CN112385826A - 瓜拿纳发酵液的制备方法及瓜拿纳发酵液的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种瓜拿纳发酵液的制备方法及瓜拿纳发酵液的用途，瓜拿纳发酵液的制备方法包括提供培养液、将培养液及多个菌种进行发酵7日以得到发酵原液，以及调整发酵原液以形成瓜拿纳发酵液。上述培养液包括以1重量份的瓜拿纳及10重量份的水所形成的瓜拿纳汁液及瓜拿纳汁液总重10％的葡萄糖。上述多个菌种包括相对于培养液为0.1％的酵母菌、相对于培养液为0.05％的乳酸菌及相对于培养液为5％的醋酸菌。
Description
技术领域
本发明关于一种发酵液，特别是关于一种瓜拿纳发酵液的制备方法及其用途。
背景技术
自有机及天然的饮食概念兴起后，生技公司及食品业者积极投入关于天然植物的相关产品的研发。为使植物相关产品对身体健康帮助有科学验证的基础，植物的活性成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。而原产于巴西亚马逊盆地地区的瓜拿纳(Guarana，学名为Paullinia cupana)亦成为研究开发的对象之一。
瓜拿纳(Guarana，学名为Paullinia cupana)，又名巴西香可可，是无患子科泡林藤属(又称保力藤属)的爬藤植物。瓜拿纳分布在巴西、秘鲁、哥伦比亚、委内瑞拉等亚马逊盆地区域。目前主要种植于巴西亚马逊州及巴西巴伊亚州。
瓜拿纳为三叶、其花小而白，且其果实具有红色的外壳，当果实成熟时会露出白色的果肉和种子。瓜拿纳的果实含有大量的咖啡因，常被用来制作糖浆、食品，并再加工成饮料。
自15世纪起，瓜拿纳便作为亚马逊人所使用的传统药材，其主要作为体能增强剂使用。在葡萄牙，自1990年代末期起，瓜拿纳被用来制作为饮料。
发明内容
在一些实施例中，一种瓜拿纳发酵液的制备方法，包括提供培养液、将培养液及多个菌种进行发酵7日以得到发酵原液，以及调整发酵原液以形成瓜拿纳发酵液。上述培养液包括以1重量份的瓜拿纳(Paullinia cupana)及10重量份的水所形成的瓜拿纳汁液及瓜拿纳汁液总重10％的葡萄糖。上述多个菌种包括相对于培养液为0.1％的酵母菌、相对于培养液为0.05％的乳酸菌及相对于培养液为5％的醋酸菌。
其中，该将该培养液及该多个菌种进行发酵的步骤包括：将该酵母菌于该培养液内发酵1日后形成第一初发酵液，其中该酵母菌为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；添加该乳酸菌于该第一初发酵液内发酵1日后形成第二初发酵液，其中该乳酸菌为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)；添加该醋酸菌于该第二初发酵液内发酵5日后形成第三初发酵液，其中该醋酸菌为乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)；以及过滤该第三初发酵液以得到该发酵原液。
其中，过滤该第三初发酵液的步骤包括：在60℃下减压浓缩及以200mesh过滤该第三初发酵液。
其中，该提供该培养液的步骤包括：混合该瓜拿纳及该水以形成瓜拿纳基液；将该瓜拿纳基液于95℃下浸提1小时以得到该瓜拿纳汁液；以及将该瓜拿纳汁液与该葡萄糖混合以得到该培养液。
其中，调整该发酵原液以形成该瓜拿纳发酵液的步骤为调整该发酵原液的糖度以形成该瓜拿纳发酵液。
其中，该瓜拿纳发酵液的总多酚含量为1600μg/ml以上。
在一些实施例中，一种瓜拿纳发酵液的制备方法所制得瓜拿纳发酵液用于制备减少受体的脂肪形成的组合物的用途，其中瓜拿纳发酵液用以提升脂肪分解酶(ATGL)表现量以减少脂肪形成。
在一些实施例中，一种瓜拿纳发酵液的制备方法所制得瓜拿纳发酵液用于制备减少受体的脂肪形成的组合物的用途，其中瓜拿纳发酵液用以减少脂质油滴的生成以减少脂肪形成。
在一些实施例中，一种以上述的瓜拿纳发酵液的制备方法所制得瓜拿纳发酵液用于制备减少受体的脂肪形成的组合物的用途，其中瓜拿纳发酵液用以降低淀粉分解酶及α-葡萄糖苷酶的活性以及减少淀粉分解成醣类后的热量吸收以减少脂肪形成。
综上所述，根据任一实施例的瓜拿纳发酵液的制备方法，其能制备瓜拿纳发酵液。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液可用于制备减少脂肪形成的组合物。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液的制备方法能提高所制得的瓜拿纳发酵液的总多酚含量。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液用以提升脂肪分解酶的表现量，进而减少受体的脂肪形成。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液用以减少脂质油滴的生成，进而减少脂肪形成。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液用以降低淀粉分解酶的活性以及减少淀粉分解成醣类后的热量吸收，进而减少脂肪形成。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1是瓜拿纳发酵液的制备流程图；
图2是图1步骤S100的细部的流程图；
图3是图1步骤S300的细部的流程图；
图4是瓜拿纳发酵液的多酚含量测量结果图；
图5是淀粉分解酶的酵素活性相对测量结果图；
图6是α-葡萄糖苷酶的酵素活性相对测量结果图；
图7是ATGL基因的表现倍率结果图；
图8是油红O染色照片；
图9是脂质油脂含量的相对测量结果图；
图10是第0周及第4周的体重数据结果图；以及
图11是第0周及第4周的腰围数据结果图。
其中，附图标记：
S100-S500:步骤
具体实施方式
关于本文中所使用的符号「％」通常是指重量百分浓度，而符号「vol％」通常是指体积百分浓度。关于本文中所使用的「瓜拿纳」通常是指瓜拿纳(Paullinia cupana)的果实(包含种子)，其果实大小为1至1.5厘米，且其为完熟果实。
请参阅图1。在一些实施例中，瓜拿纳汁液的制备方法下列步骤：提供培养液(步骤S100)、将培养液及多个菌种进行发酵7日以得到发酵原液(步骤S300)，以及调整发酵原液以形成瓜拿纳发酵液(步骤S500)。其中，培养液包括以1重量份的瓜拿纳(Paulliniacupana)及10重量份的水所形成的瓜拿纳汁液及瓜拿纳汁液总重10％的葡萄糖。多个菌种包括相对于培养液为0.1％的酵母菌、相对于培养液为0.05％的乳酸菌及相对于培养液为5％的醋酸菌。
在一些实施例中，酵母菌可以是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中，乳酸菌可以是胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)或植物乳杆菌。在一些实施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)。
请参阅图2。在一些实施例中，步骤S100包括下列步骤：混合瓜拿纳及水以形成瓜拿纳基液(步骤S110)、将瓜拿纳基液于95℃下浸提1小时以得到瓜拿纳汁液(步骤S120)，以及将瓜拿纳汁液与葡萄糖混合以得到培养液(步骤S130)。于此，瓜拿纳基液中，瓜拿纳与水的比例为1：10。
在步骤S110的一些实施例中，与水混和的瓜拿纳为颗粒状。换言之，在混和瓜拿纳及水之前，瓜拿纳需先打碎以形成瓜拿纳颗粒，以便于与水充分混合。
在一些实施例中，于此所选用的瓜拿纳可为包含红色外壳、白色果肉及种子的全果，全果果实大小为1至1.5厘米，且为完熟果实。换言之，瓜拿纳全果连果壳及种子一起打碎成瓜拿纳颗粒。
在步骤S120的一些实施例中，瓜拿纳汁液的浸提方式是通过将瓜拿纳浸泡在恒温为95℃的水中静置1小时。在步骤S120的另一些实施例中，瓜拿纳汁液的浸提方式是通过将瓜拿纳浸泡在水中后将瓜拿纳与水置于95℃的环境下静置1小时。
在一些实施例，瓜拿纳汁液以其总重10％的葡萄糖调整其糖度为10°Bx至10.4°Bx以形成培养液。于此，糖度为10°Bx至10.4°Bx的培养液可以确保后续发酵的顺利进行，并确保菌种有足够的养份消耗。
在一些实施例中，所获得的培养液可采取自然降温的方式冷却至室温，以利于后续将培养液与多种菌种进行发酵。
在一些实施例中，培养液的pH值为6.3±2。
请参阅图3。在一些实施例中，步骤S300包括下列步骤：首先，将酵母菌于培养液内发酵1日后形成第一初发酵液(步骤S310)。换言之，0.1％的酵母菌与培养液混合成的第一混合液进行发酵1日后形成第一初发酵液。其中，酵母菌的添加量是相对于培养液总重的1％。在一些实施例中，第一混合液是在28℃至37℃下进行发酵。并且，在步骤S310的一实施态样中，酵母菌为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
于第一初发酵液形成后，再添加乳酸菌于第一初发酵液内发酵1日后形成第二初发酵液(步骤S330)。换言之，0.05％的乳酸菌与第一初发酵液混合成的第二混合液进行发酵1日后形成第二初发酵液。其中，乳酸菌的添加量是相对于培养液总重的0.05％。在一些实施例中，第二混合液是在28℃至37℃下进行发酵。并且，在步骤S330的一实施态样中，乳酸菌为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)。
于第二初发酵液形成后，再添加醋酸菌于第二初发酵液内发酵5日后形成第三初发酵液(步骤S350)。换言之，5％的醋酸菌与第二初发酵液混合成的第三混合液进行发酵5日以形成第三初发酵液。其中，醋酸菌的添加量是相对于培养液总重的5％。在一些实施例中，第三混合液是在28℃至37℃下进行发酵。并且，在步骤S350的一实施态样中，醋酸菌为乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)。并且，第三初发酵液的pH值为3至4。在一些实施例中，第三初发酵液的pH值为3.4。
于第三初发酵液形成后，过滤第三初发酵液以得到发酵原液(步骤S370)。在步骤S370的一实施态样中，第三初发酵液的过滤步骤包括在60℃下减压浓缩，及以200目数(mesh)的网孔的滤网过滤第三初发酵液以得到发酵原液。于此，发酵原液的pH值为3至4。在一些实施例中，发酵原液的pH值为3.4。
再请参阅图1。再得到发酵原液后，调整发酵原液以形成瓜拿纳发酵液(步骤S500)。举例来说，通过调整发酵原液的糖度或/及浓度可形成瓜拿纳发酵液。在步骤S500的一实施态样中，调整发酵原液的糖度以形成瓜拿纳发酵液。在一些实施例中，通过添加相对于发酵原液总重60％的寡糖至发酵原液以形成瓜拿纳发酵液。于此，瓜拿纳发酵液的糖度为40°Bx。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液的总多酚(total polyphenol)含量为1600微克/毫升(μg/ml)以上。换言之，每1毫升的瓜拿纳发酵液中含有1600微克以上的总多酚含量。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液具有提升脂肪分解酶基因的表现量的作用。其中，脂肪分解酶可以为脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液具有减少脂质油滴的生成的作用。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液具有降低淀粉分解酶(Amylase)的活性的作用。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液具有降低α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的活性的作用。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液具有减少受体体内的淀粉分解成醣类后的热量吸收的作用。在一些实施例中，瓜拿纳发酵液能通过下列一种或多种细胞层面的作用来达成减脂及/或减少热量吸收的作用：提升脂肪分解酶(ATGL)基因的表现量、减少脂质油滴生成、降低淀粉分解酶的活性以及降低α-葡萄糖苷酶的活性。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液能用于制备提升脂肪分解酶(ATGL)基因的表现量的组合物。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液能用于制备减少脂质油滴生成的组合物。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液能用于制备降低淀粉分解酶(Amylase)及/或α-葡萄糖苷酶的活性的组合物。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液能用于制备减少受体体内的淀粉分解成醣类后的热量吸收的组合物。
在一些实施例中，瓜拿纳发酵液能用于制备减少受体的脂肪形成的组合物。
在一些实施例中，前述的任一组合物可为医药品。换言之，此医药品包含有效含量的瓜拿纳发酵液。
在一些实施例中，前述的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于经肠地道、非经肠地道(parenterally)、口服的、或局部地(topically)投药剂型。
在一些实施例中，经肠道或口服的投药剂型可为，但不限于，锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)或类似之物。在一些实施例中，非经肠地道或局部地投药剂型可为，但不限于，注射品(injection)、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(externalpreparation)或类似之物。在一些实施例中，注射品的投药方式可为皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)或病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，前述的医药品可包含被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。在一些实施例中，医药上可接受的载剂可为下列载剂中一种或多种：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似之物。关于选用的载剂的种类与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在一些实施例中，作为医药上可接受的载剂的溶剂可为水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、或含有醇的水性溶液(aqueous solutioncontaining alcohol)。
在一些实施例中，前述的任一组合物可为食用组合物。换言之，食用组合物包含特定含量的瓜拿纳发酵液。在一些实施例中，前述的食用组合物可为食品产品或食品添加物(food additive)。在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
在一些实施例中，前述的任一组合物可为化妆品或保养品。换言之，化妆品或保养品包含特定含量的瓜拿纳发酵液。
在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。在一些实施例中，前述的化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。
范例一：瓜拿纳发酵液的制备
将瓜拿纳全果(包含果壳、果肉及果核)敲碎成瓜拿纳颗粒后，取1重量份的瓜拿纳颗粒及10重量份的水混合成瓜拿纳基液。接着，将瓜拿纳基液于95℃下浸提1小时以得到瓜拿纳汁液。将瓜拿纳汁液与其总重10％的葡萄糖混合以形成作为发酵用的培养液。并且，培养液的糖度为10.4°Bx且pH值为6.3。
将培养液冷却至室温(25℃)并将冷却后的培养液置于发酵桶中，接着添加相对于培养液总重为0.1％的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(BCRC)且寄存编号BCRC20271)至发酵桶内的培养液中以形成第一混合液。将第一混合液于30℃进行发酵1日以形成第一初发酵液。
于发酵桶内的第一初发酵液中添加相对于培养液总重为0.05％的胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum TCI378，购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(BCRC)且寄存编号BCRC910760)以形成第二混合液。将第二混合液于30℃进行发酵1日以形成第二初发酵液。
于发酵桶内的第二初发酵液中添加相对于培养液总重为5％的乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti，购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(BCRC)且寄存编号11688)以形成第三混合液。将第三混合液于30℃进行发酵5日以形成第三初发酵液。接着，确认第三初发酵液的酸碱值是否为pH3.4以确认发酵结束时间点。
将发酵结束的第三初发酵液于60℃下进行以减压浓缩机进行减压浓缩，并200目数(mesh)的网孔的滤网过滤第三初发酵液以得到发酵原液。并且，添加相对于发酵原液总重60％的异麦芽寡糖至发酵原液中，以调整发酵原液的糖度至40°Bx以形成瓜拿纳发酵液。
范例二：瓜拿纳水萃液的制备
将瓜拿纳全果(包含果壳、果肉及果核)敲碎成瓜拿纳颗粒后，取1重量份的瓜拿纳颗粒及10重量份的水混合成瓜拿纳基液。接着，将瓜拿纳基液于95℃下浸提1小时以得到瓜拿纳水萃原液。将瓜拿纳水萃原液与其总重10％的葡萄糖混合以形成瓜拿纳水萃液。并且，瓜拿纳水萃液的糖度为10.4°Bx且pH值为6.3。
实验一：总多酚含量测试
1-1.标准曲线
秤取10.0毫克(mg)的没食子酸(Gallic acid)置于10mL容量瓶中，然后以水(H2O)定量至10mL，以得到没食子酸的储备溶液(stock solution)。将没食子酸的储备溶液稀释10倍，即100μL没食子酸的储备溶液加900μL的水，以得到100μg/mL没食子酸的初始溶液(即含1000ppm的没食子酸)。然后，依据下表1配置0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、及100μg/mL的没食子酸的标准溶液，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至玻璃试管中。加入500μL的福林酚试剂(Folin-Ciocalteu's phenol reagent，购自Merck)至各玻璃试管内与标准溶液混合均匀并静置3分钟后，再加入400μL的7.5％碳酸钠(sodiumcarbonate)混合均匀后反应30分钟以得到标准反应溶液。取200μL的标准反应溶液至96孔盘中，并测量其在750nm下的吸光值，以获得标准曲线。
表1
| 标准溶液(μg/mL) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 初始溶液(μL) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 水(μL) | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
1-2.实验结果
将实验组的测试样品(即范例一的瓜拿纳发酵液)及对照组的测试样品(即范例二的瓜拿纳水萃液)分别以水稀释10倍，并取100微升(μL)至离心管中。在含有稀释10倍的测试样品的离心管中加入500μL的福林酚试剂并与测试样品混合均匀并静置3分钟后，再加入400μL的7.5％碳酸钠混合均匀后反应30分钟以得到待测反应溶液。将装有待测反应溶液的离心管进行震荡以确保无气泡后，取200μL的待测反应溶液至96孔盘中，并测量待测反应溶液于750nm下的吸光值。
接着，利用标准曲线与内插法将待测反应溶液的吸光值换算成总多酚含量。于此，可得到实验组(即瓜拿纳发酵液)的总多酚含量为1617.45μg/mL，且对照组(即瓜拿纳水萃液)的总多酚含量为728.09μg/mL，如图4所示。
由此可知，瓜拿纳通过微生物发酵后，可增加总多酚含量2.2倍。即，相对于瓜拿纳水萃液，瓜拿纳发酵液能提升抗氧化活性。
实验二：淀粉分解酶的酵素活性测试
2-1.溶剂配置
含有6mM氯化钠的0.02穆尔浓度(M)磷酸钠缓冲溶液(Sodium phosphate buffer)(以下简称NaCl-Pi缓冲溶液)：将0.7356克的磷酸一氢钠(购自J.T.Baker，编号3828-01)、0.5492克的磷酸二氢钠(购自Sigma，编号04270)及1.7532克的氯化钠(购自第一化工，编号C4B07)混合并溶于500毫升的水(H2O)中，以配置含有6mM氯化钠且酸碱值(pH)为6.3的NaCl-Pi缓冲溶液。
2当量浓度(N)氢氧化钠(NaOH)溶液：以8克氢氧化钠(购自Macron，编号7708-10)溶于100毫升水中，以配置2N的氢氧化钠溶液。
二硝基水杨酸颜色试剂(Dinitrosalicylic acid color reagent，以下称终止剂)：将1克3,5-二硝基水杨酸(购自Sigma，编号D0550)溶入50毫升去离子水中，再缓慢加入30克酒石酸钾钠(sodium potassium tartrate tetrahydrate，购自Sigma，编号32312)及缓慢加入20毫升2N氢氧化钠溶液，并以去离子水定量至100毫升。于此，可得到终止剂。其中，终止剂的保存期限为两周之内。
1％淀粉溶液：秤取1克淀粉至100毫升NaCl-Pi缓冲溶液并缓慢加热使淀粉完全溶解于NaCl-Pi缓冲溶液中，待加热后的含有淀粉的NaCl-Pi缓冲溶液降至室温后，以水定量至100毫升。于此，可得到1％淀粉溶液，并储存于4℃环境。此外，进行酵素活性测试前至少要将1％淀粉溶液置于室温下4至5分钟。
α-淀粉分解酶(α-amylase)溶液(5单位/毫升)：将0.0096克α-淀粉分解酶溶解于25毫升NaCl-Pi缓冲溶液。于此，可得到每毫升5单位的α-淀粉分解酶溶液。一般而言，α-淀粉分解酶溶液储存于4℃环境，并可存放2至3天。
2-2.测试流程
依据下表2进行各测试组别的淀粉分解酶的酵素活性测试。其中，测试组别中实验组(0分钟)、对照组(0分钟)及控制组(0分钟)代表α-淀粉分解酶并无与淀粉反应的测试组别(以下称反应起始点(0分钟))，而实验组(10分钟)、对照组(10分钟)及控制组(10分钟)代表α-淀粉分解酶与淀粉进行10分钟反应的测试组别(以下称反应终止点(10分钟))。
表2
于表2中，瓜拿纳发酵液及瓜拿纳水萃液均是以水进行稀释，且各测试组别皆进行三重复实验。反应酵素为5单位/毫升的α-淀粉分解酶溶液。反应酵素作用的反应基质为1％淀粉溶液。换言之，酵素(即，α-淀粉分解酶)作用的基质为淀粉。
依照表2，首先，分别取200μL的测试样品(即，5倍稀释的瓜拿纳发酵液、5倍稀释的瓜拿纳水萃液及NaCl-Pi缓冲溶液)至离心管中，接着分别于各离心管中加入200μL的α-淀粉分解酶溶液(5单位/毫升)，并将装有测试样品及α-淀粉分解酶溶液的离心管进行震荡使测试样品及α-淀粉分解酶溶液混合均匀以形成待反应溶液，并将装有待反应溶液的离心管置于25℃环境下反应10分钟。
接着，将反应起始点(0分钟)的三组测试组别分别加入400μL的终止剂至离心管中与待反应溶液混合均匀，再分别加入200μL的1％淀粉溶液并于25℃下静置10分钟以形成未反应溶液。换言之，在反应起始点(0分钟)的测试组别中，α-淀粉分解酶不会与淀粉产生反应。
而反应终止点(10分钟)的三组测试组别则分别加入200μL的1％淀粉溶液至离心管中，使1％淀粉溶液与待反应溶液混合均匀以形成混合溶液。装有混合溶液的离心管置于25℃下反应10分钟以形成反应溶液，然后再加入400μL的终止剂与反应溶液混合均匀，以停止淀粉与α-淀粉分解酶反应。
然后，将反应起始点(0分钟)的三组测试组别(即装有未反应溶液的离心管)及反应终止点(10分钟)的三组测试组别(即装有反应溶液的离心管)置于沸水(100℃)中反应5分钟，并将6组测试组别的离心管冷却至室温(25℃)，以形成6组测试组别的待测溶液。
从离心管中分别取出150μL待测溶液与850μL水混合以稀释待测溶液。接着取200μL稀释后的待测溶液至96孔盘中，并测量其在540nm下的吸光值。
2-3.实验结果
根据下列公式(1)计算各测试组别相对于控制组的淀粉分解酶的酵素活性百分比(％)，如图5所示。换言之，是将控制组的淀粉分解酶的酵素活性百分比视为100％，来计算实验组与对照组的淀粉分解酶的酵素活性百分比(％)。
公式(1)
其中，％α-Amylase活性代表淀粉分解酶酵素活性百分比(％)；A540nm(Sample10min-Sample 0min)代表反应终止点(10分钟)的测试组别在540nm下的吸光值与反应起始点(0分钟)的测试组别在540nm下的吸光值之间的差值，且此测试组别为实验组或对照组。A540nm(Control 10min-Control 0min)代表反应终止点(10分钟)的控制组在540nm下的吸光值与反应起始点(0分钟)的控制组在540nm下的吸光值之间的差值。
请参考图5。相较于控制组(酵素活性视为100％)，实验组的淀粉分解酶酵素活性百分比为20.9％。换言之，实验组的淀粉分解酶的酵素活性百分比相对于控制组明显下降79.1％(约80％)。并且，相较于控制组，对照组的淀粉分解酶的酵素活性百分比为77.7％。换言之，对照组的淀粉分解酶的酵素活性百分比相对于控制组下降22.3％。由此可知，瓜拿纳发酵液对于淀粉分解酶的酵素活性的抑制能力明显高于瓜拿纳水萃液对于淀粉分解酶酵素活性的抑制能力。
实验三：α-葡萄糖苷酶的酵素活性抑制测试
3-1.溶剂配置
0.1穆尔浓度(M)磷酸钠缓冲溶液(Sodium phosphate buffer，以下简称Pi缓冲溶液)：将4.7283克的磷酸一氢钠(购自J.T.Baker，编号3828-01)及2.0028克的磷酸二氢钠(购自Sigma，编号04270)混合并溶于400毫升的逆渗透水(RO水)中，并以定量瓶定量至500毫升，以得到酸碱值(pH)为7.0的Pi缓冲溶液。
2.5mM对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(p-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside,PNPG)：秤取0.0377克PNPG以逆渗透水(RO水)定量至100毫升。
0.2M碳酸钠(Na2CO3)：秤取2.1198克碳酸钠以RO水定量至100毫升，作为α-葡萄糖苷酶的终止剂。
0.2单位/毫升(units/ml)α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，购自sigma ChemicalCo.(St.Louis,MO,G5003-100UN))溶液：取3.85毫克的固态α-葡萄糖苷酶以2.0毫升的0.1MPi缓冲溶液溶解，以得到50U/毫升的α-葡萄糖苷酶原液。接着，取0.1毫升50U/毫升的α-葡萄糖苷酶原液并以RO水定量至25毫升，即可得到0.2U/毫升α-葡萄糖苷酶溶液。其中每毫克固态的α-葡萄糖苷酶的活性为26单位(units)。
3-2.测试流程
依据下表3进行各测试组别的淀粉分解酶的酵素活性测试。其中，测试组别中实验组(0分钟)、对照组(0分钟)及控制组(0分钟)代表α-葡萄糖苷酶并无与PNPG反应的测试组别(以下称反应起始点(0分钟))，而实验组(5分钟)、对照组(5分钟)及控制组(5分钟)代表α-葡萄糖苷酶与PNPG进行5分钟反应的测试组别(以下称反应终止点(5分钟))。
表3
于表3中，范例一的瓜拿纳发酵液及范例二的瓜拿纳水萃液均是以水进行稀释，且各测试组别皆进行三重复实验。反应酵素为0.2单位/毫升α-葡萄糖苷酶溶液。反应酵素作用的反应基质为2.5mM PNPG。
依照表3，首先，分别取160μL的测试样品(即，5倍稀释的瓜拿纳发酵液、5倍稀释的瓜拿纳水萃液及Pi缓冲溶液)至96孔盘中，接着分别于各孔中加入20μL Pi缓冲溶液以形成待反应溶液。
接着，将反应起始点(0分钟)的三组测试组别分别加入20μL的Pi缓冲溶液至对应的孔中与待反应溶液混合均匀并于25℃下反应10分钟。于反应10分钟后，于每孔中加入20μL的2.5mM PNPG，并将待反应溶液、Pi缓冲溶液及PNPG混合均匀后置于37℃下反应5分钟以形成0分钟组反应溶液。于0分钟组反应溶液中加入80μL终止剂，以中止α-葡萄糖苷酶的活性。接着，于0分钟组反应溶液与终止剂混合均匀后，测量其在405nm下的吸光值。
而反应终止点(5分钟)的三组测试组别则分别加入20μL的0.2单位/毫升α-葡萄糖苷酶溶液至对应的孔中与待反应溶液混合均匀，接着，将反应终止点(5分钟)的三组测试组别置于25℃下反应10分钟，以活化α-葡萄糖苷酶。于反应10分钟后，再于每孔中加入20μL的2.5mM PNPG，使活化的α-葡萄糖苷酶与PNPG作用。将待反应溶液、α-葡萄糖苷酶溶液及PNPG混合均匀后置于37℃下反应5分钟以形成5分钟组反应溶液。于5分钟组反应溶液中加入80μL终止剂，以中止α-葡萄糖苷酶的活性。接着，5分钟组反应溶液与终止剂混合均匀后，测量其在405nm下的吸光值。
3-3.实验结果
根据下列公式(2)计算实验组及对照组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比(％)，如图6所示。换言之，是将控制组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比视为100％，来计算实验组与对照组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比(％)。
公式(2)
其中，％α-Glucosidase活性代表α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比(％)；A405nm(Sample 5min-Sample 0min)代表反应终止点(5分钟)的测试组别在405nm下的吸光值与反应起始点(0分钟)的测试组别在405nm下的吸光值之间的差值，且此测试组别为实验组或对照组。A405nm(Sample 5min-Sample 0min)代表反应终止点(5分钟)的控制组在405nm下的吸光值与反应起始点(0分钟)的控制组在405nm下的吸光值之间的差值。
请参考图6。相较于控制组(酵素活性视为100％)，实验组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比为0％。换言之，实验组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比相对于控制组明显下降100％，代表瓜拿纳发酵液完全抑制α-葡萄糖苷酶的酵素活性。并且，相较于控制组，对照组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比为10.2％。换言之，对照组相对于控制组的α-葡萄糖苷酶的酵素活性百分比下降89.8％。由此可知，瓜拿纳发酵液对于α-葡萄糖苷酶的酵素活性的抑制能力明显高于瓜拿纳水萃液对于对于α-葡萄糖苷酶的酵素活性的抑制能力。于此，瓜拿纳发酵液具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性的能力。
实验四：脂肪分解酶基因表现检测
4-1.检测标的及溶液配置
以脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)基因作为脂肪分解酶基因检测的标的。
于此，所使用的条件培养基(Condition Medium)为添加有20vol％FBS(品牌：Gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素的最低必需培养基α(Minimum Essential MediumAlpha，MEMα，品牌：Gibco)。
4-2.检测流程
首先，以每孔1×105个细胞的细胞数，将小鼠骨髓基质细胞株OP9(购自
编号CRL-2749TM)接种于含有2mL条件培养基的6孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养48小时。接着，于培养48小时候，再将含有OP9细胞的6孔培养盘置于37℃下接续培养7天。并于7-10天的培养期间，每2天更换一次新鲜的2mL条件培养基。并于培养7-10天后，使用显微镜(厂牌：ZEISS)观察各孔中的细胞内的油滴(lipid droplet)形成以确认OP9细胞完全分化成脂肪细胞。
将脂肪细胞分成3个组别：实验组、对照组以及控制组。移除各组别的条件培养基，并更换成每孔2mL实验培养基，然后置于37℃下分别接续培养48小时。其中，实验组的实验培养基为含有0.031vol％范例一中所得到的瓜拿纳发酵液的条件培养基。对照组的实验培养基为含有0.031vol％范例二中所得到的瓜拿纳水萃液的条件培养基。控制组的实验培养基为单纯的条件培养基(即不含瓜拿纳发酵液或瓜拿纳水萃液)。
于培养48小时后，移除各孔中的实验培养基并以PBS清洗一次。去除PBS，接着以RNA纯化套组(RNA purification kit，品牌：GeneMark)从各组别的脂肪细胞提取出RNA。接着，通过反转录酶套组(SuperScriptTMReverse Transcriptase kit，品牌：Invitrogen)将各组别提取出的RNA反转录为cDNA，并通过ABI系统(ABI StepOne PlusTMSystem，品牌：Applied Biosystems)配合二引子(Primer)(如表4所示，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)量化脂肪细胞内ATGL基因的表现量，并以2-ΔΔCt方法进行基因定量，如图7所示。需要特别说明的是，图7中的基因表现是以相对表现倍率数呈现，其中使用Excel软件的STDEV公式计算标准偏差，且各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析。在图7中，「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05。
表4
4-3.实验结果
请参阅图7。控制组的ATGL基因的表现量视为1.00(即控制组的ATGL基因的表现量为100％)。相较于控制组，实验组的ATGL基因的表现量为3.30，而对照组的ATGL基因的表现量为1.57。于此，实验组的ATGL基因的表现量相较于控制组有显著地提高，且实验组的ATGL基因的表现量相较于对照组亦有明显提高。由此可知，瓜拿纳发酵液能有效地提高脂肪分解酶基因的表现，进而提高脂肪分解酶。换言之，瓜拿纳发酵液具有分解脂肪的功能，进而避免脂肪累积，达成减少受体的脂肪形成及减脂的功效。并且，瓜拿纳通过微生物发酵后可能产出较瓜拿纳水萃液多的分解脂肪的活性成分。
实验五：脂肪堆积检测
5-1.溶剂配置
于此，所使用的前脂肪细胞增殖培养基(pre-adipocyte expansion medium)为添加有20vol％FBS(品牌：Gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素的最低必需培养基α(MinimumEssential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco)。所使用的分化培养基(differentiationmedium)为添加有20vol％FBS(品牌：Gibco)及1vol％盘尼西林-链霉素的MEMα(品牌：Gibco)。并且，将油-红O染色试剂(品牌：Sigma)彻底溶解于100％异丙醇(isopropanol，供货商：ECHO)以配制3mg/mL的油-红O染色试剂的储备溶液。为获得可供使用的油-红O工作溶液(oil-red O working solution)，于使用前实时将油-红O染色试剂的储备溶液以二次水(ddH2O)稀释至浓度1.8mg/mL，即为60％油-红O染色试剂的储备溶液。
5-2.检测流程
首先，以每孔8×104个细胞的细胞数，将小鼠骨髓基质细胞株OP9(购自
编号CRL-2749TM)接种于含有500μL前脂肪细胞增殖培养基的24孔培养盘的各孔中，并置于37℃下培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μL分化培养基。于培养7天后，使用显微镜(厂牌：ZEISS)观察各孔中的细胞内的油滴(lipid droplet)形成以确认细胞完全分化成脂肪细胞，供后续实验使用。
在培养24小时后，将脂肪细胞分成3个组别：实验组、对照组以及控制组。移除各组别的分化培养基，并更换成每孔500μL实验培养基，然后置于37℃下接续培养7天。于7天的培养期间，每3天更换一次新鲜的500μL实验培养基。其中，实验组的实验培养基为含有0.062vol％范例一中所得到的瓜拿纳发酵液的分化培养基。对照组的实验培养基为含有0.062vol％范例二中所得到的瓜拿纳水萃液的分化培养基。控制组的实验培养基为单纯的分化培养基(即不含瓜拿纳发酵液或瓜拿纳水萃液)。
接着，移除各孔中的实验培养基并以1xPBS润洗二次。继而，于各孔内添加1mL的10％甲醛(formaldehyde，供货商：ECHO)并于室温下培养30分钟，藉以固定细胞。之后，移除各孔内的甲醛并以1mL PBS对各孔润洗二次。于再次润洗后，添加1mL的60％异丙醇至每孔中并作用1分钟。接着，移除异丙醇，再添加1mL油-红O工作溶液并于室温下作用1小时。
于作用1小时候，移除油-红O工作溶液并以1mL的60％异丙醇快速退染5秒。于退染后，染色后的细胞以显微镜拍照以取得染色后的细胞的显微照片，如图8所示。
接着，加入100％异丙醇至各孔中，并置于振荡器(shaker)上反应10分钟以溶解染剂。然后，从各孔中取100μL前述的染剂-异丙醇溶液至96孔培养盘并于510nm的波长下以ELISA读取仪(厂牌：BioTek)读取各孔的吸光值(OD510)。
于量测后，藉由将所测得的吸光值代入下列公式(3)而计算出脂质油滴相对含量(％)。换言之，于此，是将控制组的脂质油滴含量视为1(即控制组的相对脂质油脂含量为100％)来计算各组别的脂质油滴相对含量(％)。并且，各组之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析，如图9所示。在图9中，「*」代表在与控制组比较下其p值小于0.05。
公式(3)
脂质油滴相对含量(％)＝(OD510 sample/OD510 control)×100％(3)
其中，OD510 sample代表欲换算的组别的吸光值，而OD510 control代表控制组的吸光值。
5-3.实验结果
请参阅图8，相较于控制组及对照组，实验组的脂肪细胞的油滴明显减少。请参阅图9，相较于控制组，实验组的脂质油滴相对含量为77.96％，且其可减少22.04％的油滴量。于此，实验组的脂质油滴相对含量相较于控制组有显著地降低。相较于控制组，对照组的脂质油滴相对含量为95.05％，且其可减少4.95％的油滴量。于此，实验组的脂质油滴相对含量相较于对照组的脂质油滴相对含量亦有明显下降。由此可知，瓜拿纳发酵液能有效地抑制脂肪累积，具有减少受体的脂肪形成的功能，进而达成减脂的功效。并且，瓜拿纳通过微生物发酵后可能产出较瓜拿纳水萃液多的减脂活性成分。
实验六：人体检测
6-1.检测流程
令8位受试者每日饮用5mL瓜拿纳发酵饮品(其含有12vol％范例一的瓜拿纳发酵液与88vol％水)，连续饮用4周。并且，于饮用前(即第0周)及饮用4周后(即第4周)，以体重计(厂牌：TANITA BC545N十合一体组成计)测量此些受试者体重以及以布尺测量此些受试者的腰围。并且，8位受试者(年龄介于20-55岁)的BMI大于或等于24并小于27，且受试者男性的体脂率大于25％、受试者女性的体脂率大于30％。
需要特别说明的是，第0周的量测结果与第4周的量测结果之间的统计学显著差异是藉由学生t-试验来统计分析，如图10及图11所示。在图10及图11中，「*」代表在与第0周比较下其p值小于0.05，且「**」代表在与第0周比较下其p值小于0.01。
6-2.检测结果
请参阅图10及图11。8位受试者的平均体重从68公斤下降至67.3公斤(如图10所示)，且此些受试者的平均腰围从85.8厘米减少至82.9厘米(如图11所示)。换言之，相比饮用前(第0周)，持续4周饮用含有瓜拿纳发酵液的瓜拿纳发酵饮品后可使此些受试者的平均体重显著地下降0.7公斤，以及使此些受试者的平均腰围显著地减少2.9厘米。由此可知，长期使用瓜拿纳发酵液可改善受体的体重及腰围，即瓜拿纳发酵液具瘦身减脂的功效。
综上所述，根据本发明任一实施例的瓜拿纳发酵液的制备方法可制备一瓜拿纳发酵液。在一些实施例中，，所制备的瓜拿纳发酵液可用于制备减少受体的脂肪形成的组合物。换言之，前述的组合物具有下列一种或多种功能：提升抗氧化活性、抑制淀粉分解酶活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性、提高脂肪分解酶基因的表现亮、抑制脂肪累积、减少受体的脂肪形成以及减脂瘦身。
虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神所作些许的更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
【序列表】
<110> 大江生医股份有限公司
<120> 瓜拿纳发酵液的制备方法及瓜拿纳发酵液的用途
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATGL-F
<400> 1
ggatggcggc atttcagaca 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATGL-R
<400> 2
caaagggttg ggttggttca g 21
Claims (9)
1.一种瓜拿纳发酵液的制备方法，其特征在于，包括：
提供培养液，该培养液包括以1重量份的瓜拿纳及10重量份的水所形成的瓜拿纳汁液及该瓜拿纳汁液总重的10％的葡萄糖；
将该培养液及多个菌种进行发酵7日以得到发酵原液，其中该多个菌种包括相对于该培养液为0.1％的酵母菌、相对于该培养液为0.05％的乳酸菌及相对于该培养液为5％的醋酸菌；以及
调整该发酵原液以形成该瓜拿纳发酵液。
2.根据权利要求1所述的瓜拿纳发酵液的制备方法，其特征在于，该将该培养液及该多个菌种进行发酵的步骤包括：
将该酵母菌于该培养液内发酵1日后形成第一初发酵液，其中该酵母菌为啤酒酵母；
添加该乳酸菌于该第一初发酵液内发酵1日后形成第二初发酵液，其中该乳酸菌为胚芽乳酸杆菌；
添加该醋酸菌于该第二初发酵液内发酵5日后形成第三初发酵液，其中该醋酸菌为乙酸醋酸菌；以及
过滤该第三初发酵液以得到该发酵原液。
3.根据权利要求2所述的瓜拿纳发酵液的制备方法，其特征在于，过滤该第三初发酵液的步骤包括：
在60℃下减压浓缩及以200mesh过滤该第三初发酵液。
4.根据权利要求1所述的瓜拿纳发酵液的制备方法，其特征在于，该提供该培养液的步骤包括：
混合该瓜拿纳及该水以形成瓜拿纳基液；
将该瓜拿纳基液于95℃下浸提1小时以得到该瓜拿纳汁液；以及
将该瓜拿纳汁液与该葡萄糖混合以得到该培养液。
5.根据权利要求1所述的瓜拿纳发酵液的制备方法，其特征在于，调整该发酵原液以形成该瓜拿纳发酵液的步骤为调整该发酵原液的糖度以形成该瓜拿纳发酵液。
6.根据权利要求1所述的瓜拿纳发酵液的制备方法，其特征在于，该瓜拿纳发酵液的总多酚含量为1600μg/ml以上。
7.一种瓜拿纳发酵液的制备方法所制得瓜拿纳发酵液用于制备减少受体的脂肪形成的组合物的用途，其特征在于，该瓜拿纳发酵液用以提升一脂肪分解酶基因的表现量以减少脂肪形成。
8.一种瓜拿纳发酵液的制备方法所制得瓜拿纳发酵液用于制备减少受体的脂肪形成的组合物的用途，其特征在于，该瓜拿纳发酵液用以减少脂质油滴的生成以减少脂肪形成。
9.一种瓜拿纳发酵液的制备方法所制得瓜拿纳发酵液用于制备减少受体的脂肪形成的组合物的用途，其特征在于，该瓜拿纳发酵液用以降低淀粉分解酶及α-葡萄糖苷酶的活性以及减少淀粉分解成醣类后的热量吸收以减少脂肪形成。
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