CN112505196A - 一种人血浆中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法 - Google Patents

一种人血浆中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2‑单硝酸异山梨酯和5‑单硝酸异山梨酯的定量分析方法。本发明通过液液萃取的方法处理血浆，采用超高效液相‑质谱联用技术(UPLC‑MS/MS)对血浆中的硝酸异山梨酯及其代谢物2‑单硝酸异山梨酯和5‑单硝酸异山梨酯浓度进行同时测定，包括以下步骤：(1)标准工作溶液的配制；(2)样品处理；(3)标准曲线制作；(4)定量分析。本发明选择性好，灵敏度高，准确度和精密度好，可直接应用于硝酸异山梨酯口服制剂的药代动力学研究和生物等效性研究。

Description

一种人血浆中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸 异山梨酯的定量分析方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，更具体地，涉及一种应用液质联用技术(UPLC-MS/MS)测定人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法。
背景技术
心绞痛是由于心肌暂时性缺血而引起的以胸痛为主要临床表现的综合征，是冠心病最常见的临床表现，也是老年人心血管系统最常见的疾病。硝酸异山梨酯是一种较新型的治疗心绞痛的有效药物，具有作用迅速、吸收完全、作用持久等特点。目前已有大量研究证实，硝酸异山梨酯对于改善心肌缺血，降低心率，减少和预防心绞痛有较好的作用。与传统抗心绞痛药物硝酸甘油不同，硝酸异山梨酯片可以直接通过口服，无肝脏首过效应，生物利用度近100％，药物半衰期较长，而不良反应较低，因此适合老年人和肝肾功能较差患者应用。
美国FDA于2015年3月发布硝酸异山梨酯的生物等效性研究的指南草案，草案中明确指出对于硝酸异山梨酯的生物等效性研究，需要同时测定血浆中的硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯。由于硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯的血浆含量极低，对方法的检出灵敏度要求高；2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯为同分异构体，且血浆基质干扰成分多，对方法的分离度和选择性要求高，这些因素使得同时测定三者的药动学曲线难度很大。
现有文献报道的大多都是采用气相色谱法，检测限高且重现性差。用HPLC-MS/MS方法同时检出三种化合物的未见报道，涉及其中两种物质检测方法的相关文献如下：
文献1报道了一种通过LC-MS/MS的方法同时定量检出人血浆中硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯(Kim H,Lee J Y,Song K S,et al.Simultaneous Separation andDetermination of Isosorbide Dinitrate and Isosorbide 5-Mononitrate in HumanPlasma by LC–MS–MS[J].Chromatographia,2010,71：595-602)。该方法采用液液萃取技术对样品进行处理，萃取剂为乙酸乙酯，复溶剂为甲醇与水，对硝酸异山梨酯的最低定量检出限为5ng/ml，对5-单硝酸异山梨酯的最低定量检出限为20ng/ml。但是该文献存在以下不足：①萃取剂仅为乙酸乙酯，存在用量大和萃取效率低的缺陷；②由于2-单硝酸异山梨酯为次要的代谢产物，其含量比5-单硝酸异山梨酯的含量还要少，依照该方法对5-单硝酸异山梨酯的最低定量检出限判定，可能无法检出2-单硝酸异山梨酯，亦表明该方法存在无法同时检出三种化合物的技术难题。
文献2报道了用LC-ESI-MS/MS方法同时定量检出人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯(Bhavesh D，PatelNageswararao，Pulakundam,AjitR，et al.Developmentand validation of a chiral LC-ESI-MS/MS method for simultaneous determinationof the enantiomeric metabolites isosorbide 2-mononitrate and isosorbide 5-mononitrate of isosorbide dinitrate in rat and human plasma[J].Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis,2019,174：396-405)。该方法是利用手性柱将两种同分异构体分离，同时结合蛋白质沉淀提取技术处理样品，实现2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量检出。但是该方法存在以下不足：①检出限高，对于两种代谢产物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的最低定量检出限分别为25ng/ml和12.4ng/ml，考虑到硝酸异山梨酯因代谢后在血浆中的含量极微，所以该方法存在不能同时检测出三种化合物的风险；②该方法对于含量小于25ng/ml或者12ng/ml的代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯是无法检出的，灵敏度偏低。
综上所述，如何提供一种选择性好、灵敏度高的检测方法，可同时定量检出人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯，且对每一个物质的定量检出限低，是本领域技术人员还未解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供了一种人血浆中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，可同时定量检出人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯，且对每一个物质的定量检出限低。
为解决上述技术问题，本发明采取了以下技术方案：
一种人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，包括如下步骤：
(1)标准工作液配制
标准曲线储备液：分别称取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯对照品，加入甲醇，均配制成浓度为100.0～200.0μg/mL的标准曲线储备液；
标准曲线工作液：分别取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯标准曲线储备液，加入甲醇，获得梯度浓度为15.00～1200ng/mL、90.00～2400ng/mL、60.00～9000ng/mL的标准曲线工作液；
混合标准曲线工作液：分别取硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯相同梯度水平、相同体积的标准曲线工作液混合，获得梯度浓度的混合标准曲线工作液，其梯度浓度分别为5.000～400.0ng/mL，30.00～800.0ng/mL和20.00～3000ng/mL；
质控储备液：分别称取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯对照品，加入甲醇，均配制成浓度为100.0～200.0μg/mL的质控储备液；
质控工作液：分别取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯质控储备液，加入甲醇，获得质控工作液，其梯度浓度分别为15.00～960.0ng/mL，90～1800ng/mL，60.00～7200ng/mL；
混合质控工作液：分别取硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯相同梯度水平、相同体积的质控工作液混合，获得梯度浓度的混合质控工作液，其梯度浓度分别为5.000～320.0ng/mL，30.00～600.0ng/mL和20.00～2400ng/mL；
内标储备液：分别取整瓶的硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6，加入甲醇，配制成内标储备液，其浓度分别为120.7μg/mL，64.12μg/mL，98.73μg/mL；
混合内标工作液：取不同体积的硝酸异山梨酯-13C6内标储备液，2-单硝酸异山梨酯-13C6与5-单硝酸异山梨酯-13C6内标储备液混匀，再加入甲醇，获得混合内标工作液，浓度分别为80.00g/mL，200.0g/mL和600.0ng/mL；
所有储备液及工作液在-20℃下保存，备用；
(2)样品处理
空白血浆：将不少于6个健康人的空腹采集的血浆混匀，配制混合健康人正常血浆；
标准曲线样品：在冰浴中，向三组空白血浆中分别加入硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的混合标准曲线工作液，涡旋混匀，配制成相应梯度浓度的标准曲线样品；硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的梯度浓度分别为0.250～20.00ng/mL，1.500～40.0ng/mL和1.000～150.0ng/mL；
质控样品：在冰浴中，向三组空白血浆中分别加入硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的混合质控工作液，涡旋混匀，配制成相应梯度浓度的质控样品；硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的梯度浓度分别为0.7500～16.00ng/mL，4.000～30.00ng/mL和3.000～120.0ng/mL；
处理过程：在冰浴中，取等体积的标准曲线样品、质控样品和空白血浆，分别加入三种混合内标工作液，涡旋混匀，再加入无机盐溶液和乙酸乙酯，涡旋、离心后，转移上清液，氮气吹干；加入复溶剂复溶，涡旋、离心，取上清液进样UPLC-MS/MS分析；
无机盐溶液选自氯化钠溶液、磷酸钾溶液中的一种；
(3)标准曲线制作
将步骤(2)得到标准曲线样品上清液进行UPLC-MS/MS分析，以硝酸异山梨酯与硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰面积比为纵坐标，以硝酸异山梨酯与硝酸异山梨酯-13C6的浓度比为横坐标，制作硝酸异山梨酯的标准曲线；以2-单硝酸异山梨酯与2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰面积比为纵坐标，以2-单硝酸异山梨酯与2-单硝酸异山梨酯-13C6的浓度比为横坐标，制作2-单硝酸异山梨酯的标准曲线；以5-单硝酸异山梨酯与5-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰面积比为纵坐标，5-单硝酸异山梨酯与5-单硝酸异山梨酯-13C6的浓度比为横坐标，制作5-单硝酸异山梨酯的标准曲线；
(4)定量分析
从冰箱中取冷冻待测血浆样品，冰浴融化，按照步骤(2)的处理过程处理和检测，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测血浆样品中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的浓度。
在一种优选的技术方案中，步骤(2)中的标准曲线样品为新鲜配制，且硝酸异山梨酯的标准曲线样品梯度浓度为0.2500、0.5000、1.000、3.000、6.000、10.00、20.00ng/mL；2-单硝酸异山梨酯标准曲线样品梯度浓度为1.500、3.000、6.000、10.00、15.00、25.00、40.00ng/mL；5-单硝酸异山梨酯标准曲线样品梯度浓度为1.000、2.000、8.000、20.00、40.00、80.00、150.0ng/mL。
在一种优选的技术方案中，步骤(2)中的质控样品为新鲜配制，且硝酸异山梨酯梯度浓度分别为0.2500、0.7500、2.000、8.000、16.00ng/mL；2-单硝酸异山梨酯梯度浓度为1.500、4.00、8.000、20.00、30.00ng/mL；5-单硝酸异山梨酯梯度浓度为1.000、3.000、30.00、60.00、120.00ng/mL。
在一种优选的技术方案中，步骤(2)中的无机盐溶液为5mMPH10氯化钠溶液。
在一种优选的技术方案中，步骤(2)中涡旋时间为3min，5000rpm离心5min。
在一种优选的技术方案中，步骤(2)中的上清液在40℃氮气吹干，复溶剂为乙酸铵水溶液或甲醇，优选为0.5mM的乙酸铵水溶液。
在一种优选的技术方案中，步骤(2)的UPLC-MS/MS工作条件为：
a.色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相A：0.1～5.0mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；柱温箱温度：40℃；流速：0.400mL/min；梯度洗脱方式：起始平衡流动相为A相，在0.2min内，流动相B比例的迅速提到30％-70％，在0.2-0.3min范围内流动相B比例的迅速降为0％；
b.质谱条件：离子源为ESI源，多反应监测MRM，离子化模式：负离子模式；电喷雾电压为-4500V；涡旋离子喷雾温度：400℃；气帘气：35psi；碰撞气：6psi；雾化气Gas1：55psi；辅助气Gas2：50psi；数据收集时间10.0min。
在一种优选的技术方案中，所述色谱条件中流动相A为0.5mM乙酸铵水溶液。
在一种优选的技术方案中，色谱条件还包括：色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.8μm；进样体积20μL，进样器温度4.0℃。
在一种优选的技术方案中，在步骤(2)UPLC-MS/MS测定过程中硝酸异山梨酯的监测离子对为295.0/59.0，去簇电压-55.00V，碰撞能量-35.00V；2-单硝酸异山梨酯的监测离子对为250.1/59.0，去簇电压-54.00V，碰撞能量-45.00V；5-单硝酸异山梨酯的监测离子对为250.0/59.0，去簇电压-50.00V，碰撞能量-45.00V；硝酸异山梨酯-13C6的监测离子对为301.0/59.1，去簇电压-78.00V，碰撞能量-43.00V；2-单硝酸异山梨酯-13C6的监测离子对为256.2/59.1，去簇电压-54.00V，碰撞能量-22.00V；5-单硝酸异山梨酯-13C6的监测离子对为256.1/59.1，去簇电压-45.00V，碰撞能量-49.00V。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用特定的萃取剂及复溶剂处理人血浆样品(萃取剂选用无机盐溶液和乙酸乙酯，无机盐溶液选用特定浓度、特定pH的氯化钠溶液，即为5mMPH10氯化钠溶液)，使三种化合物的峰面积均可达到定量要求，且色谱峰形和效果较好。从而证明采用本发明中特定的萃取剂和复溶剂，在达到定量检测的前提下，能降低血浆和有机溶剂使用量，提高萃取效率；
(2)本发明采用特定的色谱条件：①选用特定柱长的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(柱长100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.8μm)，可以使该方法在最短的时间内定量分析出三种化合物；②选用特定的梯度洗脱条件，其中洗脱流动相A为0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B为甲醇；流速：0.400mL/min；起始平衡流动相为A相，在0.2min内，流动相B比例的迅速提到30％-70％，在0.2-0.3min范围内流动相B比例的迅速降为0％，可以很好的将两种同分异构体的代谢物(2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯)分离，达到定量分析的要求。
结合(1)和(2)，在本发明中，只有采用萃取剂为5mMPH10氯化钠溶液和乙酸乙酯的液液萃取方法处理人血浆样品，同时色谱条件中选用柱长为100mm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱及特定的梯度洗脱条件(洗脱流动相A为0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B为甲醇；流速：0.400mL/min；起始平衡流动相为A相，在0.2min内，流动相B比例的迅速提到30％-70％，在0.2-0.3min范围内流动相B比例的迅速降为0％；)才能使得本方法对硝酸异山梨酯的检测定量下限为0.2500ng/mL；2-单硝酸异山梨酯的检测定量下限为1.500ng/mL；5-单硝酸异山梨酯的检测定量下限为1.000ng/mL。
综上所述，本发明能够满足人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的含量检测要求，可直接应用于硝酸异山梨酯口服制剂的药代动力学研究和生物等效性研究。本发明的检测方法选择性好，灵敏度高，批内和批间的准确度和精密度均良好。
附图说明
图1为实施例1中人血浆中硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱；5-单硝酸异山梨酯(上)，2-单硝酸异山梨酯(中)，硝酸异山梨酯(下)。
图2为实施例1中人血浆中硝酸异山梨酯的定量分析方法代表性的标准曲线范围及图谱。
图3为实施例1中为人血浆中2-单硝酸异山梨酯的定量分析方法代表性的标准曲线范围及图谱。
图4为实施例1中为人血浆中5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法代表性的标准曲线范围及图谱。
图5为对比例1中方案1的人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱；内标样品(上)；待测样品(下)。
图6为对比例1中方案2的人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱；内标样品(上)；待测样品(下)。
图7为对比例1中方案3的人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱；内标样品(上)；待测样品(下)。
图8为对比例2中选用50mm色谱柱时人血浆中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱；硝酸异山梨酯(上)，5-单硝酸异山梨酯(中)，2-单硝酸异山梨酯(下)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：人血浆中硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析
一、主要仪器
AB公司Exion AD-SCIEX Triple QuadTM 5500的超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪。
二、液质条件
2.1色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.8μm。流动相A：0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；柱温箱温度：40℃；流速：0.400mL/min；洗脱方式为梯度洗脱，见表1。
表1.UPLC-MS/MS色谱洗脱梯度
Time(min) A(％) B(％) 流速(mL/min)
0.00 100.0 0.0 0.400
0.05 40.0 60.0 0.400
0.20 40.0 60.0 0.400
0.21 100.0 0.0 0.400
2.70 60.0 40.0 0.400
3.20 42.0 58.0 0.400
3.30 80.0 20.0 0.400
4.70 80.0 20.0 0.400
7.20 25.0 85.0 0.400
8.20 25.0 85.0 0.400
8.30 100.0 0.0 0.400
10.0 100.0 0.0 0.400
2.2质谱条件
应用SCIEX TRPLE QUADTM 5500质谱系统，采用负离子MRM模式扫描检测，质谱参数见表2，MRM参数见表3。
表2.UPLC-MS/MS质谱条件
离子源 Turbo Spray
离子模式 Negative
多重反应监测模式 MRM
Curtain Gas(CUR) 35psi
Collision Gas(CAD) 6psi
Ion Spray Voltage(IS) -4500V
Temperatμre(TEM) 400℃
Ion Soμrce Gas1 55psi
Ion Soμrce Gas2 50psi
Synchronization Mode LC Sync
表3.MRM参数
Figure BDA0002862592300000081
三、试验过程
3.1、标准工作液配制
3.1.1标准曲线储备液及混合工作液的配制
称取硝酸异山梨酯6.859mg，加入甲醇，配制成浓度为137.0μg/mL的硝酸异山梨酯标准曲线储备液；称取2-单硝酸异山梨酯7.174mg，加入甲醇，配制成浓度为103.6μg/mL的2-单硝酸异山梨酯标准曲线储备液；称取5-单硝酸异山梨酯5.304mg，加入甲醇，配制成浓度为106.1μg/mL的5-单硝酸异山梨酯标准曲线储备液。
将上述储备液，分别加入适量甲醇，获得梯度浓度的工作液：硝酸异山梨酯标准曲线工作溶液的梯度浓度为15.00、30.00、60.00、180.0、360.0、600.0、1200ng/mL；2-单硝酸异山梨酯工作溶液的梯度浓度为90.00、180.0、360.0、600.0、900.0、1500、2400ng/mL；5-单硝酸异山梨酯工作溶液的梯度浓度为60.00、120.0、480.0、1200、2400、4800、9000ng/mL。
相同梯度水平的标准曲线工作液各取3mL,混匀，获得混合标准曲线工作液：硝酸异山梨酯梯度浓度为5.000、10.00、20.00、60.00、120.0、200.0、400.0ng/mL；2-单硝酸异山梨酯梯度浓度为30.00、60.00、120.0、200.0、300.0、500.0、800.0ng/mL；5-单硝酸异山梨酯梯度浓度为20.00、40.00、160.0、400.0、800.0、1600、3000ng/mL。
3.1.2质控储备液及混合工作液的配制
称取硝酸异山梨酯6.732mg，加入甲醇，配制成浓度为134.5μg/mL的硝酸异山梨酯质控储备液；称取2-单硝酸异山梨酯7.245mg，加入甲醇，配制成浓度为104.6μg/mL的2-单硝酸异山梨酯质控储备液；称取5-单硝酸异山梨酯5.381mg，加入甲醇，配制成浓度为107.6μg/mL的5-单硝酸异山梨酯质控储备液。
将上述质控储备液，分别加入适量甲醇，获得梯度浓度质控工作液：硝酸异山梨酯质控工作溶液的梯度浓度分别为15.00、45.00、120.0、480.0、960.0ng/mL；2-单硝酸异山梨酯工作溶液的梯度浓度为90.00、240.0、480.0、1200、1800ng/mL；5-单硝酸异山梨酯工作溶液的梯度浓度为60.00、180.00、1800、3600、7200ng/mL。
相同梯度的质控工作液各取3mL,混匀得混合质控工作液：硝酸异山梨酯梯度浓度分别为5.000、15.00、40.00、160.0、320.0ng/mL；2-单硝酸异山梨酯梯度浓度为30.00、80.00、160.0、400.0、600.0ng/mL；5-单硝酸异山梨酯梯度浓度为20.00、60.00、600.0、1200、3200ng/mL。
3.1.3内标储备液及混合工作液的配制
分别取整瓶的硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6，加入甲醇，配制成内标储备液，其浓度分别为120.7μg/mL，64.12μg/mL，98.73μg/mL；
取不同体积的硝酸异山梨酯-13C6内标储备液，2-单硝酸异山梨酯-13C6与5-单硝酸异山梨酯-13C6内标储备液混匀，再加入适量甲醇，获得混合内标工作溶液，浓度分别为80.00，200.0和600.0ng/mL。
所有储备液及工作溶液在-20℃下保存，备用。
3.2血浆样品的处理
将血浆样品从冰箱中取出，在冰浴中融化，每个小管中的样品分别涡旋1min混匀；
3.2.1标准曲线样品
预先标记好的5.0mL聚丙烯离心管加入285μL空白血浆和15μL的混合标准曲线工作液，涡旋1min混匀，既得标准曲线样品：硝酸异山梨酯的标准曲线样品梯度浓度为0.2500、0.5000、1.000、3.000、6.000、10.00、20.00；2-单硝酸异山梨酯标准曲线样品梯度浓度为1.500、3.000、6.000、10.00、15.00、25.00、40.00ng/mL；5-单硝酸异山梨酯标准曲线样品梯度浓度为1.000、2.000、8.000、20.00、40.00、80.00、150.0ng/mL。
3.2.2质控样品
预先标记好的5.0mL聚丙烯离心管加入285μL空白血浆和15μL的质控混合工作液，涡旋1min混匀，既得质控样品：硝酸异山梨酯LLOQQC、LQC、GMQC、MQC和HQC质控浓度分别为0.2500、0.7500、2.000、8.000、16.00ng/mL；2-单硝酸异山梨酯LLOQQC、LQC、GMQC、MQC和HQC质控浓度分别为1.500、4.000、8.000、20.00、30.00ng/mL；5-单硝酸异山梨酯LLOQQC、LQC、GMQC、MQC和HQC质控浓度分别为1.000、3.000、30.00、60.00、120.0ng/mL。
3.2.3待测样品
从冰箱中取冷冻待测血浆样品，冰浴融化。预先标记好的5.0mL聚丙烯离心管加入300μL待测样品血浆。
3.2.4样品处理
上述每个样品加入30μL混合内标工作液，30μL 5mMPH10氯化钠溶液，涡旋1min，再加入2100μL乙酸乙酯，涡旋3min，在4℃离心机中以5000rpm离心5min，转移1500μL至深孔96孔板，萃取液在40℃氮气吹干；再加入100μL0.5mM的乙酸铵水溶液，将96孔板封膜后，涡旋1min，4℃下，4000rpm离心5min，进样20μl进行UPLC-MS/MS检测分析。
处理后的样品在4℃自动进样器进样(暂存4℃的冰箱)。
3.3、标准曲线
应用Analyst 1.6.3(Sciex)软件进行色谱图采集和色谱峰积分。标准样品的化合物和内标的色谱峰面积比为纵坐标，化合物和内标的浓度比为横坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行线性回归，所得的回归方程(y＝ax+b)即为标准曲线。
硝酸异山梨酯的代表性标准曲线为：y＝1.49x+0.0247(r＝0.9993)，表明在0.250～20.00ng/mL范围内线性关系良好；
2-单硝酸异山梨酯的代表性标准曲线为：y＝0.369x+0.000936(r＝0.9998)，表明在1.500～40.00ng/mL范围内线性关系良好；
5-单硝酸异山梨酯的代表性标准曲线为：y＝1.03x+0.00127(r＝0.9995)，表明在1.000～150.0ng/mL范围内线性关系良好。
3.4、定量分析
应用Analyst 1.6.3(Sciex)软件，按步骤3.3所得的标准曲线方程计算，得到待测血浆样品中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的浓度。
四、试验结果比较
人血浆中硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的代表性的MRM图谱见图1：5-单硝酸异山梨酯的保留时间为2.90min(上)；2-单硝酸异山梨酯的保留时间为2.67min(中)；硝酸异山梨酯的保留时间为6.81min(下)；可见，人血浆中硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯分离度均符合要求；
人血浆中硝酸异山梨酯的定量分析方法代表性的标准曲线范围及图谱见图2，硝酸异山梨酯在0.250～20.00ng/mL范围内线性关系良好；
人血浆中2-单硝酸异山梨酯的定量分析方法代表性的标准曲线范围及图谱见图3，2-单硝酸异山梨酯在1.500～40.00ng/mL范围内线性关系良好；
人血浆中5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法代表性的标准曲线范围及图谱见图4，5-单硝酸异山梨酯在1.000～150.0ng/mL范围内线性关系良好。
实施例2：准确度和精密度的评估
本实施例对实施例1中测定人血浆硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯浓度的准确度和精密度进行评价。
一、采用实施例1中的混合标准曲线工作液和混合质控工作液。
二、采用实施例1中的血浆样品处理方法处理标准曲线样品和质控样品。
三、采用实施例1中的血浆样品处理方法处理LLOQQC、LQC、GMQC、MQC和HQC样品，每个浓度水平6个重复的，评估批内精密度和准确度。通过3个分析批，至少在两天内进行，评估批间的精密度和准确度。硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯浓度的批内和批间精密度和准确度分别见表4，表5和表6。
表4.硝酸异山梨酯的批内、批间样品检测的精密度和准确度
Figure BDA0002862592300000111
Figure BDA0002862592300000121
Figure BDA0002862592300000131
Figure BDA0002862592300000141
Figure BDA0002862592300000151
表5.2-单硝酸异山梨酯的批内、批间样品检测的精密度和准确度
Figure BDA0002862592300000152
Figure BDA0002862592300000161
Figure BDA0002862592300000171
表6.5-单硝酸异山梨酯的批内、批间样品检测的精密度和准确度
Figure BDA0002862592300000172
Figure BDA0002862592300000181
Figure BDA0002862592300000191
结果表明，硝酸异山梨酯、2-单硝酸异、山梨酯和5-单硝酸异山梨酯血浆样品批内、批间精密度均符合要求。
实施例3：萃取剂的筛选
通过采用不同条件液液萃取方法对人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的萃取结果比较。为了降低血浆和有机溶剂使用量，降低工作量，提高萃取效率，我们对萃取剂进行了如下筛选：
首先，筛选了乙酸乙酯、甲基叔丁基醚及乙酸乙酯+甲基叔丁基醚，发现用乙酸乙酯萃取的效率最佳；
进一步，为了更好的提高萃取率，考虑加入盐溶液来降低三种化合物在水相的溶解度。我们筛选了不同种类的无机盐溶液，主要包括氯化钠溶液，碳酸钠溶液，乙酸铵溶液，磷酸钾溶液等，发现只有磷酸钾溶液和氯化钠溶液对这三种化合物在定量限内有质谱响应，色谱峰形和效果相对较好，具体筛选步骤如下：
一、采用实施例1中的混合标准曲线工作液。
二、人血浆处理方法
预先标记好的5.0mL聚丙烯离心管加入285μL空白血浆和15μL的混合标准曲线工作液，涡旋1min混匀，制备STD1样品：硝酸异山梨酯STD1浓度为0.2500ng/mL；2-单硝酸异山梨酯STD1浓度为1.500ng/mL；5-单硝酸异山梨酯STD1浓度为1.000ng/mL。
方案1、上述每个样品加入30μL混合内标工作液，加入2100μL乙酸乙酯，涡旋3min。
方案2、上述每个样品加入30μL混合内标工作液，30μL5mMPH10氯化钠溶液，涡旋1min，再加入2100μL乙酸乙酯，涡旋3min。
方案3、上述每个样品加入30μL混合内标工作液，30μL 5mM磷酸钾溶液，涡旋1min，再加入2100μL乙酸乙酯，涡旋3min。
以上样品每份平行3份，在4℃离心机中以5000rpm离心5min，转移1500μL至深孔96孔板，萃取液在40℃氮气吹干；再加入100μL 0.5mM的乙酸铵水溶液，将96孔板封膜后，涡旋1min，4℃下，4000rpm离心5min，进样20μL进行UPLC-MS/MS检测分析。
三、实验结果比较
血浆不同处理条件下，硝酸异山梨酯的萃取结果见表7，2-单硝酸异山梨酯的萃取结果见表8，5-单硝酸异山梨酯的萃取结果见表9。
表7.实施例3三种方案的硝酸异山梨酯的萃取结果
Figure BDA0002862592300000201
Figure BDA0002862592300000211
表8.实施例3三种方案的2-单硝酸异山梨酯的萃取结果
Figure BDA0002862592300000212
表9.实施例3三种方案的5-单硝酸异山梨酯的萃取结果
Figure BDA0002862592300000213
在本方法的标准曲线定量限，以信噪比大于等于10要求计算，硝酸异山梨酯的响应峰面积至少为100000，2-单硝酸异山梨酯响应峰面积至少为20000，5-单硝酸异山梨酯响应峰面积至少为90000。由表7、表8和表9可知，当萃取剂选为乙酸乙酯、5mM磷酸钾溶液+乙酸乙酯时，萃取效率低，硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯的峰面积都达不到定量要求，相对而言，萃取剂选为5mMPH10氯化钠溶液+乙酸乙酯时，萃取效率最高，硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的峰面积都达到定量要求。
对比例1：不同液相条件对人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的分离度比较
由于2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯为同分异构体，且在筛选人血浆时发现血浆对硝酸异山梨酯和2-单硝酸异山梨酯有干扰，因此，我们对色谱条件进行了长时间优化。设定了如下的色谱条件进行比较，具体步骤如下：
一、采用实施例1中的混合标准曲线工作液。
二、采用实施例1中的血浆样品处理方法处理标准曲线第一个浓度样品。
三、色谱条件：色谱柱为ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱，色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.8μm。流动相A：0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；柱温箱温度：40℃；流速：0.400mL/min；不同的梯度洗脱。
方案1、色谱柱用A相先平衡10min，然后用下面梯度洗脱分析。
Time(min) A(％) B(％) 流速(mL/min)
0.00 100.0 0.0 0.400
2.70 80.0 20.0 0.400
4.70 60.0 40.0 0.400
7.20 25.0 85.0 0.400
8.20 25.0 85.0 0.400
8.30 100.0 0.0 0.400
10.0 100.0 0.0 0.400
方案2、色谱柱用A相先平衡10min，然后用下面梯度洗脱分析。
Figure BDA0002862592300000221
Figure BDA0002862592300000231
方案3、色谱柱用A相90％，B相10％平衡10min，然后用下面梯度洗脱分析。
Time(min) A(％) B(％) 流速(mL/min)
0.00 90.0 10.0 0.400
0.10 80.0 20.0 0.400
0.20 80.0 20.0 0.400
0.21 90.0 10.0 0.400
2.70 60.0 40.0 0.400
3.20 42.0 58.0 0.400
3.30 80.0 20.0 0.400
4.70 80.0 20.0 0.400
7.20 25.0 85.0 0.400
8.20 25.0 85.0 0.400
8.30 100.0 0.0 0.400
10.0 100.0 0.0 0.400
四、试验结果比较
方案1检测结果见图5，人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱，保留时间分别3.66min和3.94min(上，同位素内标位置)，待测样品中2-单硝酸异山梨酯与内源性干扰和5-单硝酸异山梨酯没有基线分离(下)；
方案2检测结果见图6，人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱，保留时间分别为2.97min和3.21min(上，同位素内标)，待测样品中2-单硝酸异山梨酯与内源性干扰没有基线分离(下)；
方案3检测结果见图7，人血浆中2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的MRM图谱，保留时间分别为3.05min和3.23min(上，同位素内标)，待测样品中2-单硝酸异山梨酯与内源性干扰没有分离(下)。
综合考虑方案1、方案2和方案3和实施例1的检测结果，确定实施例1中的色谱条件为本发明的最佳色谱条件。
对比例2：色谱柱长的筛选
本方法在早期开发探索性研究阶段，考察了色谱柱的长短对分离度的影响。又考虑到在色谱分离过程中，长柱比短柱有优势，但随着色谱柱长度增加，分离时间也要增大，对于UPLC-MS系统，高效短柱是优选；另外，在大量的生物样本分析检测中，如对生物等效研究的样品检测，分析周期也是要考虑的因素，要尽量节省时间，提高分析效率，所以我们未考察柱长为150mm对分离度的影响，主要考察了柱长为100mm和50mm同类型色谱柱对三种化合物分离度的影响。
柱长为100mm的色谱柱的检测结果见图1，人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的分离度及峰形都符合要求；而同类型50mm色谱柱的检测结果见图8，2-单硝酸异山梨酯与5-单硝酸异山梨酯的色谱峰几乎重叠，且基质对硝酸异山梨酯色谱峰有干扰，达不到生物样品定量分析的要求。
综上所述，确认柱长为100mm的色谱柱为本发明的最佳的色谱柱长。
以上结果表明，本发明采用液液萃取法处理人血浆样品，以稳定同位素标记化合物为内标，超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)在ESI负离子及多反应监测模式(MRM)下，检测人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的含量。本发明的检测方法选择性好，灵敏度高，硝酸异山梨酯在0.250～20.00ng/mL范围内线性关系良好；2-单硝酸异山梨酯在1.500～40.00ng/mL范围内线性关系良好；5-单硝酸异山梨酯在1.000～150.0ng/mL范围内线性关系良好，批内和批间的准确度和精密度均良好。本发明能够满足同时检测人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯含量要求，可直接应用于硝酸异山梨酯口服制剂的药代动力学研究和生物等效性研究。
以上对本发明的实施方式做了说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)标准工作液配制
标准曲线储备液：分别称取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯对照品，加入甲醇，均配制成浓度为100.0～200.0μg/mL的标准曲线储备液；
标准曲线工作液：分别取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯标准曲线储备液，加入甲醇，获得梯度浓度为15.00～1200ng/mL、90.00～2400ng/mL、60.00～9000ng/mL的标准曲线工作液；
混合标准曲线工作液：分别取硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯相同梯度水平、相同体积的标准曲线工作液混合，获得梯度浓度的混合标准曲线工作液，其梯度浓度分别为5.000～400.0ng/mL，30.00～800.0ng/mL和20.00～3000ng/mL；
质控储备液：分别称取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯对照品，加入甲醇，均配制成浓度为100.0～200.0μg/mL的质控储备液；
质控工作液：分别取硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯质控储备液，加入甲醇，获得质控工作液，其梯度浓度分别为15.00～960.0ng/mL，90～1800ng/mL，60.00～7200ng/mL；
混合质控工作液：分别取硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯相同梯度水平、相同体积的质控工作液混合，获得梯度浓度的混合质控工作液，其梯度浓度分别为5.000～320.0ng/mL，30.00～600.0ng/mL和20.00～2400ng/mL；
内标储备液：分别取整瓶的硝酸异山梨酯-13C6、2-单硝酸异山梨酯-13C6、5-单硝酸异山梨酯-13C6，加入甲醇，配制成内标储备液，其浓度分别为120.7μg/mL，64.12μg/mL，98.73μg/mL；
混合内标工作液：取不同体积的硝酸异山梨酯-13C6内标储备液，2-单硝酸异山梨酯-13C6与5-单硝酸异山梨酯-13C6内标储备液混匀，再加入甲醇，获得混合内标工作液，浓度分别为80.00g/mL，200.0g/mL和600.0ng/mL；
所有储备液及工作液在-20℃下保存，备用；
(2)样品处理
空白血浆：将不少于6个健康人的空腹采集的血浆混匀，配制混合健康人正常血浆；
标准曲线样品：在冰浴中，向三组空白血浆中分别加入硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的混合标准曲线工作液，涡旋混匀，配制成相应梯度浓度的标准曲线样品；硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的梯度浓度分别为0.250～20.00ng/mL，1.500～40.0ng/mL和1.000～150.0ng/mL；
质控样品：在冰浴中，向三组空白血浆中分别加入硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的混合质控工作液，涡旋混匀，配制成相应梯度浓度的质控样品；硝酸异山梨酯，2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的梯度浓度分别为0.7500～16.00ng/mL，4.000～30.00ng/mL和3.000～120.0ng/mL；
处理过程：在冰浴中，取等体积的标准曲线样品、质控样品和空白血浆，分别加入三种混合内标工作液，涡旋混匀，再加入无机盐溶液和乙酸乙酯，涡旋、离心后，转移上清液，氮气吹干；加入复溶剂复溶，涡旋、离心，取上清液进样UPLC-MS/MS分析；
所述无机盐溶液选自氯化钠溶液、磷酸钾溶液中的一种；
(3)标准曲线制作
将步骤(2)得到标准曲线样品上清液进行UPLC-MS/MS分析，以硝酸异山梨酯与硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰面积比为纵坐标，以硝酸异山梨酯与硝酸异山梨酯-13C6的浓度比为横坐标，制作硝酸异山梨酯的标准曲线；以2-单硝酸异山梨酯与2-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰面积比为纵坐标，以2-单硝酸异山梨酯与2-单硝酸异山梨酯-13C6的浓度比为横坐标，制作2-单硝酸异山梨酯的标准曲线；以5-单硝酸异山梨酯与5-单硝酸异山梨酯-13C6的色谱峰面积比为纵坐标，5-单硝酸异山梨酯与5-单硝酸异山梨酯-13C6的浓度比为横坐标，制作5-单硝酸异山梨酯的标准曲线；
(4)定量分析
从冰箱中取冷冻待测血浆样品，冰浴融化，按照步骤(2)的处理过程处理和检测，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测血浆样品中硝酸异山梨酯、2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的浓度。
2.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中的标准曲线样品为新鲜配制，且硝酸异山梨酯的标准曲线样品梯度浓度为0.2500、0.5000、1.000、3.000、6.000、10.00、20.00ng/mL；2-单硝酸异山梨酯标准曲线样品梯度浓度为1.500、3.000、6.000、10.00、15.00、25.00、40.00ng/mL；5-单硝酸异山梨酯标准曲线样品梯度浓度为1.000、2.000、8.000、20.00、40.00、80.00、150.0ng/mL。
3.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中的质控样品为新鲜配制，且硝酸异山梨酯梯度浓度分别为0.2500、0.7500、2.000、8.000、16.00ng/mL；2-单硝酸异山梨酯梯度浓度为1.500、4.00、8.000、20.00、30.00ng/mL；5-单硝酸异山梨酯梯度浓度为1.000、3.000、30.00、60.00、120.00ng/mL。
4.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中的无机盐溶液为5mMPH10氯化钠溶液。
5.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中涡旋时间为3min，5000rpm离心5min。
6.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)中的上清液在40℃氮气吹干，复溶剂为乙酸铵水溶液或甲醇，优选为0.5mM的乙酸铵水溶液。
7.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)的UPLC-MS/MS工作条件为：
a.色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相A：0.1～5.0mM乙酸铵水溶液；流动相B：甲醇；柱温箱温度：40℃；流速：0.400mL/min；梯度洗脱方式：起始平衡流动相为A相，在0.2min内，流动相B比例的迅速提到30％-70％，在0.2-0.3min范围内流动相B比例的迅速降为0％；
b.质谱条件：离子源为ESI源，多反应监测MRM，离子化模式：负离子模式；电喷雾电压为-4500V；涡旋离子喷雾温度：400℃；气帘气：35psi；碰撞气：6psi；雾化气Gas1：55psi；辅助气Gas 2：50psi；数据收集时间10.0min。
8.根据权利要求7所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，所述色谱条件中流动相A为0.5mM乙酸铵水溶液。
9.根据权利要求7所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，色谱条件还包括：色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为1.8μm；进样体积20μL，进样器温度4.0℃。
10.根据权利要求1所述的人血浆中硝酸异山梨酯及其代谢物2-单硝酸异山梨酯和5-单硝酸异山梨酯的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)UPLC-MS/MS测定过程中硝酸异山梨酯的监测离子对为295.0/59.0，去簇电压-55.00V，碰撞能量-35.00V；2-单硝酸异山梨酯的监测离子对为250.1/59.0，去簇电压-54.00V，碰撞能量-45.00V；5-单硝酸异山梨酯的监测离子对为250.0/59.0，去簇电压-50.00V，碰撞能量-45.00V；硝酸异山梨酯-13C6的监测离子对为301.0/59.1，去簇电压-78.00V，碰撞能量-43.00V；2-单硝酸异山梨酯-13C6的监测离子对为256.2/59.1，去簇电压-54.00V，碰撞能量-22.00V；5-单硝酸异山梨酯-13C6的监测离子对为256.1/59.1，去簇电压-45.00V，碰撞能量-49.00V。
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