CN112481262A

CN112481262A - 一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法

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Publication number: CN112481262A
Application number: CN202011407452.3A
Authority: CN
Inventors: 张玉波; 黄雷; 朱秀生; 王雪岩
Original assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Current assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: CN112481262B

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，属于分子生物学技术领域。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，利用CRISPR/Cas9精确切割基因组中核心元件附近的靶位点，同时设计供体ssDNA通过同源重组的方式在动物细胞中进行核心元件的定点删除，检测靶基因转录活性及相关细胞表型来研究增强子核心元件的细胞生物学功能。通过自有技术定位将候选增强子精确定位到25bp的序列长度范围，提高功能研究的准确性，与此同时通过对ssDNA的精细设计，实现了元件的高效定点删除，其操作简便，技术体系稳定，为调控元件功能研究提供了便利。

Description

一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法。

背景技术

增强子是真核生物基因组中的一类重要的非编码元件，对靶基因的转录激活具有关键的调控作用。虽然已有大量的研究对真核生物不同组织器官的特异性增强子进行了预测和功能验证，但是由于现有技术产生的增强子序列的片段较长(约600bp～10kb)，不便于其核心调控元件的预测和细胞生物学功能的研究。

目前对增强子核心调控元件的研究方法是，先利用生物信息学的方法对潜在的DNA基序(Motif)进行预测，然后通过ChIP-seq技术进行进一步的验证。然而，现有方法在调控元件的预测时可能受到计算方法和数据库的影响，导致预测结果的误差，而且，ChIP-seq技术本身存在分辨率较低和信噪比较高的问题，很难实现精确的定位。与此同时，在进行增强子编辑或敲除时，由于现有的增强子序列长度较大，存在很多潜在的功能区域，很难精确定位核心调控元件，容易干扰了细胞生物学功能的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和供体ssDNA同源重组敲除增强子来研究增强子核心元件的细胞生物学功能，实现精确定位的目的。

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，包括以下步骤：

1)设计增强子的靶位点gRNA并插入CRISPR/Cas9质粒中，得到CRISPR/Cas9重组载体；

2)设计并制备增强子的供体ssDNA；

3)CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA共同转染细胞，得到转染细胞；

4)对所述转染细胞检测，得到增强子细胞生物学功能；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

优选的，步骤1)中当载体中启动子为U6启动子时，设计得到的增强子的靶位点gRNA的5'端以G开始。

优选的，所述增强子的靶位点gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3所示的gRNA。

优选的，靶位点gRNA插入CRISPR/Cas9质粒的多克隆位点为Bbs I酶切位点；

所述CRISPR/Cas9质粒为px458。

优选的，步骤2)中所述增强子的供体ssDNA的设计方法包括以下内容：

B1.以Cas9蛋白在基因组中的切割位点为中心，截取上游90bp和下游90bp分别作为ssDNA的左右同源臂，其中下游的90bp删除了25bp的增强子核心元件序列并在基因组上向3'端延伸了25bp以补齐下游的90bp序列；

B2.将gRNA识别位点进行突变设计，引入基因组中该区域不存在的内切酶位点；

B3.将PAM序列的NGG突变为NCG。

优选的，供体ssDNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQ IDNO:6所示的供体ssDNA。

优选的，所述CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA的质量比为3:2；

细胞的转染体系为250μL Opti-MEM培养基、7.5μL Lipofectmine 3000试剂、1.5μg质粒DNA、1μg ssDNA和5μL P3000试剂。

优选的，所述检测包括所述转染细胞中增强子的检测、所述转染细胞的细胞增殖活性和靶基因表达情况检测。

优选的，所述转染细胞中增强子的检测采用普通PCR扩增的方法进行；

普通PCR扩增的反应体系为95℃，5min预变性；95℃，1min，65℃，30sec，72℃，1min，30个循环，每个循环退火温度递降0.8℃，延伸时间1kb/30s；

普通PCR扩增用引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12所示的引物对。

优选的，所述靶基因表达情况检测包括以ACTB基因为内参基因，采用RT-qPCR方法检测靶基因；

所述转染细胞的细胞增殖活性的检测包括CCK8细胞增殖活性检测和EdU细胞增殖活性检测。

本发明提供的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，利用CRISPR/Cas9精确切割基因组中增强子核心元件的靶位点，同时设计供体ssDNA通过同源重组的方式在动物细胞中进行核心元件的定点删除，然后对转染细胞进行目的检测来研究该增强子核心元件在细胞中发挥增强靶基因表达的细胞生物学功能。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行靶位点的切割并结合ssDNA的定点整合，能够实现增强子核心调控元件的精确删除；同时本发明在设计ssDNA序列和gRNA时，将结合位点精确定位至25bp的序列长度范围，有效排除了多余序列的影响因素，同时提高了功能研究的准确性，与此同时通过对ssDNA的精细设计，实现了元件的高效定点删除，其操作简便，技术体系稳定，为调控元件功能研究提供了便利。

同时，本发明提供的方法，具有广泛的适用性，可以用于动植物细胞的增强子核心调控元件细胞生物学功能研究，尤其适用于动物，例如但不限于实验动物如小鼠、果蝇、斑马鱼等。

进一步的，本发明在进行供体ssDNA序列设计时，去除了PAM序列，免除了新位点被在此切割的可能，并且在序列中引入了基因组原先位点中没有的内切酶位点，后续阳性克隆基因型的鉴定提供了有利条件。

附图说明

图1A为本发明实施例的gRNA设计参数设置示意图；

图1B为本发明实施例的gRNA设计结果示意图；

图1C为本发明实施例的enhancer1相关gRNA设计结果；

图1D为本发明实施例的enhancer2相关gRNA设计结果；

图1E为本发明实施例的enhancer3相关gRNA设计结果；

图2为本发明实施例的px458载体图谱；

图3A为本发明实施例的ssDNA_enhancer1测序验证结果；

图3B为本发明实施例的ssDNA_enhancer2测序验证结果；

图3C为本发明实施例的ssDNA_enhancer3测序验证结果；

图4为本发明实施例的单克隆形态示意图；

图5A为本发明实施例的ssDNA设计及基因型检测示意图；

图5B为本发明实施例的增强子敲除阳性克隆酶切鉴定结果；

图6为本发明实施例的靶基因Cdh1表达检测结果；

图7为本发明实施例的三个增强子敲除细胞的CCK8增殖活性检测结果；

图8为本发明实施例的三个增强子敲除细胞的EDU细胞增殖能力检测。

具体实施方式

2)设计并制备增强子的供体ssDNA；

4)对所述转染细胞检测，得到增强子细胞生物学功能；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

本发明设计增强子的靶位点gRNA并插入CRISPR/Cas9质粒中，得到CRISPR/Cas9重组载体。

在本发明中，增强子的靶位点gRNA优选采用gRNA的在线设计方法。在本发明实施例中，所述gRNA的在线设计使用Lei Stanley Qi Lab的http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp进行。本发明对所述gRNA的在线设计的具体操作步骤不做具体限定，采用本领域所熟知的gRNA的在线设计的常用方法即可。当载体中启动子为U6启动子时，设计得到的增强子的靶位点gRNA的5'端优选以G开始，优选将设计得到的gRNA5'端第一个碱基替换为G。

在本发明中，当所述增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO:13时，所述增强子的靶位点gRNA优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的gRNA。当所述增强子的核苷酸序列为SEQID NO:14时，所述增强子的靶位点gRNA优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的gRNA。当所述增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO:15时，所述增强子的靶位点gRNA优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的gRNA。

在本发明中，所述CRISPR/Cas9质粒优选为px458。所述靶位点gRNA插入CRISPR/Cas9质粒的多克隆位点优选为Bbs I酶切位点。构建CRISPR/Cas9重组载体时，靶位点gRNA的正链为CACC-gRNA，靶位点gRNA的负链为AAAC-gRNA，通过粘性末端的互补将gRNA连入载体。本发明对插入的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切、连接的方法即可。构建得到CRISPR/Cas9重组载体后，优选还包括阳性CRISPR/Cas9重组载体的鉴定。所述鉴定方法优选将构建的载体导入大肠杆菌中进行培养，AMP筛选，得到的单菌落培养后提取质粒，测序。将测序正确的重组载体进行后续应用。

本发明设计并制备增强子的供体ssDNA。

在本发明中，所述增强子的供体ssDNA的设计方法优选包括以下内容：

B1.以Cas9蛋白在基因组中的切割位点为中心，截取上游90bp和下游90bp分别作为ssDNA的左右同源臂，其中下游的90bp删除了25bp的增强子核心元件序列并在基因组上向3'端延伸了25bp以补齐下游的90bp序列，供体ssDNA的序列长度为180bp；

B2.将gRNA识别位点进行突变设计，引入基因组中该区域不存在的内切酶位点，例如Hind III的酶切点位；

B3.将PAM序列的NGG突变为NCG。

在本发明中，当所述增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO:13时，供体ssDNA包括核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4所示的供体ssDNA。当所述增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO:14时，供体ssDNA包括核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5所示的供体ssDNA当所述增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO:15时，供体ssDNA包括核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6所示的供体ssDNA。本发明对所述供体ssDNA的制备没有特殊限制，采用本领域所熟知的供体ssDNA的制备方法即可，例如人工合成。在本发明实施例中，所述供体ssDNA委托金唯智公司合成。

得到CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA后，本发明将所述CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA共同转染细胞，得到转染细胞。

在本发明中，所述细胞优选为真核细胞，更优选为动物细胞，例如小鼠胚胎干细胞。在本发明实施例中，所述小鼠胚胎干细胞为mESCs E14。

在本发明中，所述转染优选利用Lipo3000转染细胞。所述CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA的质量比优选为3:2。细胞的转染体系优选为250μL Opti-MEM培养基、7.5μLLipofectmine 3000试剂、1.5μg质粒DNA、1μg ssDNA和5μLP3000试剂。

在本发明中，得到转染细胞后，优选还包括单克隆铺板、单克隆挑选、单克隆培养。

得到转染细胞后，本发明对所述转染细胞检测，得到增强子细胞生物学功能。

在本发明中，所述检测优选包括所述转染细胞中增强子的检测、所述转染细胞的细胞增殖活性和靶基因表达情况检测。所述转染细胞中增强子的检测优选采用普通PCR扩增的方法进行。普通PCR扩增的反应体系为95℃，5min预变性；95℃，1min，65℃，30sec，72℃，1min，30个循环，每个循环退火温度递降0.8℃，延伸时间1kb/30s。普通PCR扩增的所用的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示的引物对(用于扩增增强子SEQID NO:13)、核苷酸序列如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示的引物对(用于扩增增强子SEQID NO:14)和核苷酸序列如SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12所示的引物对(用于扩增增强子SEQ ID NO:15)。

在本发明中，所述靶基因表达情况检测优选包括以ACTB基因为内参基因，采用RT-qPCR方法检测靶基因。本发明中，所述靶基因为Cdh1。所述用RT-qPCR扩增用引物信息如下：Cdh1-F:CTGAGATGGACAGAGAAGAC(SEQ ID NO:16)，Cdh1-R:CATTGACGTCTAACAGGACC(SEQ IDNO:17)，ACTB-F：TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC(SEQ ID NO:18)，ACTB-R：CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA(SEQ ID NO:19)。RT-qPCR扩增的扩增程序：95℃预变性30sec；95℃，10sec，60℃，30sec，40个循环；溶解曲线，95℃，15sec，60℃，60sec，95℃，15sec。

在本发明中，所述转染细胞的细胞增殖活性的检测包括CCK8细胞增殖活性检测和EdU细胞增殖活性检测。本发明对所述CCK8细胞增殖活性检测和EdU细胞增殖活性检测方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞增殖活性检测方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、靶位点的确定

增强子核心元件序列信息来源于公开号CN110885845A、专利名称为一种基于随机序列利用载体筛选活性增强子的方法的专利的数据。选取了其中的三个增强子核心元件(它们的靶基因为Cdh1基因)。序列信息如下：

>enhancer1_mm9_dna range＝chr8:109102516-1091025405'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none

GGCTTCTGGGTTTGTCATTCCTCAG(SEQ ID NO:13)

>enhancer2_mm9_dna range＝chr8:109211057-1092110815'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none

CCCACACCAGGGATTAAACAAAAAA(SEQ ID NO:14)

>enhancer3_mm9_dna range＝chr8:109499126-1094991505'pad＝03'pad＝0strand＝+repeatMasking＝none

AAGAACACCTAAAAATGCAAGCCCA(SEQ ID NO:15)

2、gRNA的在线设计

利用在线网站平台Lei Stanley Qi Lab的http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp进行gRNA设计(图1A)。靶位点的设计以G开始，这是由表达载体上的U6启动子决定的；尽量避开GC富集区域，以防止甲基化对互补配对可能的干扰；选择特异性位点，降低脱靶概率。具体操作步骤如下：

(1)选择Using nuclease，利用经典的spCas9酶进行基因组切割(图1A)。

(2)选择物种，本实施例的物种为小鼠(图1A)。

(3)输入序列信息，点击CRISPR-ERA search(图1A)。

(4)根据E+S score的数值选择排名靠前的gRNA序列(图1B)。在UCSC中浏览和提取拟定的gRNA序列信息(图1C，图1D，图1E)。

(4)gRNA序列选择：分别选取排名为第一的gRNA作为enhancer1至enhancer3位点相关gRNA序列进行后续的实验。gRNA信息如下：

>enhancer1_gRNA sequence

TGGCCTCTTTATTAACCTAC(SEQ ID NO:20)

应U6启动子的要求，去掉5'的T。

>enhancer1_gRNA sequence_option

GGCCTCTTTATTAACCTAC(SEQ ID NO:1)

>enhancer2_sgRNA sequence

GACTGTCTCAATGCTCTAGG(SEQ ID NO:2)

>enhancer3_sgRNA sequence

TAAACAAGCTCACTGTGTAG(SEQ ID NO:21)

应U6启动子的要求，去掉5'的T,替换成G

>enhancer3_sgRNA sequence_option

GAAACAAGCTCACTGTGTAG(SEQ ID NO:3)

三条gRNA在基因组中的识别位点信息如下：

>enhancer1_gRNA target_mm10_dnarange＝chr8:106578549-106578567

GGCCTCTTTATTAACCTAC(SEQ ID NO:22)

>enhancer2_gRNA target_mm10_dnarange＝chr8:106687099-106687117

CCTAGAGCATTGAGACAGTC(SEQ ID NO:23)

>enhancer3_gRNA target_mm10_dnarange＝chr8:106975163-106975181

AAACAAGCTCACTGTGTAG(SEQ ID NO:24)。

3、px458表达载体构建

(1)px458载体骨架的U6 promoter和gRNA scaffold之间有两个Bbs I酶切位点(图2)，利用Bbs I进行酶切，通过粘性末端的互补将gRNA连入载体。

(2)合成gRNA寡核苷酸链，正链：CACC-gRNA，负链：AAAC-gRNA，用ddH₂O溶解gRNAprimer，浓度100μM，各取1μL，6.5μL ddH₂O，1μL 10×T4ligationbuffer(NEB)，0.5μL T4PNK(NEB M0201S)配制成10μL退火反应体系，在PCR仪中进行退火和磷酸化。反应程序：37℃，30min，95℃5min，梯度降温至25℃，5℃/min。

(3)1:200稀释退火产物。取6μL退火产物，加入1μL线性化的质粒，1μL 10×T4ligationbuffer，1μL T4 DNA ligase，1μL ddH₂O，配制成10μL连接反应体系，室温连接4～6h。

(4)进行大肠杆菌感受态转化、涂AMP板和克隆测序。

于冰上解冻感受态细胞，取10μL连接产物直接加入100μL感受态中，冰浴30min，然后进行42℃水浴热激45s，立即置于冰上冷却2～3min，加入900μL LB(无抗生素)，恒温摇床中37℃复苏1h(200～250rpm)，取100μL菌液均匀涂布至AMP培养板中，于37℃培养12～16h，随机挑取3～5个菌体单克隆进行sanger测序，测序引物：hU6-F:GAGGGCCTATTTCCCATGATT(SEQ ID NO:25)。

测序结果见图3A、图3B和图3C。

(5)阳性质粒克隆的菌液扩大培养与质粒提取。

每管加入30mL LB中，30μL Amp，恒温摇床37℃，200rpm，摇菌12～16h。菌液5000×g室温离心10min，收集菌体沉淀，小心除去上清，加250μL SolutionⅠ/RNase A，涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌体，加250μL的SolutionⅡ，轻轻来回颠倒混匀4～6次，得到澄清的裂解液。在室温孵育2min，加125μL的预冷BufferN3(提前置于冰上)，颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀，12000×g 25℃离心10分钟，小心移上清至干净的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution。颠倒混匀7～10次，在冰上孵育10min，孵育过程中可颠倒几次。42℃孵育5min，溶菌产物再次变浑浊，12000×g 25℃离心3min。转移上清至新的1.5mL离心管中，加入0.5倍体积96％～100％的乙醇(室温)，颠倒混匀6～7次，室温孵育1～2min，取混合液加入到一个干净的HiBindTM DNA Mini柱装配与2mL的收集管内，10000×g室温离心1min过柱，弃滤液。取500μL BufferHB洗柱，离心过柱如上。加700μL DNA Wash Buffer洗柱两遍，离心过柱如上。弃滤液，将空柱子套回离心管，以最大转速(≥13000×g)离心2min，干燥柱子。将柱子套在一个新的1.5mL离心管中，取80μL Endotoxin-Free Elution Buffer加在柱子上，以最大转速(≥13000×g)离心1min洗脱质粒，用于后续实验。

实施例2

1、ssDNA的设计与制备

以Cas9蛋白在基因组中的切割位点为中心，截取上游90bp和下游90bp分别作为ssDNA的左右同源臂，其中下游的90bp删除了25bp的增强子核心元件序列并在基因组上向3'端延伸了25bp以补齐下游的90bp序列，设计的ssDNA长度为180bp。与此同时，将gRNA识别位点进行突变设计，引物入基因组中该区域不存在的内切酶位点以便于后续的基因型检测，并将PAM序列的NGG突变为NCG以防止Cas9蛋白对编辑位点的重复切割。ssDNA设计原理示意图详见图5A。

将设计的ssDNA序列信息提供给金唯智公司，委托其进行合成，并提供2μg的干粉产品。ssDNA序列信息如下所示。其中标实线下划线的为左同源臂，虚线下划线的为右同源臂，斜体字母为Hind III酶切位点。序列验证的测序结果见图3A～图3C。

ssDNA_enhancer1:Length:180

和/或ssDNA_enhancer2:Length:180

ssDNA_enhancer3:Length:180

实施例3

1、细胞转染

(1)利用Lipo3000转染细胞，细胞铺板数量应该适当调整，转染时细胞生长密度30％～60％。6孔板细胞铺板量为1.5×10⁵/孔～1.8×10⁵/孔。参考试剂说明书进行转染操作。本实施例所使用的细胞为小鼠胚胎干细胞(mESCs，E14)。

(2)转染实验前，提前更换新鲜的全培养基，将Opti-MEM培养基、Lipofectmine3000试剂和P3000试剂平衡至室温，冻存的质粒DNA在4℃融化备用。

(3)培养体系在24孔板中配制，EP管可能会吸附脂质体，降低转染效率。用100μLOpti-MEM培养基润洗一下24孔板，避免转染体系在孔板中的残留导致转染体系的体积不准。以6孔板中一孔培养细胞的转染为例，配制转染体系：①125μL Opti-MEM培养基中加入7.5μL Lipofectmine 3000试剂，用200μL枪头吹打15次，充分混匀；②125μL Opti-MEM培养基中加入1.5μg质粒DNA、1μg ssDNA和5μL P3000试剂，用200μL枪头吹打15次，充分混匀。将①和②的溶液以1:1比例混合，用200μL枪头吹打15次，充分混匀，室温孵育10～15min。注意此过程中动作应尽量轻柔，孵育好的转染体系一定不能剧烈晃动更不能用移液器吹打。用1mL移液器缓慢吸取转染体系，逐滴、悬空、均匀的将转染体系缓慢加入6孔板的细胞中，将6孔板放入二氧化碳培养箱中继续培养24h后更换新鲜全培养基，观测转染效率或进行后续的实验。转染体系分别构建，E1，E2和E3分别单独、两两组合或三者共同转染的细胞株，分别记为EO(E1)、EO(E2)、EO(E3)、EO(E1，E2)、EO(E2，E3)、EO(E1，E3)，EO(E1，E2，E3)。

2、单克隆铺板

在明胶包被的60mm培养皿中铺板1000～5000个细胞，每天更换完全培养基，单克隆生成至直径200μm以上即可进行挑选，一般需要培养5～7天。

3、单克隆挑选

提前将96孔板用明胶包被，并在每孔中加入约100μL完全培养基。可以用10mL移液管加液，1滴液体约50μL。用200μL移液器配备带滤芯的吸头挑选单克隆，每个培养皿随机挑选20～30个单克隆，一般以单克隆的直径大小为统一判定标准(图4)。基因敲除细胞代次计为G0代。

4、单克隆培养

单克隆在96孔板中培养24h后，将其传代至48孔板中培养48h即可进行基因型的鉴定。基因敲除细胞代次记为G1代，以此类推。48孔板中的细胞用100μL消化酶进行消化，然后加入300μL完全培养基终止消化，用带滤芯的200μL吸头轻轻吹打细胞15次使其成为单细胞状态。每孔取出200μL细胞悬液至200μL PCR管中用于基因型的鉴定。注意一定要将孔板中每孔的编号和PCR管的编号一一对应。48孔板中每孔添加300μL完全培养基，将剩余的细胞继续培养24～48h，根据基因型的鉴定结果将阳性的细胞冻存或传代至12孔板进行扩大培养。

5、阳性单克隆的鉴定

将PCR管中的细胞以300～500×g于室温离心5min，吸弃培养基。然后每管中加入30μL细胞裂解液进行裂解(50mM KCl，1.5mM MgCl₂，10mM Tris-HCl，pH值8.5，0.5％NonidetP40，0.5％Triton X-100，10μg/ml Proteinase K)，裂解条件为65℃，30min，95℃，10min。裂解产物可以在4℃保存1个月，或直接用于PCR扩增。20μL PCR扩增体系中加入1μL裂解产物，利用2×诺唯赞的高保真酶预混液进行扩增，扩增程序为Touchdown(95℃，5min预变性；95℃，1min，65℃，30sec，72℃，1min，30个循环，每个循环退火温度递降0.8℃)，延伸时间1kb/30s。扩增引物信息如下：

Enhancer1_F:CTCAGACTCAGAGATCCCTC(SEQ ID NO:7)

Enhancer1_R:CTCTGCCTCTTGTAGGGAAG(SEQ ID NO:8)

Enhancer2_F:TCCATCAGATTGGCCTGTAG(SEQ ID NO:9)

Enhancer2_R:AACTGCTCTGAGCACCAGAC(SEQ ID NO:10)

Enhancer3_F:GTCAGTGCTCTTATCTGCTG(SEQ ID NO:11)

Enhancer3_R:GCAGAGCTGTCTACATAGTG(SEQ ID NO:12)。

利用HindIII进行PCR扩增产物的酶切鉴定以确定阳性克隆的基因型。

结果见图5A和图5B。其中enhancer1至enhancer3引物的扩增产物长度分别888bp、1029bp和1022bp，如果基因型为野生型，则这些序列中没有HindIII酶切位点，无法被该酶切割，以此作为敲除细胞基因型的判定标准。如图5B所示，它们均能被酶切，且条带符合预期的结果，即Enhancer1(504bp+384bp)、Enhancer2(699bp+330bp)、Enhancer3(580bp+442bp)，与此同时无野生型条带，表明其为双等位基因的敲除。

6、靶基因表达量检测

提取细胞的总RNA，利用反转录试剂盒进行cDNA的合成，然后通过定量试剂盒进行基因表达量的相对定量，以ACTB基因为内参基因。靶基因Cdh1表达检测结果见图6。引物信息如下：Cdh1-F:CTGAGATGGACAGAGAAGAC(SEQ ID NO:16)，Cdh1-R:CATTGACGTCTAACAGGACC(SEQ ID NO:17)，ACTB-F：TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC(SEQ ID NO:18)，ACTB-R：CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA(SEQ ID NO:19)。定量PCR扩增程序：95℃预变性30sec；95℃，10sec，60℃，30sec，40个循环；溶解曲线，95℃，15sec，60℃，60sec，95℃，15sec。

7、CCK8细胞增殖活性检测

在96孔板中接种细胞悬液(100uL，5000～10000个细胞)，培养板于培养箱中培养24小时(37℃，5％二氧化碳条件)。向每孔中加入10μL CCK-8溶液(Dojindo)，在培养箱中孵育1～4小时后用酶标仪测定450nm处的吸光度，以吸光度值为标准比较不同细胞的增殖活性。

如图7所示，E1、E2、E3三敲的细胞的CCK8反应液的OD值较野生型细胞具有显著性的提高，而该OD值能够间接反映细胞的增殖速率，即OD值越高，增殖的细胞数量越多。

8、EdU细胞增殖检测

EdU细胞增殖检测试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司。细胞的增殖检测流程参照试剂说明书进行，具体操作如下：

(1)EdU标记：用DMEM完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，吸出培养基并用PBS洗1～2次，每次5min。细胞固定：每孔加入50μL细胞固定液(4％多聚甲醛)，在室温孵育30min，倒掉固定液；每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸溶液，脱色摇床孵育5min，用100μL PBS脱色摇床清洗5min；每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗5min。

(2)染色：每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液(见表1)，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10min，弃渗透剂；DNA染色：用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst 33342反应液，避光保存；每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；每孔每次加入100μL PBS清洗1～3次；染色完成后立即进行观测。

表1

染色反应液的配制参考(现用现配)

结果见图8。如图所示，敲除细胞的EDU染色阳性细胞数量(绿色)明显多于野生型细胞，EDU染色能够标记增殖的细胞，表明敲除细胞的增殖速率高于野生型细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院农业基因组研究所

<120> 一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcctcttta ttaacctac 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactgtctca atgctctagg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaacaagct cactgtgtag 20

<210> 4

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttaatggct gctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 60

tttcaaagcc acttggcctc tttattaagc ttcacgtgtc ttgagacttg attcctgtct 120

agatccctct tattccagaa atgacaggat ttccatgtac ctgcatcaat gcatcttagc 180

<210> 5

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccaccagtc ctggggctct ggtatttata ctttctccag aatccccaga actaaaccat 60

ctgcagctga caaagatcat gccccgtcct aaagctttga gacagtcaca attaacggct 120

gtagacaaac tgaagcagtc ccatatatat attcatataa cataaccgaa atcaaaattc 180

<210> 6

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagtgtggg taatgagtga ctggatcagt gtcgaaggga acagtttccg catctttact 60

tatggaaggg tcttaaacaa gcttactgtg tagccgtttg cacagccaga tttaattact 120

actgcctgtc tcctcacggg tgtttaaaat aaacttgcat attctgttac agtttaagaa 180

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcagactca gagatccctc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctctgcctct tgtagggaag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccatcagat tggcctgtag 20

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aactgctctg agcaccagac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcagtgctc ttatctgctg 20

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcagagctgt ctacatagtg 20

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcttctggg tttgtcattc ctcag 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccacaccag ggattaaaca aaaaa 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagaacacct aaaaatgcaa gccca 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgagatgga cagagaagac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cattgacgtc taacaggacc 20

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tggtgggtat gggtcagaag gactc 25

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

catggctggg gtgttgaagg tctca 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tggcctcttt attaacctac 20

<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taaacaagct cactgtgtag 20

<210> 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggcctcttta ttaacctac 19

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctagagcat tgagacagtc 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aaacaagctc actgtgtag 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gagggcctat ttcccatgat t 21

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)设计并制备增强子的供体ssDNA；

3)用CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA共同转染细胞，得到转染细胞；

4)对所述转染细胞检测，得到增强子细胞生物学功能；

步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。

2.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，步骤1)中当载体中启动子为U6启动子时，设计的增强子的靶位点gRNA的5'端以G开始。

3.根据权利要求2所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，所述增强子的靶位点gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3所示的gRNA。

4.根据权利要求1～3任意一项所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，靶位点gRNA插入CRISPR/Cas9质粒的多克隆位点为Bbs I酶切位点；

所述CRISPR/Cas9质粒为px458。

5.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，步骤2)中所述增强子的供体ssDNA的设计方法包括以下内容：

B1.以Cas9蛋白在基因组中的切割位点为中心，截取上游90bp和下游90bp分别作为ssDNA的左右同源臂，其中下游的90bp序列删除了增强子核心元件序列并在基因组上向3'端延伸了增强子序列长度以补齐下游的90bp序列；

B3.将PAM序列的NGG突变为NCG。

6.根据权利要求5所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，所述供体ssDNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和/或SEQID NO:6所示的供体ssDNA。

7.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9重组载体和供体ssDNA的质量比为3:2；

8.根据权利要求1～3和5～7任意一项所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，所述检测包括所述转染细胞中增强子的检测、所述转染细胞的细胞增殖活性和靶基因表达情况的检测。

9.根据权利要求8所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，所述转染细胞中增强子的检测采用普通PCR扩增的方法进行检测；

普通PCR扩增用引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示的引物对、核苷酸序列如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO:11/SEQID NO:12所示的引物对。

10.根据权利要求8所述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术分析增强子细胞生物学功能的方法，其特征在于，所述靶基因表达情况检测包括以ACTB基因为内参基因，采用RT-qPCR方法检测靶基因；