIC1-처리군으로부터의 폐는 비히클 대조군 동물과 비교하여 폐 중량의 유의한 감소를 나타냈고 (p = 0.001), 모의 동물의 것과 유의하게 상이하지 않았다 (p = 0.432) (도 11a). 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색된 섹션은 정상 폐 조직학을 나타내는 모의 동물과 비교하여 (도 11b), 비히클-처리 동물은 예상된 바와 같이 심한 호중구 침윤으로 폐포 공간의 현저한 경화 및 폐포 세포벽의 비후를 나타냈다 (도 11c). 대조적으로, PIC1로 예방적으로 처리된 동물은 폐 구조에 대한 손상이 감소된 것으로 나타났다 (도 11d).
실시예 4
이 실시예는 PIC1이 호중구-매개 폐 손상, 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 활성 및 백혈구감소증을 감소시킨다는 것을 제시한다. 이 모델에서 호중구 매개 폐 손상을 약화시키는데 있어서 PIC1의 역할을 평가하기 위해, 비히클 및 PIC1-처리 동물로부터의 호중구 침윤 및 세포벽 비후에 대한 H&E 섹션의 맹검 등급화를 수행하였다. 호중구 침윤 및 세포벽 비후를 정상 폐를 나타내는 0의 점수 및 중증 폐 손상을 나타내는 4의 점수로 0 내지 4의 척도로 점수를 매겼다. 폐 중량의 감소 및 조직학적 분석과 일치하여, PIC1을 받은 동물은 비히클 대조군 동물과 비교하여 유의하게 개선된 폐 손상 점수를 가졌다 (p = 0.003) (도 12a). 비히클 대조군 동물은 평균 1.5이고 25 및 75 사분위수에서 훨씬 더 촘촘한 분포를 가진 PIC1-처리 동물과 비교하여 평균 2.0 및 더 넓은 분포로 더 높은 정도의 손상을 나타냈다.
이 TRALI 모델에서 호중구의 병원성 역할을 추가로 평가하기 위해, 미엘로퍼옥시다제 (MPO)를 통한 호중구-매개 폐 손상에 대한 PIC1의 효과를 평가하였다. MPO는 호중구 과립에서 주요 퍼옥시다제 효소이며, 차아염소산 및 다른 반응성 산소 종의 형성을 통해 염증성 폐 손상 뿐만 아니라 많은 폐 질환에서 호중구 세포외 트랩 (NET)의 원인이 된다. TRALI 폐 조직에서 MPO 활성이 검출될 수 있는지를 확인하기 위해, PIC1을 받은 동물 또는 비히클 대조군 동물의 조직 균질액으로부터의 세포외 MPO를 항체 포획 방법론에 의해 단리한 후, 과산화수소의 존재 하에 앰플렉스 레드를 형광 레조루핀(Resorufin)으로 MPO-매개 산화시켰다. 25초마다 0 내지 10분으로 형광을 판독하였다. 비히클을 받은 동물과 비교하여, PIC1-처리 동물은 5분 (p = 0.005) 및 10분 (p= 0.002)에서 MPO 활성 수준이 유의하게 감소하였다 (도 12b).
일시적 백혈구감소증은 폐 조직의 호중구 분리로부터 초래될 수 있으며 TRALI의 동물 모델 뿐만 아니라 TRALI를 가진 환자에서도 관찰되었다. 도 10의 데이터를 또한 참조한다. 비히클 대 PIC1-처리 동물의 면역 세포의 순환 수준을 확인하기 위해, 안락사 전에 혈액을 회수하였다. 비히클을 받은 동물과 비교하여, PIC1-처리 동물은 백혈구 (p = 0.043) 및 림프구 (p = 0.048)의 혈중 수준에서 유의한 증가를 나타냈다 (도 13a 및 13b). 게다가, 순환 호중구 및 단핵구는 또한 비히클을 받은 동물과 비교하여 PIC1-처리 동물의 혈류 중 수의 증가 경향을 나타냈으나, 통계적 유의성 (호중구, p = 0.101; 단핵구, p = 0.229)에 도달하지 못하였다 (각각 도 13c 및 13d).
실시예 5
이 실시예는 PIC1이 순환에서 호중구 세포외 트랩 (NET) 바이오마커의 수준을 감소시킨다는 것을 제시한다. TRALI의 뮤린 모델에서, 활성화된 호중구는 급성 폐 손상의 원인이 되는 NET를 방출할 수 있으며, NET 바이오마커 유리 DNA는 TRALI 환자의 혈액에서 상승된다. PIC1이 순환에서 유리 DNA의 수준에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, PIC1 또는 비히클을 받은 동물로부터 혈장 중 DNA 수준을 피코그린 검정으로 정량화하였다. 비히클을 받은 동물과 비교하여, PIC1-처리 동물로부터 단리된 혈장 중 유리 DNA의 수준은 유의하게 감소되었다 (p = 0.02) (도 14). 종합하면, 조직학, 폐 조직에서 MPO 활성의 감소, 백혈구감소증의 결여 및 순환에서 유리 DNA의 감소에 의해 평가된 바와 같이 호중구-매개 폐 손상의 감소는 PIC1이 이 신규한 TRALI 동물 모델에서 면역 세포-매개 급성 폐 손상을 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 6
이 실시예는 PA-dPEG24가 생체내에서 MPO 활성 및 NET 형성을 억제할 수 있는 정도를 시험하기 위한 실험을 기재한다. 복강내 (IP) 주사된 정제된 MPO를 이용하여 래트에서의 염증성 복막염 모델을 개발하였다.
인간 호중구 MPO (리 바이오솔루션즈)를 멸균 염수에 각각의 실험에 필요한 각각의 용량으로 희석하였다. PA-dPEG24 (폴리펩티드 그룹) 형태의 PIC1을 가용화하고 0.5 M 히스티딘 완충제에 희석하고, pH 6.5로 조정한 다음에, 각각의 실험에 사용된 각각의 용량 각각으로 희석하였다.
위스타 래트를 이스턴 버지니아 메디컬 스쿨 IRB 승인 프로토콜 (#17-008) 하에 따라 수행된 실험에서 진정시키고 정제된 MPO로 IP 주사하였다. 이들 실험에서 대략 200 g 중량의 16주령 수컷 위스타 래트를 사용하였다. 래트는 모든 절차 전에 케타민 및 아세프로마진으로 진정제 투여를 받았다. 그 다음에 이들은 염수에 MPO로 1 ml IP 주사를 받았다. 명시된 시간 간격 후, 꼬리 정맥 정맥절개술을 수행하여 K2EDTA 마이크로테이너 (BD)에서 250 mcl의 혈액을 수득하였다. 이어서 동물을 페이탈플러스(FatalPlus) IV로 안락사시켰다. 이어서, 20 ml의 빙냉 PBS로 복막 세척을 IV 주사에 의해 수행한 후 마사지하고 무딘 바늘 및 주사기로 복막의 작은 구멍으로부터 추출을 수행하였다.
세포를 침강시키고 상청액을 TMB의 MPO 과산화에 대해 시험하였으며, 여기서 샘플 처리를 다음과 같이 수행하였다. 복막 세척액을 1500×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 및 다른 잔해물을 침강시켰다. 생성된 복막 세척 상청액을 분취하고 추가 분석을 위해 동결시켰다. 세포 펠렛을 염수로 원래의 부피로 재현탁시키고 세포를 혈구계에서 계수하였다. 라벤더 상부 혈액 수집 튜브의 원심분리 후 혈장을 수집하였다.
MPO 활성 검정을 다음과 같이 수행하였다. 표준 곡선에 대한 순수한 MPO와 함께 복막액을 96 웰 플레이트에서 0.1 ml로 연속 적정한 후 0.1 ml의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) (피셔)을 첨가하였다. 1분 후, 0.1 ml의 2.5 M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 표준 곡선으로부터 선형 회귀를 사용하여, MPO 활성을 각각의 샘플에 대해 계산하였다.
MPO-매개 복막염 용량-반응 실험을 다음과 같이 수행하였다. MPO-매개 퍼옥시다제 활성 및 NET 형성을 입증하는 정제된 MPO의 용량을 결정하기 위해 용량 반응 파일럿 실험을 수행하였다. 정제된 MPO를 0.01, 0.03 및 0.1 mg의 용량으로 래트에 IP 주사하였다. 1시간 후, 래트를 안락사시키고, 복막 세척을 수행하였다. 결과는 도 17에 제시되어 있다. MPO 용량이 0.1 mg으로 증가함에 따라, TMB-기반 검정에 의해 측정된 복막 세척액에서 퍼옥시다제 활성의 증가 경향 (P = 0.12)이 입증되었다.
복막 세척 상청액에서, 유리 DNA를 피코그린 검정을 통해 네토시스의 마커로서 측정하였다. 표준 곡선에 대한 DNA (인비트로겐)와 함께, 복막액 또는 혈장을 96 웰 플레이트에서 0.1 ml로 연속 적정하고 콴트(Quant)-iT 피코그린 (피셔) 검정에서 사용하였다. 키트 사용설명서에 의해 지시된 바와 같이 피코그린 용액을 희석하고 샘플에 첨가하고, 이를 10분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션한 다음에 여기 480 nm / 방출 520 nm에서 형광성 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다). 표준 곡선으로부터 선형 회귀를 사용하여, DNA 농도를 각각의 샘플에 대해 정량화하였다.
결과는 도 18에 제시되어 있다. 유리 DNA 증가 경향은 용량이 0.1 mg MPO 용량으로 증가함에 따라 주목되었다 (P = 0.19). 이들 실험의 결과는 최고 용량의 MPO, 즉 0.1 mg이 시험된 더 낮은 용량보다 더 많은 활성을 나타낼 가능성이 더 큰 용량-반응 관계를 시사하였다.
요약하면, 래트에 IP 주사된 MPO는 복막에서의 증가된 과산화 활성을 초래하였으며 (도 17) 유리 DNA를 증가시켰는데 이는 네토시스를 시사한다 (도 18).
이어서 MPO-매개 복막염 시간 경과 실험을 수행하였다. 이 모델에서 복막의 정제된 MPO에 대한 최적의 체류 시간을 평가하기 위해 시간 경과 실험을 수행하였다. MPO를 더 높은 0.1 mg 용량으로 IP 투여하였고, 복막 세척은 안락사 후 MPO 주사 후 1, 2 및 4시간에 수행하였다. 도 19에 제시된 바와 같이, MPO 퍼옥시다제 활성의 10배 증가는 주사 후 2시간에 (P = 0.005), 4시간 째에 추가 증가 없이 입증되었다. 유리 DNA의 8배 증가는 도 20에 제시된 바와 같이, 주사 후 2시간에 입증되었다 (P = 0.03). 이들 결과는 IP 주사된 정제된 MPO가 주사 후 2시간에 복막 세척액에서 퍼옥시다제 활성 및 네토시스를 증가시켰음을 시사하였다.
MPO-매개 복막염에서 MPO 및 네토시스의 억제에 대한 PIC1, 특히 PA-dPEG24의 효과를 검정하였다. 일련의 증가하는 용량의 PA-dPEG24 (1 mg, 5 mg, 및 20 mg)를 즉시, 즉, 정제된 MPO를 접종한 지 1분 후에 복강내로 IP 주사한 후 2시간 후에 정맥절개술, 안락사 및 복막 세척을 행하였다. PA-dPEG24가 투여되지 않은 대조군을 사용하였다. 상기 논의된 방법에 따른 MPO 활성 검정 및 유리 DNA 검정은 0 mg, 1 mg, 5 mg 및 20 mg PA-dPEG24 용량 각각에 대해 수행하였다.
MPO 활성 검정의 결과를 도 21에 제시되어 있고 유리 DNA 검정 (복막 세척 상청액 유리 DNA에서)에 대한 결과는 도 22에 제시되어 있다. 이 모델에서 IP 주사된 PIC1은 복막에서의 감소된 과산화 활성을 나타냈고 (도 21) 네토시스 감소 경향을 나타냈다 (도 22). 특히, 20 mg 용량 (100 mg/kg)의 PA-dPEG24는 MPO 주사 후 PA-dPEG24가없는 것과 비교하여 TMB에 의한 퍼옥시다제 활성의 5배 감소 (P = 0.015)를 입증하였다. 5 mg (25 mg/kg) 및 1 mg (5 mg/kg)의 PA-dPEG24 용량에 대해 MPO 활성의 통계적으로 유의한 감소 (P < 0.019)가 또한 입증되었다. PA-dPEG24가 없는 것과 비교하여, 20 mg (100 mg/kg) 용량의 PA-dPEG24에 대해 복막액 (P = 0.11)에서 유리 DNA 감소 경향이 주목되었다.
유리 DNA는 또한 혈장에서 측정되었으며, 그 결과는 도 23에 제시되어 있다. MPO 주사 후 PIC1이 없는 경우와 비교하여, 최고 용량의 PA-dPEG24를 사용한 경우 유리 DNA가 최저인 유사한 경향 (P = 0.22)이 밝혀졌다. 이들 결과는 PA-dPEG24가 이 정제된 MPO 복막염 모델에서 생체내에서 MPO-매개 퍼옥시다제 활성을 감소시킬 수 있음을 입증한다. 결과는 또한 PA-dPEG24가 생체내에서 MPO-매개 네토시스를 감소시키는 것이 가능할 수 있음을 시사한다.
참고문헌
본원에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함한 모든 참고문헌은 마치 각각의 참고문헌이 본원에 개별적으로 그리고 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 명시되고 그 전문이 제시된 것과 같이 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
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- PIC1 펩티드의 치료 유효량을 포함하는, 대상체에서 폐 손상, 폐 조직으로의 호중구 침습 및 폐 조직에서의 MPO 활성 중 하나 이상을 억제하기 위한 제약 조성물로서,
상기 PIC1 펩티드는 IALILEPICCQERAA-dPEG24 (서열식별번호: 19)의 서열을 포함하고,
상기 PIC1 펩티드는 5 내지 160 mg/kg 대상체 체중의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물. - 제1항에 있어서, 대상체에서 염증을 억제하는데 효과적인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 대상체에서 염증성 조직 손상을 억제하는데 효과적인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 대상체에서 정상 폐 구조를 보존하는데 효과적인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 폐 손상, 폐 조직으로의 호중구 침습 및 폐 조직에서의 MPO 활성 중 둘 이상을 억제하는데 효과적인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 대상체에서 보체 시스템의 면역 복합체 활성화를 조정하는데 효과적인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, PIC1 펩티드가 5 내지 100 mg/kg 대상체 체중의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, PIC1 펩티드가 정맥내로 투여되는 것인 제약 조성물.
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