CN112444478B - 一种用于血细胞成像计数的样品池及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于血细胞成像计数的样品池、包含样品池的血细胞计数试剂盒及血细胞计数分析方法。所述样品池是用亲水材料处理载玻片表面制作亲水通道，再将疏水材料转移到载玻片上制作疏水边缘，确定样品池边界，无需密封，血细胞样品在亲水作用力下均匀扩散，形成血细胞的单层分布，便于血细胞成像。所述样品池进一步应用于血细胞计数试剂盒和血细胞计数分析方法中。通过所述试剂盒、以及血细胞计数分析方法，可以实现痕量取血、便捷操作，以及满足经济环保、广泛普及的应用需求。

Description

一种用于血细胞成像计数的样品池及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生化检测领域，具体而言，涉及检测血液样品中血细胞数目的 样品池及其制备方法与应用。

背景技术

血细胞计数，是用于检测血细胞的特征性变量，包括红细胞、白细胞、血 小板以及白细胞各分类的计数，可被广泛应用于生物学和疾病学研究,例如检测 基本健康状况、筛查某些疾病、检测由医学治疗引起的身体变化等。

血细胞计数分析通常需要使用流式细胞分析仪。流式细胞分析仪进行血细 胞计数的原理是使分散在液体中的悬浮细胞逐个通过小孔，此时测量阻抗的变 化、样品对光源的吸收、散射以及荧光响应等信号，以获得细胞的体积、类别 及数量等一系列参数。这种分析方法需要昂贵的仪器、大量的试剂耗材、专业 人员的熟练操作以及定期的设备维护，因此在经济和交通不发达的地区难以实现现场和快速检测。

因此，在保证结果准确性的前提下，有必要简化样品制备步骤和仪器操作 步骤。为实现这一目标，申请人及团队研制出了大视场显微成像用于血细胞计 数的方法与设备，采用简单的样品制备步骤，实现了人体体液和动物血液中红 细胞、白细胞、血小板以及白细胞三分类的准确计数(参见文献1.Lab Chip 2014, 14,3029-3036；文献2.US PatentNo.10,024,858B2；文献3.Anal Chem 2015,87, 11854；文献4.Anal and Bioanal 2019,411:2767-2780)。与传统的流式细胞术相比，上述方法不涉及样品的持续流动，不需要大量的试剂耗材以及对仪器的 定期校正，整个系统的成本较低，并且只需要几微升的指尖血样品。然而，这 种细胞计数方法目前使用的是一种商业样品池，其更适用于普通的细胞成像，作为特制的血细胞计数样品池有所欠缺；同时，其购买成本约为5美元，作为耗 材只能完成两次测试，在资源匮乏的地区进行应用研究缺乏优势。为了解决这 个问题，文献4记载了一种通过软刻印的方法制备的微流控血细胞成像样品池， 但样品池的制作过程需要训练有素的实验室人员借助经验才能完成，例如，需 要控制手指压力的大小来控制玻璃胶的厚度，因此无法实现标准化的流程。而 且，对于文献4中样品池的使用过程来说，血细胞样品的导入和后续样品池的密封等步骤也无法实现自动化，同样需要娴熟的经验以确保计数检测的准确性。 因此，这种样品池的制作与使用过程均无法实现标准化的操作。

发明内容

为了改善现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种血细胞成像样 品池，所述样品池能够制备痕量血样，其制作方便，成本较低，并且使用简单， 不需要密封，较容易实现检测装置的微型化、标准化和智能化。

本发明的第二目的在于提供一种血细胞计数试剂盒，其包含上述血细胞样 品池。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：

一方面，本发明提供一种用于血细胞成像计数的样品池，包括载玻片，所 述载玻片表面形成亲水通道和疏水边缘，所述疏水边缘分布于亲水通道四周， 形成闭合边缘。

根据本发明，所述亲水通道和疏水边缘形成一个可以容纳血细胞样品的样 品池，例如所述亲水通道被疏水边缘包围，疏水边缘形成样品池边界，所述血 细胞样品在亲水通道内平铺，不进入疏水边缘，也不流出亲水通道。

根据本发明的实施方案，所述亲水通道的亲水性可以使血细胞样品在整个 亲水通道内平铺，优选血细胞样品在亲水通道内可自由流动，例如所述亲水通 道的水接触角小于60°，例如小于45°，或小于20°，或小于10°，或小于8°；所述疏水边缘的疏水性能使血细胞样品保留在亲水通道处、不进入疏水边缘，例如 所述疏水边缘的水接触角大于80°，优选大于90°，或大于100°。

根据本发明的实施方案，所述亲水通道由亲水材料的亲水处理形成，其是 在载玻片表面经亲水材料处理形成亲水表面，所述亲水材料可以是但不仅限于 带亲水基团(例如氨基、巯基、羧基、磺酸基、硫酸基、羟基等亲水基团)的化合物或亲水性纳米材料。在本发明的一个实施方案中，所述亲水材料为纳米 二氧化硅。

根据本发明的实施方案，所述疏水边缘是由疏水材料的疏水处理形成，其 是在载玻片表面经疏水材料处理形成疏水表面，所述疏水材料可以是但不仅限 于带疏水基团的小分子化合物或高分子聚合物，所述疏水基团可以选自长链烷 基、芳基、卤素等亲油基团中的一种或两种以上，所述长链烷基可以为碳原子 数≥3的烷基，例如3-40个碳原子的烷基，优选6-18个碳原子的烷基；所述带疏 水基团的化合物可以选自带上述疏水基团的硅烷、脂肪酸酯、油脂类化合物等 材料。本发明一个实施方案中，采用的疏水材料选自三氯十八烷基硅烷(OTS)。 根据本发明的实施方案，所述亲水通道的形状和尺寸没有特别限定，可以根据 检测系统显微装置的观测范围来选择，优选与检测系统的显微镜观测范围相匹配。

根据本发明的实施方案，所述样品池的尺寸没有特别的限定，可以根据检 测系统显微观察装置所需要的范围来选择，例如长18mm、宽3mm。所述样品 池的厚度没有特别的限定，本领域技术人员可根据需要调整疏水边缘的厚度， 例如可以进行多次疏水处理，形成疏水材料的多层叠加。本领域技术人员应当 理解，在本发明中，所述样品池的厚度无需精确控制，以实现血细胞样品保留 在亲水通道内，不越过疏水边缘为准。

根据本发明的实施方案，所述用于血细胞成像的样品池是上端开放式的， 上端不包含任何形式的密封，例如其不包括盖玻片或其他任何密封材料。

另一方面，本发明还提供上述用于血细胞成像计数的样品池的制备方法， 包括以下步骤：

(1)将载玻片表面用亲水材料处理，形成亲水表面；

(2)将形成亲水表面的载玻片除中间区域外用疏水材料处理，中间区域不 覆盖疏水材料，形成疏水边缘围绕的亲水通道。

根据本发明的实施方案，所述步骤(1)亲水材料处理载玻片表面的方法包 括但不限于浸泡、旋涂、喷淋、软刻印、等离子处理等方法。例如，将载玻片 浸泡到亲水材料的溶液中，进行亲水处理。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)疏水材料处理载玻片表面的方法包 括但不限于浸泡、旋涂、喷淋、软刻印、等离子处理等方法。例如，采用软刻 印法将疏水材料转移到载玻片表面，形成疏水边缘。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)是将所述疏水材料配制为溶液，粘 附到印章的底部，然后将所述印章按压至载玻片表面，实现疏水材料的转移， 例如，所述疏水材料的溶液为三氯十八烷基硅烷(OTS)的己烷溶液，例如OTS 的浓度为1-3mM。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)还包括使用模具制成印章，例如制 成PDMS(聚二甲基硅氧烷)印章。

根据本发明的实施方案，所述用于血细胞成像的样品池的制备方法，包括 以下步骤：

(1)将载玻片浸泡到纳米二氧化硅溶液中，浸泡时间为1-5min，进行亲水 处理；

(2)制作印章：所述印章是将PDMS和固化剂(例如8：1～11:1的质量比) 倾倒在固定有模具的培养皿上，再进行固化(例如在恒温干燥箱中于75～85℃ 固化0.5～1.5h)，固化后PDMS底部形成图案，将它移出模具切成长方体制成 PDMS印章；例如所述模具选自宽度为6mm或3mm的长方形；

制作疏水边缘：采用印章的软刻印法将疏水材料转移到载玻片亲水表面的 中间长方形区域的四周，形成疏水边缘。

在本发明的一个具体实施方案中，所述制作疏水边缘的步骤包括：配制OTS 己烷溶液(例如1-3mM)；用棉签蘸取OTS溶液涂抹在制作好的PDMS印章上， 涂抹3次，立刻吹干后转移至载玻片上，按压1-3分钟。移开PDMS印章后，除了 预留的长方形区域之外，载玻片的表面均覆盖OTS，形成疏水边缘。

优选的，所述样品池制作包含预处理步骤：先使用擦镜纸和乙醇擦拭载玻 片表面以除去灰尘等杂质。再将载玻片置于98％浓硫酸与30％双氧水的混合溶 液中(体积比为7：3)中，于50～70℃超声0.5～2h，对载玻片进行清洁和初步 的亲水处理。然后，再用超纯水将载玻片于25℃超声清洗2～4次，每次10min。

另一方面，本发明还提供一种血细胞计数试剂盒，包括如上所述的用于血 细胞成像的样品池。

根据本发明的实施方案，所述血细胞计数试剂盒还包括球化和/或裂解红细 胞的表面活性剂、以及用于白细胞和血小板染色的染色剂。

根据本发明的实施方案，所述试剂盒中还包含一种或多种保湿剂。所述保 湿剂可以选自但不限于多元醇类、氨基酸类、蛋白类、透明质酸、神经酰胺、 吡咯烷酮羧酸、尿素、乳酸钠、维生素原B5等化合物。例如，本发明的一个具 体实施方案中，所述保湿剂选自甘油。所述保湿剂的量以稀释剂的体积比 5％～-30％为计，例如10％-20％。所述稀释剂可以为PBS缓冲液。

根据本发明的实施方案，所述表面活性剂为季铵盐固体两性表面活性剂； 例如包含磺酸基和季铵盐的固体两性表面活性剂，如N，N-二甲基-N-(3-磺丙 基)-1-八烷铵内盐、N，N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十二烷铵内盐、N，N-二 甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵内盐等。所述表面活性剂还可以为阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠。

根据本发明的实施方案，所述染色剂选自吖啶橙。

根据本发明的实施方案，所述试剂盒中包含的两性表面活性剂和染色剂的 量分别以加入血细胞样品后工作浓度为13～35μM和30～50μM为计，更优选的 以18～30μM和35～45μM为计，最优选的以22μM和37.5μM为计；优选的，所 述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为40～80倍，更优选的，所述倍数为50～70 倍，最优选的为60～62倍。

根据本发明的实施方案，所述试剂盒中包含的阴离子表面活性剂和染色剂 的量分别以加入血细胞样品后工作浓度为1～10mM和45～250μM为计，更优选 的以2～8mM和100～200μM为计，最优选的，为5.2mM和150μM为计。优选 的，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为2～10倍，更优选的，所述倍数为4～ 8倍，最优选的为5～7倍。

根据本发明的实施方案，所述两性表面活性剂可用于血细胞计数和白细胞 分类，所述阴离子表面活性剂可用于白细胞分类。

本领域技术人员可以理解，所述“工作浓度”为本领域技术人员采用试剂盒 进行实验测定时，将试剂盒中的相应试剂与目标生物样本混合后用于具体测定 的液体中试剂的浓度。

根据本发明的实施方案进一步理解，所述“工作浓度”为将上述表面活性剂 和染色剂分别与稀释或未被稀释的血细胞样品混合后相应试剂的最终浓度。

另一方面，本发明进一步提供一种血细胞计数分析方法，包括如下步骤：

(1)采用表面活性剂、染色剂、保湿剂、稀释剂和血细胞样品进行混合，

(2)将步骤(1)得到的混合物加入如前所述的样品池亲水通道中；

(3)采用成像装置获取样品池成像信息。

本发明所涉及的“血细胞”主要包含红细胞、白细胞和血小板。本领域技术 人员可以理解，本发明所涉及的样品根据上下文可称为“血样”、“含血细胞的样 品”、“血细胞样品”、“含血样品”或“血”等，适用于本发明的样品可来源于不同 类型的体液，包括全血、唾液、尿液、脊髓液、腹膜液、滑膜液、乳汁、痰等。

本发明中，“被稀释剂稀释的倍数”可通常的理解为＝定容体积/原始血细胞样 品的移取体积。

本发明的有益效果：

(1)本发明使用亲水材料处理载玻片表面，再将疏水材料转移到载玻片上， 制作四周有疏水边缘的亲水通道，可使得血细胞样品在亲水作用力下均匀扩散， 形成血细胞的单层分布，便于血细胞成像，以实现对红细胞、血小板和白细胞 的准确计数，以及对白细胞进行三分类计数。本发明的血细胞计数样品池和计数方法与现有的商用血细胞分析方法的结果具有一致性。

(2)本发明的样品池无需在上端设置另一个表面，例如，无需盖玻片的控 制，也无需控制样品池的厚度，样品池的制作流程更简便，成本更低。在使用 时不需要密封，被测血样的体积仍然可以精确控制，其采用加入保湿剂进行保 湿，防止血细胞皱缩，维持血细胞的良好形态。即使未受过专业训练的普通人，使用本发明所述的样品池和试剂条件，也可以便利地结合大视场显微成像与自 动化的数据分析方法，实现血细胞的准确计数，有利于这种分析方法的微型化 与智能化发展。

(3)本发明通过采用玻璃片和亲水、疏水材料确定样品池的边界，相较于 塑料制成的商业样品池，更加经济环保。

附图说明

图1为本发明样品池的结构示意图。

图2为本发明样品池的制作方法流程示意图，①亲水处理，②吹干得到亲水 处理后的载玻片，③软刻印法转移疏水材料，④形成疏水边缘制成样品池。

图3为实施例1所制备的样品池亲水通道与疏水边缘的水接触角测试结果； 图a为样品池的实物图，图b、c为样品池亲水通道和疏水边缘处的接触角测试。

图4为实施例1所制备的样品池中血细胞样品的流动过程示意图(a)和流动 完成后的实物图(b)。

图5为实施例1所制备的样品池中血细胞的大视场成像图；a)整个样品池的 亮场和荧光成像叠加图；b)白色实线框区域的荧光成像。c)黑色实线框区域 的亮场、荧光成像叠加图；d)白色虚线框区域的亮场、荧光成像叠加图。

图6为实施例1所制备的样品池用于血细胞计数和白细胞三分类的检测结 果；第一行为3个不同的血细胞样品的细胞计数测试值与临床血细胞分析仪的 结果对照；第二行为3个不同的血细胞样品的白细胞三分类的测试值与临床血细 胞分析仪的结果对照。

图7为使用实施例1所制备的样品池对红细胞、白细胞、血小板计数的结果 与临床血细胞分析仪的结果比较；第一行为相关性分析；第二行为Bland-Altman 分析。

图8为使用实施例1所制备的样品池对白细胞三分类计数的结果与血细胞分 析仪的结果比较；第一行为相关性分析；第二行为Bland-Altman分析。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当 理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明 保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保 护的范围内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法； 下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1样品池制作及性能测试

1.1样品池制作

用擦镜纸蘸取乙醇擦拭载玻片(25mm×75mm)，以除去其表面的灰尘 等杂质。将载玻片置于食人鱼溶液(98％浓硫酸：30％双氧水＝7：3，体积比) 中，65℃超声1小时,以进一步清洁玻片。用超纯水将载玻片于室温超声清洗 3次，每次10分钟。载玻片经吹干后，浸泡于纳米二氧化硅溶液中1分钟，进 行亲水处理，取出吹干，形成亲水性较强的表面。

将聚二甲氧基硅烷(PDMS)的有机硅弹性体与固化剂以质量比10：1混 匀，倾倒在固定有模具的培养皿中，于80℃的恒温干燥箱中固化1小时。固化 后PDMS底部形成通道图案，将它从培养皿中轻轻移出，制成含长方形通道的 PDMS印章，其中中间的长方形区域尺寸为18mm×3mm。

配制2mM的三氯十八烷基硅烷(OTS)的己烷溶液。用棉签蘸取OTS 溶液涂抹在制作好的PDMS印章上，涂抹3次，立刻吹干后转移至载玻片 上，按压1分钟。移开PDMS印章后，除了预留的长方形区域之外，载玻 片的表面均覆盖OTS。将制作好的样品池封装好，避免表面灰尘的污染， 以备后续使用。

1.2样品池亲/疏水性能测试

亲水通道的亲水性和疏水边缘的疏水性采用水接触角测量仪进行测试。水滴 体积为3μL，测试结果如图3所示。亲水通道处的接触角为3.8°，证明其亲水 性较强。疏水边缘处的接触角为105.4°，证实其较强的疏水性。

实施例2用样品池进行血细胞计数

2.1样品制备

用微量进样器移取60μL含有10％甘油(体积比)的磷酸盐缓冲液 (PBS)，加入预埋有干剂(DOPS和吖啶橙)的离心管，其最终浓度为22μM 的N,N-二甲基-N-(3-磺丙基)-1-十八烷铵内盐(DOPS)、37.5μM的吖啶橙 AO。加入1μL全血，使红细胞发生球化，使白细胞和血小板染色，制得 的样品以供后续的成像计数测试所用。

用微量进样器移取5μL全血，加入预埋有干剂(SDS和吖啶橙)的 离心管，其最终浓度为5.2mM的十二烷基硫酸钠(SDS)和150μM的AO。 试剂与全血作用完全后，加入20μL含有20％甘油(体积比)的PBS缓 冲液。制得的样品以供后续的白细胞三分类测试所用。

2.2加样

制备好的血细胞样品从样品池亲水通道的中心处打入，样品自动在亲水通 道内向两边扩散流动，形成均匀的血细胞薄层，如图4所示。由于前述样品制 备的试剂中加入了少量甘油，血细胞不会因为失水发生皱缩的现象，将保持良 好的形态，以保证后续成像和计数的准确性。

2.3大视场成像

将样品池中的血细胞样品置于大视场显微镜下进行成像分析，结果如图5所 示。我们测试了3个不同的血细胞样品(1号、2号、3号)，它们的红细胞、白 细胞、血小板计数及白细胞三分类的数值各不相同。将成像分析的结果与血细 胞分析仪(Sysmex TX-4000i)的结果进行对照，结果如图6所示。二者没有显 著的差异，说明这种样品池可以用于血细胞的准确计数和白细胞三分类的准确 检测。

实施例3测量20组临床血样并与临床结果比较

按照本发明描述的装置和方法测试了20组临床血样，得到它们的红细胞总 数、血小板总数、白细胞总数以及白细胞三分类数值，并将结果与临床使用的 血细胞分析仪(Sysmex TX-4000i)的结果进行比较。

图7与图8分别显示了血细胞计数以及白细胞三分类比较的结果，图7与 图8的第一行图片显示了本发明方法得到的分析值与临床检测结果之间的相关 性，中间黑色实线为分析值与对照值完全吻合时的情况，其上下最近的两条灰 色线之间为对照值的95％置信区间，定义为对照值±1.96标准偏差，标准偏差来源于血液分析仪的制造商。中间黑色实线上下距离稍远的两条黑色线之间为 血细胞分析仪的行业标准可接受的误差范围，此范围为红细胞6％、白细胞 15％；对于白细胞的三分类，由于没有明确的行业标准，我们使用文献中报道 的误差范围(文献5：Mauro Buttarello et al，Automated Blood CellCounts: State of the Art，Am J Clin Pathol，2008，130，104-115，粒细胞：23.4％， 淋巴细胞15％，单核细胞14.8％)。从图中可以看出，除单核细胞外，大部分 数据点都落在误差范围允许以内。

图7与图8的第二行图片显示了测试值与对照值之间的一致性。以每个 样品测试值与对照值二者的均值为横轴，差值为纵轴作图，中间的实线代 表了所有样品的测试值与对照值差值的平均值,上下的虚线之间为95％置 信区间。从图中结果可知，采用这种样品池和测试方法所得的血细胞计数 与白细胞三分类的结果，与业内使用的血细胞分析仪的测试结果没有显著 差异。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施 方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (53)

1.一种用于血细胞成像计数的样品池，其特征在于，包括载玻片，所述载玻片表面形成亲水通道和疏水边缘，所述疏水边缘分布于亲水通道四周，形成闭合边缘，所述样品池是上端开放式的，不包含任何形式的密封；所述亲水通道的水接触角小于20°，所述疏水边缘的水接触角大于90°。

2.根据权利要求1所述的样品池，其特征在于，所述疏水边缘的水接触角大于100°。

3.根据权利要求1所述的样品池，其特征在于，所述亲水通道由亲水材料亲水处理形成，所述亲水材料选自带有亲水基团的化合物或亲水性的纳米材料。

4.根据权利要求3所述的样品池，其特征在于，所述亲水基团选自氨基、巯基、羧基、磺酸基、硫酸基、羟基中的一种或两种以上，所述亲水性的纳米材料为纳米二氧化硅。

5.根据权利要求1至4任一项所述的样品池，其特征在于，所述疏水边缘是由疏水材料疏水处理形成。

6.根据权利要求5所述的样品池，其特征在于，所述疏水材料为带有疏水基团的化合物。

7.根据权利要求6所述的样品池，其特征在于，所述疏水基团选自长链烷基、芳基、卤素等亲油基团中的一种或两种以上。

8.根据权利要求7所述的样品池，其特征在于，所述长链烷基为碳原子数3-40的烷基。

9.根据权利要求8所述的样品池，其特征在于，所述长链烷基为碳原子数6-18个碳原子的烷基。

10.根据权利要求6所述的样品池，其特征在于，所述带有疏水基团的化合物选自带有所述疏水基团的硅烷、脂肪酸酯、油脂类化合物中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的样品池，其特征在于，所述疏水材料选自三氯十八烷基硅烷。

12.根据权利要求1-11任一项所述的用于血细胞成像计数的样品池的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将载玻片表面用亲水材料处理，形成亲水表面；

（2）将形成亲水表面的载玻片的边缘用疏水材料处理，中间不覆盖疏水材料，四周覆盖疏水材料，形成疏水边缘围绕的亲水通道。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）亲水材料处理表面的方法选自浸泡、旋涂、喷淋、软刻印、等离子处理中的一种或两种以上。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）亲水材料处理表面的方法选自将载玻片浸泡到亲水材料的溶液中，进行亲水处理。

15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）疏水材料处理表面的方法选自浸泡、旋涂、喷淋、软刻印、等离子处理中的一种或两种以上。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）疏水材料处理表面的方法采用软刻印法将疏水材料转移到载玻片表面，形成疏水边缘。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）是将所述疏水材料配制为溶液，粘附到印章的底部，然后将所述印章按压至形成亲水表面的载玻片表面，实现疏水材料的转移。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，疏水材料的溶液为三氯十八烷基硅烷的己烷溶液。

19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述三氯十八烷基硅烷的己烷溶液的浓度为1-3mM。

20.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）还包括使用模具制成所述印章。

21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）还包括使用模具制成聚二甲基硅氧烷印章。

22.根据权利要求12至21任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）将载玻片浸泡到纳米二氧化硅溶液中，进行亲水处理；

（2）制作印章：所述印章是将PDMS和固化剂倾倒在固定有模具的培养皿上，再进行固化，固化后PDMS底部形成图案，将它移出模具切成长方体制成PDMS印章；

制作疏水边缘：采用印章的软刻印法将疏水材料转移到载玻片表面的亲水表面四周，形成疏水边缘。

23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述PDMS和固化剂的质量比为8：1～11:1。

24.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述固化为在恒温干燥箱中于75～85℃固化0.5～1.5h。

25.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述制作疏水边缘的步骤包括：配制OTS己烷溶液；蘸取OTS溶液涂抹在制作好的PDMS印章上，干燥后转移至载玻片上，按压1-3分钟；移开PDMS印章后，除了预留的长方形区域之外，载玻片的表面均覆盖OTS，形成疏水边缘。

26.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述OTS己烷溶液的浓度为1-3 mM。

27.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包含对载玻片的预处理步骤：先使用擦镜纸和乙醇擦拭载玻片以除去其表面的灰尘等杂质，再将载玻片置于98%浓硫酸与30%双氧水的混合溶液中，于50～70℃超声0.5～2h，对玻片进行清洁和亲水处理，然后，再用超纯水将载玻片于25℃超声清洗2～4次，每次10 min。

28.根据权利要求27所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中浓硫酸与双氧水的体积比为7：3。

29.一种血细胞计数试剂盒，包括如权利要求1-11任一项所述的用于血细胞成像计数的样品池。

30.如权利要求29所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞计数试剂盒还包括球化和/或裂解红细胞的表面活性剂、以及用于白细胞和血小板染色的染色剂。

31.如权利要求29所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括保湿剂。

32.如权利要求31所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述保湿剂选自多元醇类、氨基酸类、蛋白类、透明质酸、神经酰胺、吡咯烷酮羧酸、尿素、乳酸钠、维生素原B5中的一种或两种以上。

33.如权利要求32所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述保湿剂选自甘油。

34.如权利要求31所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述保湿剂的量以稀释剂的体积比5%~30%为计。

35.根据权利要求30所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为季铵盐固体两性表面活性剂。

36.根据权利要求35所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为包含磺酸基和季铵盐的固体两性表面活性剂。

37.根据权利要求36所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自N，N-二甲基-N-（3-磺丙基）-1-八烷铵内盐、N，N-二甲基-N-（3-磺丙基）-1-十二烷铵内盐、N，N-二甲基-N-（3-磺丙基）-1-十八烷铵内盐中的至少一种。

38.根据权利要求30所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为阴离子表面活性剂。

39.根据权利要求38所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠。

40.根据权利要求30所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述染色剂选自吖啶橙。

41.根据权利要求35-37任一项所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的两性表面活性剂和染色剂的量分别以加入血细胞样品后工作浓度以13～35 μM和30～50 μM为计。

42.根据权利要求41所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的两性表面活性剂和染色剂的量分别以加入血细胞样品后工作浓度以18～30 μM和35～45 μM为计。

43.根据权利要求42所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的两性表面活性剂和染色剂的量分别以加入血细胞样品后工作浓度以22 μM和37.5 μM为计。

44.根据权利要求41所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为40～80倍。

45.根据权利要求44所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为50～70倍。

46.根据权利要求45所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞样品被稀释剂稀释倍数的为60～62倍。

47.根据权利要求38或39所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的阴离子表面活性剂和染色剂的量分别以加入血细胞样品后工作浓度以1～10 mM和45～250μM为计。

48.根据权利要求47所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的阴离子表面活性剂和染色剂的量分别以加入血细胞样品后工作浓度以2～8 mM和100～200 μM为计。

49.根据权利要求48所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的阴离子表面活性剂和染色剂的量分别以加入血细胞样品后工作浓度以5.2 mM和150μM为计。

50.根据权利要求48所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为2～10倍。

51.根据权利要求50所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为4～8倍。

52.根据权利要求51所述的血细胞计数试剂盒，其特征在于，所述血细胞样品被稀释剂稀释的倍数为5～7倍。

53.一种血细胞计数分析方法，包括如下步骤：

（1）采用表面活性剂、染色剂、保湿剂、稀释剂和血细胞样品进行混合，

（2）将步骤（1）得到的混合物加入如权利要求1-11任一项所述的样品池亲水通道中；

（3）采用成像装置获取样品池成像信息。