CN101525664A - 牛泌乳量及品质相关基因pou1f1作为分子标记的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域。具体公开了一种奶牛泌乳量及品质相关的POUIF1基因片段作为分子标记的应用。所述基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中在序列表SEQ ID NO：1的第15640bp处有1个A15640－T15640的碱基突变，导致HinfI－RFLP多态性。同时公开了扩增所述基因和检测序列表SEQ ID NO：1的第15640bp处A－T碱基突变的正、反向引物对的DNA序列。本发明为奶牛分子标记辅助选择提供了一种新标记。

Description

牛泌乳量及品质相关基因POU1F1作为分子标记的应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及一种与牛泌乳量及品质相关POU1F1基因片段作为分子标记的应用。

背景技术

就我国奶牛的情况而言，高产良种奶牛相对缺乏，奶牛品种和遗传品质比较差，因此在我国需加强高产奶牛的选育。家畜的重要经济性状往往是受到遗传和环境的作用，奶牛的产奶性状(包括产奶量、乳脂含量、乳蛋白含量、乳脂率、乳蛋白率等)主要是受遗传因素控制，并受到环境因素的影响。

随着现代分子生物学技术的发展，利用分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术进行选育已经成为可能，从遗传上选择有优势的等位基因，实施分子育种与常规育种相结合，不仅提高选种的相对准确率和效率，而且可以进行早期选择、提高选择强度、缩短世代间隔。应用分子标记的现代育种技术对于提高奶牛的产奶量和改善乳品质是先进有效的方法。将灵敏度极高的一些DNA分析手段应用于奶牛育种中，其主要目的是在DNA分子水平上寻找与奶牛产奶性状密切相关的遗传标记，用于奶牛的标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)，实现早期选择，加快育种速度，奶牛分子育种是未来奶牛品种改良的主要手段。

垂体特异性转录因子(Pituitary Specific Transcription Factor，POU1F1，或简称Pit-1)是POU结构域(PIT-OCT-UNC domain)中几种同源(异型)蛋白之一，目前已被正式命名为POUIF1。POU结构域是由一段DNA结合区域组成，包括一个POU特异性区域(POU-specific domain，POU-SD)和一个POU同源性区域(POU-homeo-domain，POU-HD)。垂体特异性转录因子POU1F1参与调节机体的细胞生长与发育，对垂体激素分泌细胞的基因转录起重要调节作用。

牛的POU1F1基因包含6个外显子和5个内含子，基因全长19654bp，其中mRNA全长1502bp，编码291个氨基酸。Moody等(1995)根据连锁分析的结果，将牛的POU1F1基因定位于牛的1号染色体。Woollard等(2000)人将POU1F1基因定位于牛1p21～22区域上。

Renaville等(1997a)在对89头意大利荷斯坦奶牛Pit-1基因第6外显子的HinfI酶切结果分析表明A等位基因与产奶量及角形、A等位基因与体深及后腿形状、A等位基因与低脂肪率和高角等都存在显著相关。Tuggle和Freeman报道奶牛的POU1F1基因与乳脂率和乳蛋白率存在显著相关。

Zwierzchowski等(2002)报道，他们对波兰黑白花奶牛第6外显子的HinfI酶切分析表明，A等位基因与产奶量和乳成分存在显著相关。Di Stasio等(2002)对肉牛的POU1F1基因的第6外显子的HinfI酶切分析表明，BB基因型与腰肉厚存在显著相关。POU1F1蛋白是动物垂体前叶特异性表达的一种具有重要功能的转录因子(Tuggle et al，1996)。POU1F1蛋白对垂体前叶胚胎发育以及生长激素(Growth Hormone，GH)、催乳素(Prolactin，PRL)和促甲状腺素亚β单位(Thyroid-StimulatingHormone β，TSH β)基因的表达起决定性作用(Mangnlam et al.，1989；Rosenfeld et al.，1991)。POU1F1蛋白与垂体中的PRL基因、GH基因、TSHβ基因及其POU1F1基因自身的启动子结合，调节这些基因的转录。通过调节这些基因的表达而对动物的生长发育、繁殖和免疫等很多方面起重要的作用。在多种垂体激素缺陷而导致侏儒的鼠和人类中，均可发现POU1F1基因缺少活性(滕勇，经荣斌，宋成义.哺乳动物POU1F1基因对其生长发育的作用.西北农业学报.2004，13(2)：11-15)。因此，POU1F1基因的突变有可能导致垂体的发育不全和阻碍GH和PRL两种激素的分泌。而这两种激素是泌乳性状的主效基因，所以POU1F1基因是一种潜在的影响泌乳的基因。

迄今为止尚未见到有关利用POU1F1基因作为牛泌乳量及品质的分子标记及应用。

发明内容

本发明的目的在于克隆牛POU1F1基因的部分DNA序列，寻找该基因突变位点以及多态性的检测方法，筛选适用于牛泌乳量及品质性状相关的分子标记及其应用。

本发明通过以下技术方案实现：

与牛泌乳量及品质性状相关基因POU1F1作为分子标记的应用，按照以下步骤制备：

用GENEBANK中提供的牛POU1F1(登录号NC_007299.3)基因的DNA序列设计引物；从奶牛血液中提取基因组总DNA，PCR扩增，得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其中在序列表SEQ ID NO：1的第15640bp处有1个A15640-T15640的碱基突变，导致Hinf I-RFLP多态性。

申请人设计了扩增上述与牛泌乳量及品质相关的POUIF1基因片段的引物对，同时该引物也是用于检测序列表SEQ ID NO：1的第15640bp处A-T碱基突变的正、反向引物，该引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5′-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3′，

反向引物：5′-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3′。

本发明为奶牛的分子标记辅助育种提供了新的遗传标记。

更详细技术细节如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明作为分子标记的奶牛POU1F1基因的部分DNA序列。

图1：是本发明的技术流程图.

图2：对目的DNA片段PCR产物的检测结果，图中：1-4泳道为PCR产物，长度为451bp；M泳道：DNA分子量标记(100bp DNA ladder)

图3：是奶牛POU1F1基因序列的Pou1f1-HinfI多态性的检测结果。

具体实施方式

实施例1奶牛POU1F1基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测

1、奶牛POU1F1基因部分DNA序列的扩增

(1)引物设计

根据GENBANK提供的牛POU1F1基因(登录号为NC_007299.3)的序列设计引物，序列信息如下：

上游引物：5′-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3′

下游引物：5′-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3′

(2)从奶牛血液中提取总DNA及检测分析

1)从奶牛血液中分离白细胞；

2)在含有白细胞的试管中加入1ml的1×SET，200uL的蛋白酶K(10mg/mL)，10％十二烷基磺酸钠(SDS)100uL。置入恒温水浴锅37℃消化过夜；

3)加入等体积的平衡酚，缓慢颠倒离心管10min，以使管内溶液混匀，4℃8000rpm离心10min；

4)小心吸取上层含有DNA的上清液，移入另一离心管中，再次加入等体积平衡酚重复(4.)操作；

5)同法吸取上清液，加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，缓慢颠倒离心管10min，4℃8000rpm离心10min；

6)吸取上清后加入氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，与以上相同的条件离心；

7)吸取上清液，加入1/10体积的NaAc(3M，pH5.2)及2倍体积的无水乙醇(无水乙醇要预冷)，振荡离心管可见内有白色的絮状物，即DNA，于-20℃放置30分钟；

8)取出样品，于12000rpm高速离心10min，小心倒掉上层无水乙醇；

9)加入1mL 70％的乙醇洗涤沉淀，同样12000rpm高速离心10min；

10)小心弃去70％乙醇，在室温下使残留乙醇挥发，加入适量的TE溶解DNA；

11)充分溶解后的DNA样可在含有溴化乙锭(EB)的1.5％琼脂糖胶上电泳检测，同时在浓度测定仪上测定浓度；将该DNA样品存放于-20℃备用。

(3)PCR扩增

PCR反应体系为10μL：10×Buffer 1.0μL，25mM Mg2+1.0μL，4μM上游引物、下游引物(如上所述)各0.5μL，10mM dNTP 0.2μL，5U/μL Taq酶0.2μL，500ng/μL DNA 0.8μL，ddH2O 5.8μL，混匀、瞬时离心。

扩增条件为：94℃预热12min→94℃变性30s→65℃退火30s→72℃延伸30s(从第二步变性到第四步进行12个循环，退火温度在每个循环降1度)→94℃变性30s→54℃退火30s→72℃延伸30s(从第五步变性到第七步进行24个循环)→72℃延伸10min→15℃10min，4℃保存。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)PCR产物回收及测序

PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后测序，测序结果显示PCR产物的长度为244bp和207bp。

2 PCR-SSCP检测及其测序寻找SNP位点

(1)PCR-SSCP检测

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，取4μL扩增产物中加入溴酚蓝变性剂混合物(0.25％溴酚蓝∶变性剂＝体积比为1∶4)10μL，95℃变性15min。变性结束后立即将PCR管置于冰水混合物上冰浴，防止DNA单链复性。然后在胶联度为39∶1的10％的聚丙烯酰胺凝胶上点样进行电泳检测。

1)10％非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制(总体积35mL)

40％丙烯酰胺溶液：  9mL

双蒸水：            19mL

5×TBE缓冲液：      3.5mL

10％AP溶液：        200μL

N，N，N′，N′-四甲基

乙二胺(TEMED)：20μL

将以上溶液于小烧杯中混合摇匀。

2)上样、电泳

凝胶聚合后拔出梳子，用注射器吸取1×TBE缓冲液(购自上海亚培生物科技有限公司)冲洗梳孔，以除去未聚合的胶液，使样品容易沉降。组装好电泳设备，用1％的琼脂糖胶液封闭好玻璃板与电泳槽之间的缝隙，防止电泳缓冲液渗漏。在上下缓冲槽中倒入足量1×TBE缓冲液，用50μL微量进样器将PCR变性产物缓缓注入梳孔。上样完毕后开启电泳仪电源，在110V-120V恒压下电泳6-8小时，直至二甲苯氰电泳指示条带迁移到凝胶底部。

3)凝胶染色

电泳完毕，取下玻板，小心地将凝胶从玻板上剥离下来，放入双蒸水中漂洗一次，然后浸入10％乙醇溶液固定5-10min；用1％硝酸脱色3-8min，然后双蒸水迅速漂洗一次，0.2％硝酸银晃动闭光染胶15-25min；染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s)，洗去凝胶表面残留的硝酸银溶液。在染胶盒中倒入含3％Na₂CO₃和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。注意观察显色情况，目的条带显现清晰后立刻将凝胶转入3％的乙酸溶液，浸泡10min停显。

4)凝胶成像与电泳条带分析

将目标条带清晰的凝胶在BIO-RAD凝胶成像系统中进行扫描并保存电泳图谱。根据电泳条带判断基因型。

(2)PCR产物的纯化和测序

在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自日本TOYOBO公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物。纯化方法为：在1.5ml离心管中加入400μL吸附液，在凝胶完全溶解之前将其放置在室温中，且不时进行搅拌，如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或溶胶难以溶解时，放入55℃水浴锅温浴5min，加入30μL磁珠，经常用漩涡混合器搅拌，并放置2min(室温)，然后放入离心机(6000rpm，5sec)，加入600μL洗净液，搅拌10sec，离心(6000rpm，5sec)，加入1mL 75％无水乙醇，搅拌10sec，瞬时高速离心，彻底去除上清部分(打开微型试管的盖子，55℃下放置5min，干燥)，加入25μL-100μL蒸馏水，搅拌10sec，放置2min后离心(6000rpm，5sec)，回收上清液。上清液中含有回收的目的片段。

从两个品种的样品中分别挑选几个DNA样品送到上海生工生物工程技术有限公司进行测序。

(3)DNA序列比对及突变位点的鉴定

用测序获得的基因序列进行序列同源性比较，用DNAstar5.01软件SeqMan和MegAlign工具对测序峰图进行分析，以鉴定和获得该DNA序列的突变信息。

3、PCR-RFLP诊断方法建立

(1)PCR产物的扩增

PCR产物的扩增如前面所述。

(2)PCR产物酶切

设计的引物如下：

上游引物：5′-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3′

下游引物：5′-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3

P1酶切反应体系为10μL：限制性内切酶Hinf I 0.2μL(10U/μL)，10×缓冲液1μL，PCR产物2μL，加ddH2O至10μL，55℃条件下水浴酶切3～4小时。

(3)PCR-RFLP检测

酶切产物检测：由于本试验扩增产物片断较小，所以都用聚丙烯酰胺凝胶进行酶切结果检测，所用的丙烯酰胺胶联度为29∶1浓度为8％的凝胶。

每板胶35mL，配制方法：

30％丙烯酰胺：9.3mL

双蒸水：      18.42mL

5×TBE：      14mL

10％AP：      0.23mL

TEMED：       20uL

酶切产物用8％丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液为1×TBE，110V恒压4小时，用银染法染色，拍照，并由带型来判断基因型，记录基因型。结果如表1-3.

表1 Pou1f1-HinfI变异位点在牛群中的等位基因频率和基因型频率

表1显示出Pou1f1-Hinf I变异位点在牛群中的等位基因频率和基因型频率，在266头奶牛中，其中BB基因型在该研究群体中的频率最大，为0.6128、其次是AB基因型，为03346、而AA基因型最低，为0.0526。等位基因A的频率为0.2199，等位基因B的频率为0.7801。由此可以看出B为优势等位基因。

表2 Pou1f1基因HinfI酶切多态性与产奶量的统计分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.01)。

表2看出三种基因型间对奶牛产奶量的影响没有达到显著差异(P＞0.05)，但是AA型和BB型之间、AB型和BB型之间达到了显著差异(P＜0.05)。

表3 POU1F1基因Hinf I酶切多态性与乳脂率和乳蛋白率的统计分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.01)。

表3可知POU1F1-HinfI不同的基因型对乳脂率和乳蛋白率的影响有显著的差异(P＞0.05)。AA型和AB型之间的差异达到了极显著水平(P＜0.01)；AA型、AB型与BB型之间达到了显著水平(P＜0.05)。乳蛋白率在不同基因型之间没有显著的差异(P＞0.05)。AA型的个体乳脂率最高，AB型的最低。但是AA型个体的蛋白率是最低的，AB型的蛋白率是最高的。

参考文献

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序列表

<110>华中农业大学

<120>牛泌乳量及品质相关基因POU1F1作为分子标记的应用

<130>

<141>2009-04-17

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15954

<212>DNA

<213>牛(Bos primigenius)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(15954)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(15867)..(15882)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(15432)..(15451)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(15640)..(15640)

<223>

<400>1

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attattctgt tccttcctgt cattatggaa accagtcatc gacctatggc gtgatggcag    3720

gtaagaaaaa ttgtctttac atgtaagatt gagtttgggg acgcttggat gcattttctg    3780

ggtcgaaggg aatcttgacc agagtgtatc atgaaattca gatctcctaa ccttagaaat    3840

tgctgctaaa tccaccactt actataatgg tccctgatct gtaacgcctt cagagatcat    3900

aatagttata cctgatcact gctgttctcc acatgcctga aatgaactgc tatgcttctt    3960

aacgcctgtg tttgctttgt atgattttta ttctaattct ctgttgccaa actgctaatt    4020

gtcacttgct tatgccattg gtgggcttgc ctccagtaat aataaggtag ctgctagcct    4080

tatgtaacta tttaaattta aaagtaaatt aactaaaata aggtcagatt taaaattcct    4140

cagttgccaa cagtgagcaa gtcagcaaaa gctttaaatg acttcattgc ccgcctccat    4200

accaacaggg ttaatgatta tgaggtacgg aacttaatag tcatcatttc ccttgagatt    4260

ttggctgttc cttcagttcc tgaatttaaa ataaaacagg aaagtgctta ataatctttt    4320

gtggctacca aagcagatag actaacttat agagcatatt cctcatcaca gtatttcttt    4380

tggccatttg gtctgtaaag ataaataaga cattgaaggc taagagagat ttgcagcaac    4440

tttagccata gttgaatcct tggcagccct gtctgagatg ctctgagtct tggataagat    4500

tgaaatagta taagttacat acttatttcc ctctggataa agaaagcatc actatatcaa    4560

gataaactat cttgtttgct gacacttaaa tgaaagtatt gttagcaact ttcttaaggg    4620

aaagaaaatc tgacgtaaga gatccactca tcacaaaatt tatgacttaa ttttagacca    4680

tggctataca gtaatttttt tgtgcacaga aattatttag aaatctcaat cttttatatt    4740

tatttctgca gcaagaaata atttcagtga caataaacta ctaatgttct atgtgaaaaa    4800

tataaacgtg tgtgtgtgca tgctcgtgta atagttgtta tccaagtagg taattaaaaa    4860

atcaaacata gatttatgcc tataaatttg aaattaaatt gaacaaagaa tttagttcac    4920

caacctttaa tttctaaaaa tttctcaaat ttacactaaa taaaacatta aaactttaaa    4980

ataatatatt ctagaacaaa ttagcttttc ctacattctg ttagagagca ttctgaataa    5040

acttatatcc tcacctttat gatgaagtga aaactgatgt tcttaatggt tacctttaaa    5100

tcttaatgtc tctcttcaat aattaaaaaa taaggaaagt catatttttc ttcctctgtg    5160

aaaacggacc gtttatgatt cgtgtactta gctgttaatc agtatccatg gttaatgaga    5220

ggatctctcg ttgaagatga actactttca ttatagaaat agtagaacaa tgtgcattta    5280

gccactagcg gtgccgctca aatgctttct gtggcctcca ccacacttgg attacagaga    5340

caagaaatga tgagtttata gacatgtgct actctttctt ggaggagaga gtccttgctg    5400

ttccttcaca gtagttccca ggaacccaca tgcaacttaa gtcatctctg cacccagcaa    5460

ggggcagcaa tgagtggagg ttagtgctca gaccaaacac tgtgagatga tttttactac    5520

tacctccctc ccaccagatc taggtagaag ctgctgagtt cacagctggc ctgagaaacc    5580

tgacttcctt cctgtttcca gggttgcagg taacaagccc aggttcacac tgagagtcca    5640

caggcaactc aggttgtgct ggtccaagtt tcctcagcag gccctcagca aactttcatc    5700

tccattagaa gttaaaaagg agaggtcttt ggaaaaacct tttaaaatga ttcaaagccc    5760

aggttggtga taataatgaa aaaaatggat gtcctaagct ttggaggtat tgctgtagtc    5820

ttaaaccaaa attacatata ttttgtcgct gaaagaaaaa ttcaccatgt caagcataga    5880

gattatattt gaatattttt gagagggaga tcattaaaat gtgatgtgct ttgtaatttg    5940

ttacaatgtc actattttga catatattca gtattagcct ttgcatcacg gcagatttaa    6000

tctcagagaa tctgaacctt tctgctgtca tccccagaga agctacacaa attgagtcat    6060

aaaacacagg gattcagaat attcaggaat tcacaaaagg tttaaaatac acaagagaaa    6120

cctgataatg tcatttgaat tttctgagaa gtctcaggcg ttcatcaaat cagccacttc    6180

cacacaatcc acagaagcgt ctaatcacca acaacgaagg ttcattgtca catactccat    6240

ataaaagtga agctgcacaa agagcaatat ttcaaagggt gtgaaattgc tttatttgaa    6300

tatggttatt ttatccctat actctgatgc ttatatgtag tctgagcatt tcattaaatt    6360

aataactcac tggaaagcaa gagctacagc tcatatttta agctaaggtt ggtaggaagg    6420

attctaatca tcagatgaat cctctgtacc tcatagtcca ggtgtgggga tatcaaagag    6480

aatgattggt ggggtgaaat gaattagcca caccaggaac taattacaaa cctcgttcaa    6540

gttagcatct caaagtgtta gtctcttcac atccaagttg tgatgggtac catacatagc    6600

tctatctgag ttgagttgtg gcagctttct accaacttag cctggttttc tccttgatct    6660

tctcttcaga tacattcata gttaaatttc ttcttctgtt tcttctctcc taagtactta    6720

aataattcaa cagcctgcag gatggataat aggaaacagg gaattacaaa tactattcaa    6780

aaatctcttc tagataaaca cgaaagaaaa ctaataacaa aaacctttca aaattctgat    6840

ttctgggtat acaaggtggt gtctgttctc atttgtaaag ctgggtgaaa gttggaaaac    6900

aaacttaatg agctgtgtac cttgcccgcc gtcctgtgtg aactgggcta atcagctaca    6960

tggtaatgat tgctaaaccc agcaaggtta tgtgttttaa tggccaccca aggtgtgcag    7020

taagagtcct tgattaaaaa ttgatcttaa gaggaaagca aaatagctga tgttggaaaa    7080

ttattcaagg agatgaatgc tctttttaaa tgagatgtga ataataagaa taaaagatga    7140

atatagctaa aaagtgtctt ttccacctgg gctaggacaa gaggtaccag aaatatgttt    7200

cacatttaca taggcaaaca gtctactttg gaggccatct cttcattctt aaattgtctt    7260

ttttctattt cctttttttc ttttttgttt tatttagttt tatttttgcc tcacttattc    7320

tggatgtgtt gacactaagg gaaggagtaa ttctgaccat cttttgcctc tggatcatga    7380

aaggcgcctg cagtagcatg gacactgtgt attattcctt aaattatgta gcatctgtct    7440

caacttcaca actcaaaagc agctacaggc aatctgtaaa caaatggcca tggctgtgct    7500

ccaaatcaac ctaatttaca gaactaggca gaagacctgt ttatatgtgg ataggatgta    7560

gcaatgcaca aaagagaaaa aaaatcacaa ttcaaattta tgatttgttt cacattgtca    7620

tgcatgaacg taaaaaaaga aaataaatgg aaatatttaa atgaactgtg ctgtgcatct    7680

ctacagcaag gtgggggtat tttactatat ccttcttccc ctgtttgttc ttttaaagct    7740

tctagctcac aacctcagag atgttgtcag ttagcagctg tctgagccac gtgctgcaga    7800

aaagcagtgt gccctgtatc atgggacctt gaatcaggtg cccgtaaggc atgctggacc    7860

tcagcttccc atcttctgct tttaaagatt taatctctgt tcctctccct cctctgccgt    7920

ccagaagtcc atgcagagca gttcagagag gctatggtgg attaatctgc agggtgaaaa    7980

tccatcttgg actgtaaaga atgtacaaac ctttccaagc tatttaggtg tgcacttgtt    8040

ctaggcttat agacaagttt ggtttatcag tgttttggaa aatattcatg aaacttctgt    8100

ggcacacaac ttcctgcatc ttttctctcc gtgctcaaac cccgacttct taatattcca    8160

ggctttagaa aaacctttta aaataccttg tcacatatac cataccaatc aatccccatt    8220

ttctcccaaa tacaggatca tataatagaa atcagtttgt ctgaccatgc ttgtgactgt    8280

cccaaatttc tgtttaacat tagtttcagg aaaactgtgt ccctgtggat aattgtggat    8340

actttcagtt aatgaaaaat aacgcagcac acatcgtgtt ttccttcctc ctctagatgc    8400

caaacttttg aacatggtat ttcttgtgca ctctttatga actcatgttc aaatttattt    8460

tctaaatgtc catttctcca gagtatttat aaagtataca ctagctttaa atttttccat    8520

aaatagagat ggcacacttc caatattttt gtaaatattt ataaaacttt tgtttgaaag    8580

catttgttta atgtgaccaa atatatttaa gatgcagaat ctttgagtca tctgatttcc    8640

ctgagtacag attacctgaa aaatgaactg attattgatg tggcctattg aggtattcac    8700

agggcttcac ttctagtttc aattgtatag tgaattcatc ttagcactca aggaacgtta    8760

tttgttttta tatgaatttt aaattgtgga taaaaaaata cacacttttt tctctgaaaa    8820

taaaacaaaa gtccttagat aaatattaag taaatgttaa cataaaggtg ataaattttt    8880

ttatatatta gtattttact taactagtag aaatctaaaa ctaacattag gccaaaaatg    8940

agctttgtta aaatgtaaca aacattaaaa aaattgaatt ttgtaataaa ttaaaaattg    9000

ataaaattgc tttttaaaat tgtatctggt ctattcaatg tagcacccac taaagcaaaa    9060

agtggatgat taacaataac aacaaaaaac tggatagttt tgatttttga aagtaatatg  9120

aattgcttta gacagaaata gtttcttttg tatgtttttt atatccatga aacagctata  9180

cttattttat gatattttgc ttaatttctc acttgtatgt attttgtttc agaaacataa  9240

tagtctactg gataggggta cacttcaaaa ttatattttc tcatataaat aatatgagcc  9300

aacaacttac tgacttgcaa tattctttgc tcattacata ttgatatatt aatttaagat  9360

ttatatattc tggcaaaata cactattact catgtctgat ttctgactgt atttatagag  9420

aaattataaa tagcataaaa ctgatgtatt ttttagtaag tttctaagaa tgattactgc  9480

ctattttcta tagtcattta tatttaattt atactcataa gaaaaatgat taattattga  9540

atattttatt tatatcaaaa tgtcttggtt atacccatgt catttaatat aaagtgaaat  9600

ccttatgaat aaaaatgtaa tatactgctg aagaaaacag aaataaaatg tgtgggaatt  9660

tggcttatac catcctgtca ccaatactcc ctgactgaga ttctctcttc tttccaaatg  9720

aagaatgaaa tctagaagca attaaacaat taaatcatgt agttttttga gatttctcat  9780

ttaactaact caatggattc agtgcttcat catttatgag ggattatgta ttgtatctca  9840

gagaaggaaa tggcaactcc agtattcttg cctggagaat cccagggaca gaggagcctg  9900

ttgggctgct gtccatgggg tcgcacagag tcggacacga ctgaagcgac ttagcagcag  9960

cagcagcagc atgtatcata tctagaattg cacccttcct tgacacttaa ctttttcttc  10020

ttaaatagta atcaagaaat gattccatca tagtatattt tgcaagaatc ttgttgctga  10080

ccttctaata gatctttaaa agttactttt tgtcgacatc catcattacc attaaatcta  10140

tttaaacctt attaatgtat tttttgttct cataattttc gttttacttg cctttactaa  10200

attaagcatt tactgataaa acattggatt tcttaatgct gtaaaatcaa tttttcaatg  10260

ctatgaaaat ttcccagaat agcacttaac atacaccttg attataatta agaaaatata  10320

cattctggta gagttgaacc tcagattcac aataacaaat gaaaagattt ttgtttgttt  10380

ttggggagcc atgctgaatt ccataaccag gaatcaaacc catgccctct atactggaag  10440

gatgaagtct taaccactgg actgctatgg aagtctttta agagaaaaac aatgatggaa  10500

aactcacact tttttgaaat ttgcttattt ctatttaaat tatttgcaag tccctggttc  10560

tttcctttgg ctttgcatta tctttgtttc cactgctccc aggaaggtgg aaaaaaaaga  10620

tcctatttat actaagctac actgacttct acttcagaaa agcaaatgtc aggtaacctt  10680

ttagaactga gactggctgt cacagaacaa tctgatgggc caaaattttc catgtatcaa  10740

aatgagggat aattacaaat ggtccttttc ttgttgttac agggagctta accccttgtc  10800

tttataagtt tcctgaccac acgttgagtc atggttttcc tcccatgcat cagcctctcc  10860

tttcagagga ccccactgcc gctgatttca agcaggagct caggcggaaa agcaaattgg    10920

ttgaagagcc aatagacatg gattctccag aaatccgaga acttgaaaag tttgccaatg    10980

agtttaaagt gagaagaatt aagctaggta ggtgcttgtt aacagctgtg ggacacacaa    11040

ctccgtctgc aaagtcttac tctattactg tttaatctct tacatgctgc tcagaagtct    11100

aagacagttc tcattctaca tctctactgt ggatgtaagt tgaattatga aaacctatag    11160

caaccttcat ttccttgtaa attcttagca gcaaaaatat atagatttct aaattaatgg    11220

tctccttttc aaacataagt ttagaaatac ctttgtttta tttgaattaa tacctttgtg    11280

tgattcaaaa gctaaaaagc tgtgagaatt gtatccctct gcttatcctt cctgtttatc    11340

agtgttatta gtttctgtga atccttctat tctatgcata ttcatataag caaattcatg    11400

tatttcttca tatagacatt tttcatttga ctattttgga gagctttcag tattagtttt    11460

ttagagagct cttcttttta atgcatctct caattccatt ttatgaatat attaccagtc    11520

tcctactgat ggaatttaga tggtcttcaa tcttatgtta ctgaagacaa tgatgcaatg    11580

attaacttca taaatagcat tttgcaccga taaaaatata tgtgcaggga aagtgttaaa    11640

agcaaaattg tttgattgaa gagcatgtgt atttgtaatt tcagtagatg tcaaattggt    11700

ctctatgtaa attctaacaa atcttattgc caccatgagt atctcctttg ccactcttca    11760

gaatatgaat tctgttaagg cagaagtttt ttgttttttg tttatttcct ttgctttctc    11820

cttaatggca tatcctcagc acttggaaca gtgactggca tgtagaataa aaaatagtta    11880

ttgaagggaa aagatgctat taatcttttg gacctttgca aatcagttag gtgaaagtag    11940

cagtttcatt ttaaatttcc cttatgagtg aagagtgaaa gaagtttttc atgtgttgga    12000

cagtcatttg taattccttt tctgtgagcg atctgttcat agcctttgct cactttctag    12060

ggtgaagtgt ttttaatgta aataatcata ataattaacc ttgatttaaa tgcatgaaat    12120

atatttttaa tggattgaac tgatagtaca aacttctgca tttgtggact gagccattgg    12180

taacttttaa tgatatcaat tgatgggcat catatgtaat cattttatgc atacaggtat    12240

atagccttgg gccctgaatt aatatgtagt tactgtttgt cataaacaca gcagtaggca    12300

tctttatgac attcattttc aatttacttt ttatatgact gtgaatgttt caaattctac    12360

attgatgaca tttgtcaact tatattctga gaatgtttga gacaatctat gaaaactttt    12420

tgcctggaga tagaagcatt accaaatgat ataataaatg cttggtgata tacataaaat    12480

gttgtgtgac caaagtctca taataagcat gcttttaggg aaagtaaaca cagttcttag    12540

ttttatttgt taacttcaac atgttgaatt tttcactctt acagctgaga taaaaatatt    12600

tgtgatatat caccatatag tttacatatt atattttaat atctatagat tttgagcata    12660

tttcaacaga tgcctaataa taatgattag agagaatttt taaatgtctt ctaaagtgtg    12720

tattaaggat tccctggtag aacagctggt aaagaatcca cctgcaatgc aggacacccc    12780

agttcaattc ctgggtcagg aagatcagtt ggagaaggga taggctaccc attccagtat    12840

tcttcggctt cccagtggct cagctgttaa agaatctgcc tgctatgagg gagatctgga    12900

ttcagtccct gggttgggaa gatcccctgg agatgggaac agctacccac tccagtattc    12960

tggcctggag aattccatgt actgtatagt ccatggggtt gcaaagaata gtctgactac    13020

acttatatta ggttataaaa atgattcatg tataattact acagtatata gcacagtggc    13080

aaaaaaataa atctggatac attaaaaaga atcatttcac tactttatac ctatgctaca    13140

ttgtctagaa acttttctta tatatttttg caaagtgtgt ttaacacatt tatccagttt    13200

ggctaaatat gaatggcaga tgttcctatc tgaattcttt tggcttctaa aatattaact    13260

tattaactag aaggaatttt ttaaaatact agacaattct acactgcata accttactgt    13320

tattctaaat tgctaacaaa tttatcgtta aaagcaatat ttaatagttg acaaaaatac    13380

tacacaaatt tatacaatag tggacccaaa tcagtgtttc ttgcaaaact gaagctcatg    13440

gcctttgtta ttctttcaca ggatacaccc agacaaatgt tggggaagct ctggcagctg    13500

tgcatggctc tgaattcagt caaacaacta tctgccgatt tgaaaacctg cagctcagct    13560

tcaaaaatgc atgcaaacta aaagcaatat tatccaaatg gctggaggaa gccgagcaag    13620

taggaggtac aaaagctgtg tttctggaaa cagtgatgtt ttaacctaaa aacaatggtt    13680

tccctcagtt gaatttgtac taaagcaaga ggtttgaagt ttggtttgat ttttctcttt    13740

gacatgaaaa ataagtatct tgtttcatca cactatgaag aaaagcaagg ccagtgaaag    13800

tgtagaaata aatttattga gaaggtaaat aatgagagaa taaaatatat agggaaagtt    13860

tctacacaat gtggcatagg tgtgaagtgg tgaaatgatt ctttttaatg tatccagatt    13920

ttttcctgct gtgctatata ctgtagtaat tattcatgaa tcatttttac aacctaatat    13980

aagtgtagcc agagcattcg cacacaccgt tctttctagt gaatagcaag caattgctag    14040

ataaacaatt taatgtgata aaaattatct acttatatta atgtcaaggc tggctaaaga    14100

gcaagatttg atagcattta gagcaactgt ttcaacaaag atagggtatg atttaaagac    14160

aactgttaat atttataaag ttaatatttt tttctgtgtt aacattttaa tctagggctt    14220

gtaatctaaa atgatgtata ctgcaaatat ttaaaacaaa aatgtatggt aattctattt    14280

tgtattgttt tataaagaaa ctttaaatcc aaatctgata gttaaaaaaa aaacctggtt    14340

tgtttttgta attattcatt gttttcgcat cacagcttta tacaatgaga aagttggtgc    14400

aaatgaaaga aaaaggaaac ggagaacaac aatcaggtat acttttgaga tattaagagt    14460

tagtggagaa gaaaatgata ttttacaaat ggaatgaaca tttgagtata atatagtttc  14520

aatataacat aaaaatgaat agagccaatt gagaaaatag gtgaaaaagc acaacattca  14580

ataaattact tctgagaaac agctggaaat ttaaaatttg atggaaaaat atgtattgtt  14640

tgattcaaga acagttttgc tctgcaagtt ttggataaaa cagaagctgt acaatcacag  14700

ctaaaaagaa tgactgtttc tactgtgtca taatgtgttg atttatgttt agacataaat  14760

cttgctccgg gaaagacccc atggactgta gcctacaggt tcctctgtcc atgggatttt  14820

ccaggcaaga ataatggagt gggttgccat ttccttctcc aggagatctt cccgacccag  14880

ggattgaacc cggatctcct acattgtagg cagatgcttt accatctgag ccacaaggga  14940

agtcatctat ctatattatt tcaaattaac aaaactggtc actagtattt tagttgctta  15000

aagttcaaaa tgacttctag catttcaagc cagattgttc atttatcttt ttgtagtttc  15060

cgtgaggctc atggaggaat tgctaatata caggttttgt tttggttggt tagttgtaca  15120

ctaaacattt caataacctg agttctgggg gacatttaga aatgcataca gaattatttt  15180

cttctcagta agtcagtgcc ctcttgtggc agaaagtgga taaacaatgt cggggttccc  15240

tccttaattt cttcctgtga ctctggtaaa aggagcctac atgagacaag catctaaatg  15300

ttcaaaaaaa cttcacattt attattgttg aaaagctttg aaggtgtttt cagtgtcttt  15360

aggtttcctt tttacgttaa tgttagtact aatatttagg aaatgtaacc taacttgatt  15420

ttgatgggcc taaaccatca tctcccttct ttcctgccaa ctcctcacct cccagtattg  15480

ctgctaaaga cgccctggag agacactttg gagaacagaa taagccttcc tctcaggaga  15540

tcctgcggat ggctgaagaa ctaaacctgg agaaagaagt ggtgagggtt tggttttgta  15600

accgaaggca gagagaaaaa cgggtgaaga caagcctgaa tcagagttta tttactattt  15660

ctaaggagca tctcgaatgc agataggctc tcctattgtg taatagcgag tgtttctact  15720

tttcattcct ttctcttctc cagccaaaat agaaattagt tatttggtta gcttcaaaaa  15780

atcacatcag taatttttgc agaagtgttt cttttctact ttaaaaataa atacaattta  15840

aattatgttg atgaattatt ctcagaaggc acattgtaca ttttaagcca aagactaata  15900

ggattcaaac aatgattctg tccctttcac tatatctttc cctctatctc tccc        15954

Claims (2)

1、牛泌乳量及品质相关的POUIF1基因片段作为分子标记的应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中在序列表SEQ ID NO：1的第15640bp处有1个A15640-T15640的碱基突变，导致HinfI-RFLP多态性。

2、一种作为分子标记应用的与牛泌乳量及品质相关的POUIF1基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其中检测序列表SEQ ID NO：1的第15640bp处A-T碱基突变的正、反向引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5′-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3′，

反向引物：5′-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3′。

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