CN112451503A - 一种细胞外释放单克隆抗体载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种细胞外释放单克隆抗体载体及其制备方法，将单克隆抗体与正电性单体，富含磷酰胆碱的单体，以及交联剂双丙烯酰胺化的酶响应多肽混合均匀，单体经静电和氢键作用力富集于单克隆抗体表面，而后以水溶性自由基引发体系引发原位自由基聚合，在单克隆抗体表面形成富含磷酰胆碱且具有酶响应性的高分子交联网络壳层。本发明的载体具有酶响应性，可以有效抑制细胞内吞，并在肿瘤微环境中可以降解，从而可以实现对单克隆抗体的细胞外释放，应用于肿瘤治疗。

Description

一种细胞外释放单克隆抗体载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及单克隆抗体载体的制备技术领域，更具体地说涉及细胞外释放单克隆抗体载体及其制备方法。
背景技术
目前，单克隆抗体已经成为临床治疗肿瘤的一种不可或缺的蛋白类药物。它具有高的特异性，高安全性，并且由于大部分单克隆抗体作用于细胞膜上的受体，不用跨越细胞膜和内涵体逃逸，因而单克隆抗体治疗的效率较高。然而，作为一种蛋白类药物，其实际应用受到其本身蛋白结构的限制，比如其脆弱的四级结构容易被破坏，从而导致失活，并且在体内环境下，容易降解，并且失活或降解的蛋白碎片还会进一步引起免疫反应，副作用较大。
通常情况下，应用纳米载体负载蛋白类药物可以有效的保护蛋白免遭降解，延长蛋白的血液循环时间并提高蛋白类药物的肿瘤靶向性，从而提高其治疗效果。然而，由于尺寸的原因，这些负载了蛋白的纳米级别的载体往往容易被细胞内吞。而单克隆抗体在载体的作用靶点并不在细胞内部，而在细胞膜表面，因此被内吞的单克隆抗体无法发挥其作用。这种难以控制的内吞限制了单克隆抗体类药物的药效。抑制单克隆抗体载体被细胞内吞的行为是提高单克隆抗体药物药效的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种细胞外释放单克隆抗体载体及其制备方法，该载体可以有效的抑制细胞对单克隆抗体的内吞，并且可以在酶催化条件下高效降解，从而在细胞外释放单克隆抗体，从而有助于提高单克隆抗体的药效，更好的抑制肿瘤，提高单克隆单体的治疗效果。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。
一种细胞外释放单克隆抗体载体及其制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成
将酶响应多肽均匀分散在缓冲液中，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺均匀分散在二甲基亚砜中，向酶响应多肽溶液中加入NAS溶液，并不断搅拌，使用氢氧化钠水溶液调节反应体系的pH至碱性，于1-8℃反应，而后透析冻干得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽；酶响应多肽序列为VPLGVRTK(缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸)，酶响应多肽和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1—10)；
在步骤1中，酶响应多肽和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(2—6)。
在步骤1中，使用缓冲液反应体系提供弱碱性反应条件，如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液。
在步骤1中，使用氢氧化钠水溶液中，NaOH浓度为0.1M-5M，调节反应体系的pH至7.5-9.0。
在步骤1中，反应时间为2-12h，之后使用数均分子量100-1000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析45-50h。
步骤2，细胞外释放单克隆抗体载体的合成
在无氧环境下，将单克隆抗体均匀分散于磷酸盐缓冲液中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于1-8℃搅拌后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应，之后透析，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体；单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS的摩尔比为1：(500-3000)：(3000-10000)：(200-3000)：(500-2000)：(100-2000)。
在步骤2中，无氧环境为惰性保护气体环境，如氮气、氦气或者氩气。
在步骤2中，单克隆抗体为临床所用的单克隆抗体药物，如尼妥珠单抗，曲妥珠单抗和西妥昔单抗。
在步骤2中，聚合反应时间为1-8h，将产物溶液用数均分子量为3500-15000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析45-50h。
在步骤2中，单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS的摩尔比为1：(1000-2000)：(5000-8000)：(1000-2000)：(800-1500)：(600-1500)。
与现有技术相比，本发明的载体为一种粒径为15nm左右的，粒径分布均匀的球型纳米载体，其主要成分为基于MPC的聚合物。该载体可以有效的抑制细胞内吞，并且在肿瘤微环境中酶过表达的情况下，可以发生快速降解，从而在细胞外将内部包裹的单克隆抗体类药物释放出来，达到细胞外释放的目的。这种释放模式可以减少被细胞内吞的单克隆抗体的比例，使单克隆抗体更好的发挥其效果。
附图说明
图1为细胞外释放单克隆抗体载体的透射电子显微镜照片。
图2为细胞外释放单克隆抗体载体的核磁氢谱图。
图3为细胞外释放单克隆抗体载体的红外光谱图。
图4为细胞外释放单克隆抗体载体的电位表征测试图。
图5为细胞外释放单克隆抗体载体的粒径表征数据图。
图6为细胞外释放单克隆抗体载体抑制细胞内吞的测试照片。
图7为加酶/无酶条件下，细胞外释放单克隆抗体载体的细胞外释放的测试照片。
图8为细胞外释放单克隆抗体载体的降解测试曲线图。
图9为本发明单克隆抗体经细胞外载体负载后对肿瘤的抑制效果图，其中a为肿瘤大小的照片，b为肿瘤体积测试结果柱状图。
图10为本发明中双丙烯酰胺化的酶响应多肽的核磁氢谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
将20mg酶响应多肽溶解于1mL硼酸-硼酸钠(pH 8.0)缓冲液中，将100mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。向酶响应多肽溶液中加入80uL NAS溶液，并不断搅拌，用1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应溶液的pH至8.5，于4℃反应12h，而后用截留分子量为300的透析袋对PBS透析48h，冻干48h得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽。
细胞外释放单克隆抗体载体的合成：在氮气环境下，将尼妥珠单克隆抗体，溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于4℃搅拌15min，而后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应。其中尼妥珠单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS摩尔比为1：500：5000：200：1000：500；之后，用截留分子量为3500的透析袋对PBS透析48h，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体溶液。
实施案例2
双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成：将40mg酶响应多肽溶解于2mL硼酸-硼酸钠(pH8.0)缓冲液中，将200mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于2mL二甲基亚砜(DMSO)中。向酶响应多肽溶液中加入0.2mL NAS溶液，并不断搅拌，用1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应溶液的pH至8.2，于10℃反应8h，而后用截留分子量为500的透析袋对PBS透析42h，冻干50h得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽。
细胞外释放单克隆抗体载体的合成：在氩气环境下，将曲妥珠单克隆抗体，溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于4℃搅拌15min，而后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应。其中曲妥珠单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS摩尔比为1：200：6000：600：1000：500；之后，用截留分子量为8000的透析袋对PBS透析48h，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体溶液。
实施例3
双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成：将30mg酶响应多肽溶解于1.5mL硼酸-硼酸钠(pH8.0)缓冲液中，将150mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于1.5mL二甲基亚砜(DMSO)中。向酶响应多肽溶液中加入0.15mL NAS溶液，并不断搅拌，用1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应溶液的pH至8.0，于4℃反应12h，而后用截留分子量为350的透析袋对PBS透析48h，冻干48h得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽。
细胞外释放单克隆抗体载体的合成：在氮气环境下，将西妥昔单克隆抗体，溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于10℃搅拌20min，而后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应。其中曲妥珠单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS摩尔比为1：400：8000：500：1200：600；之后，用截留分子量为7000-14000的透析袋对PBS透析48h，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体溶液。
实施例4
双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成：将20mg酶响应多肽溶解于2mL硼酸-硼酸钠(pH8.0)缓冲液中，将80mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于0.8mL二甲基亚砜(DMSO)中。向酶响应多肽溶液中加入80uL NAS溶液，并不断搅拌，用1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应溶液的pH至8.5，于10℃反应8h，而后用截留分子量为350的透析袋对PBS透析48h，冻干48h得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽。
细胞外释放单克隆抗体载体的合成：在氮气环境下，将西妥昔单克隆抗体，溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于10℃搅拌20min，而后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应。其中曲妥珠单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS摩尔比为1：600：10000：600：800：400；之后，用截留分子量为8000的透析袋对PBS透析48h，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体溶液。
实施案例5
双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成：将60mg酶响应多肽溶解于3mL硼酸-硼酸钠(pH8.0)缓冲液中，将300mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于3mL二甲基亚砜(DMSO)中。向酶响应多肽溶液中加入240uL NAS溶液，并不断搅拌，用1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应溶液的pH至8.5，于4℃反应12h，而后用截留分子量为500的透析袋对PBS透析42h，冻干48h得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽。
细胞外释放单克隆抗体载体的合成：在氩气环境下，将尼妥珠单克隆抗体，溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于4℃搅拌20min，而后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应。其中曲妥珠单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS摩尔比为1：500：7000：400：900：450；之后，用截留分子量为6000的透析袋对PBS透析48h，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体溶液。
实施案例6
双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成：将10mg酶响应多肽溶解于0.5mL硼酸-硼酸钠(pH 8.0)缓冲液中，将100mg N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。向酶响应多肽溶液中加入40uL NAS溶液，并不断搅拌，用1M氢氧化钠(NaOH)溶液调节反应溶液的pH至8.0，于10℃反应8h，而后用截留分子量为400的透析袋对PBS透析42h，冻干48h得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽。
细胞外释放单克隆抗体载体的合成：在氮气环境下，将曲妥珠单克隆抗体，溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于4℃搅拌20min，而后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应。其中曲妥珠单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS摩尔比为1：350：4000：350：820：410；之后，用截留分子量为6000的透析袋对PBS透析48h，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体溶液。
本发明采用的酶响应多肽序列为VPLGVRTK(缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸)，分子量为869.1，购自上海强耀生物科技有限公司。如附图10所示，本发明中双丙烯酰胺化的酶响应多肽的核磁氢谱图，改性后的多肽在5-7ppm之间存在新的吸收峰，这些峰属于改性后多肽上双键的吸收峰，表明双丙烯酰胺化多肽合成成功。
对本发明制备的单克隆抗体进行表征。图1为细胞外释放单克隆抗体载体的透射电子显微镜图(TEM)。图1显示细胞外释放单克隆抗体载体的粒径为15nm左右，粒径分布均匀，形态为球型。图2该载体核磁氢谱图。在载体的核磁图中，δ＝4.7ppm的峰为溶剂D2O中残余的H2O的溶剂峰，载体在δ＝3.1ppm处出现很强的MPC的特征峰，此峰对应于聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)PMPC分子结构中-N(CH3)3中H的振动峰，此外，在δ＝0.5-2.0ppm处出现的峰对应于PMPC分子中-CH2-C(CH3)-上H的振动峰，而δ＝3.8-4.2ppm处出现的一系列峰则主要对应于PMPC分子侧基上H的振动峰。核磁氢谱的结构表明，载体已经成功合成，其主要成分为基于MPC的聚合物。使用傅里叶变换红外光谱仪进行红外光谱检测，取1mg冻干后的载体与KBr混合，研磨后压片。利用傅里叶变换红外光谱仪进行红外光谱检测并使用牛血清白蛋白作为对照组，如附图3所示。由图3中可以看出载体在1725，1241，1073和966cm-1处出现特征振动峰，这些峰是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱基聚合物的特征吸收峰。红外光谱表明载体的主要材料为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱基聚合物。
再使用Zeta电位仪进行Zeta电位检测，利用Zeta电位仪对1mg/mL的载体溶液的Zeta电位进行检测，牛血清白蛋白为对照组，如附图4所示。牛血清白蛋白呈现负电位，而经载体包裹后，负载蛋白的载体电位变为近中性(～5mV)。该实验表明蛋白负载载体的成功合成，载体的电位为近中性。使用粒度仪进行载体粒径的检测，浓度为1mg/mL的载体经粒度仪测试粒径，如附图5所示，载体的水力学粒径大约在15nm左右，集中在12—15nm。
图6为细胞外释放单克隆抗体载体的细胞内吞的测试照片。首先将载体标记荧光异硫氰酸酯(FITC)，而后将标记后的载体加入到人肺腺癌细胞(PC-9)中，进行共培养。其中载体的浓度控制在1mg/mL，共培养时间为4h。而后用PBS清洗细胞三次，用DAPI对细胞核进行染色，通过激光共聚焦进行观察。如图6所示，在培养时间内，并没有载体(绿色荧光)被细胞内吞，表明载体有抑制细胞内吞的能力。使用共聚焦显微镜进行负载单抗载体的细胞外释放测试，PC 9细胞接种于6孔板中，向其中加入FITC标记的单克隆抗体负载载体，并向其中加入胶原(对照组不加酶)，4h后，用PBS对细胞进行清洗，用DAPI(蓝色)和DiI(红色)对细胞核和细胞膜进行染色，最后通过共聚焦显微镜进行成像观察。如附图7所示，未加入酶的细胞组中没有观察到载体(绿色荧光)，表明载体不会进入细胞。在加入酶处理的细胞组中，可以观察到明显的绿色荧光，表明载体可以在酶存在条件下进行降解，并细胞外释放出荧光标记的单克隆抗体，从而与细胞膜表面的受体进行结合。
图8为细胞外释放单克隆抗体载体的降解图。首先将载体与胶原酶(Ⅳ)培养，不同时间点通过激光粒度仪检测其粒径变化。从图中可以看出，加入胶原酶的载体随着孵育的时间光散射强度不断降低，说明其随着时间发生降解。此结果说明，该载体具有酶响应释放能力。图6—8共同说明该载体可以抑制细胞内吞，并且可以酶响应释放，从而可达到细胞外释放的效果。
对本发明单克隆抗体经载体负载后对肿瘤的抑制效果，接种肺癌肿瘤的小鼠被分成4组：1：不进行处理；2：经尾静脉注射单克隆抗体(5mg/kg)；3:经尾静脉注射负载单克隆抗体的普通载体(无磷酰胆碱，5mg/kg)；4经尾静脉注射负载单克隆抗体的细胞外释放载体(5mg/kg))，实验周期为3周。实验结束后观察肿瘤大小。如附图9所示，单克隆抗体经细胞外载体负载后对肿瘤的抑制效果，a为肿瘤大小的照片，b为肿瘤体积柱状图，从图中可以看出，经细胞外释放载体负载后抗体对肿瘤的抑制效果最好，明显好于其他方案。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现细胞外释放单克隆抗体载体的制备，经测试，表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞外释放单克隆抗体载体，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成
将酶响应多肽均匀分散在缓冲液中，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺均匀分散在二甲基亚砜中，向酶响应多肽溶液中加入NAS溶液，并不断搅拌，使用氢氧化钠水溶液调节反应体系的pH至碱性，于1-8℃反应，而后透析冻干得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽；酶响应多肽序列为VPLGVRTK(缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸)，酶响应多肽和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1—10)；
步骤2，细胞外释放单克隆抗体载体的合成
在无氧环境下，将单克隆抗体均匀分散于磷酸盐缓冲液中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于1-8℃搅拌后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应，之后透析，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体；单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS的摩尔比为1：(500-3000)：(3000-10000)：(200-3000)：(500-2000)：(100-2000)。
2.根据权利要求1所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体，其特征在于，在步骤1中，酶响应多肽和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(2—6)；反应时间为2-12h，之后使用数均分子量100-1000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析45-50h。
3.根据权利要求1所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体，其特征在于，在步骤1中，使用缓冲液反应体系提供弱碱性反应条件，如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液；使用氢氧化钠水溶液中，NaOH浓度为0.1M-5M，调节反应体系的pH至7.5-9.0。
4.根据权利要求1所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体，其特征在于，在步骤2中，无氧环境为惰性保护气体环境，如氮气、氦气或者氩气；聚合反应时间为1-8h，将产物溶液用数均分子量为3500-15000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析45-50h。
5.根据权利要求1所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体，其特征在于，在步骤2中，单克隆抗体为临床所用的单克隆抗体药物，如尼妥珠单抗，曲妥珠单抗和西妥昔单抗；单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS的摩尔比为1：(1000-2000)：(5000-8000)：(1000-2000)：(800-1500)：(600-1500)。
6.一种细胞外释放单克隆抗体载体的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：
步骤1，双丙烯酰胺化酶响应多肽的合成
将酶响应多肽均匀分散在缓冲液中，将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺均匀分散在二甲基亚砜中，向酶响应多肽溶液中加入NAS溶液，并不断搅拌，使用氢氧化钠水溶液调节反应体系的pH至碱性，于1-8℃反应，而后透析冻干得到双丙烯酰胺化的酶响应多肽；酶响应多肽序列为VPLGVRTK(缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-精氨酸-苏氨酸-赖氨酸)，酶响应多肽和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1—10)；
步骤2，细胞外释放单克隆抗体载体的合成
在无氧环境下，将单克隆抗体均匀分散于磷酸盐缓冲液中，依次向其中加入N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM)，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，双丙烯酰胺化酶响应多肽，四甲基乙二胺(TEMED)，于1-8℃搅拌后加入过硫酸铵(APS)引发聚合反应，之后透析，即可获得细胞外释放单克隆抗体载体；单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS的摩尔比为1：(500-3000)：(3000-10000)：(200-3000)：(500-2000)：(100-2000)。
7.根据权利要求6所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体的制备方法，其特征在于，在步骤1中，酶响应多肽和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(2—6)；反应时间为2-12h，之后使用数均分子量100-1000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析45-50h。
8.根据权利要求6所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体的制备方法，其特征在于，在步骤1中，使用缓冲液反应体系提供弱碱性反应条件，如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液；使用氢氧化钠水溶液中，NaOH浓度为0.1M-5M，调节反应体系的pH至7.5-9.0。
9.根据权利要求6所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体的制备方法，其特征在于，在步骤2中，无氧环境为惰性保护气体环境，如氮气、氦气或者氩气；聚合反应时间为1-8h，将产物溶液用数均分子量为3500-15000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析45-50h。
10.根据权利要求6所述的一种细胞外释放单克隆抗体载体的制备方法，其特征在于，在步骤2中，单克隆抗体为临床所用的单克隆抗体药物，如尼妥珠单抗，曲妥珠单抗和西妥昔单抗；单克隆抗体：APM：MPC：双丙烯酰胺化酶响应多肽：TEMED：APS的摩尔比为1：(1000-2000)：(5000-8000)：(1000-2000)：(800-1500)：(600-1500)。
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