CN112444506A - 显微成像的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明属于显微成像技术领域,具体为一种显微成像的方法及装置。显微成像的方法包括:用照明辐射照明样品,检测检测辐射;检测辐射由照明辐射照明样品引起;捕获至少一个第一图像,第一图像具有从样品发射的检测辐射的强度数据;由校正算法从所述至少一个第一图像中计算出第二图像;第二图像分辨率小于第一图像分辨率。显微成像的装置配置为能够执行所述方法。本发明可以获得更高分辨率的图像,并且能够适用于快速地动态超分辨显微成像。
Description
技术领域
本发明属于显微成像技术领域,具体涉及一种显微成像的方法及装置。
背景技术
在现代光学成像技术中,荧光显微镜具有可以特异性标记,同时可以对活细胞进行实施动态成像等优势,在生命科学研究中获得了广泛应用。但是传统的光学显微镜由于受到衍射极限的限制,其横向分辨率为200 nm-350 nm,即被限制在半个波长左右。此分辨率限制了其在小于200 nm的亚细胞水平上生命科学领域中的动态研究。其中诸如核孔中心位置(大约30nm)、微管直径(外径约25nm,内径约14nm)和囊泡等一些亚细胞结构尺寸不大于50 nm,甚至不大于30 nm。
近年来,为了突破衍射极限,多种超分辨光学显微技术被科研工作者相继提出,例如基于单分子定位技术的光激活定位显微术、随机光学重构显微术等,基于可逆饱和光转移过程的受激发射损耗显微术,基于改变照明光空间结构的结构光照明荧光显微术,基于随机光学波动超分辨显微术等。这里“超分辨”是指超过衍射极限的分辨率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有超高图像分辨率、优异成像质量的图像显微成像的方法及装置。
本发明提供了显微成像的方法,包括以下步骤:
提供样品;
用照明辐射照明样品,并且检测检测辐射,其中,检测辐射由照明辐射照明样品引起;
捕获至少一个第一图像,第一图像具有从样品发射的检测辐射的强度数据;以及
通过校正算法从至少一个第一图像中计算出第二图像;其中,第一图像具有第一分辨率,第二图像具有比第一分辨率小的第二分辨率。
在实施例中,检测辐射包括光信号,特别是荧光信号。
在实施例中,捕获至少一个第一图像采用以下技术中的至少一个:结构光照明显微技术、受激发射损耗显微技术、具有检测器阵列的共聚焦显微技术和/或光激活定位显微技术。
在实施例中,捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合,其中采用带有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射,生成原始图像的集合;所述原始图像的集合包括对应于具有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射所引起的检测辐射从而生成的原始图像。
在替代的实施例中,捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合,其中在含有多个检测器元件的检测器阵列中生成原始图像的集合;所述原始图像的集合包括检测辐射在每个检测器元件的检测平面中生成的原始图像。
在实施例中,捕获至少一个第一图像还包括以下步骤:
基于生成的原始图像的集合,使用第一重构算法重构原始图像,以获得第一图像,其中第一重构算法为三相位重构算法和/或四相位重构算法,第一图像具有样品的检测辐射的强度信息的数据;以及
在样品的同一检测区域中,以指定的时间间隔获取至少一个第一图像,其中至少一个第一图像配置为按指定的时间间隔排序的图像序列。
在实施例中,指定的时间间隔至少不大于50 ms,至少一个第一图像的数量不少于50帧。
在实施例中,校正算法包括径向波动定位算法,径向波动定位算法配置为针对至少一个第一图像中的每一个第一图像基于径向波动定位算法定位和标记检测辐射的强度中心位置,从而得到标记强度中心位置的至少一个第三图像,其中至少一个第三图像配置为按指定的时间间隔排序的图像序列。
在实施例中,校正算法还包括相关性算法,相关性算法配置为基于时间序列和至少一个第三图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度之间的关系计算出每个像素上的相关因子,并且基于每个像素上的相关因子,以获得第二图像。
在替代的实施例中,捕获至少一个第一图像还包括以下步骤:
基于原始图像的集合,通过径向波动定位算法定位和标记检测辐射的强度的中心位置,并且相应地获得第四图像的集合;
用第一重构算法重构第四图像的集合,以获得已经具有标记检测辐射的强度中心位置的第一图像;以及
在样品的同一检测区域中,以指定的时间间隔获取至少一个第一图像,其中至少一个第一图像配置为按指定的时间间隔排序的图像序列。
在实施例中,校正算法包括相关性算法,相关性算法配置为基于时间序列和至少一个第四图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度位置之间的关系计算出每个像素上的相关因子,并且基于每个像素上的相关因子,以获得第二图像。
在实施例中,第一分辨率不大于200 nm,特别是不大于100 nm。
在实施例中,第二分辨率小于或等于第一分辨率的二分之一,特别地小于或等于第一分辨率的三分之一,特别是不大于30 nm。
根据另一个方面,提供了显微成像的装置,其配置为执行如上所述的方法。
根据另一方面,提供的显微成像的装置,包括:
照明源模块,所述照明源模块包括提供照明辐射的照明源;
照明光学单元,配置为将照明辐射聚焦到要检测的样品中;
检测光学单元,配置为布置在照明光学单元的束路径下游,并且在与所述样品的焦平面共轭的平面处获得发射的检测辐射;
检测模块,配置为将所获得的检测辐射转换为电信号;以及
计算单元,配置为处理具有转换的电信号的原始图像,所述计算单元包括:
图像生成模块,配置为生成所述图像的集合;
时序图像生成模块,在采集时间中,生成一系列时间相关的多个图像或者多个图像的集合;
第一重构模块,配置为采用第一重构算法将图像的集合重构,以得到一帧具有第一分辨率的图像;
定位模块,配置为使用径向波动算法计算并标记图像中的检测辐射的强度中心位置;
第二重构模块,采用第二重构算法将多个按时间排列的图像计算并重构出一帧具有第二分辨率的图像;
其中,所述第一分辨率大于所述第二分辨率。
根据另一个方面,提供了显微镜系统,其包括执行如上所述方法的显微成像的装置。
本发明提供了一种显微成像的方法。通过将光学径向波动算法与诸如结构光照明显微技术、具有检测器阵列的共聚焦显微技术等的超分辨荧光显微技术结合,可以获得更高分辨率的图像,并且能够灵活地适用于大范围的超分辨荧光显微技术。
更具体地,在现存的超分辨显微技术的情况下,例如STORM的单分子显微技术,需要例如光开关荧光蛋白可以用不同光在亮态和暗态之间转换,并且重复多次,直至光漂白;然后采集几千张或几万张图像以获得高分辨荧光图像。在这样的情况下,选择的荧光样品要求具有光稳定性高、不易漂白,对比度高。但是由于需要多次转换荧光状态而照明辐射照射样品的时间较长,从而导致光毒性大,同时由于长时间的观测可能发生一定程度的样品移动或者照明辐射的不均匀,从而产生具有伪影的图像。
与单分子显微技术相比较,本发明的实施例中,获得的图像能够有效地降低图像中的伪影,以改进成像的质量。例如,该方法仅需要几十张或几百张图像,因而具有更快的采集速度,而且减少了样品制备的复杂度,降低对荧光样品的要求,并且因此实现低光毒性。有利的,由于无需对现有系统做附加的硬件改造,从而实现了低系统复杂度、高信噪比、多个信号的高速成像。另外,由于获得了具有例如小于50 nm的分辨率的图像和较快的采集速度,因此本发明适合于观察活细胞中的亚细胞器的动态过程。要理解的是,前面的一般性描述和下面的详细的描述二者都是示例性的,并且意图在于提供要求保护的技术的进一步说明。
附图说明
图1是结构光照明超分辨显微术的技术原理示意图。
图2是根据实施例的显微成像的装置的结构的示意性框图。
图3是根据第一实施例的显微成像的方法的流程图。
图4是根据第二实施例的显微成像的方法的流程图。
图5是根据第三实施例的显微成像的方法的流程图。
图6(a)-(c)是根据第二实施例的显微成像的方法的各个步骤中的成像模拟图。
图7是对应于图6(a)-(c)中的分辨率对比图。
图8(a)-(b)是针对细胞的微管根据第二实施例的显微成像的方法的各个步骤中的超分辨荧光图。
图9(a)是图8(a)中位置1处微管的高斯分布曲线图;图9(b)是在图8(a)中的位置2处微管的高斯分布曲线图,图9(c)是在图8(b)中的位置1-1处微管的高斯分布曲线图,图9(d)是在图8(b)中的位置2-2处微管的高斯分布曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图,对本发明的技术方案作进一步清楚、完整的描述。显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的实施例,本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另外定义,本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性,而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同,而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接,而是可以包括电性的连接,不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系,当被描述对象的绝对位置改变后,则该相对位置关系也可能相应地改变。
作为示例,提出了结构光照明超分辨显微术。结构光照明超分辨显微术可以配置为改变照明辐射的空间结构的照明方式来将样品成像。这种空间结构可以是载频条纹,诸如摩尔纹。有利地,具有照明辐射的空间结构的照明方式提供在常规宽场照明方式(例如常规宽场显微术)下不能观测的高频信息,也就是高分辨率的信息。具体而言,通过在傅立叶频域内处理分析图像频谱,将高频分量移动到低频范围内,从而获取超分辨率的图像。因此,结构光照明超分辨显微术的分辨率优选地不大于200 nm,优选地大约100 nm。
图1是示例性结构光照明超分辨显微术的技术原理示意图。如图1所示,其中图1(a)是使用常规的宽场显微术的两个颗粒的荧光成像图,这两个颗粒之间的间距小于衍射极限距离。在这种情况下,仅观察到一个椭圆形的亮斑,但是无法明确区分这两个颗粒。通过引入如图1(b)示出的示例性的载频条纹,能够得到具有不同高频分量的信息,诸如具有不同相位结构信息的图像的集合。然后通过重构算法,对所获取的具有不同相位结构信息的图像的集合进行分析和重构,最终得到一帧分辨率大约为100 nm的超分辨图像,如图1(c)所示。可以看到,通过结构光照明超分辨显微术的引入,虽然可以明确区分这两个颗粒,但是无法进一步判断每个颗粒的真实大小和轮廓。如果两个颗粒的间距小于100 nm,或者当单个颗粒小于100 nm,则结构光照明超分辨显微术则无法进一步分辨。另外,结构光照明超分辨显微术发生一定程度的样品漂移或者照明辐射的不均匀,可能导致重构图像生成重构伪影,从而使得获得图像信噪比差。
为了解决上述问题,因此,下面将提出进一步提高分辨率的显微成像的装置及其方法。
图2是根据实施例的显微成像的装置的结构的示意性框图。参考图2,显微成像的装置200可以包括照明源模块210、扫描模块220、照明光学单元230、样品台240、检测光学单元250、检测模块260和计算单元270。其中,照明源模块210、扫描模块220、照明光学单元230、样品台240、检测光学单元250和检测模块260布置为在光学上共轴。
在示例性实施例中,照明源模块210可以包括照明源、空间结构模块和光束成形模块。照明源提供照明辐射IR,其波长可以是从近紫外到近红外的范围。作为示例,照明源可以包括激光器、氙灯和/或汞灯。优选地,照明源可以是皮秒脉冲或飞秒脉冲的激光器。附加地,激光器的波长配置为可调谐的。在实施例中,空间结构模块配置为改变照明辐射的空间结构的照明方式。作为示例,空间结构模块可以包括空间调制器、相位延迟器等。在实施例中,光束成形模块配置为将由照明源提供的照明辐射IR成形,例如准直。因此,照明源模块210提供成形的照明辐射IR。可选地,在照明源模块210的布置中可以省略空间结构模块。
扫描模块220可以布置在照明源模块210的束路径下游,并且可以是扫描机,例如一对扫描振镜。扫描机可以配置为使用成形的照明辐射IR对要检测的样品区域进行扫描。具体地,成形的照明辐射IR通过扫描机在至少两个方向上以控制的方式是可偏转的。优选地,该扫描模块220可以布置在例如具有检测器阵列的共聚焦显微成像的装置中。可选地,在一些显微成像的装置的布置中可以省略扫描模块220,例如结构光照明显微成像的装置。
照明光学单元230可以布置在扫描模块220或照明源模块210的束路径下游,并且可以包括至少一个照明物镜,其中该照明物镜可以具有不同的放大倍率,例如10倍、20倍、30倍、40倍、60倍、或100倍、甚至更高倍数。至少一个照明物镜的位于束路径中的照明物镜可以配置为将由扫描机偏转的照明辐射IR聚焦到要检测的样品中。
样品台240可以布置在照明光学单元230的束路径下游,并且可以配置为其上通过样品保持件(未示出)保持要检测的样品。在使用由扫描机偏转的照明辐射IR扫描要检测的样品区域的焦平面之后,包含在样品中的物质受照明辐射IR的激发以发射检测辐射DR。作为示例,该物质可以包括诸如量子点等荧光纳米材料、绿色荧光蛋白、带荧光材料标记的抗体或病毒、或者自体荧光的分子及其等同物。因此,在该情况下,检测辐射DR可以是荧光信号。替代地,检测辐射DR还可以是其他受激发射的信号,例如磷光信号等。附加地,要检测的样品配置为包埋在盖玻片中、或培育在培养皿中、或其它便于观察的容器中。
检测光学单元250可以布置在样品台240的束路径下游,并且可以包括至少一个检测物镜、分束器、滤光器等。在束路径中的检测物镜可以收集发射的检测辐射DR,并且在束路径下游、与样品的焦平面共轭的平面处由下面要解释的检测模块260获取检测辐射DR。值得注意的,本文所述的照明物镜和检测物镜可以是同时起照明和检测作用的相同物镜,但也可以是两个不同的物镜,以分别照明和检测样品。另外,分束器配置为将检测辐射DR与照明辐射IR分离开。滤光器可以配置为从检测辐射DR过滤出具有不同波长范围的检测辐射DR。其中,滤光器可以在光路中根据需求更换或省略。可选地,可以在束路径中插入检测侧的针孔,以提高检测辐射DR的分辨率。
检测模块260可以布置在检测光学单元的束路径下游,并且包括至少一个检测器。根据具有不同的波长范围的检测辐射DR,检测器可以选自光电二极管、雪崩二极管、光电倍增管、EMCCD、CCD、和/或检测器阵列及其组合。检测器可以配置为将获得的检测辐射DR转换为电信号以发送到计算单元270。发送到计算单元270的电信号作为原始数据。例如,在具有检测器阵列的共聚焦显微技术的情况下,可以使用检测器阵列,其中的每一个检测器元件可以对样品的焦平面共轭的像平面进行成像。
计算单元270可以布置在计算装置中,并且可以配置为进行处理原始图像的操作。在实施例中,计算单元270可以包括图像生成模块272、第一重构模块274、定位模块276、第二重构模块278。
图像生成模块272配置为生成图像的集合。针对不同的相位结构中的每一个,从接收的原始数据生成具有对应的相位结构的图像,将不同的相位结构的图像组合以生成具有不同相位结构的图像的集合,也简称为图像的集合。例如,在结构光显微成像技术的情况下,针对三种不同的相位结构,生成九个具有对应相位结构的图像的集合。
同样,时序图像生成模块273配置为在采集时间中,生成一系列时间相关的多个图像或者多个图像的集合。其中,采集时间具有一定的时间间隔,例如小于30 ms、小于20 ms、甚至更小,以在相对静止的采集时间内生成更多的后续要处理的图像或图像的集合。
第一重构模块274配置为采用第一重构算法将图像的集合重构,以得到一帧具有第一分辨率的图像。第一重构算法可以是三位相重构算法或四位相重构算法。
定位模块276配置为使用径向波动算法计算并标记图像中的检测辐射DR的强度中心位置,以实现对检测辐射DR的强度中心进行高分辨率的定位。其中,径向波动算法可以配置为计算图像中的点扩散函数径向梯度收敛程度,一个图像生成一个径向梯度图。
可选地,定位模块276还可以包括对相对固定的标记物中心的像素点坐标再次定位。在本文的上下文中,在获得图像之后,可选地对每个图像中的标记物进行定位,标记图像中的标记物中心的像素点坐标。具体而言,给定理论上两个图像的期望位移量,确定获得的两个图像中的标记物中心的像素点坐标的实际位移量,然后计算实际偏移量与期望偏移量的相对偏移差,基于相对偏移差以及标记物的中心的像素点坐标来校正两个图像的漂移,进而减少图像中出现的伪影。例如,如果两个图像是不同时间间隔的图像,则期望位移量可以设定为零;或者如果两个图像是具有不同相位位置的图像,则期望位移量可以设定为某一不为零的数值;或者如果两个图像是基于不同检测阵列中的检测元件采集的图像,则期望位移量可以设定为零。
第二重构模块278配置为采用第二重构算法将多个按时间排列的图像计算并重构出一帧具有第二分辨率的图像。第二重构算法可以配置为在采集时间序列中,获取图像中的每个像素点上检测辐射DR信号的波动性。在一个实施例中,可以基于经过径向分布处理的具有高阶分量的图像中计算高阶分量的相关因子,并且根据相关因子得到超分辨率图像。因为荧光背景噪声或随机噪声经过相关累积计算得到的相关因子很低,而相对静止的检测辐射DR信号的相关因子很高,这实现在很大程度上降低背景信号、提高信噪比,从而有利于得到超分辨图像。有利地,第二分辨率小于第一分辨率。
在示例性实施例中,提供一种显微镜,特别是超分辨显微镜,其中包含如上所述的显微成像的装置。具体地,显微镜的布置可以配备为正置物镜或倒置物镜。所使用的物镜具有较高的数值孔径,使得进一步改进了显微镜系统的分辨率。因为显微镜中的显微成像的装置的布置和优点与如上所述的显微成像的装置的布置和优点实质相同,在此不再重复描述。
下文中,在示例性实施例中,图3-5详细描述上述显微成像的装置的显微成像的方法的流程图。
图3是根据第一实施例的显微成像的方法的流程图。
在步骤S300中,提供样品,该样品通过样品保持件放置在样品台240上。
在步骤S302中,用由照明源模块210提供的照明辐射IR穿过照明光学单元230照明样品,使得由照明辐射IR激发的样品发射检测辐射DR。发射的检测辐射DR穿过检测光学单元250到达检测模块260的表面处。优选地,检测模块260的表面所在的平面与样品的发射检测辐射DR的焦平面是彼此光学共轭。优选地,照明源具有不同相位结构的照明方式。
在步骤S304中,用检测模块260检测样品的检测辐射DR。同时,将检测到的检测辐射DR的信号经由诸如信号传输线发送到计算单元270。
在步骤S306中,用计算单元270捕获至少一个第一图像,该第一图像具有样品的检测辐射DR的强度信息的数据。其中,第一图像具有大约100 nm的第一分辨率。
在步骤S308中,由校正算法从至少一个第一图像中计算出第二图像。在实施例中,第二图像具有比第一分辨率更小的第二分辨率,其具有大约不大于50 nm,优选地不大于40nm,更优选地不大于33 nm。
图4和图5分别是根据第二实施例和第三实施例的显微成像的方法的流程图。同样,图4中的步骤S400-S404和图5中的步骤S500-S504与图3中的步骤S300-S304的步骤实质相同,因此在此不再重复描述。下文,侧重于描述图4和图5与图3不同的步骤。
参考图4,在步骤S406中,生成原始图像的集合。所述原始图像的集合包括至少两个对应于具有互不相同的相位结构的照明辐射的检测辐射所生成的原始图像。具体而言,当照明辐射IR具有不同的相位结构的照明方式时,基于检测由对应发射的检测辐射DR的信号,生成对应相位结构的原始图像。使得在不同的照明方式下获得具有不同相位结构的原始图像。在本文的上下文中,优选地,可以指定若干个照明方式,以一定顺序周期性重复这指定数目的照明方式,也叫做照明方式的集合。在以照明方式的集合照明样品,检测针对对应相位结构的检测辐射,并且生成原始图像的集合。
在替代的实施例中,生成原始图像的集合,其中在含有多个检测器元件的检测器阵列中生成原始图像的集合,具体地,原始图像的集合包括所述检测辐射在每个检测器元件的检测平面中生成的原始图像。以传统共聚焦成像的单检测器的布置为例,针孔设置在检测器的上游,针孔在空间中很大程度上限制了检测器获取艾里斑的光子数。在针孔设置在检测阵列中的多个检测器元件的上游时,每个检测元件可以获取多个包含艾里斑的原始图像的数据,以便于随后的重构。多检测元件的布置通过采集到更多的光子数,进一步提高后续重构的图像的分辨率。
在步骤S408中,用第一重构算法重构原始图像的集合,以获得第一图像。该第一图像具有样品的检测辐射DR的强度信息的数据。其中,第一图像具有大约100 nm的第一分辨率。
在步骤S410中,以指定的时间间隔获取至少一个第一图像。优选地,第一图像的数量可以不少于30帧、不少于50帧,不少于100帧。指定的时间间隔可以在保证信噪比的前提下越小越好,例如小于30 ms、小于20 ms、甚至更小,这实现能够在样品相对静止的时间段(例如若干秒)内获得尽可能多的图像集合以供后续分析和处理。获取第一图像的集合的过程可以通过计算单元270进行设定,也可以由使用者手动地进行停止操作,其中可设定的参数包括获取的第一图像的集合的个数,或者检测样品的总时间段等。
如已知的,例如荧光信号的检测辐射在时间序列中是随机涨落的。在步骤S412中,基于径向波动定位算法标记检测辐射的强度的中心位置,以获得至少一个第三图像。该第三图像中带标记的检测强度的中心位置。
值得注意的,为了进一步提高成像的速度和效率,还可以采用替代的实施例。一旦在步骤S408中获取到一张第一图像,同时采用径向波动定位算法标记第一图像以获得第三图像。换言之,获得第一图像,然后采用径向波动定位算法来获得第三图像,并且按一定的时间序列获得至少一个第三图像,以确保得到的第三图像具有标记的中心位置。通过进一步优化处理图像的顺序,缩短成像的时间,从而提高成像的效率并且实现高分辨率的第三图像。第三图像可以降低第一图像因为重构而出现的伪影。
在步骤S414中,用第二重构算法重构至少一个第三图像,以获得第二图像。第二重构算法是相关性算法。由校正算法从至少一个第三图像中计算出第二图像。在实施例中,相关性算法配置为基于时间序列和至少一个第三图像中的每一个图像中的同一像素位置上的强度之间的关系计算出每个像素上的相关因子,并且基于所述每个像素上的相关因子获得所述第二图像。获得的第二图像具有比第一分辨率更小的第二分辨率,其具有大约不大于50 nm,优选地不大于40 nm,更优选地不大于33 nm。
随后,参考作为显微成像的方法的第三实施例的图5。图5中的步骤S506与图4中的步骤S406实质相同,因此在此不再重复描述。
参考图5,在步骤S508中,在原始图像的集合中,通过径向波动定位算法标记检测辐射的强度的中心位置,并且相应地获得第四图像的集合。
在步骤S510中,用第一重构算法重构第四图像的集合,以获得第一图像。原理上,步骤S510中获取的第一图像因为先前经过径向波动算法的处理,比步骤S410中获取的第一图像相比具有更好的分辨率。
值得注意的,在该实施例的实践中,还可能产生如下问题:在先进行径向波动,再进行重构的过程中,由于原始图像中存在不同相位的高频信息,获得的每个第一图像都会发生轻微的移动,所以第一图像会产生因样品漂移而导致的伪影。为了防止样品漂移,将标记物引入样品中,例如选择光量子效率高的稳定荧光纳米材料作为标记物,标记物的位置的相对偏移。在本文的上下文中,为了消除伪影,在获得每个第四图像或者第一图像中的一个步骤之后,可选地对每个第四图像或第一图像中的标记物进行定位,标记图像中的标记物中心的像素点坐标。具体而言,给定理论上两个图像的期望位移量,确定获得的两个图像中的标记物中心的像素点坐标的实际位移量,然后计算实际偏移量与期望偏移量的相对偏移差,基于相对偏移差以及标记物的中心的像素点坐标来校正两个图像的漂移,进而减少图像中出现的伪影。例如,两个图像可以是如下文的不同时间间隔的图像,期望位移量可以设定为零;或者两个图像可以是具有不同相位位置的图像,期望位移量可以设定为某一不为零的数值;或者两个图像可以是基于不同检测阵列中的检测元件采集的图像,期望位移量可以设定为零。
在步骤S512中,以指定的时间间隔获取至少一个第一图像。优选地,第一图像的个数可以不少于30帧、不少于50帧,不少于100帧。指定的时间间隔可以在保证信噪比的前提下越小越好,例如小于30 ms、小于20 ms、甚至更小,这实现能够在样品相对静止的时间段(例如若干秒)内获得尽可能多的图像集合以供后续分析和处理。获取第一图像的过程可以通过计算单元270进行设定,也可以由使用者手动地进行停止操作,其中可设定的参数包括获取的第一图像的帧数,或者检测样品的总时间段等。在步骤S514中,用第二重构算法重构至少一个第一图像,以获得第二图像。第二重构算法是相关性算法。由校正算法从至少一个第一图像中计算出第二图像。在实施例中,相关性算法配置为基于时间序列和至少一个第一图像中的每一个图像中的同一像素位置上的强度之间的关系计算出每个像素上的相关因子,并且基于所述每个像素上的相关因子获得所述第二图像。获得的第二图像具有比第一分辨率更小的第二分辨率,其具有大约不大于50 nm,优选地不大于40 nm,更优选地不大于33 nm。
如图2所示的显微成像的装置200可以至少包括如上所述的步骤的方法进行操作。该显微成像的装置200可以包括在显微镜系统中。
在实践中,使用第二实施例的显微成像的方法在数据模拟实验中再现。
图6(a)-(c)是根据第二实施例的显微成像的方法的各个步骤中的成像模拟图。图6(a)是在模拟的情况下由检测单元获取的原始图像或者宽场显微的图像,并且参考图7,原始图像的分辨率大于200 nm;图6(b)是在模拟的情况下在检测的原始图像集合中通过第一重构算法获得的第一图像,并且参考图7,第一图像的分辨率为112 nm,即大约100 nm;以及,图6(b)是在模拟的情况下在至少一个第一图像中通过校正算法获得第二图像,并且参考图7,第二图像的分辨率约为30 nm。显然,经过第二实施例的方法,改进了显微成像的方法,使得能够在达到约30 nm的分辨率,并且能够快速动态地捕获具有高信噪比的超分辨图像。
图8(a)是针对Alexa488标记的细胞微管,在检测的原始图像集合中通过第一重构算法获得的至第一图像。然后分别测量标记的位置1和位置2处的微管的分辨率,其分辨率分别为104 nm和92 nm,如图9(a)和(b)的高斯分布曲线所示。此外,在图8(a)样品的检测区域中,设定30 ms的曝光时间间隔和200帧的获取第一图像的个数,从而得到在相同样品检测区域中的时序性的第一图像,也就是说至少一个第一图像。图8(b)是至少一个第一图像中通过校正算法获得第二图像。校正算法包括对时序性的第一图像中的荧光强度中心位置定位和标记,并且将已经定位和标记的荧光中心位置根据所采集的时间序列统计图像中各个像素点在时间序列上的波动性以获得相关因子,并使用各个像素点上的相关因子重构获得第二图像。参考图8(b),标记的位置1-1和位置2-2的微管恰好对应于图8(a)的位置1和位置2的微管,并且如图8(b)所示的第二图像在如图8(a)所示的第一图像经由校正算法(其包括光学径向波动算法和相关性算法)之后,进一步改进所得到的第二图像的分辨率。具体而言,位置1-1和位置2-2处微管的分辨率分别为30 nm和21 nm,如图9(c)和(d)的高斯分布曲线所示。因此,在实践中验证了本发明的实施例的可行性。随着分辨率小于30nm以下,使得有利于研究者对亚细胞器进行快速动态的研究。
以上结合具体实施例描述了本申请的基本原理,但是,需要指出的是,在本申请中提及的优点、优势、效果等仅是示例而非限制,不能认为这些优点、优势、效果等是本申请的各个实施例必须具备的。另外,上述公开的具体细节仅是为了示例的作用和便于理解的作用,而非限制,上述细节并不限制本申请为必须采用上述具体的细节来实现。
值得注意的,本申请中的步骤流程图以及以上方法描述仅作为例示性的例子并且不旨在于要求或暗示必须按照给出的顺序进行各个实施例的步骤,某些步骤可以并行、彼此独立或按照其他适当的顺序执行。另外,诸如“其次”、“然后”、“接下来”等等的词语不旨在于限制步骤的顺序;这些词语仅用于引导读者通读这些方法的描述。
本发明中涉及的器件、装置、设备、系统的方框图仅作为例示性的例子并且不意图要求或暗示必须按照方框图示出的方式进行连接、布置、配置。还需要指出的是,在本申请的装置和方法中,各部件或各步骤是可以分解和/或重新组合的。这些分解和/或重新组合应视为本申请的等效方案。
Claims (19)
1.一种显微成像的方法,包括以下步骤:
提供样品;
用照明辐射照明样品,并且检测检测辐射,其中,所述检测辐射由照明辐射照明所述样品引起;
捕获至少一个第一图像,所述第一图像具有从所述样品发射的检测辐射的强度数据;以及
通过校正算法从所述至少一个第一图像中计算出第二图像;
其中,所述第一图像具有第一分辨率,所述第二图像具有比所述第一分辨率小的第二分辨率。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述检测辐射包括光信号,特别是荧光信号。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述捕获至少一个第一图像采用以下技术中的至少一个:结构光照明显微技术、受激发射损耗显微技术、具有检测器阵列的共聚焦显微技术和/或光激活定位显微技术。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合,其中采用带有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射,生成原始图像的集合;所述原始图像的集合包括对应于具有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射所引起的检测辐射从而生成的原始图像。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合,其中在含有多个检测器元件的检测器阵列中生成原始图像的集合;所述原始图像的集合包括所述检测辐射在每个检测器元件的检测平面中生成的原始图像。
6. 根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,所述捕获至少一个第一图像还包括以下步骤:
基于生成的原始图像的集合,使用第一重构算法重构所述原始图像,以获得所述第一图像,其中所述第一重构算法为三相位重构算法和/或四相位重构算法,所述第一图像具有样品的检测辐射的强度信息的数据;以及
在样品的同一检测区域中,以指定的时间间隔获取所述至少一个第一图像,其中所述至少一个第一图像配置为按所述指定的时间间隔排序的图像序列。
7. 根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述指定的时间间隔至少不大于50 ms,所述至少一个第一图像的数量不少于50帧。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述校正算法包括径向波动定位算法,所述径向波动定位算法配置为针对所述至少一个第一图像中的每一个第一图像基于所述径向波动定位算法定位和标记所述检测辐射的强度中心位置,从而得到标记所述强度中心位置的至少一个第三图像,其中所述至少一个第三图像配置为按所述指定的时间间隔排序的图像序列。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述校正算法还包括相关性算法,所述相关性算法配置为基于时间序列和所述至少一个第三图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度之间的关系计算出每个像素上的相关因子,并且基于所述每个像素上的相关因子,以获得所述第二图像。
10.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于,捕获至少一个第一图像还包括以下步骤:
基于原始图像的集合,通过径向波动定位算法定位和标记检测辐射的强度的中心位置,并且相应地获得第四图像的集合;
用第一重构算法重构第四图像的集合,以获得已经具有标记所述检测辐射的强度中心位置的第一图像;以及
在样品的同一检测区域中,以指定的时间间隔获取所述至少一个第一图像,其中所述至少一个第一图像配置为按所述指定的时间间隔排序的图像序列。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述校正算法包括相关性算法,所述相关性算法配置为基于时间序列和所述至少一个第一图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度之间的关系计算出同一像素位置上的相关因子,并且基于所述每个像素上的相关因子,以获得所述第二图像。
12. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一分辨率不大于200 nm。
13. 根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述第一分辨率不大于100 nm。
14.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第二分辨率不大于所述第一分辨率的二分之一。
15.根据权利要求14所述的方法,其特征在于,所述第二分辨率不大于所述第一分辨率的三分之一。
16. 根据权利要求15所述的方法,其特征在于,所述第二分辨率不大于30 nm。
17.一种显微成像的装置,其特征在于,所述显微成像的装置配置为执行上述如权利要求1-16中任一项所述的方法。
18.根据权利要求17所述的显微成像的装置,其特征在于,包括:
照明源模块,所述照明源模块包括提供照明辐射的照明源;
照明光学单元,配置为将所述照明辐射聚焦到要检测的样品中;
检测光学单元,配置为布置在所述照明光学单元的束路径下游,并且在与所述样品的焦平面共轭的平面处获得发射的检测辐射;
检测模块,配置为将所获得的检测辐射转换为电信号;以及
计算单元,配置为处理具有转换的电信号的原始图像,所述计算单元包括:
图像生成模块,配置为生成所述图像的集合;
时序图像生成模块,在采集时间中,生成一系列时间相关的多个图像或者多个图像的集合;
第一重构模块,配置为采用第一重构算法将图像的集合重构,以得到一帧具有第一分辨率的图像;
定位模块,配置为使用径向波动算法计算并标记图像中的检测辐射的强度中心位置;
第二重构模块,采用第二重构算法将多个按时间排列的图像计算并重构出一帧具有第二分辨率的图像;
其中所述第一分辨率大于所述第二分辨率。
19.一种显微镜系统,其特征在于,所述显微镜系统包括如权利要求17所述的显微成像的装置。
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