CN112485417B - 一种多指标联检化学发光免疫试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多指标联检化学发光免疫试剂盒，包括盒体和设于所述盒体内的磁珠抗体溶液、发光粒子抗体溶液、洗涤液、激发溶液，所述盒体内设有多个反应小孔，所述发光粒子抗体溶液包括多种搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子。上述多指标联检化学发光免疫试剂盒，通过设计合成了多种搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子，并对其进行抗原抗体偶联，使之作为磁免疫化学发光的信号物质，解决了在单个分析流程中只有一种信号物质发出单一波长的光信号的问题，实现了多指标联合检测。本发明还提供了一种上述多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法。

Description

一种多指标联检化学发光免疫试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及化学发光免疫技术领域，特别涉及一种多指标联检化学发光免疫试剂盒及其制备方法。
背景技术
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光免疫分析仪包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。目前的商品化的化学发光系统有四种：HRP——鲁米诺体系、ALP——AMPPD体系、吖啶酯直接标记体系、三联吡啶钌电化学发光体系。
CPPO，双草酸酯，化学名为双(2,4,5–三氯水杨酸正戊酯)草酸酯，分子式是C26H24Cl6O8，分子量为677.182，CAS登记号为30431-54-0，不溶于水,易溶于有机溶剂用作发光材料。化学发光冷光源是种颇具应用前景的新型光源，是人类用化学手段模拟生物系统(如萤火虫)的结果。化学冷光源作为光源有许多独特的优点。化学发光过程无火焰，基本无热辐射，不产生表观电流，不出现碳分效应，可作为无干扰光源。化学发光过程不受地域，环境和气候条件的限制。是一种方便的无污染光源，具有其它光源无法比拟的能量转换效率。
现有的化学发光免疫试剂盒，商品化的化学发光系统的发光物质都只有一种，从发光原理和发光条件上看，四种不同的发光体系无法统一，导致了现有的化学发光系统都无法进行多指标联合检测，检测效率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种多指标联检化学发光免疫试剂盒及其制备方法，以解决现有的化学发光免疫试剂盒因无法进行多指标联合检测而导致检测效率低的问题。
本发明提供了一种多指标联检化学发光免疫试剂盒，包括盒体和设于所述盒体内的磁珠抗体溶液、发光粒子抗体溶液、洗涤液、激发溶液，所述盒体内设有多个反应小孔，其中：所述磁珠抗体溶液用于搭载抗体；所述发光粒子抗体溶液用于标记被测抗原；所述洗涤溶液用于清除非被测抗原；所述激发溶液用于使得搭载抗体后的磁珠抗体溶液和标记后的被测抗原发光，所述发光粒子抗体溶液包括多种搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子。
上述多指标联检化学发光免疫试剂盒，使用时，将50ul磁珠抗体溶液加入反应小孔中，加入50ul样本，加入50ul发光微球抗体溶液，混匀，在37℃的环境下温育20min，然后进行磁分离，用冲洗液洗涤4次，最后磁分离去掉上清液后，加入100ul激发溶液混匀，稳定30秒后记录相应波长的光强度值，将标准品的浓度与光强度值做图得到标准曲线，未知样品的浓度，经由光强度反向计算得到，通过设计合成了多种搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子，并对其进行抗原抗体偶联，使之作为磁免疫化学发光的信号物质，解决了在单个分析流程中只有一种信号物质发出单一波长的光信号的问题，实现了多指标联合检测。
本发明还提供了一种多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，包括：合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子；合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子偶联抗体，以形成发光粒子抗体溶液；合成磁珠抗体溶液；配置激发溶液。
进一步地，所述合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子的方法包括：在容器中加入去离子水与聚苯乙烯纳米颗粒，乳化剂充分溶解，以得到溶解混合物；在所述溶解混合物中加入乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、CPPO以及荧光分子混匀后，缓慢加在水相上，形成混合液体；将所述混合液体用均质机乳化处理，并在恒温条件下，搅拌2h～48后逐滴加入乙醇破乳，然后缓慢加热至60度，搅拌2h后使用离心水洗涤2次，定容到固含量1％。
进一步地，所述苯乙烯纳米颗粒的固含量为0.5％～3％。
进一步地，所述乳化剂包括脂肪醇与聚氧乙烯醚MOA-7，其含量为1‰～1％。
进一步地，所述形成发光粒子抗体溶液的方法包括：取吗啉乙磺酸缓冲液，加入载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子，并加入碳二亚胺，在37℃下活化2h；离心处理后用缓冲液洗涤2次，加入四种病毒以及四种病毒对应的标记抗体，在37℃的温度下包被12h以上。加入甘氨酸、牛血清白蛋白，在4℃的温度下封闭12h，离心处理后重悬于保存液中，稀释500倍使用。
进一步地，所述保存液包括防老剂2246、牛血清白蛋白、蔗糖以及吐温80。
进一步地，所述四种病毒包括呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒，以及甲型流感病毒。
进一步地，所述磁珠抗体溶液的制备方法包括：选取氨基磁珠，用硼酸盐缓冲液洗涤3次，并放入硼酸盐缓冲液中悬置；加入环氧氯丙烷，在37℃的环境下混匀活化0.5～4h；再用硼酸盐缓冲液洗涤3次，并放入硼酸盐缓冲液中悬置；加入抗体，在37℃的环境下混匀包被0.5～20h，完成后磁分离，重悬于保存液中。
进一步地，所述激发溶液的配置方法包括：在醋酸盐缓冲液中加入H2O2混匀，加入N,N-二甲基甲酰胺对甲基苯甲酸及水杨酸溶解后，慢慢加入所述H2O2溶液中；加入月桂酰肌氨酸钠后缓缓加入异丙醇，混匀得到所述激发溶液。
附图说明
图1为本发明第一实施例中的多指标联检化学发光免疫试剂盒的原理图；
图2为图1中激发溶液的分子式图；
图3为本发明第二实施例中的多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法的流程图；
图4为甲型流感病毒的发光曲线图；
图5为图4中的甲型流感病毒在不同浓度抗原的信号梯度图；
图6为乙型流感病毒的发光曲线图；
图7为图6中的乙型流感病毒在不同浓度抗原的信号梯度图；
图8为呼吸道合胞病毒的发光曲线图；
图9为图8中的呼吸道合胞病毒在不同浓度抗原的信号梯度图；
图10为呼吸道腺病毒的发光曲线图；
图11为图10中的呼吸道腺病毒在不同浓度抗原的信号梯度图。
主要元件符号说明：
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干个实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被称为“固设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
请参阅图1和图2，本发明第一实施例提供的一种多指标联检化学发光免疫试剂盒，包括盒体和设于所述盒体内的磁珠抗体溶液、发光粒子抗体溶液、洗涤液、激发溶液，所述盒体内设有多个反应小孔，其中：所述磁珠抗体溶液用于搭载抗体；所述发光粒子抗体溶液用于标记被测抗原；所述洗涤溶液用于清除非被测抗原；所述激发溶液用于使得搭载抗体后的磁珠抗体溶液和标记后的被测抗原发光，所述发光粒子抗体溶液包括多种搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子。
上述多指标联检化学发光免疫试剂盒，使用时，将50ul磁珠抗体溶液加入反应小孔中，加入50ul样本，加入50ul发光微球抗体溶液，混匀，在37℃的环境下温育20min，然后进行磁分离，用冲洗液(10mm PBS(phosphate buffer saline磷酸缓冲盐溶液)，0.05％吐温80)洗涤4次，最后磁分离去掉上清液后，加入100ul激发溶液混匀，稳定30秒后记录相应波长的光强度值，将标准品的浓度与光强度值做图得到标准曲线，未知样品的浓度，经由光强度反向计算得到，通过设计合成了多种搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子，并对其进行抗原抗体偶联，使之作为磁免疫化学发光的信号物质，解决了在单个分析流程中只有一种信号物质发出单一波长的光信号的问题，实现了多指标联合检测。
请参阅图3至图11本发明第二实施例提供的一种多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，包括步骤S01至步骤S03。
步骤S01，合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子。
具体的，所述合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子的方法包括：在容器中加入去离子水与聚苯乙烯纳米颗粒，乳化剂充分溶解，以得到溶解混合物；在所述溶解混合物中加入乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、CPPO以及荧光分子混匀后，缓慢加在水相上，形成混合液体；将所述混合液体用均质机乳化处理，并在恒温条件下，搅拌2h～48后逐滴加入乙醇破乳，然后缓慢加热至60度，搅拌2h后使用离心水洗涤2次，定容到固含量1％。所用的4种荧光分子为蓝色9,10-双(4-甲氧基苯基)-2-氯-蒽；绿色9，10-双苯乙炔基蒽；黄色1，8-二氯-9，10-双苯乙炔基蒽；红色5,6,11,12-四苯基并四苯；4种油溶性荧光分子。所用的cppo为双(2,4,5–三氯水杨酸正戊酯)草酸酯。
其中，所用的聚苯乙烯纳米颗粒为多孔高透光羧基聚苯乙烯纳米颗粒粒径为117nm，(粒径范围90nm～300nm)。合成步骤为：250ml三颈瓶中加入90ml去离子水与10％固含量的粒径为117nm聚苯乙烯纳米颗粒(固含量1％，范围0.5％～3％)。加入乳化剂AEO-7(脂肪醇与聚氧乙烯醚MOA-7)0.1g(1‰～1％)充分溶解。乙酸乙酯20ml、DMF(N,N-Dimethylformamide，N,N-二甲基甲酰胺)10ml(比例1：1，2：1，3：1)、0.2gCPPO(其他实施例中，可以为0.05g～0.35g)、0.05g(其他实施例中，可以为0.01g～0.1g)荧光分子混匀后，缓慢加在水相上。混合液体用均质机乳化处理10分钟。恒温25度(其他实施例中，可以为10度～37度之间)，搅拌24h(其他实施例中，可以为2h～48h)。24h以后逐滴加入100ml乙醇破乳，缓慢加热至60度，搅拌2h。完成后离心水洗涤2次，定容到固含量1％备用。
步骤S02，合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子偶联抗体，以形成发光粒子抗体溶液。具体的，所述形成发光粒子抗体溶液的方法包括：取吗啉乙磺酸缓冲液，加入载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子，并加入碳二亚胺，在37℃下活化2h；离心处理后用缓冲液洗涤2次，加入四种病毒以及四种病毒对应的标记抗体，在37℃的温度下包被12h以上。加入甘氨酸、牛血清白蛋白，在4℃的温度下封闭12h，离心处理后重悬于保存液中，稀释500倍使用。
具体的，在本发明实施例中，为了举例说明，本发明(以甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，呼吸道腺病毒4个项目联合检测为例)采用夹心法抗原抗体反应的原理，双抗体夹心法检测原理检测样本中是否含有甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，呼吸道腺病毒抗原。
具体的，取50mM pH6.5(在本发明的的其他实施例中，可以为25mM～100mM，pH6.0～8.0)的MES(4-Morpholineethanesulfonic acid hydrate，吗啉乙磺酸)缓冲液900ul，加入100ul 1％浓度的载有(CPPO和荧光分子)的羧基聚苯乙烯纳米粒子(五种颜色纳米粒子)，加入EDC(碳二亚胺)2mg(在本发明的的其他实施例中，可以为0.5mg～5mg)。37度活化2h。离心，用10mM PBS pH7.8的缓冲液洗涤2次。加入呼吸道腺病毒(蓝色)，呼吸道合胞病毒(绿色)，乙型流感病毒(黄色)，甲型流感病毒(红色)四个项对应的标记抗体(浓度都为150ug)，37度包被12h以上。加入甘氨酸至终浓度1mM，加入BSA至终浓度0.5％。4度封闭12h。离心，重悬于200ul的保存液中，保存液可以由10mMPBS(防老剂2246)pH7.8、1％BSA(牛血清白蛋白)、4％蔗糖、0.1％吐温80组成，使用时，稀释500倍使用。
步骤S03，合成磁珠抗体溶液。
所述磁珠抗体溶液的制备方法包括：选取氨基磁珠，用硼酸盐缓冲液洗涤3次，并放入硼酸盐缓冲液中悬置；加入环氧氯丙烷，在37℃的环境下混匀活化0.5～4h；再用硼酸盐缓冲液洗涤3次，并放入硼酸盐缓冲液中悬置；加入抗体，在37℃的环境下混匀包被0.5～20h，完成后磁分离，重悬于保存液中。
其中，磁珠选取3um惰性表面氨基磁珠，并按下述方法偶联：称取湿重10mg(其他实施例中，可以为5mg～20mg)，3um氨基磁珠，用pH8.0的50mM(其他实施例中，可以为pH7.0～8.5，浓度20mM～80mM)硼酸盐缓冲液洗涤3次，每次500ul。用1ml硼酸盐缓冲液悬置存放。加入25ul(其他实施例中，可以为5ul～50ul)环氧氯丙烷，37度混匀活化2h(其他实施例中，可以为0.5～4h)。用pH8.0的50mM硼酸盐缓冲液洗涤3次，每次500ul。用1ml硼酸盐缓冲液悬置存放。加入抗体150ug(其他实施例中，可以为50ug～200ug)。37度混匀包被4h(其他实施例中，可以为0.5～20h)。完成后磁分离，重悬于的保存液中1ml，保存液可以由10mMPBS(防老剂2246)pH7.8、1％BSA(牛血清白蛋白)、4％蔗糖、0.1％吐温80组成，磁珠溶液(10mg/ml)制备完成。
步骤S04，配置激发溶液。
所述激发溶液的配置方法包括：在醋酸盐缓冲液中加入H2O2混匀，加入N,N-二甲基甲酰胺对甲基苯甲酸及水杨酸溶解后，慢慢加入所述H2O2溶液中；加入月桂酰肌氨酸钠后缓缓加入异丙醇，混匀得到所述激发溶液。
具体的，在80mlpH6.5的50mM醋酸盐缓冲液加入20ml30％H2O2混匀。500ulDMF加5mg(其他实施例中，可以为1mg～10mg)对甲基苯甲酸及2.5mg(其他实施例中，可以为1.5mg～25mg)水杨酸溶解后，慢慢加入上述H2O2溶液中。加入0.45g(其他实施例中，可以为0.1g～1g)月桂酰肌氨酸钠(LS97)。最后缓缓加入15ml(其他实施例中，可以为5ml～25ml)异丙醇。混匀得到激发溶液。
通过上述方法制备出的多指标联检化学发光免疫试剂盒，实现了至少4个项目同时进行化学发光测定。大大提高了分析速度。同时仅仅需要一种发光液，即可实现多个波长同时发射。且在测试时不需要光源进行激发，避免了光源波动带来的荧光信号波动，提高了信号的稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子；
合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子偶联抗体，以形成发光粒子抗体溶液；
合成磁珠抗体溶液；
配置激发溶液；
所述合成搭载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子的方法包括：
在容器中加入去离子水与聚苯乙烯纳米颗粒，乳化剂充分溶解，以得到溶解混合物；
在所述溶解混合物中加入乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、CPPO以及荧光分子混匀后，缓慢加在水相上，形成混合液体；
将所述混合液体用均质机乳化处理，并在恒温条件下，搅拌2h～48后逐滴加入乙醇破乳，然后缓慢加热至60度，搅拌2h后使用离心水洗涤2次，定容到固含量1％；
所述形成发光粒子抗体溶液的方法包括：
取吗啉乙磺酸缓冲液，加入载有CPPO和荧光分子的羧基聚苯乙烯纳米粒子，并加入碳二亚胺，在37℃下活化2h；
离心处理后用缓冲液洗涤2次，加入四种病毒以及四种病毒对应的标记抗体，在37℃的温度下包被12h以上；
加入甘氨酸、牛血清白蛋白，在4℃的温度下封闭12h，离心处理后重悬于保存液中，稀释500倍使用；
所述磁珠抗体溶液的制备方法包括：
选取氨基磁珠，用硼酸盐缓冲液洗涤3次，并放入硼酸盐缓冲液中悬置；
加入环氧氯丙烷，在37℃的环境下混匀活化0.5～4h；
再用硼酸盐缓冲液洗涤3次，并放入硼酸盐缓冲液中悬置；
加入抗体，在37℃的环境下混匀包被0.5～20h，完成后磁分离，重悬于保存液中；
所述激发溶液的配置方法包括：
在醋酸盐缓冲液中加入H2O2混匀，慢慢加入N,N-二甲基甲酰胺对甲基苯甲酸及水杨酸溶解；
加入月桂酰肌氨酸钠后缓缓加入异丙醇，混匀得到所述激发溶液。
2.根据权利要求1所述的多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述苯乙烯纳米颗粒的固含量为0.5％～3％。
3.根据权利要求1所述的多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，所述乳化剂包括脂肪醇与聚氧乙烯醚MOA-7，其含量为1‰～1％。
4.根据权利要求1所述的多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，其特征在于，所述保存液包括防老剂2246、牛血清白蛋白、蔗糖以及吐温80。
5.根据权利要求1所述的多指标联检化学发光免疫试剂盒的制备方法，所述四种病毒包括呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、乙型流感病毒，以及甲型流感病毒。
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