CN112458160A - 与新型冠状病毒肺炎重症相关的11q14.2区域的多态性的检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019，COVID‑19)重症风险相关基因区域11q14.2的SNP位点rs10831496的检测方法、试剂盒及其应用。所述方法为基因分型(包括但不限于TaqMan分型和Sequenom分型)，本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及其应用。另外，本发明将11q14.2的SNP位点rs10831496与COVID‑19的重症风险进行关联分析，公开该SNP及其应用。其中，该SNP位于人类基因组区域11q14.2，确定了11q14.2是COVID‑19的一个重症风险相关基因区域，能够有效用于筛选COVID‑19重症风险易感人群，并具有辅助指导COVID‑19重症治疗的潜在应用价值。

Description

与新型冠状病毒肺炎重症相关的11q14.2区域的多态性的检 测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及与新型冠状病毒肺炎重症相关的 11q14.2区域的多态性的检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2感染人体后，可导致以发热、咳嗽和呼吸困难为主要特征的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)，严重威胁人民的生命健康。然而，SARS-CoV-2感染人体后，个体会发生显著不同的病程转归，可表现为单纯性感染、轻型肺炎、普通型肺炎、重型肺炎和危重型肺炎。个体感染SARS-CoV-2后发生不同临床转归的原因，可能是由于个体间的性别、年龄等因素存在差异所造成。例如，有报道显示，年老的个体、男性个体和基础健康状况较差的个体，在感染SARS-CoV-2后，更易诱发重症肺炎。另一方面，已有研究显示，机体的遗传因素在病毒感染后的临床转归过程中也发挥着重要的作用。例如，重症急性呼吸综合征(SARS)由SARS-CoV 感染引起，携带趋化因子配体2(CCL2)基因变异G-2518A的个体，能够招募更多的单核细胞和巨噬细胞，进而导致这些个体对SARS-CoV更为易感。又如，乙型肝炎病毒(HBV)感染个体后，部分个体能够自我清除病毒，部分个体将发展成为持续性感染者，其重要原因之一在于编码HBV的受体钠离子牛磺胆酸共转运多肽(sodium-taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP)的基因SLC10A1存在基因多态性rs4646287，部分个体的NTCP受体可阻止HBV侵袭和感染肝细胞。

感染性疾病易感基因的发现，对于疾病的临床治疗具有重要意义。例如，编码干扰素λ3的IL28B基因，其遗传变异rs12979860与慢性丙型肝炎(HCV) 的发生显著相关。采用聚乙二醇干扰素α联用利巴韦林治疗方案，携带IL28B基因易感位点的个体，其HCV病毒(尤其是G1型病毒)的清除率显著高于不携带易感位点的个体。因此，发现COVID-19重症相关的易感基因，有望为 COVID-19的发生、病程的进展、治疗效果以及预后提供理论基础和研究线索。

全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)被证明可以无偏、有效的发掘疾病或表型相关的SNP。至今，已有超过2000篇全基因组关联研究被报道。GWAS发现的疾病易感基因，已被后续的机制研究证明在疾病的发生、发展过程中发挥重要的作用，为疾病防诊治措施的研发奠定了坚实的基础。近期，一项针对意大利和西班牙人的GWAS成功鉴定出2个SNP与 COVID-19重症伴呼吸衰竭显著相关，分别是：位于3p21.31的rs11385942和 9q34.2的rs657152。这两个SNP的频率分布在不同人群中差异较大，尤其是rs11385942，其在中国人群中不存在遗传多态性。

目前，尚无中国人群COVID-19重症遗传易感性的研究报道。基于SNP的 COVID-19重症预测技术仍有待开发。

发明内容

本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

为发掘新的COVID-19重症易感基因，发明人招募了2个COVID-19患者人群(人群1：招募自甲医院，以下简称甲人群；人群2：招募自乙医院，以下简称乙人群)。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，发明人将COVID-19患者分为轻型、普通型、重型和危重型患者。其中，轻型和普通型患者为轻症患者，在本研究中作为对照，重型和危重型患者为重症患者，在本研究中作为病例。由此，甲人群包括663例病例和322例对照，乙人群包括200例病例和207例对照。发明人采用基于病例-对照策略，在两个人群中开展全基因组关联研究，并对两个人群的结果进行荟萃分析。最终，成功定位 11q14.2为COVID-19重症的易感区域。进一步，发明人对该区域进行了更细致的分析。

本发明旨在至少一定程度上解决相关领域中的技术问题之一。

根据本发明的第一方面，本发明提出检测SNP的试剂在制备试剂盒中的用途，其中，所述试剂盒用于COVID-19患者筛查，所述SNP为rs10831496，该位点位于人类第11号染色体88,557,991位置(基于人类基因组第hg19版本)。发明人针对两个人群采用基于病例-对照的策略完成关联分析，最终确定 rs10831496与COVID-19重症风险显著相关，由此，利用所述检测SNP的试剂可以有效进行COVID-19重症患者的筛查。

根据本发明的一些实施例，所述试剂包括引物和/或探针。

根据本发明的一些实施例，所述rs10831496为AA或AG的基因型是 COVID-19重症高风险的指示。通过分析表达数量性状基因座(expression Quantitative Trait Loci，eQTL)，发明人发现，rs10831496风险等位A等位 (AA或AG)与血液组织中CTSC基因的高表达显著相关。由此，可以通过检测rs10831496的基因型来有效进行COVID-19重症患者的筛查，且具有辅助指示COVID-19重症治疗(如已开展3期临床试验的CTSC靶向药物 Brensocatib)的潜在应用价值。

根据本发明的第二方面，本发明提出一种用于COVID-19患者筛查的试剂盒，所述试剂盒含有检测SNP的试剂，所述SNP为rs10831496。发明人针对两个人群采用基于病例-对照的策略完成关联分析，最终确定rs10831496与 COVID-19重症风险显著相关，由此，利用所述试剂盒可以有效检测COVID-19 重症。

根据本发明的一些实施例，所述试剂包括引物和/或探针。所述试剂的使用方法包括但不限于TaqMan分型和Sequenom分型等。

根据本发明的一些实施例，所述引物为 ACGTTGGATGGGGACCCCTGCTCTAAATAA(SEQID NO：1)和 ACGTTGGATGACATATGCATACCCGTCTAC(SEQ ID NO：2)。其中，ACGTTGGATGGGGACCCCTGCTCTAAATAA为前向引物， ACGTTGGATGACATATGCATACCCGTCTAC为后向引物，利用前向引物和后向引物可以有效地检测本发明所述SNP位点。

根据本发明的一些实施例，所述探针为(FAM) CAGTACCTACATATGGgTAT(SEQ IDNO：3)和/或(HEX) CAGTACCTACATATGGaTAT(SEQ ID NO：4)。利用所述探针可以有效地检测本发明所述SNP位点。

根据本发明的一些实施例，所述rs10831496为AA或AG的基因型是 COVID-19重症高风险的指示。根据本发明的实施例，利用本发明的引物组能够有效地对待测个体的上述与COVID-19重症风险相关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对这种SNP标记的检测，确定待测个体该SNP标记位点的基因型，从而能够有效预测待检测个体是否为 COVID-19重症高风险个体。具体地，COVID-19重症患者中rs10831496风险等位A等位的频率显著高于其在轻症患者中的频率。从而，如所述SNP标记位点的基因型为AA时，则能够预测待测个体易感重症COVID-19。此外， rs10831496风险等位A等位(AA或AG)与血液组织中CTSC基因的高表达显著相关。COVID-19重症患者气道组织中CTSC表达显著高于其在轻症患者中的表达，且以往报道CTSC参与细胞因子风暴。由此，用于检测前文所述的本发明的SNP标记的引物组，能够有效用于筛选重症COVID-19易感群体，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地预测重症COVID-19个体，为临床救治以及预后评估等提供理论基础。

根据本发明的第三方面，本发明提出一种用于COVID-19重症患者筛查的设备，包括：

测序装置，所述测序装置用于对患者的全基因组中至少之一进行测序，以便获得测序结果；其中，所述全基因组中至少之一为包括rs10831496的区域。

比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连，且用于基于所述测序结果，确定rs10831496的基因类型；

分析装置，所述分析装置与所述比对装置相连，且用于基于所述SNP类型确定COVID-19重症风险。发明人针对两个人群采用基于病例-对照的策略完成全基因组关联分析，最终确定rs10831496与COVID-19重症风险显著相关，由此，利用所述试剂盒可以有效检测重症COVID-19。

根据本发明的具体实施例，所述测序装置用于对个体的全基因组中预定区域进行测序，以便获得测序结果；其中，所述预定区域为rs10831496上游1 Kb，下游1Kb。由此，可以更加有效地进行测序。

附图说明

图1：根据本发明的实施例1的甲人群和乙人群关联结果荟萃分析绘制的分位数图。采用固定效应模型对甲人群和乙人群的全基因组关联分析结果进行荟萃分析。分位数图计算的膨胀系数λ为1.026。红线代表没有真实关联的无效假设。

图2：根据本发明的实施例1的甲人群和乙人群关联结果荟萃分析绘制的曼哈顿图。曼哈顿图表示甲人群和乙人群全基因组关联分析结果的荟萃分析结果。甲人群和乙人群的全基因组关联分析是在加性模型下采用逻辑斯蒂回归分析方法进行计算，其结果进行荟萃分析(固定效应模型)后得到如图所示的P值。红色虚线表示全基因组显著性阈值P＝5×10^-8。11q14.2达到这个阈值并突出显示。横轴代表人类参考基因组位置(hg19版本)，纵轴表示-log₁₀(P)。

图3：根据本发明的实施例1的甲人群(A)和乙人群(B)关联结果绘制的分位数图，甲人群(C)和乙人群(D)关联结果的曼哈顿图。

图4：根据本发明的实施例1的甲人群和乙人群关联结果荟萃分析绘制的rs10831496染色体位置区域图。

区域图显示11q14.2的rs10831496上下游1兆碱基(Mb)的区域。P值为甲人群和乙人群关联结果荟萃分析结果。基因组位置基于人类参考基因组(hg19版本)位置。rs10831496的P值显示为紫色。其他SNPs与rs10831496的连锁不平衡(LD)值(r²)用标记颜色表示。红色表示r²≥0.8，橙色表示0.6≤r²＜ 0.8，绿色表示0.4≤r²＜0.6，浅蓝色表示0.2≤r²＜0.4，蓝色表示r²＜0.2。千人基因组参考人群的估计重组率(来自千人基因组项目的2014年11月发行版本)用浅蓝色纵轴表示。

图5：根据本发明的实施例1的甲人群(A)和乙人群(B)关联结果分别绘制的rs10831496染色体位置区域图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例

实施例1 COVID-19重症的全基因组关联研究

1、材料与方法

1.1研究对象

本项全基因组关联研究纳入了1,431例COVID-19住院患者。这些患者招募自两家医院：(1)第一个人群于2020年2月4日至2020年3月23日之间招募自甲医院(n＝1,010；定义为甲人群)；(2)第二个人群于2020年1月 15日至2020年3月30日之间招募自乙医院(n＝421；定义为乙人群)。新型冠状病毒肺炎的诊断依据为：对采集自上述两家医院患者的鼻咽拭子样本进行逆转录-聚合酶链反应分析，证实为新型冠状病毒核酸阳性即诊断成立。根据新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)对新型冠状病毒肺炎患者进行临床分类，简述如下：(一)轻型。临床症状轻微，影像学未见肺炎表现；(二)普通型。具有发热、呼吸道等症状，影像学可见肺炎表现；(三)重型。符合下列任何一条：1.呼吸窘迫，RR≥30次/分；2.静息状态下，指氧饱和度≤ 93％；3.动脉血氧分压(PaO₂)/吸氧浓度(FiO₂)≤300mmHg(1mmHg＝0.133kPa)。(四)危重型。符合以下情况之一者：1.出现呼吸衰竭，且需要机械通气；2.出现休克；3.合并其他器官功能衰竭需重症加强护理病房监护治疗。

本研究中将重型和危重型的COVID-19患者定义为“病例”，将轻型和普通型的COVID-19患者定义为“对照”。由此，甲人群包括679例病例和331例对照，乙人群包括206例病例和215例对照。经过质量控制后，甲人群保留663 例病例和322例对照纳入进行后续关联分析，该人群病例的平均年龄 64.2±13.7，男女比例1.1，对照的平均年龄56.6±13.9，男女比例1.1。乙人群保留200例病例和207例对照纳入进行后续关联分析，该人群病例的平均年龄 61.8±14.0，男女比例1.2，对照的平均年龄52.2±16.2，男女比例0.9。由于本研究的样本采集均来自于医院住院患者，不包括无症状感染者和绝大多数无需入院治疗的轻型患者。因此，本研究中的重型/危重型患者百分比(～60％)远高于总体感染人群中的比例(～15％)。两个人群中患者的临床信息来自电子病历，发明人提取了年龄，性别，并发症(包括高血压，糖尿病，冠状动脉疾病，慢性乙型肝炎，慢性阻塞性肺疾病，慢性肾脏疾病和癌症)和症状(发烧，咳嗽，头痛，疲劳，咽痛和呼吸困难)等信息。用于全基因组关联研究样本的人群信息可参见表1。

1.2关联研究

使用SNPTEST软件2.5.4版本的逻辑斯蒂回归进行病例对照关联分析，逻辑斯蒂回归中对年龄，性别和并发症(高血压，II型糖尿病和冠心病)进行了校正。此外，为检验关联区域是否存在多个关联信号，发明人以rs10831496为条件进行了逻辑回归分析。

为检验研究是否存在人群分层等因素导致的系统性偏差，发明人使用分位数图(quantile-quantile plot，Q-Q plot)和膨胀系数(genomic inflation factor) 进行判别。膨胀系数衡量实际获得的关联P值与预期P值之间存在的差异。分位数图和膨胀系数使用R软件的qqman包进行绘制和计算。

1.3统计学检验

病例与对照组之间临床特征的差异的比较，根据样本量选择χ²检验或 Fisher精确检验。荟萃分析使用META软件1.7版本中的固定效应模型完成，用以将两个人群关联分析得到的比值比和95％置信区间进行合并。荟萃分析中 P值以5×10^-8作为全基因组范围内显著性阈值。发明人计算了Q统计量以检验组间异质性，当P＜0.05时，异质性被认为具有统计学意义。候选SNP位点与个体的性别和年龄分层分析使用逻辑斯蒂回归分析。

2、结果

2.1全基因组SNP数据质量控制结果

为发掘COVID-19重症易感区域，发明人使用昂飞(Affymetrix)公司

World芯片(Affymetrix

World Arrays)对甲人群和乙人群的 1,431名COVID-19患者的770,570个SNP进行基因分型。由于两个人群均采用相同的基因分型平台，所以，发明人对这两个人群的分型数据进行统一的质量控制。经过严格的质量控制(表2)，甲人群保留663例病例和322例对照，乙人群保留200例病例和207例对照。两个人群最终都保留558,642个SNP，平均检出率分别为98.6％和98.9％。

表2甲人群和乙人群的质量控制过程

(a)甲人群与乙人群样本的质量控制

(b)SNP质量控制过程

2.2关联分析结果

发明人对两个人群分别进行关联分析，并对关联分析结果进行荟萃分析，从而鉴定到与COVID-19重症显著关联的基因座(达到全基因组范围显著性阈值P＝5×10^-8)：11q14.2(标志SNP为rs10831496；A等位基因比值比(OR) 为1.65；95％置信区间为1.38-1.97；P＝4.08×10^-8)(表3、图1、图2和图 3)。rs10831496在甲人群和乙人群中也达到名义上的显著相关性(P＜0.001；表3、图4和图5)。在两个人群中没有观察到rs10831496的OR值的异质性 (P_{heterogeneity}为0.70；表3)

此外，当以rs10831496进行条件分析时，11q14.2区域没有其他SNP达到显著关联(P＞0.001)，这表明在11q14.2区域可能存在一个单独的易感性位点。rs10831496与年龄、性别和并发症之间无统计学交互作用(P＞0.05；表 4)。

根据GWAS目录，11q14.2区域的若干SNPs已被证明与许多免疫相关的表型关联，包括传染性疾病(如人类免疫缺陷病毒感染)，自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)和免疫细胞数量(如嗜酸性粒细胞)(表5)。这些以往报道的SNPs与rs10831496呈较弱的连锁不平衡(r²＜0.2)。以上结果进一步表明，11q14.2区域有多个独立的人类表型相关基因座，这些基因座具有不同的免疫相关表型效应。

综上，研究新发现了一个重型COVID19的易感区域11q14.2。

实施例2 rs10831496区域易感基因定位分析

rs10831496位于11q14.2区域的GRM5基因内含子区。rs10831496上下游1Mb范围内包括四个基因：CTSC、GRM5、TYR和NOX4(图3)。根据QTLbase的eQTL数据， rs10831496的风险等位A与血液和肾脏组织中组织蛋白酶C(Cathepsin C，CTSC)基因高表达显著相关，该eQTL在血液组织中尤为显著(最显著的P＝5.4×10^-30；表6)。在 GTEx数据库中的食管和肌肉组织中，rs10831496风险等位A与CTSC基因高表达显著关联的eQTL信号进一步得到验证(P值分别为1.4×10^-3和9.5×10^-3；表6)。11q14.2区域其余3个基因与rs10831496的eQTL无显著相关性(P＞0.05)。综上所述，这些结果表明 CTSC在COVID-19的发生发展中具有潜在的作用。

11q14.2最可能的候选关联基因为CTSC。该基因编码一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶(也称为二肽基肽酶1，DPP1)，该蛋白在激活免疫细胞中的多种丝氨酸蛋白酶方面发挥重要作用。根据对GTEx数据库的查询结果，CTSC主要在血液、脾和肺组织中表达。CTSC在调节炎症反应中的作用已得到广泛研究。例如，在CTSC敲除的慢性阻塞性肺疾病和脓毒症小鼠模型中，炎症细胞浸润和促炎细胞因子生成显著降低。临床上，CTSC被认为是炎症性疾病治疗的潜在靶点。更有意思的是，名为“STOP-COVID19”的三期临床试验已经处于受试者招募阶段，以评估CTSC(DPP1)抑制剂Brensocatib(DB15638)是否对重型 COVID19患者治疗有效(https：//stop-covid19.org.uk/)。此外，已有实验证明SARS-CoV- 2利用其他两种溶酶体半胱氨酸蛋白酶的作用进入人体细胞，即组织蛋白酶B和L (CtsB/L)；而CtsB/L抑制剂(E64-d)和TMPRSS2抑制剂(甲磺酸卡莫司他)联合使用可完全阻断SARS-CoV-2进入细胞。以上证据表明，CTSC在COVID-19的发生发展中发挥作用具有很强的生物学合理性。

综上，11q14.2区域的候选易感基因可能是CTSC。本发明的发现可能为进一步探索新冠肺炎的发生发展机理、临床救治以及预后评估措施等提供理论基础，且具有潜在的应用价值。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.检测SNP的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于COVID-19重症患者筛查，所述SNP为rs10831496。

2.根据权利要求1所述的用途，所述试剂包括引物和探针的至少之一。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述rs10831496为AA或AG的基因型是COVID-19重症高风险的指示。

4.一种用于重症COVID-19患者筛查的试剂盒，其特征在于：

含有检测SNP的试剂，所述SNP为rs10831496。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂包括引物和/或探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述引物为

ACGTTGGATGGGGACCCCTGCTCTAAATAA和

ACGTTGGATGACATATGCATACCCGTCTAC。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，所述探针为(FAM)

CAGTACCTACATATGGgTAT和/或(HEX)CAGTACCTACATATGGaTAT。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述rs10831496为AA或AG的基因型是COVID-19重症高风险的指示。

9.一种用于COVID-19重症患者筛查的设备，其特征在于，包括：

测序装置，所述测序装置用于对患者的基因组进行测序，以便获得测序结果；

比对装置，所述比对装置与所述测序装置相连，且用于基于所述测序结果，确定rs10831496的基因类型；

分析装置，所述分析装置与所述比对装置相连，且用于基于所述SNP类型确定COVID-19重症风险。

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