CN112501313B - 荷斯坦奶牛泌乳性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物分子标记筛选领域，具体涉及荷斯坦奶牛泌乳性状相关的分子标记及其应用。所述分子标记由奶牛PDIA3基因测序后得到，筛选到5个与泌乳性状关联的SNP标记。利用单个SNP或其组合标记的单倍型对荷斯坦奶牛泌乳性状进行关联分析。5个SNP标记的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5所示。本发明还涉及PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5位点基因型的检测引物组合的开发和1个单倍型组合的应用。所述基因型中的两个SNP位点基因型分别与荷斯坦奶牛305d产奶量和乳蛋白量显著相关；单倍型组合与荷斯坦奶牛乳蛋白量显著相关。本发明可在奶牛标记辅助选择中应用。

Description

荷斯坦奶牛泌乳性状相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于动物分子标记筛选和辅助选择技术领域。具体涉及荷斯坦奶牛泌乳性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
研究表明，在单核苷酸多态SNP标记数据中加入目标性状的已知功能基因信息，可提高基因组育种值预测的准确性(Zhe Zhang et al,2014)。二硫键异构酶A3(PDIA3)又名ERp57，是一种有助于糖蛋白的折叠的内质网蛋白。虽然大多数细胞中的PDIA3蛋白位于内质网内，但它也可以存在于细胞核内或质膜上(R.Khanal和I.Nemere,2007)。Deng等(2019)通过GWAS分析共鉴定出9个与奶牛产奶量密切相关的基因，发现PDIA3可能是影响奶牛泌乳性状的候选基因。Allison等(2018)报道称乳腺上皮细胞PDIA3基因对小鼠乳腺生长具有必要作用。实际上，在Janjanam等在2014年就发现PDIA3在哺乳动物信号途径和网络上的定位中表现出高产奶量和低产奶量样品的差异表达。综上来看，PDIA3可能是一个能影响奶牛泌乳性状的重要候选基因。然而，目前尚未发现该基因多态性与奶牛产奶性状的相关分析。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能与荷斯坦奶牛泌乳性状相关的候选基因PDIA3。
本发明的第二个目的是筛选多个荷斯坦奶牛泌乳性状相关基因PDIA3的多态位点(SNP)。
本发明的第三个目是筛选与荷斯坦奶牛泌乳性状关联的单倍型块组合。
本发明的第四个目的是本发明的分子标记在荷斯坦奶牛泌乳性状标记辅助选择中的应用，其中的应用包括PDIA3基因与奶牛产奶性状关联的SNP以及单倍型组合物的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人提供了与荷斯坦奶牛(Bos taurus)泌乳性状性相关的5个SNP标记，所述的应用包括单独使用或组合使用的情况，所述SNP标记的核苷酸序列如下所述：
(1)SEQ ID NO:1(突变位点为g.-1713T>C)
aaaataagtggcatgaaaggatacgctcaaggacccatccagcccataaggaaagaggtggcctctcgctgcatcgcactcgaagggtgctcattagcctctgggcatgtgtaatccgttctacatgacgaggttttatggagaatcgtacaagctggtgttgatctcccaacataagcttcttctgacgggaagaatctacatcaaaaataaaaaagggacagtggataaacataaaaagaaatctttgggagtatcaagagcaggtagggttgagcggcgggaacacttgttaagtaatggacccctcccataccccR1(c)gagggcttaccttgctgttccttcacatagcaactaatactagtttgaagtaagagctaacctattgcttatgaccaacactgttcatgcccaagataagttacaggttcaaccctcaaagttctcagtgtctttggtggaaacatccaggccaaccagggctactaggtatcctaggcctaaaaacgagtgacatagttctatctcctggattcagagctttacttactaagtctttatcaagtttggtgtaactttttaaaagctgcaaccaaaccaatctcccctgaattttccacctttaaaattttctctgcttcctactcttcggag
上述序列中第320位处的R1碱基是C或T，导致PDIA3基因的多态性。
(2)SEQ ID NO:2(突变位点为g.-934G>A)
caggctgctgaccaagtatctctcggattgtgtgccgtggcacagcttggctcaagccttgcagatgctcgatgagagagaaagtatcaatgagccgggaacgaatggcatcagcccggggtagttgcatgtR2(g)tcctgatgggtgataagtggccatgtctgttaagaaaataaaagtgtcatttcatttttggagttgcaccaaggcttagagattctcttccctttctcccaaggtcttcgcccttaagaggacaaatacattgtactcagactcaaggccttttgaaacaaaaggagacgggattcattaaagaatctgcgtagttgactaagcggccaggcgccttcacccgtgtgacagcagttctcgttaaatgcagcagccacaaaaggtaggagtcccgggttggacaaagaggaattcaagcactacctggacctgagggagtcaggtaatgcaatgagatgggacagagggag
上述序列中第133位处的R2碱基是G或A，导致PDIA3基因的多态性。
(3)SEQ ID NO:3(突变位点为g.-695C>A)
caggctgctgaccaagtatctctcggattgtgtgccgtggcacagcttggctcaagccttgcagatgctcgatgagagagaaagtatcaatgagccgggaacgaatggcatcagcccggggtagttgcatgtgtcctgatgggtgataagtggccatgtctgttaagaaaataaaagtgtcatttcatttttggagttgcaccaaggcttagagattctcttccctttctcccaaggtcttcgcccttaagaggacaaatacattgtactcagactcaaggccttttgaaacaaaaggagacgggattcattaaagaatctgcgtagttgactaagcggccaggcgccttcacccgtgtgacagcagttctR3(c)gttaaatgcagcagccacaaaaggtaggagtcccgggttggacaaagaggaattcaagcactacctggacctgagggagtcaggtaatgcaatgagatgggacagagggag
上述序列中第372位处的R3碱基是C或A，导致PDIA3基因的多态性。
(4)SEQ ID NO:4(突变位点为g.-483G>A)
ggtaatgcaatgagatgggacagagggagggctcaagaactggctccgaaaagaaaaacccagttccatgaggaactggataaaaggcaacagcctgacattttgaaaatgtgtccgatcccaagcgtgGccactccaacgcgctccctcgggtgccagctccttctctcaattcccgctcctgggcctcttctcagcccaggctctcttccgcccactcagccctgacttcaactcctccgcctccggttctggcgccccctgagctcggctgtccgcaggcgggacgaattcagggtcggctcccagctccgcagcgccacacgtccggctcccgcccggtcccgcccggtcccgggttccggctggtccccggacccacccccaggagcaaccagcgacccgggccccccttcgcggccccggtcgccccggcgctcgccgcctcggccccgccccacgctccggccactcggcggttaccagct
上述序列中第130位处的R4碱基是G或A，导致PDIA3基因的多态性。
(5)SEQ ID NO:5(突变位点为g.-434C>T)
ggtaatgcaatgagatgggacagagggagggctcaagaactggctccgaaaagaaaaacccagttccatgaggaactggataaaaggcaacagcctgacattttgaaaatgtgtccgatcccaagcgtgaccactccaacgcgctccctcgggtgccagctccttctctcaattcccgR5(c)tcctgggcctcttctcagcccaggctctcttccgcccactcagccctgacttcaactcctccgcctccggttctggcgccccctgagctcggctgtccgcaggcgggacgaattcagggtcggctcccagctccgcagcgccacacgtccggctcccgcccggtcccgcccggtcccgggttccggctggtccccggacccacccccaggagcaaccagcgacccgggccccccttcgcggccccggtcgccccggcgctcgccgcctcggccccgccccacgctccggccactcggcggttaccagct
上述序列中第179位处的R5碱基是C或T，导致PDIA3基因的多态性。
本发明筛选了检测PDIA3基因突变位点的引物组合序列，所述引物组合的序列如下所述：检测突变位点R1(g.-1713T>C)的引物组合：
SEQ ID NO:6F：5'AAAATAAGTGGCATGAAAGG 3'，
SEQ ID NO:7R：5'CTCCGAAGAGTAGGAAGCAG 3'；
检测突变位点R2(g.-934G>A)、R3(g.-695C>A)的引物组合：
SEQ ID NO:8F：5'CAGGCTGCTGACCAAGTA 3'，
SEQ ID NO:9R：5'CTCCCTCTGTCCCATCTC 3'；
检测突变位点R4(g.-483G>A)、R5(g.-434C>T)的引物组合：
SEQ ID NO:10F：5'GGTAATGCAATGAGATGGGACA 3'，
SEQ ID NO:11R：5'AGCTGGTAACCGCCGAGTG 3'。
本发明筛选得到一种单倍型模块1中与荷斯坦奶牛泌乳性状相关的优势单倍型组合H1H1，该单倍型组合的DNA序列为AGC/AGC。
申请人提供了一种筛选奶牛(以荷斯坦奶牛为例)泌乳性状相关分子标记的方法，所述的方法包括下列步骤：
(1)从NCBI数据库上查找奶牛PDIA3基因的核苷酸序列。
(2)设计引物对20头荷斯坦奶牛DNA混合池样本进行PCR扩增。
(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行测序。
(4)利用chromes软件观察测序结果，筛选得到5个PDIA3基因的SNP位点。
(5)根据测序结果，选择初步筛选得到的5个SNPs位点，利用Sequenom SNP分型检测方法对251头荷斯坦奶牛群体进行SNP基因分型。
(6)将5个SNP位点与奶牛6个泌乳性状(高峰奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d泌乳量、乳脂量、乳蛋白量)进行关联分析。
(7)用Haploview软件对5个SNP位点进行单倍型分析，检测到3个位点(g.-1713 T>C、g.-695C>A、g.-434 C>T)组成1个单倍型块。
(8)利用Phase软件将上述连锁的单倍型block与251头奶牛个体进行一一对应，得到不同的单倍型组合。
(9)将单倍型组合进一步与251头奶牛的6个产奶性状进行关联分析。
本发明的引物组合可在荷斯坦奶牛泌乳性状辅助选择中应用。
本发明的分子标记可在荷斯坦奶牛泌乳性状辅助选择中应用。
本发明的的单倍型组合可在荷斯坦奶牛泌乳性状辅助选择中应用。
更详细的技术方案见《具体实施方式》。
附图说明
图1：本发明的技术流程图。
图2：PDIA3基因质谱分型的检测结果。附图标记说明：根据测序结果可知，在奶牛21号染色体基因全序列的第55368538位碱基处出现T>C碱基替换，该替换引起PDIA3基因启动子区域的多态性。
图3：PDIA3基因质谱分型的检测结果。附图标记说明：根据测序结果可知，在奶牛21号染色体基因全序列的第55369317位碱基处出现G>A碱基替换，该替换引起PDIA3基因启动子区域的多态性。
图4：PDIA3基因质谱分型的检测结果。附图标记说明：根据测序结果可知，在奶牛21号染色体基因全序列的第55369556位碱基处出现C>A碱基替换，该替换引起PDIA3基因启动子区域的多态性。
图5：PDIA3基因质谱分型的检测结果。附图标记说明：根据测序结果可知，在奶牛21号染色体基因全序列的第55369768位碱基处出现G>A碱基替换，该替换引起PDIA3基因启动子区域的多态性。
图6：PDIA3基因质谱分型的检测结果。附图标记说明：根据测序结果可知，在奶牛21号染色体基因全序列的第55369817位碱基处出现C>T碱基替换，该替换引起PDIA3基因启动子区域的多态性。
图7：PDIA3基因SNP位点连锁不平衡分析。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的第一个分子标记(突变位点为g.-1713 T>C)，序列长度为653bp。
序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的第二个分子标记(突变位点为g.-934G>A)，序列长度为482bp。
序列表SEQ ID NO:3是本发明克隆的第三个分子标记(突变位点为g.-695C>A)，序列长度为483bp。
序列表SEQ ID NO:4是本发明克隆的第四个分子标记(突变位点为g.-434C>T)，序列长度为488bp。
序列表SEQ ID NO:5是本发明克隆的第五个分子标记(突变位点为g.-434C>T)，序列长度为179bp。
序列表SEQ ID NO:6是系列检测PDIA3基因突变位点的引物组合，检测突变位点R1(g.-1713 T>C)的引物组合的上游引物。
序列表SEQ ID NO:7是是系列检测PDIA3基因突变位点的引物组合的检测突变位点R1(g.-1713T>C)的引物组合的下游引物。。
序列表SEQ ID NO:8系列检测PDIA3基因突变位点的引物组合的检测突变位点R2，R3(g.-934G>A)、R3(g.-695C>A))的引物组合的上游引物。
序列表SEQ ID NO:9是列检测PDIA3基因突变位点的引物组合的检测突变位点R2，R3(g.-934G>A)、R3(g.-695C>A))的引物组合的下游引物。
序列表SEQ ID NO:10系列检测PDIA3基因突变位点的引物组合的检测突变位点R4，R5(g.-483 G>A)、R5(g.-434C>T)引物组合的上游引物。
序列表SEQ ID NO:11系列检测PDIA3基因突变位点的引物组合的检测突变位点R4，R5(g.-483 G>A)、R5(g.-434C>T)的引物组合的下游引物。
实施例1：荷斯坦奶牛泌乳性状关联的PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5标记的鉴定及检测，PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5位点上基因型的引物设计
1.试验对象
选择251头荷斯坦奶牛，其DNA样本分别来自中国南方地区的4个奶牛牧场。所有泌乳记录来自牧场和DHI中心，血液中提取的奶牛DNA基因组由华中农业大学动物繁殖与特种经济动物学系实验室保存。
2.引物设计
根据奶牛PDIA3基因序列(登录号Gene ID:281803)为模板，利用Primer5.0引物设计软件，分别设计如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：5片段所示的引物组合，并委托北京擎科生物科技有限公司(武汉)合成。
3.PCR扩增反应
以荷斯坦奶牛基因组DNA为模板，按如下程序进行PCR扩增反应，PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002849466170000061
表2 PCR反应条件
Figure BDA0002849466170000062
4.PCR产物测序
将所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行序列测定，测序工作由北京擎科生物科技有限公司(武汉)完成。经BLAST比对分析，发现PDIA3基因上存在5个SNP标记，分别是PDIA3_SNP1为g.-1713 T>C，PDIA3_SNP2为g.-934 G>A，PDIA3_SNP3为g.-695 C>A，PDIA3_SNP4为g.-483 G>A，PDIA3_SNP5为g.-434 C>T。这些突变引起PDIA3基因的多态性。发明在奶牛PDIA3基因中共找到5个SNP位点，均位于启动子区。
上述检测所得的5个SNP标记的核苷酸序列请参见《发明内容》中的“技术方案”，或参考序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5所示的序列。
检测所得的5个SNP标记即，PDIA3_SNP1-5突变位点的引物DNA序列参见《发明内容》中的“技术方案”，或参考序列表SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:11所示的序列。
实施例2：PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5标记在奶牛泌乳性状的关联分析中的应用
为了确定筛选到的荷斯坦奶牛PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5标记与奶牛泌乳表型差异是否相关，本实施例选择荷斯坦奶牛(251头)为试验材料。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行多态性检测，并分析不同基因型与奶牛泌乳性状的相关性。采用R语言统计软件中的混合线性模型(Mixed)进行基因型和表型值之间的关联分析，分析模型为：
Yijfy＝U+Gi+Pj+Ksfy+e
式中，Yijfy为性状观察值；U为性状总平均值；Gi为基因型效应；Pj为胎次效应；Kfy为场次和年份混合效应；e为随机误差，假定服从(0，δ2)分布。
对荷斯坦奶牛PDIA3基因突变位点多态性检测，用Sequenom SNP分型检测方法对251头荷斯坦奶牛群体进行SNP基因分型，结果如表3所示除了g.-483 G>A位点只有两个基因型，其余每个位点均检测到三种基因型。本发明针对上述筛选得到的5个突变位点进行群体遗传信息分析。多态信息含量显示2个SNP位点(g.-695 C>A和g.-434 C>T)PIC含量在0.25-0.31，属于中度多态，表明这些多态信息含量较高，遗传变异较大，具有更大的选择潜力；其余3个SNP位点PIC含量均小于0.25，属于低度多态，表明这些位点的遗传变异较小，选择潜力较小。杂合度显示，在该奶牛群体中平均基因杂合度为0.22，这些位点的基因型杂合度均低于0.38，说明在奶牛群体中这些位点突变概率较低，群体内遗传变异较小。
对PDIA3_SNP1-5位点的不同基因型与荷斯坦奶牛泌乳性状进行最小二乘分析，确定了PDIA3_SNP1-5为与泌乳性状相关的2个SNP标记。从表4中可看出有2个SNP位点与奶牛产奶性状显著相关，其中SNP位点(g.-695 C>A)与乳蛋白量显著相关(p<0.05)；SNP位点(g.-434 C>T)与305d产奶量极显著相关(p<0.05)；其中g.-695 C>A位点的CA基因型个体的乳蛋白量显著高于CC基因型个体(p<0.05)，同样，g.-434 C>T位点的CT基因型个体305d产奶量显著高于CC基因型个体。
实施例3：PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5位点的单倍型组合的鉴定
(1)单倍型与单倍型组合的构建
利用Haploview软件进行PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5的单倍型分析，同时将得到的所有个体的PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5位点的基因型数据输入PHASE程序，计算得到每个个体的基因型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度。
表3 PDIA3基因5个SNPs位点在荷斯坦奶牛群体中的遗传信息
Figure BDA0002849466170000081
示。结果发现SNP位点g.-1713 T>C，g.-934 G>A，g.-695 C>A参与构成一个单倍型块(haplotype block)，均处于高度连锁状态。单倍型block1包含3个SNP位点，长度为1kb。
(2)不同单倍型组合与产奶性状关联分析
计算所有个体单倍型组合的单倍型频率，筛选单倍型频率高于10％的组合，发现block1中单倍型组合H1H1、H2H1、H3H1的频率分别为59.4％、19.9％、15.9％。
将这些单倍型组合进一步与产奶性状关联分析，发现在block1单倍型组合与乳蛋白量显著相关(p<0.05)；其中单倍型组合H3H1个体乳蛋白量分别为185.78±118.94kg，显著高于其它单倍型组合个体(p<0.05)。从关联分析数据中得知单倍型组合H3H1为优势单倍型组合个体，其乳蛋白量显著高于其他个体型(p<0.05)，其个体数量占群体15.9％(表5)。因此，在本实施例的试验群体中H3H1(其序列为CGC/AGC)单倍型组合最佳。
表4 PDIA3基因SNP位点多态性与荷斯坦奶牛泌乳性状关联分析
Figure BDA0002849466170000091
注：在表4中,(1)以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同时表示差异显著(P<0.05)，未标注者表示差异不显著(P>0.05)。(2)PM：高峰奶量；MY：305d产奶量；
FY：乳脂量；FP：乳脂率；PY：乳蛋白量；PP：乳蛋白单倍型block分析结果如图7所示。
表5 Block1单倍型组合与荷斯坦奶牛泌乳性能关联分析
Figure BDA0002849466170000101
注：同行上标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
本实施例鉴定一个具有优良泌乳性状的PDIA3_SNP1至PDIA3_SNP5位点的单倍型组合block1，其优势单倍型组合H3H1的序列为：CGC/AGC。这个单倍型组合可以应用于筛选具有优良泌乳性状奶牛的分子标记辅助选择中。
主要参考文献
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<141> 2020-12-22
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 653
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(653)
<220>
<221> mutation
<222> (320)..(320)
<400> 1
aaaataagtg gcatgaaagg atacgctcaa ggacccatcc agcccataag gaaagaggtg 60
gcctctcgct gcatcgcact cgaagggtgc tcattagcct ctgggcatgt gtaatccgtt 120
ctacatgacg aggttttatg gagaatcgta caagctggtg ttgatctccc aacataagct 180
tcttctgacg ggaagaatct acatcaaaaa taaaaaaggg acagtggata aacataaaaa 240
gaaatctttg ggagtatcaa gagcaggtag ggttgagcgg cgggaacact tgttaagtaa 300
tggacccctc ccataccccc gagggcttac cttgctgttc cttcacatag caactaatac 360
tagtttgaag taagagctaa cctattgctt atgaccaaca ctgttcatgc ccaagataag 420
ttacaggttc aaccctcaaa gttctcagtg tctttggtgg aaacatccag gccaaccagg 480
gctactaggt atcctaggcc taaaaacgag tgacatagtt ctatctcctg gattcagagc 540
tttacttact aagtctttat caagtttggt gtaacttttt aaaagctgca accaaaccaa 600
tctcccctga attttccacc tttaaaattt tctctgcttc ctactcttcg gag 653
<210> 2
<211> 482
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(482)
<220>
<221> mutation
<222> (133)..(133)
<400> 2
caggctgctg accaagtatc tctcggattg tgtgccgtgg cacagcttgg ctcaagcctt 60
gcagatgctc gatgagagag aaagtatcaa tgagccggga acgaatggca tcagcccggg 120
gtagttgcat gtgcctgatg ggtgataagt ggccatgtct gttaagaaaa taaaagtgtc 180
atttcatttt tggagttgca ccaaggctta gagattctct tccctttctc ccaaggtctt 240
cgcccttaag aggacaaata cattgtactc agactcaagg ccttttgaaa caaaaggaga 300
cgggattcat taaagaatct gcgtagttga ctaagcggcc aggcgccttc acccgtgtga 360
cagcagttct cgttaaatgc agcagccaca aaaggtagga gtcccgggtt ggacaaagag 420
gaattcaagc actacctgga cctgagggag tcaggtaatg caatgagatg ggacagaggg 480
ag 482
<210> 3
<211> 483
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(483)
<220>
<221> mutation
<222> (372)..(372)
<400> 3
caggctgctg accaagtatc tctcggattg tgtgccgtgg cacagcttgg ctcaagcctt 60
gcagatgctc gatgagagag aaagtatcaa tgagccggga acgaatggca tcagcccggg 120
gtagttgcat gtgtcctgat gggtgataag tggccatgtc tgttaagaaa ataaaagtgt 180
catttcattt ttggagttgc accaaggctt agagattctc ttccctttct cccaaggtct 240
tcgcccttaa gaggacaaat acattgtact cagactcaag gccttttgaa acaaaaggag 300
acgggattca ttaaagaatc tgcgtagttg actaagcggc caggcgcctt cacccgtgtg 360
acagcagttc tcgttaaatg cagcagccac aaaaggtagg agtcccgggt tggacaaaga 420
ggaattcaag cactacctgg acctgaggga gtcaggtaat gcaatgagat gggacagagg 480
gag 483
<210> 4
<211> 488
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(488)
<220>
<221> mutation
<222> (130)..(130)
<400> 4
ggtaatgcaa tgagatggga cagagggagg gctcaagaac tggctccgaa aagaaaaacc 60
cagttccatg aggaactgga taaaaggcaa cagcctgaca ttttgaaaat gtgtccgatc 120
ccaagcgtgg ccactccaac gcgctccctc gggtgccagc tccttctctc aattcccgct 180
cctgggcctc ttctcagccc aggctctctt ccgcccactc agccctgact tcaactcctc 240
cgcctccggt tctggcgccc cctgagctcg gctgtccgca ggcgggacga attcagggtc 300
ggctcccagc tccgcagcgc cacacgtccg gctcccgccc ggtcccgccc ggtcccgggt 360
tccggctggt ccccggaccc acccccagga gcaaccagcg acccgggccc cccttcgcgg 420
ccccggtcgc cccggcgctc gccgcctcgg ccccgcccca cgctccggcc actcggcggt 480
taccagct 488
<210> 5
<211> 488
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(488)
<220>
<221> mutation
<222> (179)..(179)
<400> 5
ggtaatgcaa tgagatggga cagagggagg gctcaagaac tggctccgaa aagaaaaacc 60
cagttccatg aggaactgga taaaaggcaa cagcctgaca ttttgaaaat gtgtccgatc 120
ccaagcgtga ccactccaac gcgctccctc gggtgccagc tccttctctc aattcccgct 180
cctgggcctc ttctcagccc aggctctctt ccgcccactc agccctgact tcaactcctc 240
cgcctccggt tctggcgccc cctgagctcg gctgtccgca ggcgggacga attcagggtc 300
ggctcccagc tccgcagcgc cacacgtccg gctcccgccc ggtcccgccc ggtcccgggt 360
tccggctggt ccccggaccc acccccagga gcaaccagcg acccgggccc cccttcgcgg 420
ccccggtcgc cccggcgctc gccgcctcgg ccccgcccca cgctccggcc actcggcggt 480
taccagct 488
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 6
aaaataagtg gcatgaaagg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 7
ctccgaagag taggaagcag 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 8
caggctgctg accaagta 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 9
ctccctctgt cccatctc 18
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(22)
<400> 10
ggtaatgcaa tgagatggga ca 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 荷斯坦奶牛(Bos taurus)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 11
agctggtaac cgccgagtg 19

Claims (1)

1.如下所述的引物组合在荷斯坦奶牛泌乳性状辅助选择中的应用，所述泌乳性状为奶牛高峰奶量、乳脂率、乳蛋白率、305d泌乳量、乳脂量和乳蛋白量性状，所述引物组合的序列如下所示：
（1）检测突变位点g.-1713 T>C的引物组合：
SEQ ID NO:6F：5' AAAATAAGTGGCATGAAAGG 3'，
SEQ ID NO:7R：5' CTCCGAAGAGTAGGAAGCAG 3'；
（2）检测突变位点g.-695C>A、 g.-934G>A的引物组合：
SEQ ID NO:8 F：5' CAGGCTGCTGACCAAGTA 3'，
SEQ ID NO:9 R：5' CTCCCTCTGTCCCATCTC 3'；
（3）检测突变位点g.-434 C>T、g.-483 G>A的引物组合：
SEQ ID NO:10 F：5' GGTAATGCAATGAGATGGGACA 3'，
SEQ ID NO:11 R：5' AGCTGGTAACCGCCGAGTG 3'。
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