CN112469730A

CN112469730A - 用于治疗癌症的ccl21和检查点抑制剂

Info

Publication number: CN112469730A
Application number: CN201980045574.1A
Authority: CN
Inventors: S·M·杜比内特; J·M·李; B·刘; R·萨利赫拉德; S·莎玛
Original assignee: University of California; US Department of Veterans Affairs VA
Current assignee: University of California; US Department of Veterans Affairs VA
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2021-03-09
Also published as: EP3790895A4; US20220177534A1; EP3790895A1; WO2019217898A1; JP2021523237A

Abstract

本公开总体上涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的树突细胞与抗PD‑1抗体的组合，所述树突细胞包括人CCL21基因。一方面，所述治疗适合患有具有高突变负荷的肿瘤的患者。

Description

用于治疗癌症的CCL21和检查点抑制剂

政府支持声明

本发明是在由美国国立卫生研究院(NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH)授予的授权号CA105705下由政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本公开总体上涉及治疗癌症的方法，所述方法包括将表达CCL21的自体抗原呈递细胞与检查点抑制剂(如抗PD-1抗体)组合施用，以减少受试者的癌症生长和其它症状。

背景技术

在美国和世界，肺癌是癌症死亡的最常见原因(1、2)。仅在美国，每年大约有20万人被诊断患有肺癌。在诊断的5年内，几乎85％的肺癌患者将死于所述疾病(3)。高病死率是由两个最主要问题引起的。首先，患者经常被诊断患有晚期疾病。其次，即使在诊断患有早期疾病并已接受治疗的患者中，复发也是常见的。因此，被诊断患有肺癌的大多数患者将在其过程中的某一点患有转移性疾病。

超过85％的肺癌患者患有非小细胞肺癌(NSCLC)，其是肺癌组织学的一组(腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌)(4)。转移性NSCLC具有不良预后，其中大多数患者不能实现对化疗的客观应答(13)。化学疗法通常还与不利的副作用概况相关。美国癌症协会(AMERICANCANCER SOCIETY)的统计揭示了转移性NSCLC的五年生存期为大约1％。对于肿瘤在EGFR或ALK融合中具有活化突变的患者，所述选择在过去的十年中已经改进，但是在PD-1/PD-L1轴的抑制剂的可获得性之前，对于85％的不具有这些分子异常的患者观察到很少的改进。

尽管已经证明PD-1/PD-L1轴的抑制在一些NSCLC患者中是非常有效的方法，但是大多数患者并未从当前的免疫治疗方法中受益。PD-1抑制剂的初步评估包含先前已经接受标准基于铂的化学疗法的患者(12、14-18)。包含PD-1抑制剂纳武单抗(NIVOLUMAB)和派姆单抗(PEMBROLIZUMAB)以及PD-L1抑制剂阿特珠单抗(ATEZOLIZUMAB)的各种药剂的研究显示大约20％的患者有客观应答。通常看到持久的应答。

在KEYNOTE-024试验中，将未经过先前的化学疗法并且在其肿瘤细胞的至少一半中具有PD-L1染色的转移性NSCLC患者随机分配到派姆单抗或基于铂的化学疗法(5)。将近一半的患者用派姆单抗实现了客观应答；并且派姆单抗导致比化学疗法更长的无进展生存期和总体生存期。

与限于在其细胞的至少一半中具有PD-L1表达的患者的KEYNOTE-024试验相反，用PD-1抑制剂纳武单抗CHECKMATE 026的类似设计的研究包含具有较低PD-L1染色水平的患者(初步分析是在其肿瘤细胞的至少5％中具有染色的患者中)(19)。CHECKMATE 026研究未显示无进展生存期的主要终点的益处，其中中位数和危害比两者在数值上均有利于化学疗法。因此，仍然需要用于初始治疗在其肿瘤细胞的至少一半中不具有PD-L1表达的患者的转移性NSCLC的免疫治疗方法。这包含大多数转移性疾病患者。

患有IV期NSCLC并且PD-L1染色少于50％的患者目前接受基于铂的化学疗法。化学疗法的缺点众所周知。除了仅基于铂的化学疗法之外，唯一批准的治疗选择是这种化学疗法(即，卡铂和培美曲塞(PEMETREXED))与派姆单抗的组合。基于非鳞状NSCLC患者的培美曲塞的组织学特异性批准，这种组合仅在非鳞状疾病中批准。这种加速批准将需要完成用于完全批准的大型随机试验。

先前，许多肿瘤学家还未接受派姆单抗和化学疗法的组合。与仅任一种治疗相比，这种组合已经显示增加患者所经历的毒性。导致批准此方法的研究包含仅123名患者，并且与评估使用PD-1或PD-L1抑制剂的化学疗法的其它研究相比具有有利的结果(20)。进一步地，研究未被设计成稳健地评估生存期，并且因此仍然存在鉴于相关毒性的关于这种组合的价值的开放问题。最近，撤回了在欧洲批准这种组合的申请。然而,最近的研究报道了III期试验，所述试验表明与接受双重化学疗法的患者相比，不考虑PD-L1表达，晚期或转移性NSCLC患者的一线派姆单抗加上化学疗法(培美曲塞加上顺铂或卡铂)在中位数随访(10.5个月)时将死亡风险降低51％(GANDHI等人：“转移性非小细胞肺癌中的派姆单抗加上化学疗法(PEMBROLIZUMAB PLUS CHEMOTHERAPY IN METASTATIC NON-SMALL-CELL LUNGCANCER.)”,《新英格兰医学杂志(N ENGL J MED)》2018年5月31日；378(22):2078-2092)。

当前，没有批准的用于NSCLC的免疫疗法组合，如将PD-1或PD-L1抑制剂与被设计成增加免疫应答的第二药物组合。已经接受最感兴趣的组合是PD-1/PD-L1抑制剂和CTLA-4抑制剂的组合。纳武单抗(抗PD-1)和伊匹单抗(IPILIMUMAB)(抗CTLA-4)是黑素瘤中的这种类型的批准组合，所述黑素瘤是一种其中每种药剂均单独有效的疾病(21)。来自CHECKMATE227 III期临床试验的结果表明，与化学疗法相比，当用一线组合纳武单抗+伊匹单抗治疗时，不考虑肿瘤PD-L1的表达，晚期NSCLC(鳞状和非鳞状)和高肿瘤突变负荷的患者具有增加的无进展生存期(PFS)(HELLMANN等人：“具有高肿瘤突变负荷的肺癌中的纳武单抗加上伊匹单抗(NIVOLUMAB PLUS IPILIMUMAB IN LUNG CANCER WITH A HIGH TUMORMUTATIONAL BURDEN.)”,《新英格兰医学杂志》2018年5月31日；378(22):2093-2104)。

在另一个随机研究(MYSTIC研究，其是PD-L1抑制剂度伐鲁单抗(DURVALUMAB)和CTLA-4抑制剂曲美木单抗(TREMELIMUMAB)的研究)中，新闻稿(PRESS RELEASE)陈述了在其细胞的至少四分之一中具有PD-L1染色的患者中，使用组合疗法的无进展生存期并不比基于铂的化学疗法更好。

从患者的角度来看，用于转移性NSCLC的当前疗法显然是次优的(23)。细胞毒性化学疗法诱导显著的毒性，而没有能力治愈转移性NSCLC患者。用PD-1/PD-L1轴的抑制剂已经清楚地看到了持久的应答。然而，在作为此试验的一部分被评估的患者群体中，预期不超过15％的患者实现客观应答，并且预期持久应答甚至更少。在这种结果目前不太可能的环境中，特别是鉴于免疫治疗方法的通常有利的副作用概况，持久临床益处的潜力使得这种方法对于将适合于试验的患者群体是相当吸引人的。

公布为WO2016/073759的国际申请PCT/US2015/059297通过引用整体并入本文。

发明内容

本公开提供了一种用于治疗受试者的癌症和减少所述受试者的肿瘤进展的改进方法，所述方法包括施用次级淋巴组织细胞因子(SLC)多肽(也称为CCL21)或表达人CCL21基因的细胞与检查点抑制剂的组合。设想的是，施用的组合将改善单独施用检查点抑制剂的功效，特别是在其中少于50％的肿瘤细胞表达PD-L1蛋白的肿瘤群体中。

在各个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症或减少所述受试者的癌症的复发的方法，所述方法包括施用有效量的组合疗法，所述组合疗法包括：A)在第0天、第21天和第42天施用SLC(CCL21)多肽或包括载体-CCL21(载体-CCL21-DC)构建体的树突细胞，以及B)从第0天开始每三周施用有效量的抗PD-1抗体。

在各个实施例中，载体是病毒载体、脂质体或其它递送载体。在各个实施例中，病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、经过修饰的安卡拉病毒(ANKARA VIRUS)、辛德比斯病毒(SINDBIS VIRUS)、疱疹病毒、CMV或水疱性口炎病毒。在各个实施例中，腺相关病毒(AAV)选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或其组合。

在各个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症或减少所述受试者的癌症的复发的方法，所述方法包括施用有效量的组合疗法，所述组合疗法包括：A)在第0天、第21天和第42天施用包括腺病毒-CCL21(AD-CCL21-DC)构建体的树突细胞，以及B)从第0天开始每三周施用有效量的抗PD-1抗体。

在各个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的肺癌或减少所述受试者的肺癌的复发的方法，所述方法包括施用有效量的组合疗法，所述组合疗法包括：A)在第0天、第21天和第42天施用包括腺病毒-CCL21(AD-CCL21-DC)构建体的树突细胞，以及B)从第0天开始每三周施用有效量的抗PD-1抗体。在各个实施例中，抗PD-1抗体选自由以下组成的组：派姆单抗、纳武单抗、皮地利珠单抗(PIDILIZUMAB)和兰伯丽珠单抗(LAMBROLIZUMAB)。在各个实施例中，所述抗PD-1抗体是每三周以200MG的剂量施用的派姆单抗。

在各个实施例中，所述AD-CCL21-DC是以5×106个细胞/注射到3×107个细胞/注射的剂量施用的。在一些实施例中，所述AD-CCL21-DC剂量是5×106、1×107或3×107个细胞/注射。

在各个实施例中，癌症是实体瘤。所述方法中设想的示例性癌症在具体实施方式中进行更充分地描述。

在各个实施例中，所述癌症在少于50％的肿瘤细胞中表达PD-L1。在各个实施例中，所述癌症在50％或更多的肿瘤细胞中表达PD-L1。在一个实施例中，通过细胞的免疫组织化学染色来评估PD-L1在肿瘤细胞上的表达。在各个实施例中，受试者已经接受一线派姆单抗加上化学疗法，或可替代地，所述受试者用这种组合未能进行初始疗法。

在各个实施例中，癌症是肺癌。在各个实施例中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。在各个实施例中，肺癌是在少于50％的细胞中表达PD-L1的IV期NSCLC。

在各个实施例中，NSCLC或其它实体瘤是鳞状细胞或非鳞状细胞肿瘤。在各个实施例中，所述受试者患有高肿瘤突变负荷。可以通过例如来自FOUNDATIONONE(剑桥,马萨诸塞州)的诊断分析来监测肿瘤突变负荷，如FOUNDATIONONE CDX^TM、

或

在各个实施例中，所述患者具有可通过CT引导的介入或支气管镜检查接近的NSCLC肿瘤，并且所述患者未接受过NSCLC的全身性治疗。在各个实施例中，所述载体-CCL21-DC是通过CT引导的或支气管镜的IT注射施用的。

在各个实施例中，所述抗PD-1抗体是静脉内施用的。

在各个实施例中，所述载体-CCL21-DC增加了CD8 T细胞向肿瘤的浸润。在各个实施例中，与未接受组合疗法的受试者相比，经过治疗的受试者的CD8细胞增加了2倍或更多倍。

在各个实施例中，所述载体-CCL21-DC增加了肿瘤中的PD-L1表达。

在各个实施例中，所述树突细胞是来自所述患者的自体细胞。

在各个实施例中，所述CCL21包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在各个实施例中，所述腺病毒是复制缺陷型腺病毒载体。

在各个实施例中，肿瘤体积减小了20％或更多。在各个实施例中，所述受试者的肿瘤大小减小了约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。在各个实施例中，所述疗法降低了所述患者的肿瘤的转移速率和/或减缓了所述患者的所述肿瘤的进展。

在各个实施例中，所述抗PD-1抗体是在第0天、第21天和第42天在载体-CCL21-DC疗法之后1小时内施用的。

在各个实施例中，所述组合疗法增加了所述受试者的肿瘤抗原特异性CD8和CD4细胞的数量。

在各个实施例中，提供了一种治疗受试者的具有高突变负荷的癌症或实体瘤的方法，所述方法包括：A.向所述受试者施用(I)SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的细胞或(IV)其任何组合，以及B.向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。

在其各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：CTLA-4抑制剂、CTLA-4受体抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD1-L2抑制剂、4-LBB抑制剂、OX40抑制剂、LAG-3抑制剂、TIM-3抑制剂或其组合。

在其各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂是抗体，任选地单克隆抗体。

在其各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，任选地伊匹单抗或曲美木单抗(TREMILIMUMAB)。

在其各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的PD1抑制剂：纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、兰伯丽珠单抗、BMS-936559、阿特珠单抗以及AMP-224、AMP224、AUNP12、BGB108、MCLA134、MEDI0680、PDROOL、REGN2810、SHR1210、STIAL LOX、STIALL LO和TSR042。

在其各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的PD-L1抑制剂：BMS-936559、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB0010718C、ALN-PDL、BGBA317、KD033、KY1003、STIA100X、STIA1010、STIA1011、STIA1012和STIA1014。

在其各个实施例中，所述SLC多肽包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在其各个实施例中，将对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸插入到载体中，并且向所述受试者施用所述载体。在其各个实施例中，所述载体是腺病毒载体。在其各个实施例中，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。

在其各个实施例中，包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。在其各个实施例中，所述APC是树突细胞。在其各个实施例中，所述树突细胞对所述受试者是自体的。

在其各个实施例中，向所述受试者施用包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的至少或约1×10⁶个细胞。在其各个实施例中，所述细胞在24小时时间段内产生至少或约0.25NG的CCL21每1×10⁶个细胞。

在其各个实施例中，所述受试者包括实体瘤，并且向所述受试者瘤内施用所述细胞。

在其各个实施例中，所述实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)实体瘤。

在其各个实施例中，在免疫检查点抑制剂之前向所述受试者施用(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合。

在其各个实施例中，在所述免疫检查点抑制剂之前约2周向所述受试者施用(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合。在其各个实施例中，向所述受试者施用(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合多于一次。

在其各个实施例中，向所述受试者每月施用一次(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合。在其各个实施例中，向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂多于一次。在其各个实施例中，向所述受试者每2周施用一次所述免疫检查点抑制剂。

在各个实施例中，提供了一种治疗受试者的癌症或实体瘤的方法，所述方法包括以下步骤：A.鉴定高突变负荷在所述受试者的肿瘤中的存在；B.向具有高突变负荷肿瘤的所述受试者施用(I)SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的细胞或(IV)其任何组合，以及C.向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。

在其各个实施例中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，任选地伊匹单抗或曲美木单抗。

在其各个实施例中，在免疫检查点抑制剂之前向所述受试者施用(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合。在其各个实施例中，在所述免疫检查点抑制剂之前约2周向所述受试者施用(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合。

在其各个实施例中，向所述受试者施用(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合多于一次。在其各个实施例中，向所述受试者每月施用一次(I)所述SLC多肽；(II)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(III)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(IV)其任何组合。

在其各个实施例中，向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂多于一次。在其各个实施例中，向所述受试者每2周施用一次所述免疫检查点抑制剂。

在其任何上述实施例中，所述高突变负荷是由所述肿瘤的活检确定的。在其各个实施例中，确定肿瘤相关新抗原。在其各个实施例中，组合疗法的功效之后是所述肿瘤的新抗原态势(LANDSCAPE)的说明。

在其各个实施例中，所述肿瘤包括选自以下的突变：KRAS、TP53(KP)或STK11/LKB1或其任何组合。在其各个实施例中，所述肿瘤具有瘤内异质性。

在其各个实施例中，通过选自以下的诊断分析来确定肿瘤突变负荷：FOUNDATIONONE CDX^TM、

和

在其各个实施例中，所述肿瘤在表皮生长因子受体或间变性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合体中不具有活化突变。

在其各个实施例中，使用在治疗之前、治疗期间和治疗之后的体细胞突变负荷和肿瘤相关新抗原来启动、规定和监测疗法。

在各个实施例中，提供了一种用于治疗有需要的受试者的高突变负荷癌症或减少所述有需要的受试者的高突变负荷癌症的复发的方法，所述方法包括施用有效量的组合疗法，所述组合疗法包括：A)在第0天、第21天和第42天施用包括载体-CCL21(载体-CCL21-DC)构建体的树突细胞，以及B)从第0天开始每三周施用有效量的抗PD-1抗体，任选地其中所述载体是腺病毒载体(AD-CCL21-DC)。

在其各个实施例中，所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗和兰伯丽珠单抗。

在其各个实施例中，所述抗PD-1抗体是每三周以200MG的剂量施用的派姆单抗。

在其各个实施例中，所述AD-CCL21-DC是以5×106个细胞/注射到3×107个细胞/注射的剂量施用的。

在其各个实施例中，所述AD-CCL21-DC剂量是5×106、1×107或3×107个细胞/注射。

在其各个实施例中，肺癌是在少于50％的细胞中表达PD-L1的IV期NSCLC。

在其各个实施例中，所述患者具有可通过CT引导的介入或支气管镜检查接近的NSCLC肿瘤，并且所述患者未接受过NSCLC的全身性治疗。在其各个实施例中，所述AD-CCL21-DC是通过CT引导的或支气管镜的IT注射施用的。

在其各个实施例中，所述抗PD-1抗体是静脉内施用的。

在其各个实施例中，所述载体-CCL21-DC增加了CD8+ T细胞向肿瘤的浸润。

在其各个实施例中，与未接受组合疗法的受试者相比，经过治疗的受试者的CD8+细胞增加了2倍或更多倍。

在其各个实施例中，所述载体-CCL21-DC增加了肿瘤中的PD-L1表达。

在其各个实施例中，所述树突细胞是来自所述患者的自体细胞。

在其各个实施例中，所述CCL21包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在其各个实施例中，所述腺病毒是复制缺陷型腺病毒载体。

在其各个实施例中，肿瘤体积减小了20％或更多。在其各个实施例中，所述受试者的肿瘤大小减小了约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。

在其各个实施例中，所述疗法降低了所述患者的肿瘤的转移速率和/或减缓了所述患者的所述肿瘤的进展。

在其各个实施例中，所述抗PD-1抗体是在第0天、第21天和第42天在载体-CCL21-DC疗法之后1小时内施用的。

在其各个实施例中，所述组合疗法增加了所述受试者的肿瘤抗原特异性CD8和CD4细胞的数量。

在其各个实施例中，所述癌症的所述高突变负荷是由所述肿瘤的活检确定的。

在其各个实施例中，确定肿瘤相关新抗原。

在其各个实施例中，组合疗法的功效之后是所述癌症的新抗原态势的说明。

在其各个实施例中，所述癌症包括选自以下的突变：KRAS、TP53(KP)或STK11/LKB1或其任何组合。

在其各个实施例中，所述癌症具有瘤内异质性。

在其各个实施例中，通过选自以下的诊断分析来确定所述癌症的突变负荷：FOUNDATIONONE CDX^TM、

和

在其各个实施例中，所述癌症在表皮生长因子受体或间变性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合体中不具有活化突变。

在其各个实施例中，使用在治疗之前、治疗期间和治疗之后的体细胞突变负荷和肿瘤相关新抗原来确定、启动、规定或监测疗法。

附图说明

图1A-1D示出了组合疗法在NSCLC的体内模型中的效果。

图2A-2B是示出了I期试验中的剂量和剂量递增的示意图。

图3是概述了在派姆单抗毒性的情况下的方案图表。

图4示出了人CCL21(SEQ ID NO:1)和鼠CCL21(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

图5A-5D示出了组合疗法在具有低突变负荷(图5A，图5B)和高突变负荷(图5C，图5D)的肿瘤中的功效。

定义

如本文所使用的，“程序性细胞死亡蛋白1”或“PD-1”是指涉及通过与两个配体PD-L1和PD-L2结合而介导的免疫检查点阻断的细胞表面受体。PD-1与其配体的结合已经显示减少T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性活性。

可用于本发明方法的多肽涵盖天然存在的蛋白质及其变型和修饰形式两者。“SLC多肽或蛋白质”是指次级淋巴组织趋化因子(SLC)。次级淋巴组织细胞因子(SLC)多肽也称为CCL21。SLC包含天然存在的哺乳动物SLC及其变体和片段。优选地，SLC是人或小鼠来源的。最优选地，SLC是人SLC。人SLC已经被克隆和测序(参见例如，NAGIRA等人(1997)《生物化学杂志(J BIOL CHEM)》272:19518；所述文献的内容通过引用并入)。

如本文所使用的，“CCL21”、“CCL21基因”或“CCL21多肽或蛋白质”是指天然存在的哺乳动物CCL21及其变体和片段。优选地，CCL21是人的。因此，人CCL21的CDNA和氨基酸序列是本领域已知的(参见例如，登录号BAA21817和AB002409)。本发明的CCL21药剂包括天然CCL21多肽、天然CCL21核酸序列、多肽和核酸变体以及能够通过CCL21表达、活性和受体结合的操纵阻断免疫应答的其它组分。

小鼠SLC也已经被克隆和测序(参见例如，登录号NP_035465和NM_011335)。HROMAS等人(1997)《免疫学杂志(J.IMMUNOL)》1.59:2554；HEDRICK等人(1997)《免疫学杂志》159:1589；以及TANABE等人(1997)《免疫学杂志》1.59:5671；所述文献的内容通过引用并入本文。

用于本文所公开的方法中的SLC多肽可以是SLC变体、SLC片段、类似物和衍生物。术语“变体”是指表现出与所描述的类型或标准不同的分子，如在具体描述的蛋白质的一个或多个对应位置具有一个或多个不同氨基酸残基的蛋白质。类似物是变体蛋白的实例。如本文所使用的，SLC相关基因和SLC相关蛋白包含本文具体描述的SLC基因和蛋白，以及前述的在结构上和/或功能上类似的变体或类似物。SLC肽类似物通常共享至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的氨基酸同源性(使用BLAST标准)。SLC核苷酸类似物优选地共享50％、60％、70％、80％、90％或更多的核酸同源性(使用BLAST标准)。然而，在一些实施例中，如本领域的技术人员所理解的，较低的同源性是优选的，以便鉴于物种特异性密码子偏好和/或针对特定靶群体定制的最佳肽表位来选择优选的残基。

“类似物”意指任一者的类似物，如WO2016/073759中所描述的类似物，其通过引用整体并入本文。可以在公布为WO2016/073759的国际申请PCT/US2015/059297中找到用于组合疗法的制备、施用和其它方面的指导，所述国际申请通过引用整体并入本文。

人和鼠SLC多肽序列如下所示。

人SLC

MAQSLALSLLILVLAFGIPRTQGSDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCS

IPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGK KGKGSKGCKRTERS QTPKGP(SEQ ID NO:1)

鼠SLC

MAQMMTLSLLSLDLALCIPWTQGSDGGGQDCCLKYSQKKIPYSIVRGYRKQEPS

LGCPIPAILFLPRKHSKPELCANPEEGWVQNLMRRLDQPPAPGKQSPGCRKNRGTSKSGKKGKGSKGCKRTEQTQPSRG(SEQ ID NO:2)

“抗原呈递细胞”(APC)是能够使T细胞活化的细胞，并且包含但不限于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突细胞(DC)。术语“树突细胞”或“DC”是指在淋巴组织或非淋巴组织中发现的形态学类似的细胞类型的不同群体的任何成员。这些细胞的特征在于其独特的形态、高水平的表面MHC II类表达。DC可以从许多组织源分离。DC具有使MHC限制性T细胞敏化的高能力，并且在原位向T细胞呈递抗原方面非常有效。抗原可以是在T细胞发育和耐受性期间表达的自身抗原，以及在正常免疫过程期间存在的外源抗原。

在本文中使用术语“治疗有效量”来指示本公开的有效改善或减轻待治疗的疾病的症状或体征的靶特异性组合物的量。

如本文关于方法使用的术语“治疗(TREAT)”、“治疗(TREATED)”“治疗(TREATING)”和“治疗(TREATMENT)”是指暂时地或永久地、部分地或完全地消除、减少、抑制或改善事件、疾病或病状的临床症状、表现或进展。这种治疗不一定是绝对有用的。

术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理病状。本文考虑的示例性癌症在具体实施方式中进行更充分地描述。用于治疗或疗法目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包含人、家畜和农场动物，以及动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。

“癌症的治疗”是指以下效果中的一种或多种效果：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包含：(I)减缓和(II)完全生长停滞；(2)减少肿瘤细胞数量；(3)维持肿瘤大小；(4)减小肿瘤大小；(5)抑制，包含(I)减少，(II)减缓或(III)完全预防肿瘤细胞浸润到外周器官中；(6)抑制，包含(I)减少，(II)减缓或(III)完全预防转移；(7)增强抗肿瘤免疫应答，这可能导致(I)维持肿瘤大小；(II)减小肿瘤大小；(III)减缓肿瘤的生长；(IV)减少、减缓或预防侵入和/或(8)在某种程度上减轻与病症有关的一种或多种症状的严重性或数量。

如本文所使用的，“药物组合物”是指适合于向受试者动物(包含人和哺乳动物)施用的组合物。药物组合物包括药理学有效量的本发明的病毒或抗原组合物，并且还包括药学上可接受的载体。药物组合物涵盖包括构成药学上可接受的载体的一种或多种活性成分和一种或多种惰性成分，以及直接或间接由任何两种或更多种成分的组合、络合或聚合产生的任何产物的组合物。因此，本发明的药物组合物涵盖通过将本发明的化合物或缀合物与药学上可接受的载体混合而制成的任何组合物。

具体实施方式

本公开提供了一种用于使用包括CCL21基因的自体细胞和检查点抑制剂(如抗PD-1抗体)的组合来治疗癌症，具体地转移性非小细胞肺癌的方法。在一方面，患者患有高突变负荷肿瘤。这种肿瘤特别适合于用本文所描述的组合物进行治疗。可以以多种方式观察或监测用本发明的组合物治疗的效果，例如可以通过评估细胞因子谱的变化、评估肿瘤生长的抑制或肿瘤杀伤来观察效果，例如举几个非限制性实例，通过观察肿瘤大小的减小和/或与肿瘤和/或肿瘤生长相关的症状的严重性的减小、存活率增加。

在一方面，在进行这里所描述的研究中关于临床因素的包含和排除标准被设计成包含这个群体的大部分。如下文所述，诊断为转移性NSCLC的许多患者是所提出试验的潜在候选者，因为大约70％的患者在小于50％的肿瘤细胞中具有PD-L1染色(5)。

研究基本原理。从分子标志物的角度来看，大多数NSCLC患者也将适合所提出的研究。排除其肿瘤显示表皮生长因子受体(EGFR)或间变性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合体中的活化突变的患者，因为这些患者具有分子靶向的一线治疗选择。在西方群体中，大约15％的患者在这两种基因之一中具有基因组异常(6-11)。尽管在研究之间存在轻微差异，但是使用22C3测定，23-30％的NSCLC患者在其细胞的至少一半中具有PD-L1表达(5、12)。其余的70％患者(在其小于50％的细胞中具有PD-L1染色的那些患者)将满足PD-L1表达的合格标准，从而允许在所提出的研究中登记。

在小于一半的肿瘤细胞中具有PD-L1表达的NSCLC患者的应答率通常为15％或更低(12)。因此，此患者群体可以基本上受益于增加T淋巴细胞浸润和PD-L1上调的方法，这两者将增加对PD-1抑制剂应答的可能性。尽管使用PD-1/PD-L1抑制剂正在评估其它组合，但是这些组合中的许多组合(如添加化学疗法、放射或CTLA-4抑制剂)显著增加毒性超过仅使用PD-1抑制剂所观察到的毒性。

缺乏PD-1/PD-L1抑制剂的功效的最通常提出的原因是不存在T淋巴细胞浸润到肿瘤中。这导致开发可以将T细胞募集到肿瘤位点的疗法的基本原理。在瘤内AD-CCL21-DC的先前临床试验中，将T淋巴细胞募集到超过一半的所评估患者的肿瘤位点(22)。根据这些发现，PD-L1表达在肿瘤位点处增加，这潜在地通过阻止募集的T淋巴细胞介导抗肿瘤应答来限制AD-CCL21-DC的功效。组合的AD-CCL21-DC和PD-1抑制具有解决这两种疗法的实质性限制因素的潜力。

AD-CCL21-DC的毒性谱在发明人的先前研究中相当有利(22)。假设局部注射AD-CCL21-DC将导致全身性T淋巴细胞应答，所述应答将优先地扩增对肿瘤抗原具有特异性的T淋巴细胞群体，而如CTLA-4抑制剂等方法将诱导更全面的T细胞活化。因此，在本文中合理地预测，添加AD-CCL21-DC将几乎不向派姆单抗添加毒性同时增加功效。

尽管AD-CCL21-DC似乎是与已经批准用于NSCLC的那些疗法非常不同的疗法，但是随着本领域的进步，清楚的是，如果AD-CCL21-DC和派姆单抗的组合是有益的，则可以克服采用的潜在障碍。例如，CAR-T细胞作为细胞疗法现在被批准用于某些血液系统恶性肿瘤。类似地，T-VEC是用于治疗恶性黑素瘤的批准的可注射疗法。尽管所提出的疗法将是注射细胞疗法，但是构造和递送这种产物所需的所有必需基础设施均是可获得的并且在疗法将被潜在地批准时很可能是甚至更常见的。

所提出的研究是I期研究。派姆单抗最初是基于I期试验而批准的；然而，所述试验特别大(12)。预期所提出的试验的结果显示施用AD-CCL21-DC与派姆单抗的组合的可行性以及生成将有助于进一步更大研究的相关数据。如果这种方法是可行的并且潜在地有效的，则最可能的策略将是然后进行将派姆单抗加上AD-CCL21-DC与基于铂的化学疗法进行比较的随机研究，作为用于在少于一半的癌细胞中具有PD-L1染色的转移性NSCLC患者的初始全身性疗法。如果在比较试验时，在这些患者中化学疗法加上PD-1/PD-L1抑制剂或任何其它组合是经过批准和优选的选择，则经过批准和优选的组合将充当对照组(CONTROLARM)。

可能的是，在进行所提出的研究期间，将出现基于生物标志物的患者群体，所述患者群体将更可能受益于AD-CCL21-DC加上派姆单抗。如果是这种情况并且关于亚群体的数据是足够强的，则确认研究可能将仅限于被认为最有可能响应这种创新方法的那些患者。

PD-1。PD-1是CD28家族中的免疫球蛋白。PD-1是I型跨膜糖蛋白，其含有涉及配体结合的胞外IG可变型(V型)结构域和涉及胞内信号传导的胞质尾区(48)。PD-1与PD-L1(或其它配体PD-L2)的结合诱导SHP-1和SHP-2募集到PD-1，从而导致对于T细胞受体(TCR)信号传导必需的CD3Z、PKCΘ和ZAP70的脱磷酸化，以及T淋巴细胞活化的下调(49、50)。在健康状况下，PD-L1使不想要的免疫应答减弱，如自身免疫(51)。

派姆单抗是用于癌症免疫疗法的人源化抗PD-1抗体。派姆单抗是高度选择性的人源化MAB，其被设计成阻断PD-1与其配体、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡配体2(PD-L2)之间的相互作用。派姆单抗是在FC区具有稳定序列改变的IGG4/K同种型。衍生自氨基酸序列的重链和轻链的理论分子量(排除糖基化)分别为49.4千道尔顿(KDA)和23.7KDA。关于派姆单抗的详细信息在调查者的手册和批准的标签中进行描述。

测试派姆单抗在治疗NSCLC患者中的安全性和功效的临床试验已经导致批准用于这种疾病的药剂。KEYNOTE-001研究显示大约20％的患者具有适度副作用谱的应答(12)。重要的是，具有>50％PD-L1基线肿瘤染色的患者比具有<50％肿瘤PD-L1表达的患者经历了更大的来自抗PD-1疗法的益处，其中在具有>50％PD-L1染色的患者中，通过实体瘤应答评估标准(RECIST)标准定义的ORR为45.2％，对比在具有1-49％PD-L1染色的患者中的16.5％以及在具有<1％PD-L1染色的患者中的10.7％。在KEYNOTE-010 II/III期研究中，2MG/KG和10MG/KG Q3W的派姆单抗在随机的IV期预治疗的具有>1％PD-L1染色的患者中显示出超过75MG/M2 Q3W多西他赛(DOCETAXEL)的显著益处(17)。在KEYNOTE-024研究中，在具有>50％PD-L1染色的未接受过治疗的患者中，200MG的派姆单抗显示出超过调查者选择的标准护理化学疗法的显著益处(5)。尽管在NSCLC患者的亚组中对抗PD-1疗法作出稳健且持久的应答，但是大多数患者未对PD-1检查点抑制剂作为单一药剂作出应答(12)。因此，需要与PD-1抑制剂的合理且有效的组合策略以增强抗PD1疗法在晚期NSCLC患者中的功效。

已经在以下中描述了PD-1的抗体：美国专利第8,735,553号；第8,617,546号；第8,008,449号；第8,741,295号；第8,552,154号；第8,354,509号；第8,779,105号；第7,563,869号；第8,287,856号；第8,927,697号；第8,088,905号；第7,595,048号；第8,168,179号；第6,808,710号；第7,943,743号；第8,246,955号；以及第8,217,149号。

设想的是，任何已知的抗PD-1抗体可以用于本发明方法。在各个实施例中，抗PD-1抗体抑制或阻断PD-1受体与其配体、PD-L1和PD-L2中的一个或两个的结合。在示例性方面，与PD-1特异性结合的单克隆抗体是纳武单抗(BMS936558；百时美施贵宝公司(BRISTOLMEYERS SQUIBB))、派姆单抗(MK-3475；默克公司(MERCK))、皮地利珠单抗(PIDILIZUMAB)(CT-011；治疗技术公司(CURETECH))、兰伯丽珠单抗(LAMBROLIZUMAB)、BMS-936559、阿特珠单抗或AMP-224(GSK/阿帕里免疫公司(AMPLIMMUNE))、AMP224(医学免疫公司(MEDIMMUNE))；AUNP12(瑞迪博士实验室有限公司(DR.REDDY'S LABORATORIES LTD.))；BGB108(百济神州公司(BEIGENE))；MCLA134(MERUS BV)；MEDI0680(医学免疫公司)；PDR001(诺华公司(NOVARTIS))；REGN2810(再生元公司(REGENERON)/赛诺菲公司(SANOFI))；SHR1210(江苏恒瑞医药公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE)/因赛特公司(INCYTE))；STIA110X(索伦托公司(SORRENTO))；STIA1110(索伦托公司)；TSR042(安阿泰生物公司(ANAPTYSBIO)/特瑟若公司(TESARO))。在示例性方面，与PD1-L1特异性结合的单克隆抗体是BMS-936559(BMS/ONO)、MPDL3280A(罗氏公司(ROCHE)/基因泰克公司(GENENTECH))或MEDI-4736(医学免疫公司)、MSB0010718C(默克公司/雪兰诺公司(SERONO))、ALN-PDL(阿里拉姆制药公司(ALNYLAM))；BGBA317(百济神州公司)；KD033(卡德蒙公司(KADMON CORP.))；KY1003(科马布有限公司(KYMAB LTD.))；STIA100X(索伦托公司)；STIA1010(索伦托公司)；STIA1011(索伦托公司)；STIA1012(索伦托公司)；和STIA1014(索伦托公司)。

还已经显示PD-L1抑制剂在抑制膀胱癌、头颈癌和胃肠癌中的实体瘤方面是有效的(HERBST RS等人,《临床肿瘤学杂志(J CLIN ONCOL)》,31:3000(2013)；HEERY CR等人,《临床肿瘤学杂志》,32:5S,3064(2014)；POWLES T等人,《临床肿瘤学杂志》,32:5S,5011(2014)；SEGAL NH等人,《临床肿瘤学杂志》,32:5S,3002(2014))。

CCL21修饰的树突细胞。CCL21(也称为次级淋巴组织趋化因子(SLC)、EXODUS 2或6CKINE)是通常在高内皮小静脉中以及脾脏和淋巴结的T细胞区中表达的高内皮衍生的CC趋化因子，其强烈吸引原始T细胞和树突细胞(DC)(CYSTER等人,《实验医学杂志(J.EXP.MED.)》,189:447–450,1999.24；OGATA等人,《血液(BLOOD)》,93:3225–3232,1999；CHAN等人,《血液》,93:3610–3616,1999；HEDRICK等人,《免疫学杂志》,159:1589–1593,1997；HROMAS等人,《免疫学杂志》,159:2554–2558,1997；NAGIRA等人,《生物化学杂志》,272:19518–19524,1997；TANABE等人,《免疫学杂志》,159:5671–5679,1997；WILLIMANN等人,《欧洲免疫学杂志(EUR.J.IMMUNOL.)》,28:2025–2034,1998)。CCL21通过两个特异性G蛋白偶联的七跨膜结构域趋化因子受体CCR7和CXCR3来介导其作用(YOSHIDA等人,《生物化学杂志》273:7118；JENH等人,《免疫学杂志》162:3765)。然而CCR7在原始T细胞和成熟DC上表达，CXCR3优先地在具有记忆表型的产生TH1细胞因子的淋巴细胞上表达(YOSHIDA等人,《生物化学杂志》273:7118；JENH等人,《免疫学杂志》162:3765)。

CCL21化学吸引DC(KELLERMANN等人,《免疫学杂志》,162:3859–3864,1999)的能力是与其它趋化因子共有的性质(SALLUSTO等人,《欧洲免疫学杂志》,28:2760–2769,1998；SOZZANI等人,《免疫学杂志》,161:1083–1086,1998；DIEU等人,《实验医学杂志》,188:373–386,1998)。然而，SLC可能是明显有利的，因为其能够在体内引发1型细胞因子应答(SHARMA等人,《免疫学杂志》,164:4558–4563,2000)。CCL21将原始淋巴细胞和抗原刺激的DC两者募集到次级淋巴器官的T细胞区中，使这些早期免疫应答组分共定位并且最终实现同源T细胞活化(CYSTER等人,《实验医学杂志》,189:447–450,1999.24)。

树突细胞是骨髓衍生的专业APC，其处理和呈递抗原以促进抗原特异性T淋巴细胞的活化和扩增(52、53)。最近的研究证明，肿瘤驻留的BATF3驱动的CD103+(小鼠)/CD141+(人)DC是肿瘤抗原运输、效应子T淋巴细胞浸润和T淋巴细胞抗肿瘤免疫力所需要的(54、55)。另外，CD103+DC产生的CXCL10是效应子T淋巴细胞迁移所需要的(55)。已经利用各种策略在癌症免疫疗法中开发活化的DC(56-59)。趋化因子是一组同源但功能不同的蛋白质，其直接介导白细胞迁移和活化以及血管生成(60)。CCL21是通过与趋化因子受体CXCR3和CCR7相互作用(40、41)、使这些早期免疫应答组分共定位以促进T淋巴细胞活化而将T淋巴细胞和DC强烈吸引到T淋巴细胞区的趋化因子(41)。另外，CCL21是有效的血管抑制剂(61)，从而为其在癌症疗法中的使用增加了进一步的支持。

研究了在2种独立的同基因鼠肺癌模型L1C2和3LLM中的重组CCL21介导的T淋巴细胞依赖性抗肿瘤应答的瘤内(IT)施用(62)。一致地，IT注射CCL21显著增加了CD4+和CD8+ T淋巴细胞和DC向肿瘤和引流淋巴结两者的浸润。伴随这些细胞浸润的是IFNγ、CXCL9、CXCL10、GM-CSF和IL-12的增加，同时免疫抑制分子PGE-2和TGFΒ伴随减少。CCL21介导的抗肿瘤应答的功效需要诱导IFNγ、CXCL9和CXCL10(63)。另外，在经过CCL21治疗的荷瘤小鼠中证明了全身性抗肿瘤免疫应答(62)。类似地，在自发性鼠支气管肺泡细胞癌的转基因小鼠模型中证明了CCL21的抗肿瘤活性(64)。

采用PD-1/PD-L1检查点阻断的癌症免疫疗法可以在包含黑素瘤和NSCLC的转移性癌症的患者亚组中诱导稳健且持久的应答；然而，由于对癌症免疫疗法的原发性、适应性或获得性抗性，大多数患者未对PD-1抑制剂作为单一药剂作出应答(79)。增强检查点阻断的有效性的策略将有益于更大的癌症患者群体，包含晚期NSCLC患者。

载体。递送CCL21表达构建体的方法涉及表达载体的使用。示例性载体包含病毒载体、脂质体或质粒载体以及其它基因递送载体。病毒载体包含腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、经过修饰的安卡拉病毒(ANKARA VIRUS)和水泡性口炎病毒。

尽管已知腺病毒载体整合到基因组DNA中的能力低，但是这一特征被这些载体提供的基因转移的高效率抵消。“腺病毒表达载体”意指包含含有足以(A)支持构建体在具有互补包装功能的宿主细胞中的包装并且(B)最终表达已经克隆于其中的感兴趣的异源基因的腺病毒序列的那些构建体。参见例如，国际专利申请PCT/US15/59297，所述专利申请通过引用并入本文。

表达载体包括基因工程化形式的腺病毒。腺病毒(一种36KB的线性双链DNA病毒)的基因组织的知识允许用外源序列取代腺病毒DNA的大片段(GRUNHAUS和HORWITZ,1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为野生型腺病毒DNA可以以游离形式复制，而没有潜在的基因毒性。而且，腺病毒在结构上是稳定的，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。

腺病毒由于其中等大小的基因组、易于操纵、高滴度、宽靶细胞范围和高感染性而特别适合用作基因转移载体。病毒基因组的两端均含有100-200个碱基对反向重复序列(ITR)，其是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域含有不同的转录单位，所述转录单位被病毒DNA复制的开始分开。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和一些细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质涉及DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(RENAN,1990)。晚期基因的产物(包含大多数病毒衣壳蛋白)仅在由主要晚期启动子(MLP)发出的单个初级转录物的显著加工后表达。MLP(位于16.8M.U.)在感染晚期期间特别有效，并且从这个启动子发出的所有MRNA均具有5'-三联前导(TPL)序列，这使得其成为优选的MRNA进行翻译。

在各个实施例中，所述载体是复制缺陷型腺病毒载体。

在各个实施例中，腺相关病毒(AAV)选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或其组合。

使用方法。可以用所提出的组合疗法治疗的示例性病状或病症包含癌症，如食管癌、胰腺癌、转移性胰腺癌、胰腺转移性腺癌、膀胱癌、胃癌(STOMACH CANCER)、纤维化癌、神经胶质瘤、恶性神经胶质瘤、弥漫性真性脑桥神经胶质瘤、复发性儿童脑瘤肾细胞癌、透明细胞转移性肾细胞癌、肾癌、前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、IV期前列腺癌、转移性黑素瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤的复发性黑素瘤、黑素瘤脑转移、IIIA期皮肤黑素瘤；IIIB期皮肤黑素瘤、IIIC期皮肤黑素瘤；IV期皮肤黑素瘤、头颈部恶性黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞非小细胞肺癌、乳腺癌、复发转移性乳腺癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤(HODGKIN'S LYMPHOMA)、滤泡性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、晚期B细胞NHL、包含弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的HL、多发性骨髓瘤、慢性髓性白血病、缓解期的成人急性髓性白血病；具有INV(16)(P13.1Q22)的成年急性髓性白血病；CBFB-MYH11；具有T(16；16)(P13.1；Q22)的成人急性髓性白血病；CBFB-MYH11；具有T(8；21)(Q22；Q22)的成人急性髓性白血病；RUNX1-RUNX1T1；具有T(9；11)(P22；Q23)的成人急性髓性白血病；MLLT3-MLL；具有T(15；17)(Q22；Q12)的成人急性早幼粒细胞白血病；PML-RARA；烷化剂相关的急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、里克特综合征(RICHTER'S SYNDROME)；华氏巨球蛋白血症(WALDENSTROM'S MACROGLOBULINEMIA)、成人胶质母细胞瘤；成人神经胶质肉瘤、复发性胶质母细胞瘤、复发性儿童横纹肌肉瘤、复发性尤文肉瘤(RECURRENT EWING SARCOMA)/外周原始神经外胚层肿瘤、复发性神经母细胞瘤；复发性骨肉瘤、结肠直肠癌、MSI阳性结肠直肠癌；MSI阴性结肠直肠癌、鼻咽非角质化癌(NASOPHARYNGEAL NONKERATINIZINGCARCINOMA)；复发性鼻咽未分化癌(RECURRENT NASOPHARYNGEAL UNDIFFERENTIATEDCARCINOMA)、宫颈腺癌；宫颈腺鳞状癌(CERVICAL ADENOSQUAMOUS CARCINOMA)；宫颈鳞状细胞癌；复发性宫颈癌；IVA期宫颈癌；IVB期宫颈癌、肛管鳞状细胞癌；转移性肛管癌；复发性肛管癌、复发性头颈癌；头颈部鳞状细胞癌(CARCINOMA,SQUAMOUS CELL OF HEAD ANDNECK)、头颈部鳞状细胞癌(HEAD AND NECK SQUAMOUS CELL CARCINOMA)(HNSCC)、卵巢癌、结肠癌、胃癌(GASTRIC CANCER)、晚期GI癌、胃腺癌；胃食管连接部腺癌(GASTROESOPHAGEALJUNCTION ADENOCARCINOMA)、骨肿瘤、软组织肉瘤；骨肉瘤、胸腺癌、尿路上皮癌、复发性梅克尔细胞癌(RECURRENT MERKEL CELL CARCINOMA)；III期梅克尔细胞癌；IV期梅克尔细胞癌、骨髓增生异常综合征和复发性蕈样真菌病(RECURRENT MYCOSIS FUNGOIDES)和塞扎里综合征(SEZARY SYNDROME)。

在一些实施例中，在用本发明方法治疗的癌症中，少于50％的肿瘤细胞在其表面上表达PD-L1蛋白。在各个实施例中，癌症在其细胞表面上具有大于50％的PD-L1染色，并且因此大于50％的肿瘤细胞在其表面上表达PD-L1蛋白。

进一步设想的是，本发明方法可用于用一线派姆单抗加上化学疗法治疗的受试者，或可替代地，可用于用这种组合未能进行初始疗法的受试者。

在一些实施例中，可以用本发明方法治疗的癌症包含转移性NSCLC和如本文所述的其它实体瘤。

设想的是，本文的方法可以减小受试者的肿瘤大小或肿瘤负荷，和/或减少受试者的转移。在各个实施例中，受试者的肿瘤大小或肿瘤体积减小了约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。在各个实施例中，所述方法将肿瘤大小或肿瘤体积减小了10％、20％、30％或更多。在各个实施例中，所述方法将肿瘤大小或肿瘤体积减小了10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

设想的是，一旦癌症已经进入缓解，本文的方法就减少肿瘤负荷并且还减少或预防肿瘤的复发。

还设想的是，所述载体-CCL21-DC的施用增加了CD8 T细胞向肿瘤的浸润。在各个实施例中，与未接受组合疗法的受试者相比，经过治疗的受试者的CD8细胞增加了2倍或更多倍。提供的是载体-CCL21-DC增加了肿瘤中的PD-L1表达。

在各个实施例中，树突细胞通过瘤内、静脉内、动脉内、腹膜内、鼻内、肌内、皮内或皮下施用，或通过CT引导的或支气管镜的IT注射施用。在各个实施例中，检查点抑制剂是静脉内施用的。

SLC、树突细胞或检查点抑制剂的施用途径将根据期望结果而发生变化。通常为了引发免疫应答，在炎症或应答的期望位点处或附近使用药剂注射。可替代地，根据疾病病状，可以保证其它施用途径。即，为了抑制肿瘤或肿瘤生长，优选的是在肿瘤位点处或附近注射药物组合物。可替代地，为了预防移植物排斥，可以使用全身性施用。同样，为了治疗或预防自身免疫性疾病，全身性施用可能是优选的。全身性施用的途径的实例包含肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、透皮(局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含以下成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液；固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或葡萄糖。

在一个实施例中，药物组合物可以通过包括SLC蛋白或适合于SLC蛋白表达到体内的位点内或周围的DNA构建体的缓释调配物或基质来递送。以此方式，可以在期望的植入位置处产生瞬时淋巴结以吸引树突细胞和T细胞，从而引发免疫应答。

设想的是，从第0天开始每三周施用抗PD-1抗体。在各个实施例中，所述抗PD-1抗体是每三周以200MG的剂量施用的派姆单抗。

在各个实施例中，所述AD-CCL21-DC是以5×106细胞/注射到3×107细胞/注射，例如5×106、1×107或3×107细胞/注射的剂量施用的。包括载体-CCL21，如腺病毒-CCL21(AD-CCL21-DC)构建体的树突细胞是以每3周间隔施用的，例如在第0天、第21天和第42天。

进一步设想的是，在适当的情况下可以施用其它辅助疗法。例如，在适当的情况下，还可以向患者施用外科手术疗法、化学疗法、细胞毒性剂、光动力疗法或放射疗法。

多种化学治疗剂可以与本发明的组合疗法组合使用。这些化学治疗剂可以是例如直接交联DNA的药剂、插入DNA中的药剂以及通过影响核酸合成而导致染色体和有丝分裂畸变的药剂。多种化学治疗剂旨在用于本文所公开的组合治疗方法中。被设想为示例性的化学治疗剂包含例如依托泊苷(VP-16)、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、喜树碱、放线菌素-D、丝裂霉素C、顺铂(CDDP)以及甚至过氧化氢。在其它实施例中，任何外科手术介入均可以与本发明组合实践。结合放射疗法，设想了用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，如Y照射、X射线、UV照射、微波以及甚至电子发射等。还设想了放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送，并且这可以与靶向抗体或其它靶向手段结合使用。细胞因子疗法也已经证明是组合治疗方案的有效配偶体。在此类组合方法中可以采用各种细胞因子。细胞因子的实例包含IL-1、IL-ΙΒ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、TGF-Β、GM-CSF、M-CSF、TNFA、ΤΝΡΒ、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、OSM、TMF、PDGF、IFN-A、IFN-Β、IFN-Γ。根据与临床适应症，如患者的病状和细胞因子的相对毒性相一致的标准方案来施用细胞因子。下文是被设想用于本发明的某些实施例中的示例性但决不是限制性的细胞因子基因表。

如本领域的普通技术人员将理解的，化学治疗剂的适当剂量通常约为临床疗法中已经采用的剂量，其中化学治疗剂单独施用或与其它化学治疗剂组合施用。仅通过举例的方式，可以使用如顺铂和其它DNA烷基化等药剂。顺铂已经广泛用于治疗癌症，其中临床应用中使用的有效剂量为20MG/IN2，每三周持续5天，总共三个疗程。顺铂不是口服吸收的，并且因此必须通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。

设想了直接交联核酸(具体地DNA)的药剂，并且在本文中显示所述药剂以最终化导致协同抗肿瘤组合的DNA损伤。可以使用如顺铂和其它DNA烷基化剂等药剂。

另外有用的药剂包含干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。此类化学治疗化合物包含阿霉素，也称为多柔比星(DOXORUBICIN)、依托泊苷、维拉帕米(VERAPAMIL)、鬼臼毒素等。广泛用于肿瘤治疗的临床环境中，这些化合物是以范围为25-75MG/IN2(对于阿霉素，以21天间隔)通过静脉内团注到以35-50MG/IN2(依托泊苷)通过静脉内或口服两倍静脉内剂量的剂量施用的。

还可以使用破坏多核苷酸前体的合成和保真性的药剂。特别有用的是已经经历广泛测试并且容易获得的药剂。如此，肿瘤组织优选使用如5-氟尿嘧啶(5-FU)等药剂，这使得这种试剂特别适用于靶向肿瘤细胞。尽管5-FU相当有毒，但其可适用于宽范围的载体，包含局部，然而通常使用剂量范围为3到15MG/KG/天的静脉内施用。

还设想了如紫杉醇等植物生物碱以用于本发明的某些方面。紫杉醇是分离自灰树短叶红豆杉(TAXUS BREVIFOLIA)的树皮的实验性抗有丝分裂剂。紫杉醇与微管蛋白结合(在与长春花生物碱所使用的位点不同的位点处)，并且促进微管的组装。当前正在对紫杉醇进行临床评估；其具有针对恶性黑素瘤和卵巢癌的活性。最大剂量是30MG/M2每天持续5天或210到250MG/M2，每3周给予一次。当然，所有这些剂量都是示例性的，并且在这些点之间的任何剂量也预期可用于本发明。

可与组合疗法结合使用的其它示例性化学治疗剂列于WO2016/073759的表B中，其通过引用整体并入本文。其中列出的每种药剂都是示例性的并且决不是限制性的。技术人员涉及“《雷明顿药物科学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)》”第15版,第33章,具体地第624-652页。剂量的一些变化必然会根据正在治疗的受试者的病状而发生。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准办公室所要求的无菌性、产热原性、一般的安全性和纯度标准。

如本文所述，在一个实施例中，本文所述的任何方法均适合于治疗患有具有高突变负荷的肿瘤的患者。在一个实施例中，肿瘤是NSCLC或另一个实体瘤，如但不限于鳞状细胞或非鳞状细胞肿瘤。肿瘤中高肿瘤突变负荷的存在可以使用多种诊断分析中的任一种从活检，例如从FOUNDATIONONE(剑桥,马萨诸塞州)，如FOUNDATIONONE CDX^TM、

或

来确定。

在非限制性实施例中，肿瘤中可能存在如KRAS、TP53(KP)和STK11/LKB1等突变。在其它实施例中，存在高非同义突变负荷。在一个实施例中，来自暴露于肿瘤下面的致癌物的高突变负荷及其对本文所述的组合治疗的易感性。如本文所述，在一个实施例中，首先评估肿瘤的突变负荷，并且对于高突变负荷的肿瘤开始如本文所述的治疗。

如将在以下实例中注意到的，在具有高突变负荷的人类肿瘤模型中证明了组合疗法对具有高突变负荷的肿瘤的功效。最近的研究证明，人NSCLC(超过85％的肺癌)具有高非同义突变负荷，这是与PD-1阻断的临床益处相关的生物标志物。KRAS突变是NSCLC中最普遍的致癌驱动子(在LUAC中约25％)，并且最近的研究揭示，STK11/LKB1(KL)和TP53(KP)肿瘤抑制基因中的共同发生的突变定义了具有独特TME免疫谱的NSCLC的不同亚组。LKB1突变最近已经被鉴定为KRAS-突变体肺腺癌(LUAC)中对PD-1阻断的原发性抗性的主要驱动子。前述仅是适于通过本文所述的方法进行治疗的肿瘤中的突变的非限制性实例。

在本文的实例中，肺癌的基因工程化小鼠模型，如KRASG12D(LKR13)、KRASG12D；P53-/-(KP)和KRASG12D；P53-/-；LKB1-/-(KPL)具有人NSCLC的常见驱动子突变。为了增加突变负荷以模拟通常具有高肿瘤突变负荷(TMB)的人NSCLC，LKR13、KP和KPL细胞暴露于烟草致癌物甲基亚硝基脲(MNU)概括了人NSCLC的突变态势。如实例中所述，这些突变体细胞系的全外显子组测序(WES)揭示了突变负荷和瘤内异质性的显著增加。图5C和5D显示，本文所述的组合疗法导致有效的肿瘤根除(*，P<0.05；**，P<0.005；****，P<0.00005)，因此指示CCL21-DC改善抗PD-1对于肺癌治疗的功效，并且具体地在高肿瘤负荷模型中的功效。

因此，在一个实施例中，临床试验设计、剂药设计和方案以及癌症治疗的其它方面的所有前述描述适用于具有高突变负荷的肿瘤的患者。此外，PCT/US15/59297中所描述的研究设计和治疗的方面适用于患有具有高突变负荷的肿瘤的患者。在非限制性方面，向受试者施用包括并表达对SLC多肽进行编码的多核苷酸的至少或约1×10⁵个或至少或约1×L0⁶个细胞。在示例性方面，向受试者施用包括并表达对SLC多肽进行编码的多核苷酸的至少或约2×L0⁶个细胞、至少或约3×L0⁶个细胞、至少或约4×L0⁶个细胞、至少或约5×L0⁶个细胞、至少或约6×L0⁶个细胞、至少或约7×L0⁶个细胞、至少或约8×L0⁶个细胞、至少或约9×L0⁶个细胞、至少或约1×10⁷个细胞、至少或约2×10⁷个细胞或至少或约3×10⁷个细胞。在示例性方面，细胞在给定时间段内产生足够量的SLC。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.10NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.15NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.20NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.25NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.30NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.35NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.40NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.45NG的SLC每1×106细胞。在示例性方面，细胞在24小时时间段内产生至少或约0.50NG的SLC每1×L0⁶个细胞。在示例性方面，1到3000万个细胞在24小时时间段内产生约0.2到0.45NG(例如，0.292NG到约0.413NG)的SLC每1×10⁶个细胞。

在示例性方面，在施用免疫检查点抑制剂之前施用SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂。在示例性方面，在施用免疫检查点抑制剂之前约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周或约4周施用SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂。

在示例性方面，在施用免疫检查点抑制剂之后施用SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂。在示例性方面，在施用免疫检查点抑制剂之后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周或约4周施用SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂。

在示例性方面，SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂与免疫检查点抑制剂同时施用。在各个实施例中，药剂以分开的调配物施用并且同时施用，其中同时是指在彼此的30分钟内给予的药剂。所述方法还提供了将SLC组合物和检查点抑制剂与第二药剂，例如可以在与SLC组合物和/或检查点抑制剂施用之前施用的、与SLC组合物和/或检查点抑制剂一起施用之后施用的或与SLC组合物和/或检查点抑制剂同时施用的化学治疗剂一起施用。

在各个实施例中，设想的是，SLC药剂和检查点抑制剂可以在同一调配物中同时给予。

在示例性方面，在施用免疫检查点抑制剂之前和之后施用SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂。在示例性方面，在施用免疫检查点抑制剂之前、在施用免疫检查点抑制剂之后并且与免疫检查点抑制剂同时施用，施用SLC多肽、SLC变体、SLC片段、SLC类似物、SLC衍生物、对所述多肽、变体或片段进行编码的SLC多核苷酸和/或本文所述的SLC药剂。

在示例性方面，向受试者施用(I)SLC多肽；(II)对SLC多肽进行编码的多核苷酸；(III)包括所述多核苷酸的细胞或(IV)其组合多于一次。在示例性方面，向受试者每周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次或每月一次施用(I)SLC多肽；(II)对SLC多肽进行编码的多核苷酸；(III)包括所述多核苷酸的细胞或(IV)其组合。在示例性方面，向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂多于一次。在示例性方面，向受试者每周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次或每月一次施用免疫检查点抑制剂。

在示例性方面，所述受试者包括实体瘤，并且向所述受试者瘤内施用所述细胞。在替代性方面，向受试者细胞肠胃外，例如静脉内或皮下施用细胞。

在示例性方面，所述方法包括以约1到约20MG/KG内的剂量约每两周向受试者静脉内施用免疫检查点抑制剂一次，并且向受试者瘤内施用约1到约3000万个细胞，所述细胞包括并表达对包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SLC多肽进行编码的SLC多核苷酸。在示例性方面，所述方法包括以约1到约20MG/KG内的剂量约每两周向受试者静脉内施用免疫检查点抑制剂一次，并且向受试者瘤内施用对包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SLC多肽进行编码的SLC多核苷酸。

在示例性方面，在第一次施用免疫检查点抑制剂之前约2周向受试者施用细胞或SLC多肽。在示例性方面，在第一次施用细胞或SLC多肽之后每月向受试者施用细胞或SLC多肽。在示例性方面，在第一次施用免疫检查点抑制剂之后两周开始，每2周向受试者施用免疫检查点抑制剂。

实例

实例1.CCL21和PD-1组合疗法在NSCLC模型中是有效的

使用NSCLC的体内模型(3LL模型和KRAS-突变体LKR13模型)来测量CCL21和抗PD-1抗体的组合对肿瘤生长和免疫刺激的功效。在共同拥有的国际专利申请PCT/US15/59297中报道了初步结果。

结果显示，在NSCLC的小鼠模型中，组合疗法优于两种单一疗法。图1A显示，通过PD-1阻断增强来自经过AD-CCL21-DC治疗的携带3LL肿瘤的小鼠的TIL的体外活性。在抗PD-1(1μG/ML)或对照抗体(1μG/ML)存在的情况下，评估针对自体肿瘤的体外T细胞细胞溶解活性。值反映平均值±SEM，N＝8只小鼠/组，*P<0.05相对于媒剂，**P<0.05相对于对照抗体。

图1B示出了在体内3LL鼠肺癌模型中的治疗效果。每5天用以下治疗携带50MM3 SC3LL肿瘤的小鼠：I)媒剂对照；II)CCL21(1.5MG/剂量IT)；III)抗PD-1(200MG/剂量IP)或IV)组合疗法，持续3次。结果显示，与单一药剂或媒剂治疗相比，组合疗法具有更小的肿瘤体积。还使用了KRAS-突变体LKR13模型。在肿瘤接种后第5天(1.5×106LKR13递送SC)，在整个研究中每隔一天如图1B所示治疗携带<25MM3肿瘤的129/E小鼠。LKR13肿瘤对单一疗法具有抗性，而所述组合在诱导后长达20天后减少肿瘤生长(图1C)。

来自图1C的肿瘤的多重免疫荧光(MIF)分析显示，与对照相比，在经过CCL21治疗组和组合组中，肿瘤PD-L1表达以及肿瘤边缘处和肿瘤内的CD8+ T细胞的流入增加(图1D)。

一致地，IT CCL21和IP抗PD-1的组合在2个独立的同基因鼠肺癌模型中均优于两种单一疗法，以引发抗肿瘤免疫力(图1B和1C)。在KLR13肿瘤模型中，响应于CCL21治疗，还观察到肿瘤CD8+ T细胞浸润和PD-L1表达增加(图1D)，这与先前的数据一致。

实例2.CCL21和抗PD-1抗体治疗非小细胞肺癌的I期试验

尽管在晚期NSCLC患者的亚群中IT施用AD-CCL21-DC会诱导CD8+ T淋巴细胞肿瘤浸润和全身性抗肿瘤应答，但是观察到经过AD-CCL21-DC治疗的患者的TME中PD-L1表达增加，这表明肿瘤介导的T淋巴细胞功能损伤可能防止了更稳健的CCL21介导的抗肿瘤应答。类似地，可以通过增强的T淋巴细胞浸润和增强的抗原呈递细胞功能来潜在地对抗PD-1/PD-L1抑制剂的功效的缺乏。因此，提出将AD-CCL21-DC疗法与PD-1抑制组合，以扩增NSCLC患者的宿主抗肿瘤免疫力。这在具有低的或不存在基线肿瘤PD-L1表达的患者中可能是特别重要的，所述患者还可以表现出最少的肿瘤T淋巴细胞浸润并且最经常不单独对PD-1抑制作出应答。当前的目标是确定AD-CCL21-DC刺激增强NSCLC患者中的抗PD-1功效的特异性抗肿瘤免疫应答的潜力。

以下实例描述了I期试验，以确定CCL21基因修饰的DC(AD-CCL21-DC)在与静脉内派姆单抗组合时在患有先前未经过治疗的晚期NSCLC患者(其肿瘤在少于50％的肿瘤细胞中表达PD-L1)中的瘤内(IT)注射的安全性和最大耐受剂量(MTD)。

此研究的另一方面将评估在用AD-CCL21-DC与静脉内派姆单抗一起施用时在患有先前未经过治疗的晚期NSCLC患者(其肿瘤在少于50％的肿瘤细胞中表达PD-L1)中的IT注射的剂量递增(EXD)期间建立的剂量治疗的受试者中的客观应答率(ORR)。当前，PD-L1免疫染色是在疾病诊断时常规进行的标准程序(22C3测定)。使用22C3测定，大约70％的NSCLC患者在<50％的肿瘤细胞中具有PD-L1表达(5、12)。

I期研究的次要目标包含定义当在AD-CCL21-DC(在剂量递增期间确定的)与静脉内派姆单抗一起施用时在患有先前未经过治疗的晚期NSCLC患者(其肿瘤在少于50％的肿瘤细胞中表达PD-L1)中的IT注射的不良事件(AE)谱，并且确定AE与研究治疗的关系。还设想的是，通过分析在AD-CCL21-DC与静脉内派姆单抗一起施用时在先前未经过治疗的晚期NSCLC患者(其肿瘤细胞在少于50％的肿瘤细胞中表达PD-L1)中的IT注射的连续治疗前和治疗后活检和血液标本来确定药物靶活性。

纳入标准

以下受试者可以包含在研究中：

1.年龄超过18岁的成人能够给出知情同意。

2.IV期病理学证明的NSCLC。

3.使用CC23抗体，在小于一半的肿瘤细胞中的PD-L1染色(0％染色是可接受的)。

4.可通过RECIST V1.1指南测量的疾病。

5.ECOG性能状态为0、1。

6.必须从初次接受NSCLC的全身性治疗。如果自上次治疗以来过去至少6个月，则接受辅助或新辅助化学疗法的患者是合格的。

7.足够的肾功能(定义为BUN≤40MG/DL或血清肌酸酐≤2MG/DL)。

8.足够的肝功能(定义为血清总胆红素≤2X正常上限(ULN)，或血清转氨酶≤3XULN)。注：在肝转移的环境中，转氨酶可以高达5X ULN。

9.足够的凝血参数(定义为PT和/或PTT≤1.5X ULN或血小板≥100,000)。

10.足够的中性粒细胞(定义为中性粒细胞绝对计数≥1,500/MM3)。

11.具有以下任一个特征并且在进行手术的放射科医师的估计中将不需要横穿大疱的病灶：I.旨在经支气管镜地进入，或II.旨在通过CT引导的经胸腔注射进入，所述横穿大疱会显著增加气胸的风险。

12.对于未经历更年期的女性中，在开始治疗之前进行阴性妊娠测试，并且在整个治疗过程中采取充分避孕。适当的避孕形式包含：I.2种适当的屏障方法；II.屏障避孕法加上激素避孕法；III.从筛选访问开始直到最后一个剂量的派姆单抗之后120天，在整个试验中避免性活动。

排除的受试者是具有先前用于IV期NSCLC的全身性疗法(包含化学疗法、放射疗法或非细胞毒性试验药剂(INVESTIGATIONAL AGENT))的那些受试者和具有敏化EGFR突变和/或ALK基因重排的患者。

材料与方法：

派姆单抗：抗PD-1免疫疗法派姆单抗(可瑞达(KEYTRUDA))由默克公司提供并且可在试验开始时获得。

重组人GM-CSF和IL-4：重组人GM-CSF和人IL-4是在R&D系统公司(R&D SYSTEMS,INC.)(明尼阿波利斯,明尼苏达州)的当前良好制造规范(CGMP)指南下制造并且测试临床使用。。

CGMP-AD-CCL21病毒衍生物：使用经过充分测试和定量的表达人CCL21的GMP级复制缺陷型腺病毒(CGMP-AD-CCL21)。由BDP/SAIC-弗雷德里克公司(FREDERICK,INC.)制造的CGMP-AD-CCL21(LOT L0604006)也是可获得的。SAIC-弗雷德里克公司是美国国家癌症研究所(NATIONAL CANCER INSTITUTE)(NCI-弗雷德里克)(弗雷德里克，马里兰州)的承包商，其是政府拥有的承包商运营的设施。

AD-CCL21转导的DC：AD-CCL21转导的DC(AD-CCL21-DC)在UCLA人基因和细胞疗法设施(HGCTF)中制备，如所述(45)。简而言之，在GMP条件下从患者的外周血制备自体的人单核细胞衍生的DC，并且用800U/ML的临床级重组人GM-CSF和400U/ML临床级重组人IL-4进行体外培养。培养6-7天后，通过在37℃在2000X G下超离心2小时，用CGMP级AD-CCL21转导DC。在各种生物安全性测试之后，然后准备AD-CCL21修饰的DC(AD-CCL21-DC)以用于通过CT引导的或支气管镜递送注射到患者的肺癌中。

PBMC的收集：在第一次计划的AD-CCL21-DC施用之前14天收集患者的自体白细胞去除术产物。白细胞去除术过程是在血除去法单元(HEMAPHERESIS UNIT)中进行的。将来自白细胞去除术产物的样品送去进行无菌测试。通过在FICOLL-PAQUE(GMP级，GE生命科学公司(GE LIFE SCIENCES))上进行密度梯度离心从白细胞去除术产物中分离PBMC。将PBMC以1×108个细胞/毫升的含有冷冻培养基的DMSO(70％RPMI-1640(美国生命技术公司(LIFETECHNOLOGIES))+20％自体血清+10％DMSO)的浓度在受控速率的冷冻冷藏容器中冷藏保存。将PBMC储存在-80℃下。将含PBMC的含有冷冻培养基的DMSO的样品送去进行无菌测试。

在向患者施用计划的AD-CCL21-DC(方案-6天、+15天和+36天)之前6天，将冷藏保存的PBMC在37℃下在水浴中快速解冻。在无血清RPMI-1640培养基中洗涤细胞，并且以5-10×106个细胞/毫升(75-150×106细胞每15ML每T175烧瓶)接种于5％培养基(RPMI-1640+5％自体血清)中。在37℃允许粘附持续2小时之后，通过用无血清RPMI-1640培养基洗涤轻轻地去除非粘附细胞。在RHGM-CSF(800U/ML)和RHIL-4(400U/ML)存在的情况下，在37℃、5％CO2培养箱中，将粘附细胞于5％培养基中培养6天。在使用之前通过0.22-μM过滤器过滤所有培养基。在DC培养4天之后，收获来自每个烧瓶的上清液的等分试样用于无菌。在DC培养5天之后，汇集每个烧瓶的上清液的等分试样，并送去进行支原体PCR测试。

在培养6天之后，通过从培养物中轻轻地移液从T175烧瓶中收获DC，在无血清RPMI-1640中洗涤，并且然后重悬于1ML的无血清RPMI-1640中。在AD-CCL21转导之前，将DC细胞悬浮液的样品(～1％)送去进行DC表型分析。向DC以1167VP/细胞添加AD-CCL21(病毒:DC MOI为100:1)。AD-CCL21的临床前表征证明，在MOI 100:1下的腺病毒转导产生了最高水平的CCL21生产而不会损害细胞活力(83)。将细胞悬浮液在25℃下在2000X G下离心两小时(84)。

DC的支气管镜检查和瘤内注射：支气管镜检查是作为门诊患者手术进行。患者将进行完全的筛选实验室工作，其证实所述患者具有足够的肾功能、肝功能、白细胞计数、血小板计数、PT/PTT和肺功能。在研究之前，患者将禁食持续至少6小时。对患者进行连续监测(ECG、非侵入性血压监测和脉搏血氧测定)并且通过鼻插管以2-6升/分钟提供氧气。为了消融呕吐反射(GAG-REFLEX)，用含有3ML的2或4％利多卡因(LIDOCAINE)的手持雾化器治疗患者，随后根据需要用20％苯佐卡因或4％利多卡因局部喷雾。由于患者的吸烟史，一些患者通过手持雾化器用沙丁胺醇2.5MG和定喘乐(ATROVENT)1.0MG进行治疗，如手术时的临床情况所指示的。根据使用静脉内抗焦虑药(例如，0.5-1MG等分试样的咪达唑仑)和镇痛药(例如，芬太尼25MG等分试样)的机构知觉镇静指南(INSTITUTIONAL CONSCIOUS SEDATIONGUIDELINES)施用知觉镇静。

光纤视频支气管镜将由在手术中训练并认证的医生经口或经鼻引入。喉、气管和双侧气道(主茎、叶和节段支气管)将被系统地可视化。如果需要另外的局部麻醉，则将2％利多卡因的两个ML等分试样在所选位点处应用于支气管粘膜。记录以此方式施用的利多卡因的量，并且将不超过4MG/KG或280MG的总剂量，以便预防利多卡因毒性。

在注射AD-CCL21-DC之前，将使用19号WANG经支气管针(米尔-罗斯实验室公司(MILL-ROSE LABORATORIES,INC.)，针长15MM，并且工作长度140CM，直径2MM)进行四次针活检以获得肿瘤的核心活检进行体外监测研究。将团块在视觉上分成4个象限，并且将从这些象限中的每个象限获得针活检。使用22号经支气管细胞学针(13MM针长，144CM工作长度并且1.8MM直径)，患者将接受4次AD-CCL21-DC注射，每个象限一次。将用AD-CCL21-DC悬浮液和注射到每个位点中的0.25ML的细胞悬浮液小心地填充细胞学针组合件的死区。在注射AD-CCL21-DC之前，将施加温和抽吸以确保针尖尚未被放置到血管结构中。可替代地，代替使用WANG经支气管针，可以使用支气管镜活检钳或通过支气管内超声引导针来获得活检。如果患者在治疗前活检之后具有如气胸或出血等并发症，则仍将注射AD-CCL21-DC，除非研究调查者和/或程序医生认为风险不适当。如果确定风险对于患者而言太高而不能接受AD-CCL21-DC注射，则患者将暂停在单独的派姆单抗上。不能完成整个AD-CCL21-DC剂量方案的患者将从MTD/MAD确定中排除，并且将由另一名参与者替代。可以通过直接支气管镜检查或支气管内超声引导来递送疫苗。

CT引导的AD-CCL21-DC瘤内注射：CT引导手术将作为门诊患者手术进行。患者将进行完全的筛选实验室工作，其证实所述患者具有足够的肾功能、肝功能、白细胞计数、血小板计数、PT/PTT和肺功能。所有CT扫描将在GE高速高级扫描仪(威斯康辛州密尔沃基的GE医疗系统公司(GE MEDICAL SYSTEMS))上进行。根据病灶的大小，在3MM、5MM或10MM准直下，将穿过靶病灶进行有限的轴向扫描。扫描将在针放置之前、期间和之后进行，以计划针放置方法并确认成功且不复杂的注射。所有患者将以通常的无菌方式准备和覆盖。将使用1％利多卡因来实现局部麻醉。没有计划镇静。在手术前后关于体温、脉搏和血压监测患者。整个手术过程中将监测血氧饱和度和血压。

对于大小>3CM的肺肿瘤，将团块分成4个相等的象限，并且每个象限将经历活检和AD-CCL21-DC注射。对于大小<3CM的肿瘤，团块将仅在单个位点进行活检和注射。将使用具有20号内活检针的19号外针来获取核心活检标本。在将针尖插入到所选靶病灶之后，将向注射器施加抽吸以确认没有进入血管结构中。将获得肺肿瘤的核心活检。通过19号外针插入的22号千叶脊椎针(CHIBA SPINAL NEEDLE)将用于递送AD-CCL21-DC。根据肿瘤的大小，将总体积为1.2ML的AD-CCL21-DC均等地注射到4个分开的象限中或注射到单个位点处，随后进行1ML的生理盐水冲洗施用。对于所有经胸膜肺内注射，将2-5ML的自体血液沿着实质针道作为血液补丁施用，同时撤回针。如果由于经胸腔注射而发生气胸，则在可行的情况下，气胸将随着注射针撤出而被排空。在活检之后发生气胸或出血的情况下，仍将注射AD-CCL21-DC，除非研究调查者和/或程序医师认为风险不适当。如果风险过高，则患者将暂停在单独的派姆单抗上。不能完成整个AD-CCL21-DC剂量方案的患者将从MTD/MAD确定中排除，并且将由另一名参与者替代。

试验研究

进行I期、非随机、剂量递增、多群组试验，随后在EXD期间建立的剂量下进行剂量扩展部分。将选择具有在少于50％的细胞中病理学确认的和放射学可测量的表达PD-L1的IV期NSCLC的患者用于此研究，所述患者具有可通过CT引导的介入或支气管镜检查接近的肿瘤并且未接受过NSCLC的全身性治疗。

登记了多达24名患者。在剂量递增期间，根据是否存在剂量限制性毒性(DLT)，评估多达12名患者，每个剂量水平评估3名或6名患者。在剂量扩展期间，以在剂量递增(EXD)期间建立的剂量评估12名患者。将通过支气管镜或CT引导的IT注射来递送AD-CCL21-DC。派姆单抗是通过静脉内施用的。

在剂量递增期间，使用经过修改的3+3设计。将三名患者分配到每个群组。登记到给定群组的患者通过CT引导的或支气管镜的IT注射接受同一AD-CCL21-DC剂量，随后在第0天、第21天和第42天在DC注射之后一小时接受IV派姆单抗200MG，并且此后每三周接受IV派姆单抗200MG，持续长达一年。AD-CCL21-DC剂量在第一群组(1)中为1×107个细胞/注射，并且在较早群组中的耐受性未决时增加到3×107个细胞/注射(2)。只有当登记到较低剂量群组的所有3名患者没有经历DLT或群组中6名患者中的1名患者具有DLT时，剂量递增才可以继续进行。如果患者在接受研究治疗的30天内死亡，则研究将暂停直到进一步评估，并且将用UCLA JCCC DSMB讨论继续研究的潜在风险与益处。如果群组1中的剂量方案(AD-CCL21-DC 1×107个细胞/注射)耐受性不好，则将允许AD-CCL21-DC的剂量降级到5×106细胞/注射(-1)。如果群组(2)指定的剂量方案(AD-CCL21-DC 3×107个细胞/注射)不是最大耐受剂量(MTD)，则不进行进一步的剂量递增，并且此剂量水平将被定义为最大施用剂量(MAD)。患者将在UCLA医疗中心登记为门诊患者。

图2列出了所提出的方案和剂量扩展。在剂量递增期间，研究应将最大耐受剂量(MTD)/最大施用剂量(MAD)建立为低于超过1/6患者经历剂量限制性毒性(DLT)时的剂量水平，或建立为剂量群组(2)，如果在群组中存在0或1/6DLT。剂量扩展的特征在于由RECISTV1.1标准定义的ORR。

剂量限制性毒性(DLT)被定义为3级或更高的毒性，如NCI通用毒性标准4.0版所定义的。在给定群组中，如果3名患者中有0名患者具有DLT，则将通过将患者登记到下一个群组来递增到下一剂量。只有当所有3名患者均已经登记到较低剂量群组中并且在28天时间段内未观察到DLT时，剂量递增才可以继续进行。如果3名患者中有2名患者或3名患者具有DLT，则剂量将降级到先前的剂量。如果3名患者中有1名患者具有DLT，则另外3名患者将被登记到同一群组中并且接受同一AD AD-CCL21-DC剂量。如果总共6名患者中有1名患者具有DLT，则剂量将递增，并且患者将被登记到下一群组中。如果6名患者中有2名患者或更多名患者具有DLT，则剂量将降级到先前的剂量。如果决定降级到其中3名患者已经被治疗的剂量，则另外3名患者以所述同一剂量进行治疗。如果另外的患者中有2名患者或更多名患者具有DLT，则将降级到先前的剂量。无论如何，如果患者在接受研究治疗的30天内死亡，则研究将暂停直到进一步评估，并且将用UCLA JCCC DSMB讨论继续研究的潜在风险与益处。在确定MTD/MAD时，将以给定剂量治疗不超过6名患者。MTD/MAD被定义为6名患者中有少于2名患者经历DLT的剂量水平。在第一群组(A)中在3名患者中有2名患者或3名患者具有DLT的情况下，将暂停研究积累。与研究药物无关的严重不良事件(SAE)(例如，来自活检或注射的气胸或其它形式的程序相关的并发症)将不被计数为DLT。出于DLT之外的原因而退出治疗的患者将被其它受试者替代直到在给定群组中至少3名可评估患者已经完成治疗。

治疗修改和毒性的一般管理：对于任何1级毒性，将不存在剂量修改。如果2级毒性发展，则调查者可以选择在仔细监测的情况下继续瘤内治疗，或停止治疗直到值返回到1级或更低，然后重新开始治疗。与肺肿瘤注射相关的预期2级毒性之一是气胸的医源性引入。如果发生气胸，可以监测患者或通过针胸廓造口术排空气胸。顽固性或扩大性气胸可能使胸管放置成为必要。这是预期的并发症，不期望这将使停止进一步的注射成为必要。因此，如果气胸在注射的72小时内随着胸廓造口术排空而消退并且在下一次注射时在放射图形学上不明显，则方案将按照规定进行。

如果观察到可能归因于DC的生物学效应的3级毒性，则停止进一步施用直到毒性降低到低于2级，并且调查者评估受试者以确定对于继续方案的临床可接受性。治疗可以由调查者酌情决定恢复，但瘤内DC的剂量减少50％。如果观察到的3级毒性是预期的程序性并发症(例如：在7天时，胸廓造口术引流没有作出应答的持续空气泄漏)，则将停止瘤内治疗直到并发症消退。如果并发症在初始疫苗施用后的7-14天之间消退，并且调查者评估受试者对于继续方案是临床可接受的，则疫苗施用将以全剂量恢复。

由于毒性导致施用延迟>2周，或尽管剂量减少但仍重复3级毒性，将导致受试者中止方案。由于施用延迟而中止的受试者将被替代，直到满足待评估的必要数量的患者。

任何4级毒性都将导致从方案中去除受试者，如根据临床情况指示的继续观察和治疗受试者。在群组中的任一个受试者的4级毒性的发展(被认为与方案治疗有关)将导致在所述剂量水平下治疗终止，以及在先前同期群组中施用的剂量下的MTD/MAD的定义。

研究药物施用30天内的任何受试者死亡都将导致暂停研究，直到确定原因的评估。如果死亡归因于方案治疗，则所有受试者的进一步治疗将停止，并且研究将被中断。

与派姆单抗暴露相关的不良事件(非严重和严重的)可以表示免疫学病因。这些不良事件可以在第一次给药后不久或最后一次剂给药治疗后数月发生。对于药物相关的毒性和严重的或危及生命的AE，必须停用派姆单抗，如图3所示。

生物学和临床应答：监测所有患者，以评估治疗的临床功效并确定应答的潜在决定因素。临床应答将在筛选时，在第63天以及此后每3个月通过CT扫描进行评估，直到疾病进展或患者从研究中退出。如下所述，将使用肿瘤活检和外周血液样品进行免疫监测。肿瘤活检还用于确定突变负荷和肿瘤相关新抗原。

多重免疫荧光(MIF)将用于表征TME的免疫表型。下表1列出了免疫表型的替代标志物(81)，其中特别强调CD8和PD-L1染色。这些测定将用在第0天、第21天和第42天收集的活检样品进行。

表1

使用来自治疗前后肿瘤样品的基因组DNA(GDNA)进行全外显子组测序(WES)以鉴定体细胞突变负荷和肿瘤相关新抗原。患者的诊断组织阻断(或石蜡包埋第0天活检，如果此类阻断不可用的话)和石蜡包埋第42天活检分别用作治疗前后样品。通过激光捕获显微切割、随后GDNA分离来富集肿瘤细胞。来自PBMC的患者GDNA用作突变分析中的种系参考。这些研究将阐明组合疗法后新抗原态势的进化。

外周血液样品：筛选，第0天、第11天、第21天、第42天、第63天、第126天、第189天、第252天、第315天。

通过流式细胞术从PMBC(第0天、第21天、第63天、第126天、第252天)分选CD8+PD-1+ T淋巴细胞，并且使用DNEASY试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))分离其GDNA。扩增TCR-Β链CDR3区，并且用调查IMMUNOSEQ测定(自适应生物技术公司(ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES))进行深度测序以确定克隆性。

使用大量细胞计数法(MASS CYTOMETRY)(CYTOF)对来自PBMC的免疫细胞亚群进行全面的免疫表型分析(第0天、第11天、第42天、第189天、第315天)，并且阐明通过治疗过程的免疫应答的进化。

作为MIF和CYTOF的互补方法，使用NANOSTRING PANCANCER免疫分析面板来监测研究患者中的抗肿瘤免疫应答。此面板由770个基因组成，并且包含与24种不同免疫细胞类型的细胞表面标志物有关的109个基因，以及表示所有类别的免疫应答的超过500个基因，包含关键检查点阻断基因。所述面板还包含用于在表达分析中的数据标准化的40个参考基因。为了基于基因表达鉴定白细胞亚群体，使用CYBERSORT方法(82)。简而言之，使用MIRNEASY RNA分离试剂盒(凯杰公司)从PBMC(第0天、第11天、第42天、第189天、第315天)分离RNA。通过在安捷伦生物分析仪(AGILENT BIOANALYZER)上运行来评估RNA质量和完整性。将两百纳克RNA用于UCLA系统生物医学中心(UCLA CENTER FOR SYSTEMS BIOMEDICINE)的NANOSTRING分析。

使用来自第0天、第63天血液样品的血浆，通过ELISA对抗AD IGM和IGG抗体进行定量。使用来自第0天、第21天、第63天、第126天、第252天的PBMC进行抗原特异性ELISPOT测定，以监测对NSCLC患者中常见的HLA匹配的TAA的免疫应答。

临床应答：筛选，第63天，Q3MO，直到疾病进展或从研究中退出：进行CT扫描以用于评估肿瘤负荷(IRRECIST患者管理标准，RECIST 1.1用于最终分析)。通过NCI通用毒性标准V 4.0的毒性用于定义与AD-CCL21-DC和派姆单抗组合疗法相关的不良事件(AE)。

在整个研究过程中，在两个阶段中监测不良事件。第一阶段构成治疗期间的安全性监测，其中使用来自第0天和第63天的血液样品，用患者血浆进行腺病毒特异性IGM和IGG抗体的ELISA。第二阶段发生在临床应答评估期间，其在筛选日、第63天以及此后每3个月进行一次，直到疾病进展或患者从研究中退出。通过NCI通用毒性标准的毒性用于定义与AD-CCL21-DC和派姆单抗组合疗法相关的AE。根据所有适用的全球法律和法规，监测所有AE并向监管机构和IRB/IEC报告。

受试者具有对在第0天之前、第63天以及此后每3个月根据免疫相关和标准RECISTV1.1指南进行分级可评估靶病灶和非靶病灶的连续测量，直到疾病进展或从方案中退出：

靶病灶

完全应答(CR)：所有靶病灶的消失

部分应答(PR)：靶病灶的最长直径(LD)的总和减少至少30％，取基线总和LD作为参考

进行性疾病(PD)：靶病灶的LD的总和增加至少20％，取自治疗开始以来记录的最小总和LD或一个或多个新病灶的出现作为参考。

稳定型疾病(SD)：既没有足够的收缩以符合PR也没有足够的增加以符合PD，取自治疗开始以来的最小总和LD作为参考。

非靶病灶

完全应答(CR)：所有非靶病灶的消失以及肿瘤标志物水平的标准化。

不完全应答/稳定型疾病(SD)：一个或多个非靶病灶的持久性或/或肿瘤标志物水平维持在正常极限以上。

进行性疾病(PD)：一种或多种新病灶的出现和/或现有非靶病灶的明确进展。尽管“非靶”病灶的明显进展仅是例外，但在此类情况下，应以治疗医师的意见为准，并且进展状态稍后应由审查小组(或研究主席)确认。

在剂量递增期间，主要终点是建立最大耐受剂量(MTD)/最大施用剂量(MAD)。因为本文所提出的组合疗法尚未在之前的临床试验中进行测试，因此此终点适用于确定可以安全给予的最有效剂量。在剂量扩展期间，主要终点是定义AD-CCL21-DC/派姆单抗组合疗法的客观应答率。具体地，研究对确定AD-CCL21-DC施用是否在癌症进展的控制中增强PD-1/PD-L1抑制感兴趣。在整个研究中，次要终点包含使用CTCAE V4.0定义毒性以对不良事件(AE)进行分级，以及通过全面的免疫监测研究确定治疗对药物靶活性的影响。

实例3.组合疗法在高突变负荷模型中的功效

这里所描述的研究证明了组合疗法对具有高突变负荷的肿瘤的功效。

最近的研究证明，人NSCLC(超过85％的肺癌)具有高非同义突变负荷，这是与PD-1阻断的临床益处相关的生物标志物。KRAS突变是NSCLC中最普遍的致癌驱动子(在LUAC中约25％)，并且最近的研究揭示，STK11/LKB1(KL)和TP53(KP)肿瘤抑制基因中的共同发生的突变定义了具有独特TME免疫谱的NSCLC的不同亚组。LKB1突变最近已经被鉴定为KRAS-突变体肺腺癌(LUAC)中对PD-1阻断的原发性抗性的主要驱动子。

肺癌的基因工程化小鼠模型(GEMM)，如KRASG12D(LKR13)、KRASG12D；P53-/-(KP)和KRASG12D；P53-/-；LKB1-/-(KPL)具有人NSCLC的常见驱动子突变。然而，最近的研究和数据揭示了在这些模型中，不模仿人NSCLC的低单核苷酸变体(SNV)，其通常具有高肿瘤突变负荷(TMB)。因此，通过将LKR13、KP和KPL细胞体外暴露于烟草致癌物甲基亚硝基脲(MNU)开发了具有各种突变负荷的GEMM，以概括人NSCLC的突变态势。这些突变体细胞系的全外显子组测序(WES)揭示了突变负荷和瘤内异质性的显著增加。

进行研究以评估IT CCL21-DC和IP抗PD-1组合疗法在新建立的两种具有低(KPL)和高(KPL-3M；KPL与三种体外MNU暴露)突变负荷的肺癌的GEMM中的功效。IT施用CCL21-DC显著增强了KPL模型中的抗PD-1功效，而仅CCL21-DC或抗PD-1则没有显示显著效果(图5A和5B)。在KPL-3M模型中，CCL21-DC和抗PD-1单一疗法引发中等功效，而组合疗法导致有效的肿瘤根除(图5C和5D)。这些数据表明，IT CCL21-DC递送改善了抗PD-1对于肺癌治疗的功效，并且具体地在高肿瘤负荷模型中的功效。

图5A-D显示，CCL21-DC的瘤内(IT)施用在肺癌的基因工程化小鼠模型(GEMM)中增强了抗PD-1功效。A)鼠KRASG12D；P53-/-；LKB-/-(KPL)模型中的IT CCL21-DC和抗PD-1组合。用7.5×104KPL细胞皮下接种FVB小鼠。在第7天，在与如上所述的相同时间点，用以下治疗携带<25MM3肿瘤的小鼠：A)媒剂对照；B)IT CCL21-DC(在第7天、第11天、第15天，106CCL21-DC/剂量)；C)IP抗PD-1(在第7天、第9天、第11天、第13天、第15天，200微克/剂量)；D)IT CCL21-DC和IP抗PD-1的组合。记录肿瘤体积。B)与A中相同，除了在研究结束时呈现肿瘤重量之外。C)除了使用携带高突变负荷的KPL-3M细胞(1.0×105个细胞)之外，与A相同。D)除了使用KPL-3M细胞之外，与B相同。通过非配对T测试确定P值。N.S.，不显著；*，P<0.05；**，P<0.005；****，P<0.00005。

实例4.CCL21和抗PD-1抗体治疗具有高突变负荷的非小细胞肺癌的I期试验

如上文实例2中详细描述的进行试验，其中如果肿瘤具有高突变负荷，则对进入到试验中的患者进行预筛选和登记，例如通过本文所述的方法确定，如但不限于来自FOUNDATIONONE(剑桥,马萨诸塞州)的诊断分析，如FOUNDATIONONE CDX^TM、

或

可以使用其它方法来确定肿瘤具有高突变负荷。然后，此试验将确定瘤内(IT)注射CCL21基因修饰的DC(AD-CCL21-DC)在与静脉内派姆单抗组合时在患有先前未经过治疗的晚期NSCLC并且具有高突变负荷的肿瘤的患者(其肿瘤在少于50％的肿瘤细胞中表达PD-L1)中的安全性和功效。

参考文献

1、L.A.Torre,R.L.Siegel,A.Jemal,《实验医学与生物学进展(Adv Exp MedBiol)》893,1-19(2016)。

2、Y.Tang等人,《肿瘤靶标与疗法(Onco Targets Ther)》10,4527-4534(2017)。

3、N.A.M.Howlader N.,Krapcho M.,Miller D.,Bishop K.,Altekruse S.F.,Kosary C.L.,Yu M.,Ruhl J.,Tatalovich Z.,Mariotto A.,Lewis D.R.,Chen H.S.,Feuer E.J.,Cronin K.A.,美国国家癌症研究所(National Cancer Institute),贝塞斯达,马里兰州(2016)。

4、R.L.Siegel,K.D.Miller,A.Jemal,《临床医师癌症杂志(CA Cancer J Clin)》65,5-29(2015年1月-2月)。

5、M.Reck等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》375,1823-1833(2016年11月10日)。

6、A.T.Shaw等人,《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》27,4247-53(2009年9月10日)。

7、T.J.Lynch等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》350,2129-39(2004年5月20日)。

8、J.G.Paez等人,《科学(Science)》304,1497-500(2004年6月4日)。

9、W.Pao等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》101,13306-11(2004年9月7日)。

10、J.P.Koivunen等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》14,4275-83(2008年7月1日)。

11、R.Chiarle等人,《自然癌症评论(Nat Rev Cancer)》8,11-23(2008年1月)。

12、E.B.Garon等人,《新英格兰医学杂志》372,2018-28(2015年5月21日)。

13、G.V.Scagliotti等人,《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》26,3543-51(2008年7月20日)。

14、J.Brahmer等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》373,123-35(2015年7月9日)。

15、H.Borghaei等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》373,1627-39(2015年10月22日)。

16、L.Horn等人,《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》,JCO2017743062(2017年10月12日)。

17、R.S.Herbst等人,《柳叶刀(Lancet)》387,1540-50(2016年4月09日)。

18、A.Rittmeyer等人,《柳叶刀(Lancet)》389,255-265(2017年1月21日)。

19、D.P.Carbone等人,《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》376,2415-2426(2017年6月22日)。

20、C.J.Langer等人,《柳叶刀肿瘤学(Lancet Oncol)》17,1497-1508(2016年11月)。

21、M.D.Hellmann等人,《柳叶刀肿瘤学(Lancet Oncol)》18,31-41(2017年1月)。

22、J.M.Lee等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》23,4556-68(2017年5月03日)。

23、S.Novello等人,《肿瘤学年鉴(Ann Oncol)》27,v1-v27(2016年9月)。

24、M.L.Spiegel等人,《癌症(Cancer)》(2017年11月10日)。

25、S.N.Gettinger等人,《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》33,2004-12(2015年4月20日)。

26、J.R.Brahmer等人,2014ASCO会议(ASCO Meeting),《临床肿瘤学杂志(J ClinOncol)》32:5s,2014(增刊：摘要8021)。

27、V.K.Anagnostou,J.R.Brahmer,《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》21,976-84(2015年3月1日)。

28、R.S.Herbst等人,《自然(Nature)》515,563-7(2014年11月27日)。

29、P.C.Tumeh等人,《自然(Nature)》515,568-71(2014年11月27日)。

30、L.Robert等人,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》3,e29244(2014)。

31、I.Yoshino等人,《癌症研究(Cancer Res)》54,3387-90(1994年7月1日)。

32、S.M.Dubinett等人,《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志(Am J RespirCell Mol Biol)》22,524-7(2000年5月)。

33、N.P.Restifo等人,《实验医学杂志(J Exp Med)》177,265-72(1993年2月1日)。

34、S.Sharma等人,《免疫学杂志(Journal of Immunology)》163,5020-8(1999年11月1日)。

35、M.K.Srivastava等人,《免疫疗法(Immunotherapy)》4,291-304(2012年3月)。

36、L.X.Zhu等人,《免疫学杂志(J Immunol)》170,3585-91(2003年4月1日)。

37、S.Sharma等人,《癌症研究(Cancer Res)》65,5211-20(2005年6月15日)。

38、F.Baratelli等人,《美国转化研究杂志(Am J Transl Res)》2,356-67(2010)。

39、S.M.Dubinett,J.M.Lee,S.Sharma,J.J.Mule,《癌症杂志(Cancer J)》16,325-35(2010年7月-8月)。

40、V.W.Chan等人,《血液(Blood)》93,3610-6(1999年6月1日)。

41、J.G.Cyster,《实验医学杂志(J Exp Med)》189,447-50(1999年2月1日)。

42、J.F.Arthur等人,《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther)》4,17-25(1997年1月-2月)。

43、P.Gallo等人,《基因疗法(Gene Ther)》12增刊1,S84-91(2005年10月)。

44、L.H.Butterfield,L.Vujanovic,《试验药物的当前观点(Curr Opin InvestigDrugs)》11,1399-408(2010年12月)。

45、F.Baratelli等人,《转化医学杂志(J Transl Med)》6,38(2008年7月22日)。

CLIN2-10784 CLIN 2：临床试验阶段项目(Clinical Trial Stage Projects)65

46、S.C.Yang等人,《癌症研究(Cancer Res)》66,3205-13(2006年3月15日)。

47、S.C.Yang等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》10,2891-901(2004年4月15日)。

48、T.Okazaki,A.Maeda,H.Nishimura,T.Kurosaki,T.Honjo,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》98,13866-71(2001年11月20日)。

49、J.L.Riley,《免疫学评论(Immunol Rev)》229,114-25(2009年5月)。

50、K.A.Sheppard等人,《FEBS学报(FEBS Lett)》574,37-41(2004年9月10日)。

51、M.E.Keir,M.J.Butte,G.J.Freeman,A.H.Sharpe,《免疫学年度评论(Annu RevImmunol)》26,677-704(2008)。

52、J.Banchereau,R.M.Steinman,《自然(Nature)》392,245-52(1998年3月19日)。

53、R.M.Steinman,《免疫学年度评论(Annu Rev Immunol)》30,1-22(2012)。

54、E.W.Roberts等人,《癌症细胞(Cancer Cell)》30,324-336(2016年8月08日)。

55、S.Spranger,D.Dai,B.Horton,T.F.Gajewski,《癌症细胞(Cancer Cell)》31,711-723e4(2017年5月08日)。

56、J.Constantino等人,《免疫学研究(Immunol Res)》65,798-810(2017年8月)。

57、A.D.Garg等人,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》6,e1328341(2017)。

58、V.Cerundolo,I.F.Hermans,M.Salio,《自然-免疫学(Nat Immunol)》5,7-10(2004年1月)。

59、R.L.Sabado,S.Balan,N.Bhardwaj,《细胞研究(Cell Res)》27,74-95(2016年1月)。

60、N.Nagarsheth,M.S.Wicha,W.Zou,《自然免疫学评论(Nat Rev Immunol)》17,559-572(2017年9月)。

61、A.P.Vicari等人,《免疫学杂志(J Immunol)》165,1992-2000(2000年8月15日)。

62、S.Sharma等人,《免疫学杂志(J Immunol)》164,4558-63(2000年5月01日)。

63、S.Sharma等人,《分子癌症(Mol Cancer)》2,22(2003年4月15日)。

64、S.Sharma等人,《癌症研究(Cancer Res)》61,6406-12(2001年9月01日)。

65、A.Ribas等人,《癌症研究(Cancer Res)》60,2218-24(2000年4月15日)。

66、S.Hillinger等人,《免疫学杂志(Journal of Immunology)》171,6457-65.(2003)。

67、S.M.Dubinett等人,《美国国立癌症研究所杂志(J Natl Cancer Inst)》87,593-7(1995年4月19日)。

68、A.Hagenbaugh等人,《实验医学杂志(J Exp Med)》185,2101-10(1997年6月16日)。

69、M.Huang等人,《癌症研究(Cancer Res)》58,1208-16(1998年3月15日)。

70、S.M.Dubinett等人,《病理学(Pathobiology)》59,372-7(1991)。

71、S.M.Dubinett,J.T.Kurnick,R.L.Kradin,《美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志(Am J Respir Cell Mol Biol)》1,361-9(1989年11月)。

72、J.Kim等人,《免疫学杂志(J Immunol)》155,2240-7(1995年8月15日)。

73、W.H.McBride等人,《癌症研究(Cancer Res)》52,3931-7(1992年7月15日)。

74、S.M.Dubinett等人,《癌症免疫现状(Cancer Immunol Immunother)》36,156-62(1993)。

75、J.M.Lee等人,在《癌症免疫疗法杂志(Journal for ImmunoTherapy ofCancer.)》(2014),第2卷,第O20页。

76、Y.Carmi等人,《自然(Nature)》521,99-104(2015年5月07日)。

77、N.A.Rizvi等人,《科学(Science)》348,124-8(2015年4月03日)。

78、K.Politi,R.S.Herbst,《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》21,2213-20(2015年5月15日)。

79、P.Sharma,S.Hu-Lieskovan,J.A.Wargo,A.Ribas,《细胞(Cell)》168,707-723(2017年2月09日)。

80、W.Zou,J.D.Wolchok,L.Chen,《科学转化医学(Sci Transl Med)》8,328rv4(2016年3月02日)。

81、E.R.Parra等人,《科学报告(Sci Rep)》7,13380(2017年10月17日)。

82、A.M.Newman等人,《自然方法(Nat Methods)》12,453-7(2015年5月)。

83、K.Riedl等人,《分子癌症(Mol Cancer)》2,35(2003年11月02日)。

84、N.Nishimura,Y.Nishioka,T.Shinohara,S.Sone,《人类基因疗法(MolCancer)》12,333-46(2001年3月1日)。

85、E.Guenova等人,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》38,3138-49(2008年11月)。

86、G.Trinchieri,《血液(Blood)》84,4008-27(1994年12月15日)。

87、S.E.Macatonia等人,《免疫学杂志(J Immunol)》154,5071-9(1995年5月15日)。

88、G.Breton等人,《实验医学杂志(J Exp Med)》213,2861-2870(2016年12月12日)。

89、M.Guilliams等人,《免疫力(Immunity)》45,669-684(2016年9月20日)。

90、M.Alcantara-Hernandez等人,《免疫力(Immunity)》47,1037-1050e6(2017年12月19日)。

91、M.Dauer等人,《免疫学杂志(J Immunol)》170,4069-76(2003年4月15日)。

92、W.Zou,L.Chen,《自然免疫学评论(Nat Rev Immunol)》8,467-77(2008年6月)。

93、J.Galon,W.H.Fridman,F.Pages,《癌症研究(Cancer Res)》67,1883-6(2007年3月1日)。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会，美国政府退伍军人事务部

（REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA UNITED

STATES GOVERNMENT REPRESENTED BY THE DEPARTMENT OF

VETERANS AFFAIRS）

<120> 用于治疗癌症的CCL21和检查点抑制剂

<130> P-580298-PC

<150> 62/828352

<151> 2019-04-02

<150> 62/669707

<151> 2018-05-10

<160> 2

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 134

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro

130

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Ala Gln Met Met Thr Leu Ser Leu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu

1 5 10 15

Cys Ile Pro Trp Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Lys Lys Ile Pro Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Pro Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys His Ser Lys Pro Glu Leu Cys Ala Asn Pro Glu Glu

65 70 75 80

Gly Trp Val Gln Asn Leu Met Arg Arg Leu Asp Gln Pro Pro Ala Pro

85 90 95

Gly Lys Gln Ser Pro Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gly Thr Ser Lys Ser

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Gln Thr

115 120 125

Gln Pro Ser Arg Gly

130

Claims

1.一种治疗受试者的具有高突变负荷的癌症或实体瘤的方法，所述方法包括：

a.向所述受试者施用(i)SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的细胞或(iv)其任何组合，以及

b.向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：CTLA-4抑制剂、CTLA-4受体抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD1-L2抑制剂、4-lBB抑制剂、OX40抑制剂、LAG-3抑制剂、TIM-3抑制剂或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体，任选地单克隆抗体。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，任选地伊匹单抗(ipilimumab)或曲美木单抗(tremilimumab)。

5.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的PD1抑制剂：纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)、兰伯丽珠单抗(Lambrolizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗(Atezolizumab)以及AMP-224、AMP224、AUNP12、BGB108、MCLA134、MEDI0680、PDROOl、REGN2810、SHR1210、STIAl lOX、STIAl l lO和TSR042。

6.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的PD-L1抑制剂：BMS-936559、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB0010718C、ALN-PDL、BGBA317、KD033、KY1003、STIA100X、STIA1010、STIA1011、STIA1012和STIA1014。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述SLC多肽包括SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸序列。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中将对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸插入到载体中，并且向所述受试者施用所述载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述载体是腺病毒载体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述APC是树突细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述树突细胞对所述受试者是自体的。

14.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的至少或约1×10⁶个细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞在24小时时间段内每1×10⁶个细胞产生至少或约0.25ng的CCL21。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述受试者包括实体瘤，并且向所述受试者瘤内施用所述细胞。

17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中所述实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)实体瘤。

18.根据权利要求1到17中任一项所述的方法，其中在免疫检查点抑制剂之前向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中在所述免疫检查点抑制剂之前约2周向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中超过一次向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中每月一次向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

22.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中超过一次向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中每2周一次向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂。

24.一种治疗受试者的癌症或实体瘤的方法，所述方法包括以下步骤：

a.鉴定高突变负荷在所述受试者的肿瘤中的存在；

b.向具有高突变负荷肿瘤的所述受试者施用(i)SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的细胞或(iv)其任何组合，以及

c.向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：CTLA-4抑制剂、CTLA-4受体抑制剂、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD1-L2抑制剂、4-lBB抑制剂、OX40抑制剂、LAG-3抑制剂、TIM-3抑制剂或其组合。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体，任选地单克隆抗体。

27.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，任选地伊匹单抗或曲美木单抗。

28.根据权利要求24到26中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的PD1抑制剂：纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、兰伯丽珠单抗、BMS-936559、阿特珠单抗以及AMP-224、AMP224、AUNP12、BGB108、MCLA134、MEDI0680、PDROOl、REGN2810、SHR1210、STIAl lOX、STIAlllO和TSR042。

29.根据权利要求24到26中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下组成的组的PD-L1抑制剂：BMS-936559、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB0010718C、ALN-PDL、BGBA317、KD033、KY1003、STIA100X、STIA1010、STIA1011、STIA1012和STIA1014。

30.根据权利要求24到29中任一项所述的方法，其中所述SLC多肽包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

31.根据权利要求24到30中任一项所述的方法，其中将对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸插入到载体中，并且向所述受试者施用所述载体。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述载体是腺病毒载体。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体。

34.根据权利要求24到31中任一项所述的方法，其中包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的所述细胞是抗原呈递细胞(APC)。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述APC是树突细胞。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述树突细胞对所述受试者是自体的。

37.根据权利要求24到36中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用至少或约1×10⁶个包括对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸的细胞。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞在24小时时间段内每1×10⁶个细胞产生至少或约0.25ng的CCL21。

39.根据权利要求24到38中任一项所述的方法，其中所述受试者包括实体瘤，并且向所述受试者瘤内施用所述细胞。

40.根据权利要求24到38中任一项所述的方法，其中所述实体瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)实体瘤。

41.根据权利要求24到40中任一项所述的方法，其中在免疫检查点抑制剂之前向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

42.根据权利要求24到40中任一项所述的方法，其中在所述免疫检查点抑制剂之前约2周向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

43.根据权利要求24到42中任一项所述的方法，其中超过一次向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

44.根据权利要求43所述的方法，其中每月一次向所述受试者施用(i)所述SLC多肽；(ii)对所述SLC多肽进行编码的所述多核苷酸；(iii)包括对所述SLC多肽进行编码的多核苷酸的所述细胞或(iv)其任何组合。

45.根据权利要求24到34中任一项所述的方法，其中超过一次向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂。

46.根据权利要求45所述的方法，其中每2周一次向所述受试者施用所述免疫检查点抑制剂。

47.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述高突变负荷是由所述肿瘤的活检确定的。

48.根据权利要求1或24所述的方法，其中确定肿瘤相关新抗原。

49.根据权利要求1或24所述的方法，其中组合疗法的功效之后是所述肿瘤的新抗原态势(landscape)的说明。

50.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述肿瘤包括选自以下的突变：KRAS、TP53(KP)或STK11/LKB1或其任何组合。

51.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述肿瘤具有瘤内异质性。

52.根据权利要求1或24所述的方法，其中通过选自以下的诊断分析来确定肿瘤突变负荷：FoundationOne CDx^TM、

和

Heme。

53.根据权利要求1或24所述的方法，其中所述肿瘤在表皮生长因子受体或间变性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合体中不具有活化突变。

54.根据权利要求1或24所述的方法，其中使用在治疗之前、治疗期间和治疗之后的体细胞突变负荷和肿瘤相关新抗原来启动、规定和监测疗法。

55.一种用于治疗有需要的受试者的癌症或减少所述受试者的高突变负荷癌症的复发的方法，所述方法包括施用有效量的组合疗法，所述组合疗法包括：a)在第0天、第21天和第42天施用包括载体-CCL21(载体-CCL21-DC)构建体的树突细胞，以及b)从第0天开始每三周施用有效量的抗PD-1抗体，任选地其中所述载体是腺病毒载体(Ad-CCL21-DC)。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗和兰伯丽珠单抗。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是每三周以200mg的剂量施用的派姆单抗。

58.根据权利要求55到57中任一项所述的方法，其中所述Ad-CCL21-DC是以5×106个细胞/注射到3×107个细胞/注射的剂量施用的。

59.根据权利要求55到58中任一项所述的方法，其中Ad-CCL21-DC剂量是5×106、1×107或3×107个细胞/注射。

60.根据权利要求55到59中任一项所述的方法，其中肺癌是在少于50％的细胞中表达PD-L1的IV期NSCLC。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述患者具有可通过CT引导的介入或支气管镜检查接近的NSCLC肿瘤，并且所述患者未接受过NSCLC的全身性治疗。

62.根据权利要求55到61中任一项所述的方法，其中所述Ad-CCL21-DC是通过CT引导的或支气管镜的IT注射施用的。

63.根据权利要求55到62中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是静脉内施用的。

64.根据权利要求55到83中任一项所述的方法，其中所述载体-CCL21-DC增加了CD8+T细胞向肿瘤的浸润。

65.根据权利要求64所述的方法，其中与未接受组合疗法的受试者相比，经过治疗的受试者的CD8+细胞增加了2倍或更多倍。

66.根据权利要求55到65中任一项所述的方法，其中所述载体-CCL21-DC增加了肿瘤中的PD-L1表达。

67.根据权利要求55到66中任一项所述的方法，其中所述树突细胞是来自所述患者的自体细胞。

68.根据权利要求55到67中任一项所述的方法，其中所述CCL21包括SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸序列。

69.根据权利要求55到68中任一项所述的方法，其中所述腺病毒是复制缺陷型腺病毒载体。

70.根据权利要求55到69中任一项所述的方法，其中肿瘤体积减小了20％或更多。

71.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者的肿瘤大小减小了约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。

72.根据权利要求55到71中任一项所述的方法，其中所述疗法降低了所述患者的肿瘤的转移速率和/或减缓了所述患者的所述肿瘤的进展。

73.根据权利要求55到72中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是在第0天、第21天和第42天在载体-CCL21-DC疗法之后1小时内施用的。

74.根据权利要求55到73中任一项所述的方法，其中所述组合疗法增加了所述受试者的肿瘤抗原特异性CD8和CD4细胞的数量。

75.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症的所述高突变负荷是由所述肿瘤的活检确定的。

76.根据权利要求55所述的方法，其中确定肿瘤相关新抗原。

77.根据权利要求55所述的方法，其中组合疗法的功效之后是所述癌症的新抗原态势的说明。

78.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症包括选自以下的突变：KRAS、TP53(KP)或STK11/LKB1或其任何组合。

79.根据权利要求76所述的方法，其中所述癌症具有瘤内异质性。

80.根据权利要求55所述的方法，其中通过选自以下的诊断分析来确定所述癌症的突变负荷：FoundationOne CDx^TM、

和

Heme。

81.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症在表皮生长因子受体或间变性淋巴瘤激酶基因(ALK)融合体中不具有活化突变。

82.根据权利要求55所述的方法，其中使用在治疗之前、治疗期间和治疗之后的体细胞突变负荷和肿瘤相关新抗原来确定、启动、规定或监测疗法。

83.一种用于治疗有需要的受试者的癌症或减少所述受试者的癌症的复发的方法，所述方法包括施用有效量的组合疗法，所述组合疗法包括：a)在第0天、第21天和第42天施用包括载体-CCL21(载体-CCL21-DC)构建体的树突细胞，以及b)从第0天开始每三周施用有效量的抗PD-1抗体，任选地其中所述载体是腺病毒载体(Ad-CCL21-DC)。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述抗PD-1抗体选自由以下组成的组：纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗和兰伯丽珠单抗。

85.根据权利要求83所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是每三周以200mg的剂量施用的派姆单抗。

86.根据权利要求83到85中任一项所述的方法，其中所述Ad-CCL21-DC是以5×10⁶个细胞/注射到3×10⁷个细胞/注射的剂量施用的。

87.根据权利要求83到86中任一项所述的方法，其中Ad-CCL21-DC剂量是5×10⁶、1×10⁷或3×10⁷个细胞/注射。

88.根据权利要求83到87中任一项所述的方法，其中肺癌是在少于50％的细胞中表达PD-L1的IV期NSCLC。

89.根据权利要求83到88中任一项所述的方法，其中所述患者具有可通过CT引导的介入或支气管镜检查接近的NSCLC肿瘤，并且所述患者未接受过NSCLC的全身性治疗。

90.根据权利要求83到89中任一项所述的方法，其中所述Ad-CCL21-DC是通过CT引导的或支气管镜的IT注射施用的。

91.根据权利要求83到90中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是静脉内施用的。

92.根据权利要求83到91中任一项所述的方法，其中所述载体-CCL21-DC增加了CD8+T细胞向肿瘤的浸润。

93.根据权利要求92所述的方法，其中与未接受组合疗法的受试者相比，经过治疗的受试者的CD8+细胞增加了2倍或更多倍。

94.根据权利要求83到93中任一项所述的方法，其中所述载体-CCL21-DC增加了肿瘤中的PD-L1表达。

95.根据权利要求83到94中任一项所述的方法，其中所述树突细胞是来自所述患者的自体细胞。

96.根据权利要求84到95中任一项所述的方法，其中所述CCL21包括SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的氨基酸序列。

97.根据权利要求83到96中任一项所述的方法，其中所述腺病毒是复制缺陷型腺病毒载体。

98.根据权利要求83到97中任一项所述的方法，其中肿瘤体积减小了20％或更多。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述受试者的肿瘤大小减小了约25-50％、约40-70％或约50-90％或更多。

100.根据权利要求83到99中任一项所述的方法，其中所述疗法降低了所述患者的肿瘤的转移速率和/或减缓了所述患者的所述肿瘤的进展。

101.根据权利要求83到100中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是在第0天、第21天和第42天在载体-CCL21-DC疗法之后1小时内施用的。

102.根据权利要求83到101中任一项所述的方法，其中所述组合疗法增加了所述受试者的肿瘤抗原特异性CD8和CD4细胞的数量。