CN112390791A - 一类dna甲基转移酶1荧光探针及其用途 - Google Patents

一类dna甲基转移酶1荧光探针及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属医药技术领域，涉及DNA甲基转移酶1荧光探针，具体涉及式1结构的由邻苯二甲酰亚胺类DNA甲基转移酶1(DNMT1)抑制剂与荧光素通过连接链(L)连接而成的荧光探针及其用途。本发明式1结构的荧光探针，或其药学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药，表现出良好的透膜入核能力和与DNMT1的结合能力，可用于制备细胞内及细胞核内的DNMT1的定量检测制剂，为细胞病变尤其是癌变程度提供预测或诊断。

Description

一类DNA甲基转移酶1荧光探针及其用途
技术领域
本发明属医药技术领域，涉及DNA甲基转移酶1荧光探针，具体 涉及一类由邻苯二甲酰亚胺类DNA甲基转移酶1(DNMT1)抑制剂与 荧光素通过连接链(L)连接而成的荧光探针，该类荧光探针表现出 良好的透膜入核能力和与DNMT1的结合能力，可用于制备细胞内及细 胞核内的DNMT1的定量检测制剂，为细胞病变尤其是癌变程度提供预 测。
背景技术
研究显示，肿瘤的形成不仅源于基因遗传，同样也受到表观遗传 修饰的影响；表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰以及mRNA 编辑等，其中，DNA甲基化是表观遗传中最主要的一种类型，抑癌基 因的甲基化将直接破坏正常细胞的动态平衡，从而诱发癌变。
研究表明，DNA甲基化主要是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的 催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将DNA的CpG岛上的 胞嘧啶转变成5-甲基胞嘧啶，从而导致该基因沉默，丧失功能。DNMTs 家族主要包括DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B，DNMT3L等，其中，DNMT1是目前研究最多的甲基转移酶，研究表明DNMT1的表达量多少 与基因甲基化程度之间存在直接相关性，而抑癌基因的甲基化过度程 度又与细胞的癌变程度直接相关，因此DNMT1的表达量的多少与细胞 的癌变程度之间存在着相关性，即DNMT1表达量越多，细胞癌变程度 越大。
目前医疗实践中，对于癌前病变的检测手段较少，且大多耗费人 力物力，同时存在着敏感性与特异性较低等问题，如宫颈癌筛查方法 中宫颈薄层细胞学检查(thinprepcytologic test，TCT)、高危人乳 头瘤病毒(high risk humanpapillomavirus，HR-HPV)和第二代杂交 捕获实验(hybrid capture2，HC2)检测均存在敏感性和特异性较差 的问题，常导致不必要的阴道镜转诊等。因此，研制新型的癌前病变 检测手段有着重要的实践意义。DNMT1是生物细胞核内一种特异性的 甲基转移酶，其表达量的多少一定程度上预示着细胞的癌变程度，因 此，实现对DNMT1表达量的检测将可以成为细胞或生物体健康状况的 量度，甚至是癌症的预测和警告。
截至目前，关于DNMT1荧光探针的市面上及文献中均未见有报 道。基于现有技术的现状，本申请的发明人将DNMT1抑制剂或其配体 通过柔性连接链与适当的荧光剂连接，提供一类可通过共聚焦显微镜 技术定量检测细胞核中DNMT1含量的荧光探针，本发明可用于与 DNMT1高表达的细胞病变，尤其是细胞癌变的预测和诊断。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一类可通过共聚焦 显微镜技术定量检测细胞核中DNMT1含量的荧光探针，本发明中将 DNMT1抑制剂或其配体通过柔性连接链与适当的荧光剂连接制成DNA 甲基转移酶1荧光探针，本发明可用于与DNMT1高表达的细胞病变， 尤其是细胞癌变的预测和诊断。
具体的，本发明的荧光探针具有下述通式1化合物结构，或其药 学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药：
Figure BDA0002166889110000031
其中，
L选自取代或未取代的C1-10亚烃基、取代或未取代的含杂原子的 C1-10杂亚烃基，当L为取代或未取代的含杂原子的C1-10杂亚烃基时， 所述的杂原子选自氧、氮和硫中的一个或多个；当杂原子为多个时， 杂原子相同或不同；
环A选自苯环，含1-3个杂原子的五元芳香杂环，含1-3杂原子 的六元芳香杂环，含6-14个原子的稠合芳香环或者芳香杂环，含3-8 个碳原子的脂肪环、或者插入杂原子的含3-8个碳原子的脂肪环；当 环中含有杂原子时，杂原子选自氧、氮和硫中的一个或多个；当杂原 子为多个时，杂原子相同或不同；
X选自碳原子，氮原子，氧原子或者硫原子；
R1选自独立的氢、卤素、羟基、氨基，硝基，氰基、取代或未取 代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氧 基，取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代或未取代的含 1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的组合；
R2选自氢，取代或未取代的含1-10个碳原子的烷基，取代或未 取代的含3-6个碳原子的环烷基，取代或未取代的含2-10个碳原子 的烯基；
R3选自独立的氢、卤素、羟基、氨基，硝基，氰基、取代或未取 代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氧 基，取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代或未取代的含 1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的组合；
R4选自氧，连有一个取代基的亚胺基或连有两个取代基的季铵；
R5选自羟基，连有一个取代基的氨基或连有两个取代基的氨基；
所述的取代的C1-10亚烃基，所述的取代的含杂原子的C1-10的杂亚 烃基，所述的取代的C1-6烃基、取代的含1-6个碳原子的烷基、取代 的含1-6个碳原子的烷氧基，取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代 的含1-6个碳原子的酰氨基、取代的含1-10个碳原子的烷基，取代 的含3-6个碳原子的环烷基，取代的含2-10个碳原子的烯基中的取 代是指被卤素、苯基和C1-10烷基中的一个或多个所取代，当存在多个 取代基时，所述的取代基相同或不同。
本发明中，术语亚烃基是指含碳、氢两种原子，由相应的烃失去 任意两个氢原子后剩下的基团 https://baike.baidu.com/item/％E8％87％AA％E7％94％B1％E5％9F％ BA/970597。术语亚烃基优选为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环 烯基、亚环炔基或亚芳基。
本发明中，术语亚烯基是指链状亚烯基，其中碳碳双键的个数为 一个或多个，碳碳双键的可位于链状亚烯基的任意位置。
本发明中，术语亚炔基是指链状亚炔基，其中碳碳三键的个数为 一个或多个，碳碳三键的可位于链状亚炔基的任意位置。
本发明中，术语亚环烯基是指环状亚烯基，其中碳碳双键的个数 为一个或多个，碳碳双键的可位于环状亚烯基的任意位置。
本发明中，术语亚环炔基是指环状亚炔基，其中碳碳三键的个数 为一个或多个，碳碳三键的可位于环状亚炔基的任意位置。
本发明中，术语杂亚烃基是指本发明中的亚烃基的任意位置插入 一个或多个杂原子，其中，亚烃基的定义同前所述。
在本发明一优选实施方案中，L选自取代或未取代的C1-10亚烃基。
在本发明一优选实施方案中，环A选自苯环，吲哚环，异吲哚环， 嘧啶环，嘌呤环，呋喃环，噻酚环，吡咯环，吡啶环，恶唑环，异恶 唑环，噻唑环，吡唑环，咪唑环，萘环，6-13个原子的稠合芳香杂 环；当环中含有杂原子时，杂原子选自氧、氮和硫中的一个或多个； 当杂原子为多个时，杂原子相同或不同。
在本发明一优选实施方案中，X选自碳原子，氮原子，氧原子。
在本发明一优选实施方案中，R1选自独立的氢、卤素、羟基、氨 基，硝基，氰基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未 取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代或未取代的含1-6个碳原子的 烷氨基，取代或未取代的含1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的 组合。
在本发明一优选实施方案中，R2选自氢，甲基，取代或未取代的 含1-10个碳原子的烷基。
在本发明一优选实施方案中，R3选自独立的氢、卤素、羟基、氨 基，硝基，氰基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未 取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代或未取代的含1-6个碳原子的 烷氨基，取代或未取代的含1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的 组合。
在本发明一优选实施方案中，R4选自氧，连有一个取代基的亚胺 基或连有两个取代基的季铵。
在本发明一优选实施方案中，R5选自羟基，连有一个取代基的氨 基或连有两个取代基的氨基。
本发明中，所述的取代的C1-10亚烃基，所述的取代的含杂原子的 C1-10的杂亚烃基，所述的取代的C1-6烃基中的取代是指被卤素、苯基 和C1-10烷基中的一个或多个所取代，当存在多个取代基时，所述的取 代基相同或不同。
本发明中，术语亚烃基是指含碳、氢两种原子，由相应的烃失去 任意两个氢原子后剩下的基团 https://baike.baidu.com/item/％E8％87％AA％E7％94％B1％E5％9F％ BA/970597。术语亚烃 基优选为亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基 或亚芳基。
本发明中，术语亚烯基是指链状亚烯基，其中碳碳双键的个数为 一个或多个，碳碳双键的可位于链状亚烯基的任意位置。
本发明中，术语亚炔基是指链状亚炔基，其中碳碳三键的个数为 一个或多个，碳碳三键的可位于链状亚炔基的任意位置。
本发明中，术语亚环烯基是指环状亚烯基，其中碳碳双键的个数 为一个或多个，碳碳双键的可位于环状亚烯基的任意位置。
本发明中，术语亚环炔基是指环状亚炔基，其中碳碳三键的个数 为一个或多个，碳碳三键的可位于环状亚炔基的任意位置。
本发明中，术语杂亚烃基是指本发明中的亚烃基的任意位置插入 一个或多个杂原子，其中，亚烃基的定义同前所述。
在本发明一优选实施方案中，式1所示荧光探针选自以下任一所 示化合物：
Figure BDA0002166889110000071
Figure BDA0002166889110000081
本发明提供了荧光探针的制备方法，本发明中以实施例1和实施 例4代表，按下述流程制得通式1化合物结构的荧光探针，
Figure RE-GDA0002293482010000091
本发明的进一步目的是式1所示荧光探针、或其药学上可以接受 的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药在制备对各类细胞内DNA 甲基转移酶1(DNMT1)定性和定量检测制剂中的用途。
本发明的进一步目的是式1所示荧光探针、或其药学上可以接受 的盐、其立体异构体或互变异构体在制备用于与DNMT1高表达相关疾 病的诊断或预测的药物中的应用；所述的与DNMT1高表达相关疾病优 选为各种恶性肿瘤，更优选为宫颈癌，口腔粘膜癌，皮肤癌等。
附图说明
图1.小分子RG108与DNMT1蛋白的亲和力拟和结果。
图2.实施例与DNMT1蛋白的亲和力测定实时传感图。
图3：荧光探针对不同DNMT1表达量的Hela细胞的定量检测。
图4.实施例1的荧光探针在临床细胞中的应用。
具体实施例
本发明中以实施例1和实施例4代表，按下述流程制备实施例 1-15所示荧光探针：
Figure RE-GDA0002293482010000111
(S)-2-(4-羟基-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸甲 酯(3)的制备
取化合物1(L-色氨酸甲酯盐酸盐))在50毫升圆底烧瓶中加入 540mg(2.1mmol)，加入15毫升乙酸，150mg乙酸钾(1.53mmol)， 然后加入化合物2(4-羟基邻苯甲酸酐)450mg(2.75mmol)。将溶 剂加热至145℃，27小时后，反应完成。蒸发溶剂，得到黄色固体， 硅胶柱色谱，得到纯产物506.6mg，收率66％.1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz)δ＝11.22(s,1H),10.80(s，1H),7.60(d，J＝4Hz，1H),7.50 (d,J＝4Hz,1H),7.24(d,J＝4Hz,1H),7.18(d,J＝4Hz，1H),7.13(d,J ＝4Hz,1H),6.98(s,2H),6.88(d,J＝4Hz,1H),5.19(s,1H),3.72(s, 3H),3.53(s,2H)；ESI-MSm/z365.1(M+H+).
甲基-(S)-2-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)-1,3-二氧代异吲 哚-2-基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸乙酯(4)的制备
取化合物3500mg(1.37mmol)，加入20mlDMF，K2CO3220mg (1.65mmol)，KI274mg(1.65mmol)，Boc-保护的2-溴乙胺370mg (1.65mmol)，80℃下反应。24小时后，反应结束。加入饱和盐水， 用EA萃取，蒸发有机相，得到固体，硅胶柱色谱，得到纯产物(4) 346mg，回收原料144mg，收率71％.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz) δ＝7.91(s,1H),7.51(dd,J＝8Hz,2H),7.28(d,J＝4Hz,1H),7.20(d, J＝4Hz,1H),7.04(d,J＝4Hz,2H),6.99(d,J＝8Hz,1H),6.96(s,1H), 5.22(s,1H),5.15(t,J＝8Hz,1H),4.07(s,2H),3.71(s,3H),3.65(d, 2H),3.49(s,1H),1.37(s,9H)；ESI-MSm/z530.3(M+Na+).
(S)-2-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2- 基)-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(5)的制备
化合物40.66mmol溶于3mlEA中，加入LiI351.5mg (2.63mmol)，并在80℃回流.1天后，在瓶壁上观察到黄色固体。加 入20mlEA后沉淀出大量固体，过滤并用EA洗涤并干燥，得到纯固 体化合物5:97mg，收率31％.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.60 (s，1H))，7.66(t，J＝8Hz，1H)，7.47(d，J＝8Hz，1H)，7.37 (d，J＝8Hz，1H)，7.28(d，J＝8Hz，1H)，7.24(d，J＝8Hz， 1H)，7.00(d，J＝8Hz，1H)，6.96(d，J＝8Hz，1H)，6.92(d，J ＝8Hz，1H)，6.86(s，1H)，4.57(s，1H)，4.13(s，2H)，3.59 (s，2H)，3.27(s，2H)，1.37(s，9H)；ESI-MSm/z492.2(M-H+)。
(S)-2-(4-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚 -3-基)丙酸(6)的制备
化合物5(0.3mmol)溶于2mlDCM：三氟乙酸＝20：1的溶剂 中，并在室温下搅拌。2小时后，反应完成。减压除去溶剂，得到粗 产物化合物6约117mg，未经纯化，直接进行下一步缩合反应，ESI-MS m/z394.2(M+H+)。
(S)-5-(3-(2-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-二氧代异吲哚 啉-4-基)氧基)乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-黄嘌呤-9-基)苯甲酸 (实施例1)的制备
取化合物6(0.18mmol)，DMF1ml，K2CO330mg(0.22mmol)， 然后加入FITC35mg(0.09mmol)并在室温下反应2小时。通过加入 乙醚使固体沉淀，经反相柱色谱，得到10mg目标化合物(实施例1)， 收率14.2％(化合物结构确证见实施例1)
(S)-2-(4-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)-3-(1H-吲哚 -3-基)丙酸甲酯(7)的制备
化合物4(1.24mmol)溶于6mlDCM/三氟乙酸盐＝20/1的溶剂中， 搅拌12小时，减压除去溶剂，柱色谱法纯化，得到化合物7120mg， 产率86.4％.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.90(s，1H)，8.53 (s，1H)，8.15(s，1H)，7.52(s，1H)，7.39(s，1H)，7.33(s， 1H)，7.26(s，1H)，7.17(s，1H)，7.07(s，2H)，7.00(s，1H)， 4.61(s，1H)，4.15(s，2H)，3.60(s，3H)，3.45(s，2H)，3.19 (s，2H)；ESI-MSm/z408.2(M-H+)。
(S)-5-(3-(2-((2-(3-(1H-吲哚-3-基)-1-甲氧基-1-氧代丙-2-基)-1,3-二 氧代异吲哚啉-4-氧乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-黄嘌呤-9-基) 苯甲酸(实施例4)的制备
取化合物7(0.36mmol)，DMF1ml，K2CO394加入mg (0.67mmol)，然后加入化合物FITC108.8mg(0.28mmol)，室温下 搅拌2小时。加入乙醚使固体沉淀，并进行柱外反相柱色谱，得到实 施例4，红色固体25mg，收率11.2％(化合物结构确证见实施例4)。
实施例1.
制得(S)-5-(3-(3-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-邻苯二甲亚酰 -4-基)氧基)乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000131
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.75(s,2H),10.20(s,2H),10.15(s, 4H),8.28(s,2H),7.85(d,J＝8Hz,2H),7.78(d,J＝8Hz,2H),7.74(d, J＝8Hz,2H),7.58(d,J＝8Hz,2H),7.49(s,4H),7.36(d,J＝8Hz,2H), 7.25(s,2H),7.19(s,1H),7.10(s,1H),7.01(s,4H),6.91(s,2H),6.68(s, 4H),6.60(s,4H),6.57(s,4H),5.05(s,2H),4.33(d,J＝12Hz,4H),3.89 (d,J＝12Hz,4H),3.53(s,4H)(共两组氢)；ESI-MSm/z783.2 (M-H+).。
实施例2.
制得(S)-5-(3-(3-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-邻苯二甲亚酰 -4-基)氧基)丙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000141
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.74(s,1H),10.14(s,2H),9.93(s, 1H),8.28(s,1H),7.86(s,1H),7.79(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.34(s,1H),7.25(d,J＝8Hz,1H), 7.00(s,2H),6.90(s,1H)，6.67(s,2H)，6.60(s,2H)，6.57(s,2H)，5.04 (s,1H)，4.15(s,2H),3.52(s,4H),1.99(s,2H)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):δ(ppm)194.26,185.10,184.43,179.96,170.28,168.11, 167.44,166.73,166.16,165.33,64.67,163.26,159.26,157.03,155.50, 153.50,151.63,146.46,136.81,135.84,132.74,128.83,126.76,124.92, 123.10,120.78,119.80,119.54,118.22,117.74,117.09,115.78,115.01, 112.44,111.25,109.63,102.04,82.03,66.38,52.10,40.29,27.40,23.82； ESI-MSm/z797.2(M+H+).。
实施例3.
制得(S)-5-(3-(3-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-邻苯二甲亚酰 -4-基)氧基)己基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000142
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.75(s,2H),10.16(s,4H),10.03(s, 1H),9.97(s,1H),8.25(s,1H),8.19(d,J＝8Hz,1H),7.88(d,J＝8Hz, 1H),7.79(d,J＝8Hz,1H),7.73(s,2H),7.59(s,1H),7.47(m,4H),7.33 (d,J＝8Hz,2H),7.26(d,J＝8Hz,2H),7.18(d,J＝8Hz,1H),7.01(s, 4H),6.91(s,2H),6.68(s,4H),6.60(s,4H),6.58(s,4H),5.04(s,2H), 4.14(d,J＝8Hz,4H),3.16(t,J＝8Hz,8H),1.72(m,4H),1.55(m,4H), 1.38(m,4H),1.25(m,4H)；ESI-MSm/z839.3(M+H+).。
实施例4.
制得(S)-5-(3-(3-((2-(1-甲氧羰基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-邻苯二甲 亚酰-4-基)氧基)乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000151
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.75(s,2H),10.20(s,2H),10.15(s, 4H),8.30(s,1H),8.22(s,1H),7.85(d,J＝8Hz,1H),7.79(d,J＝8Hz, 1H),7.73(d,J＝8Hz,2H),7.55(d,J＝8Hz,1H),7.48(d,J＝8Hz,4H), 7.36(m,2H),7.24(d,J＝8Hz,2H),7.16(d,J＝8Hz,1H),7.00(d,J＝8 Hz,4H),6.88(t,J＝8Hz,2H),6.66(s,4H),6.59(s,4H),6.56(s,4H), 5.16(s,2H),4.33(d,J＝12Hz,4H),3.87(d,J＝12Hz,4H),3.69(s, 6H),3.65(s,4H)；ESI-MSm/z797.2(M-H+).。
实施例5.
制得(S)-5-(3-(3-((2-(1-甲氧羰基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-邻苯二甲 亚酰-4-基)氧基)丙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000161
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝11.03(s,1H),10.88(s,1H),10.33 (s,2H),8.95(s,1H),8.46(s,1H),7.85(d,J＝8Hz,1H),7.76(d,J＝8Hz, 1H),7.49(d,J＝8Hz,2H),7.33(d,J＝8Hz,1H),7.26(d,J＝8Hz,1H),7.16 (d,J＝8Hz,1H),7.02(t,J＝8Hz,2H),6.91(d,J＝8Hz,1H),6.74(s,2H), 6.57(s,4H)，5.16(s,1H)，4.28(s,2H)，3.69(s,4H)，3.52(s,3H)，2.04(s, 2H)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz):δ(ppm)180.53,169.29,168.49, 166.52,165.83,165.06,162.12,159.44,157.70,155.62,152.44,151.69, 146.45,141.65,136.95,135.85,132.60,128.78,128.52,126.72,126.26, 123.74,123.34,120.76,119.81,118.22,117.73,115.68,115.21,115.10, 112.47,111.29,110.71,109.56,109.49,109.03,102.10,66.53,52.49, 51.76,31.04,29.66,27.76,23.91；ESI-MSm/z811.2(M+H+).。
实施例6.
制得(S)-5-(3-(3-((2-(1-甲氧羰基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-邻苯二甲 亚酰-4-基)氧基)己基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000162
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.77(s,2H),10.15(s,4H),9.99(s, 1H),9.92(s,1H),8.24(s,1H),8.15(s,2H),7.87(d,J＝8Hz,1H),7.79(s, 2H),7.72(s,2H),7.57(s,1H),7.45(m,4H),7.32(d,J＝8Hz,2H),7.25(d, J＝8Hz,2H),7.17(d,J＝8Hz,1H),7.02(s,4H),6.89(s,2H),6.61(s,4H), 6.57(s,4H),5.16(s,2H),4.13(d,J＝8Hz,4H),3.69(s,6H),3.46(d,J＝8 Hz,8H),1.72(m,4H),1.59(m,4H),1.40(m,4H),1.31(m,4H)； ESI-MSm/z853.3(M+H+).。
实施例7.
制得(S)-4-(3-(2-((2-(1-羧基-2-(1H-咪唑-3-基)乙基)-1,3- 邻苯二甲亚酰-4-基)氧基)乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-呫吨-9- 基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000171
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝12.94(s,1H),10.54(s,1H),10.14(s, 2H),8.28(s,1H),7.86(s,1H),7.79(s,1H),7.76(s,1H),7.73(s,1H), 7.71(d,J＝8Hz,1H),7.57(s,1H),7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),6.78 (d,J＝8Hz,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H),4.15 (s,2H),3.56(s,4H)；ESI-MSm/z735.2(M+H+).。
实施例8.
制得(S)-4-(3-(2((2-(1-羧基-2-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H) -基)乙基)-1,3-二恶吲哚啉-4-基)氧基)乙基)硫脲基)-2-(6- 羟基-3-氧代-3H-黄嘌呤-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000181
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝11.23(s,1H),10.75(s,1H),10.14(s, 2H),8.28(s,1H),7.79(s,1H),7.76(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.44(d.J＝8Hz,1H),7.40(d.J＝8Hz,1H),6.67(s,2H),6.60 (s,2H),6.57(s,2H),5.77(d.J＝8Hz,1H),5.04(s,1H),4.15(s,2H),3.22 (s,4H)；ESI-MSm/z778.2(M+H+).。
实施例9.
制得(S)-4-(3-(2-((2-(2-(1H-苯并[d]咪唑-3-基)-1-羧乙基) -1,3-二恶吲哚啉-4-基)(氧)乙基)硫脲基-2-(6-羟基-3-氧代-3H-黄 嘌呤-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000182
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.89(s,1H),10.14(s,2H),8.28(s, 1H),8.28(s,1H),7.79(s,1H),7.76(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.40(d.J＝8Hz,1H),7.25(d,J＝8Hz,1H),7.00(s,2H),6.90 (s,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H),4.15(s,2H), 3.12(s,4H)；ESI-MSm/z784.3(M+H+).。
实施例10.
制得(S)-4-(3-(2-((2-(2-(1H-苯并[d]咪唑-3-基)-1-羧乙基) -1,3-二恶吲哚啉-4-基)(氧)乙基)硫脲基-2-(6-羟基-3-氧代-3H- 黄嘌呤-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000191
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝11.54(s,1H),10.14(s,2H),8.28(s, 1H),7.92(s,1H),7.79(s,1H),7.76(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.25(d,J＝8Hz,1H),7.14(d,J＝8Hz, 1H),7.00(s,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H), 4.15(s,2H),3.99(s,4H)；ESI-MSm/z786.2(M+H+).。
实施例11.
制得(S)-4-(3-(2-((2-(2-(5-溴-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1-羧乙 基)-1,3-二恶吲哚啉-4-基)(氧)乙基)硫脲基-2-(6-羟基-3-氧代-3H- 黄嘌呤-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000192
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.23(s,1H),10.14(s,2H),8.28(s, 1H),7.79(s,1H),7.76(s,1H),7.73(s,1H),7.60(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.30(s,1H),7.22(d,J＝8Hz,1H),7.13 (d,J＝8Hz,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H),4.15 (s,2H),3.78(s,4H)；ESI-MSm/z862.1(M+H+).。
实施例12.
制得(S)-4-(3-(2-((2-(2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1-羧乙基) -1,3-二恶吲哚啉-4-基)(氧)乙基)硫脲基-2-(6-羟基-3-氧代-3H-黄 嘌呤-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000201
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.27(s,1H),10.14(s,2H),9.94(s, 2H),8.28(s,1H),8.18(s,1H),8.03(s,1H),7.79(s,1H),7.76(s,1H), 7.73(s,1H),7.57(s,1H),7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),6.67(s, 2H)，6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H),4.15(s,2H),2.98(s,4H)； ESI-MSm/z801.2(M+H+).。
实施例13.
制得(S)-4-(3-(2-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-二 恶吲哚啉-4-基)-氮烷基)乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-黄 嘌呤-9-基)苯甲酸
Figure BDA0002166889110000202
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.56(s,1H),10.14(s,2H),9.93(s, 1H),8.28(s,1H),7.86(s,1H),7.79(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.34(s,1H),7.25(d,J＝8Hz,1H), 7.00(s,2H),6.90(s,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s, 1H),4.15(s,2H),3.12(s,4H)；ESI-MSm/z782.2(M+H+).。
实施例14.
制得(S)-5-(3-(3-(2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙基)-1,3-二 恶吲哚啉-4-基)丙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-黄嘌呤-9-基) 苯甲酸
Figure BDA0002166889110000211
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.90(s,1H),10.14(s,2H),9.93(s, 1H),8.28(s,1H),7.86(s,1H),7.79(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H), 7.47(s,1H),7.40(d,J＝8Hz,1H),7.34(s,1H),7.25(d,J＝8Hz,1H),7.00 (s,2H),6.90(s,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H), 4.15(s,2H),3.52(s,4H),1.97(s,2H)；ESI-MSm/z781.3(M-H+).。
实施例15.
制得(S)-N-(9-(2-羧基-5-(3-(2-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚 -3-基)乙基)-1,3-二恶吲哚啉-4-基)氧基)乙基)硫脲基)苯基)-6- (二乙基氨基)-3H-呫吨-3-亚基)-N-乙基乙烷胺
Figure BDA0002166889110000212
1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ＝10.64(s,1H),9.93(s,1H),8.28(s, 1H),7.86(s,1H),7.79(s,1H),7.73(s,1H),7.57(s,1H),7.47(s,1H), 7.40(d,J＝8Hz,1H),7.34(s,1H),7.25(d,J＝8Hz,1H),7.00(s,2H),6.90 (s,1H),6.67(s,2H),6.60(s,2H),6.57(s,2H),5.04(s,1H),4.15(s,2H), 4.07(s,4H),3.52(s,4H),3.34(s,4H),1.41(s,6H)，1.32(s,6H)； ESI-MSm/z894.5(M-H+).。
实施例16.
荧光探针与DNMT1的结合能力SPR实验结果：
实验操作：在pH分别为5.5、5.0、4.5和4.0的10mM醋酸钠缓 冲液与终浓度为50.7μg/mL的DNMT1蛋白的结合能力进行检测，根 据结果选择最佳偶联pH值，在该浓度下将DNMT1蛋白与CM5芯 片进行偶联，再将DNMT1蛋白与小分子荧光探针的亲和力测定，以 DNMT1抑制剂RG108为阳性对照，对亲和力测定数据进行分析；
实验结果：DNMT1蛋白与CM5芯片的最佳偶联pH值为5.0。 小分子荧光探针与DNMT1之间的相互作用如表1和图1-2所示；
结果显示：所有测试小分子荧光探针与DNMT1之间的相互作用 力显著高于RG108与DNMT1之间的相互作用力，高出近两个数量 级。
表1：小分子荧光探针与DNMT1酶之间的结合能力
Figure BDA0002166889110000221
Figure BDA0002166889110000231
实施例17.小分子荧光探针在HeLa细胞中的显像
实验操作：以实施例1为例，小分子荧光探针与构建DNMT1高 表达Hela细胞(高出3.5倍)和普通Hela细胞共孵育4h，并以DAPI 染色后，共聚焦荧光显微镜拍照，以ImageJ软件进行定量分析；
实验结果：从直观的共聚焦图片以及间接的定量参数来看，该探 针在DNMT1高表达的细胞中的富集能力显著高于普通细胞90％以 上，如图3和表2所示，结果表明，所述小分子荧光探针可用于细胞 内DNMT1含量的定性和定量检测。
表2.实施例1-6在不同细胞的细胞核中荧光强度比较
Figure BDA0002166889110000232
实施例18.小分子荧光探针在临床病理细胞中的显像
以实施例1中的(S)-5-(3-(3-((2-(1-羧基-2-(1H-吲哚-3-基)乙 基)-1,3-邻苯二甲亚酰-4-基)氧基)乙基)硫脲基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H- 呫吨-9-基)苯甲酸为例，进行与临床二级病变的宫颈脱落细胞和正常 宫颈脱落细胞共孵育4h后，并以DAPI染色后以ImageJ进行定量； 实验结果显示：子宫颈病变细胞的DNMT1表达量高于正常细胞，也高 于其他的癌变细胞；将该探针应用于临床上发生了二级病变的宫颈细 胞，结果如图4和表3所示，探针在细胞核中的聚集程度远高于正常 宫颈脱落细胞，高出了360％；结果表明本探针能实现靶向DNMT1的 能力，并且具有临床应用价值，可实现在医疗中对于宫颈病变细胞病变程度的预测和诊断。
表3.实施例1的荧光探针在不同临床细胞的细胞核中荧光强度比较
Figure BDA0002166889110000241

Claims (7)

1.一类具有下述通式1结构的荧光探针，或其药学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药：
Figure FDA0002166889100000011
其中，
L选自取代或未取代的C1-10亚烃基、取代或未取代的含杂原子的C1-10杂亚烃基，当L为取代或未取代的含杂原子的C1-10杂亚烃基时，所述的杂原子选自氧、氮和硫中的一个或多个；当杂原子为多个时，杂原子相同或不同；
环A选自苯环，含1-3个杂原子的五元芳香杂环，含1-3杂原子的六元芳香杂环，含6-14个原子的稠合芳香环或者芳香杂环，含3-8个碳原子的脂肪环、或者插入杂原子的含3-8个碳原子的脂肪环；当环中含有杂原子时，杂原子选自氧、氮和硫中的一个或多个；当杂原子为多个时，杂原子相同或不同；
X选自碳原子，氮原子，氧原子或者硫原子；
R1选自独立的氢、卤素、羟基、氨基，硝基，氰基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代或未取代的含1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的组合；
R2选自氢，取代或未取代的含1-10个碳原子的烷基，取代或未取代的含3-6个碳原子的环烷基，取代或未取代的含2-10个碳原子的烯基；
R3选自独立的氢、卤素、羟基、氨基，硝基，氰基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代或未取代的含1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的组合；
R4选自氧，连有一个取代基的亚胺基或连有两个取代基的季铵；
R5选自羟基，连有一个取代基的氨基或连有两个取代基的氨基；
所述的取代的C1-10亚烃基，所述的取代的含杂原子的C1-10的杂亚烃基，所述的取代的C1-6烃基、取代的含1-6个碳原子的烷基、取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代的含1-6个碳原子的酰氨基、取代的含1-10个碳原子的烷基，取代的含3-6个碳原子的环烷基，取代的含2-10个碳原子的烯基中的取代是指被卤素、苯基和C1-10烷基中的一个或多个所取代，当存在多个取代基时，所述的取代基相同或不同。
2.如权利要求1所述的通式1结构的荧光探针，或其药学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药，其特征在于，
L选自取代或未取代的C1-10亚烃基；
和/或，环A选自苯环，吲哚环，异吲哚环，嘧啶环，嘌呤环，呋喃环，噻酚环，吡咯环，吡啶环，恶唑环，异恶唑环，噻唑环，吡唑环，咪唑环，萘环，6-13个原子的稠合芳香杂环；当环中含有杂原子时，杂原子选自氧、氮和硫中的一个或多个；当杂原子为多个时，杂原子相同或不同；
和/或，X选自碳原子，氮原子，氧原子；
和/或，R1选自独立的氢、卤素、羟基、氨基，硝基，氰基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代或未取代的含1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的组合；
和/或，R2选自氢，甲基，取代或未取代的含1-10个碳原子的烷基；
和/或，R3选自独立的氢、卤素、羟基、氨基，硝基，氰基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷基、取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氧基，取代或未取代的含1-6个碳原子的烷氨基，取代或未取代的含1-6个碳原子的酰氨基，或者以上基团的组合；
和/或，R4选自氧，连有一个取代基的亚胺基或连有两个取代基的季铵；
和/或，R5选自羟基，连有一个取代基的氨基或连有两个取代基的氨基。
3.如权利要求1或2所述的通式1结构的荧光探针，或其药学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药，其特征在于，
所述的式1所示荧光探针选自以下任一所示化合物：
Figure FDA0002166889100000041
Figure FDA0002166889100000051
4.权利要求1所述的通式1结构的荧光探针、或其药学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药在制备用于各类细胞内DNA甲基转移酶1(DNMT1)定性定量检测制剂中的应用。
5.权利要求1所述的通式1结构的荧光探针、或其药学上可以接受的盐、其立体异构体或互变异构体、或前药在用于制备与DNMT1高表达相关疾病的诊断或预测的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的与DNMT1高表达相关疾病为恶性肿瘤。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的与DNMT1高表达相关疾病为宫颈癌，口腔粘膜癌，皮肤癌。
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