CN112384530A - 对戊型肝炎病毒orf2i蛋白具有特异性的抗体及其用于诊断目的的用途 - Google Patents
对戊型肝炎病毒orf2i蛋白具有特异性的抗体及其用于诊断目的的用途 Download PDFInfo
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Abstract
戊型肝炎病毒(HEV)每年造成2000万例感染，其中有340万例有症状的病例和70,000例死亡，其主要发生在世界欠发达地区。HEV是一种含有线性、单链、正义RNA基因组的准包膜病毒，其含有三个开放阅读框(ORF)，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF2编码ORF2病毒衣壳蛋白，其参与颗粒组装，结合宿主细胞并引发中和抗体。最近，3种不同形式的ORF2衣壳蛋白被鉴定：感染性/细胞内ORF2(ORF2i)、糖基化ORF2(ORF2g)和切割的ORF2(ORF2c)。ORF2i蛋白(已鉴定其精确序列)是与感染性颗粒相关的形式，因此对ORF2i蛋白具有特异性的抗体将适用于HEV的诊断。本发明通过提供结合戊型肝炎病毒的ORF2i蛋白的抗体来满足该需求，其中所述抗体不结合戊型肝炎病毒的ORF2g蛋白或ORF2c，并且其中所述抗体的表位包含来自SEQ ID NO:1的氨基酸残基的10‑23中的至少一个氨基酸残基。
Description
技术领域
本发明涉及对戊型肝炎病毒ORF2i蛋白具有特异性的抗体及其用于诊断目的的用途。
背景技术
戊型肝炎病毒(HEV)每年造成2000万例感染，其中有340万例有症状的病例和70,000例死亡，其主要发生在世界欠发达地区。它作为水源性爆发或通过粪-口途径的散发病例引发急性肝炎(Debing Y,Moradpour D,Neyts J,et al.Update on Hepatitis EVirology:Implications for Clinical Practice.Journal of Hepatology2016；65:200-212)。尽管HEV感染通常是自愈的，但已报道了严重形式或慢性感染，主要是在免疫功能低下的患者中。在孕妇中也报道了很高的死亡率。HEV感染还与肝外疾病相关(Pischke S,Hartl J,Pas SD,et al.Hepatitis E virus infection beyond the liver？Journal ofHepatology 2016.10.1016/j.jhep.2016.11.016)。四种基因型(gt)在人中具有致病性。Gt1和gt2仅感染人，而gt3和gt4是人畜共患的并且主要感染哺乳动物，偶尔会传播给人。最近，gt3感染已在西方世界出现，这可能是由于食用了受污染的食物和输血(Debing Y,Moradpour D,Neyts J,et al.Update on Hepatitis E Virology:Implications forClinical Practice.Journal of Hepatology2016；65:200-212)。戊型肝炎的诊断基于检测患者血清中的抗HEV抗体和/或病毒RNA(Khuroo MS,Khuroo MS.Hepatitis E:anemerging global disease-from discovery towards control and cure.Journal ofViral Hepatitis 2016；23:68–79)。最近，开发了一种基于检测HEV抗原衣壳蛋白的新测定(
Biologicals)，特别是针对没有分子诊断工具的实验室。
HEV是一种含有线性、单链、正义RNA基因组的准包膜病毒，其含有三个开放阅读框(ORF)，即ORF1、ORF2和ORF3(Debing Y,Moradpour D,Neyts J,et al.Update onHepatitis E Virology:Implications for Clinical Practice.Journal ofHepatology2016；65:200-212)。ORF1是编码非结构性多蛋白(ORF1蛋白)的最大基因，其含有数个病毒复制所必需的功能域。ORF2编码ORF2病毒衣壳蛋白，其参与颗粒组装，结合宿主细胞并引发中和抗体。ORF3编码小的多功能磷蛋白，其参与病毒体的形态发生和流出。尽管HEV是胆汁和粪便中的非包膜病毒，但已经描述了患者血清和细胞培养物产生的颗粒与细胞脂质相关，并在其表面显示ORF3蛋白(Okamoto H.Culture systems for hepatitis Evirus.J Gastroenterol2012；48:147–158)。
最近，鉴定了3种不同形式的ORF2衣壳蛋白：感染性/细胞内ORF2(ORF2i)、糖基化ORF2(ORF2g)和切割的ORF2(ORF2c)(Montpellier C.,et al."Hepatitis E viruslifecycle and identification of3forms of the ORF2 capsid protein."Gastroenterology 154.1(2018):211-223)。ORF2i蛋白(已鉴定其精确序列)是与感染性颗粒相关的形式。ORF2i蛋白未被糖基化，很可能不会转移到内质网(ER)内腔中并停留在胞质区室。相反，ORF2g和ORF2c蛋白在细胞培养和感染患者的血清中大量分泌、被唾液酸化、N-和O-糖基化，但与感染性病毒体无关。重要的是，ORF2g和ORF2c蛋白是HEV感染患者血清中存在的主要抗原。因此，对ORF2i蛋白具有特异性的抗体将适合于诊断HEV。
发明简述
本发明涉及对戊型肝炎病毒的ORF2i蛋白具有特异性的抗体及其用于诊断目的的用途。特别地，本发明由权利要求书限定。
发明详述
本发明的第一目的涉及结合戊型肝炎病毒的ORF2i蛋白的抗体，其中所述抗体不结合戊型肝炎病毒的ORF2g蛋白或ORF2c，并且其中所述抗体的表位包含来自SEQ ID NO:1的氨基酸残基10-23中的至少一个氨基酸残基。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的由氨基酸残基组成的化合物。多肽不限于特定长度：它必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含多肽序列的最大氨基酸数没有限制。肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义内，并且除非另外特别指出，否则这些术语在本文中可以互换使用。如本文所用，该术语是指短链，其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体，并且是指较长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中蛋白质有很多类型。在一个实施方案中，如本文所用，术语“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的线性聚合物，优选具有小于约50个氨基酸残基的链长；“多肽”是指通过肽键连接在一起的至少50个氨基酸的线性聚合物；并且蛋白质具体是指由一种或多种任选地被糖基化的肽或多肽和任选的非多肽辅因子形成的功能实体。该术语也不包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的天然存在和非天然存在的其它修饰。多肽可以是完整的蛋白质或其子序列。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
如本文所用，术语“ORF2i蛋白”是指戊型肝炎病毒ORF2衣壳蛋白(ORF2i)，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列并且其中所述蛋白质未被糖基化。
SEQ ID NO:1:
1LPMLPAPPA10 GQPSGRRRGRRSGG 23AGGGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFAADIVSQSGAGTRPRQPPRPLGSAWRDQSQRPSAAPRRRSAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQATYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTRAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPASISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKTEVGKTRES
根据本发明，本发明的ORF2i蛋白的质量为约80kDa。
如本文所用，术语“ORF2g蛋白”是指戊型肝炎病毒ORF2衣壳蛋白(ORF2g)，其包含与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列并且其中所述蛋白质被糖基化。
SEQ ID NO:2:
SGGAGGGFWGDRVDSQPFALPYIHPTNPFAADIVSQSGAGTRPRQPPRPLGSAWRDQSQRPSAAPRRRSAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQATYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTRAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPASISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKTEVGKTRES
根据本发明，本发明的ORF2g蛋白的质量为约90kDa。
如本文所用，术语“ORF2c蛋白”是指戊型肝炎病毒ORF2衣壳蛋白(ORF2c)，其包含与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列并且其中所述蛋白质被糖基化。
SEQ ID NO:3
SAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQATYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTRAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPASISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKTEVGKTRES
根据本发明，本发明的ORF2c蛋白的质量为约75kDa。
如本文所用，相对于蛋白质，术语“糖基化”是指在蛋白质分子的一个或多个位点存在碳水化合物部分。特别地，糖基化蛋白质是指典型地通过添加N-聚糖或O-聚糖来修饰的蛋白质。
根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少90％同一性是指第一序列与第二氨基酸序列具有90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或100％的同一性。序列同一性经常用百分比同一性(或相似性或同源性)来测量；百分比越高，两个序列越相似。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于：Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981；Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444,1988；Higgins and Sharp,Gene,73:237-244,1988；Higgins and Sharp,CABIOS,5:151-153,1989；Corpet et al.Nuc.Acids Res.,16:10881-10890,1988；Huang et al.,Comp.Appls Biosci.,8:155-165,1992；and Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.,24:307-31,1994)。Altschul et al.,Nat.Genet.,6:119-129,1994,详细介绍了序列比对方法和同源性计算。例如，可以使用比对工具ALIGN(Myers和Miller，CABIOS 4:11-17,1989)或LFASTA(Pearson和Lipman，1988)进行序列比较(Internet
1996,W.R.Pearsonand the University of Virginia,fasta20u63 version 2.0u63,release dateDecember 1996)。ALIGN将整个序列进行相互比较，而LFASTA则比较局部区域的相似性。例如，这些比对工具及其各自的教程可在因特网上的NCSA网站上获得。或者，为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，可以使用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵执行Blast 2序列功能(空位存在罚分为11，每个残基缺口罚分为1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用设置为默认参数的PAM30矩阵，采用Blast 2序列功能进行比对(开放空位9，延伸空位1罚分)。BLAST序列比较系统可从例如NCBI网站获得；还参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410,1990；Gish.&States,Nature Genet.,3:266-272,1993；Maddenet al.Meth.Enzymol.,266:131-141,1996；Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997；和Zhang&Madden,Genome Res.,7:649-656,1997。
如本文所用，术语“抗体”具有其在本领域中的一般含义，并且是指具有抗原结合区的任何抗体样分子，该术语包括包含抗原结合结构域的抗体片段，诸如Fab'、Fab、F(ab')2和单域抗体(DAB)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种轻链，lambda(1)和kappa(k)。存在五种主要的重链类别(或同种型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定区结构域(CL)和重链的恒定区结构域(CH)赋予重要的生物学特性，诸如抗体链结合、分泌、经胎盘移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基影响整个结构域的结构，从而影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点包括六个CDR，其包含来自各重链和轻链V区中的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。
术语“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，其保留与抗原表位特异性相互作用(例如通过结合、位阻、稳定/去稳定化、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链抗体分子，特别是scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHI结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(例如sdAb(VL或VH)、骆驼科动物VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体，例如，二价片段，其包含两个通过铰链区的二硫键连接的Fab片段和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被加入单域抗体、最大抗体、微型抗体、纳米抗体、体内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv(参见，例如Hollinger and Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以基于诸如III型纤连蛋白的多肽被接枝到支架中(参见U.S.Patent No.:6,703,19，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，和残留“Fc”片段，该名称反映了其容易结晶的能力。
术语“Fab”表示分子量为约50,000且具有抗原结合活性的抗体片段，其中在通过用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG获得的片段中，H链的N末端侧的一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
术语“F(ab')2”是指具有约100,000分子量和抗原结合活性的抗体片段，其在通过用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中，比经由铰链区的二硫键结合的Fab稍大。
术语“Fab”指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切断F(ab')2的铰链区的二硫键而获得。
单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH:VL异二聚体，其通常从包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合体表达。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH:VL异二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFvs的结合自发形成，也可以通过肽接头(诸如二价sc(Fv)2)偶联单价scFvs产生。
根据本发明，本发明的抗体对ORF2i蛋白具有特异性。如本文所用，术语“特异性”是指抗体可检测地结合ORF2i蛋白上存在的表位的能力，同时与ORF2g蛋白和ORF2c蛋白具有相对较少的可检测反应性。
如本文所用，术语“表位”是指位于蛋白质(抗体与其结合)上的氨基酸的特定排列。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线性的或构象的，即在抗原的各个区域中涉及两个或多个不一定是连续的氨基酸序列。因此，本发明的表位包含来自SEQ ID NO:1的氨基酸残基10-23(即SEQ ID NO:4)的至少一个氨基酸残基。
SEQ ID NO:4
GQPSGRRRGRRSGG
在一些实施方案中，本发明的抗体结合包含来自SEQ ID NO:4或来自与SEQ IDNO:4具有至少90％同一性的序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基的表位。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的氨基酸序列的表位。
如本文所用，本文所用的术语“结合”是指两个分子之间的直接缔合，这是由于例如共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥的相互作用。特别地，如本文所用，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“结合”典型地是具有对应于约10-7M或更小的KD的亲和力的结合，诸如约10-8M或更小，诸如约10-9M或更小，约10-10M或更小，或者约10-11M或更小。
如本文其它地方所述，可以通过结合或竞争性结合测定，例如使用Biacore仪器，以相对地测定特异性。特异性可以通过例如与其他无关分子的非特异性结合相比，与特异性抗原结合的约10：1、约20：1、约50：1、约100：1、10,000：1或更高比例的亲和力/亲合力来表现。如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位的结合强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，该解离常数Kd被定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]为抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]为未结合抗体的摩尔浓度并且[Ag]为未结合抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka由1/Kd定义。测定mAb亲和力的优选方法可以在Harlow,et al.,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene PublishingAssoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993),and Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)中找到，这些参考文献通过引用整体并入本文。用于测定mAb亲和力的一种优选的标准方法是使用Biacore仪器。
在一些实施方案中，抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。如本文所用，术语“多克隆抗体”是指抗血清中免疫后针对抗原产生的多种免疫球蛋白，并且其可以识别并结合该抗原的一个或多个表位。如本文所用，术语“单克隆抗体”、“单克隆Ab”、“单克隆抗体组合物”、“mAb”等是指单分子组成的抗体分子的制剂。可以使用Kohler和Milstein的方法(Nature,256:495,1975)产生单克隆抗体。为了制备可用于本发明的单克隆抗体，以合适的间隔(例如每周两次、每周一次、每月两次或每月一次)用相关病毒抗原形式免疫接种小鼠或其它合适的宿主动物(例如小鼠、山羊、骆驼科动物等)。典型地，免疫原性形式由具有在SEQ IDNO:1的第10-23位氨基酸残基范围内的氨基酸序列的肽(即SEQ ID NO:4)组成。可以在处死后一周内向动物施用最终“加强”的抗原形式。通常需要在免疫接种期间使用免疫佐剂。合适的免疫佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、Ribi佐剂、Hunter's Titermax、皂苷佐剂如QS21或Quil A，或含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它合适的佐剂是本领域众所周知的。可以通过皮下、腹膜内、肌肉内、静脉内、鼻内或其它途径免疫接种动物。在免疫接种方案后，从动物的脾、淋巴结或其它器官分离淋巴细胞，并使用诸如聚乙二醇的试剂与合适的骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。融合后，如所述使用标准方法将细胞置于允许杂交瘤生长但不允许融合伴侣生长的培养基中(Coding,Monoclonal Antibodies:Principlesand Practice:Production andApplication of Monoclonal Antibodies in CellBiology,Biochemistry andImmunology,3rd edition,Academic Press,New York,1996)。培养杂交瘤后，分析细胞上清液中所需特异性抗体(即，选择性结合抗原)的存在。合适的分析技术包括ELISA、免疫荧光、流式细胞术、免疫沉淀和蛋白质印迹。其它筛选技术是本领域众所周知的。优选的技术是确认抗体与构象完整的天然折叠抗原结合的技术，例如非变性ELISA、流式细胞术和免疫沉淀。
在一些实施方案中，本发明的抗体与可检测标记物缀合。例如，合适的可检测标记包括放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这种可检测标记的免疫缀合物的方法是本领域普通技术人员众所周知的，并在下文中更详细地描述。例如，可检测标记可以是通过放射自显影检测的放射性同位素。对于本发明的目的特别有用的同位素是3H、125I、131I、35S和14C。本发明的抗体也可以用荧光化合物标记。本发明的荧光标记抗体的存在是通过将免疫缀合物暴露于适当波长的光并检测所得的荧光来确定的。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺和Alexa Fluor染料。或者，可以通过将所述抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记本发明的抗体。通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。类似地，生物发光化合物可以用于标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光类型，其中催化蛋白可提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。典型地，当抗体与酶偶联后，在适当的底物存在下孵育抗体，酶部分与底物反应产生化学部分，该化学部分可通过例如分光光度法、荧光法或可见光法检测手段。可用于可检测地标记多特异性免疫缀合物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。本领域技术人员将知晓可以根据本发明采用的其它合适的标签。使用本领域已知的标准技术完成标记部分与抗本发明抗体的结合。在这方面，典型方法由Kennedy et al.,Clin.Chim.Acta 70:1,1976；Schurs et al.,Clin.Chim.Acta 81:1,1977；Shih et al.,Int'U.Cancer 46:1101,1990；Stein et al,Cancer Res.50:1330,1990；and Coligan,supra所描述。此外，通过使用本发明的已经与抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素缀合的抗体，可以增强免疫化学检测的便利性和多功能性。{例如，参见Wilchek et al.(eds.),"Avidin-Biotin Technology,"Methods InEnzymology(Vol.184)(Academic Press 1990)；Bayer et al.,"ImmunochemicalApplications of Avidin-Biotin Technology,"in Methods In Molecular Biology(Vol.10)149-162(Manson,ed.,The Humana Press,Inc.1992)。
在一些实施方案中，本发明的抗体与可检测标记物缀合。例如，合适的可检测标记包括放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这种可检测标记的免疫缀合物的方法是本领域普通技术人员众所周知的，并在下文中更详细地描述。例如，可检测标记可以是通过放射自显影检测的放射性同位素。对于本发明的目的特别有用的同位素是3H，125I，131I，35S和14C。本发明的抗体也可以用荧光化合物标记。本发明的荧光标记抗体的存在是通过将免疫缀合物暴露于适当波长的光并检测所得的荧光来确定的。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺和Alexa Fluor染料。或者，可以通过将所述抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记本发明的抗体。通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。类似地，生物发光化合物可以用于标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光类型，其中催化蛋白可提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。典型地，当抗体与如上所述的荧光标记偶联后，融合蛋白的存在可以通过本领域众所周知的任何手段例如显微镜或显微镜或自动分析系统来检测。通常，当抗体与酶偶联时，酶部分与底物反应产生化学部分，该化学部分可通过例如分光光度法、荧光法或可见光法检测手段。可用于可检测地标记多特异性免疫缀合物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)和碱性磷酸酶。本领域技术人员将知晓可以根据本发明采用的其它合适的标签。使用本领域已知的标准技术完成标记部分与抗本发明抗体的结合。在这方面，典型方法由Kennedy et al.,Clin.Chim.Acta 70:1,1976；Schurs et al.,Clin.Chim.Acta 81:1,1977；Shih et al.,Int'U.Cancer 46:1101,1990；Stein et al,Cancer Res.50:1330,1990；and Coligan,supra所描述。此外，通过使用本发明的已经与抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素缀合的抗体，可以增强免疫化学检测的便利性和多功能性。{例如，参见Wilchek et al.(eds.),"Avidin-Biotin Technology,"Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press1990)；Bayer et al.,"Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,"in Methods In Molecular Biology(Vol.10)149-162(Manson,ed.,The Humana Press,Inc.1992)。
本发明的抗体特别用于诊断目的。特别地，本发明的抗体适合于确定样品中戊型肝炎病毒感染性颗粒的存在。更特别地，本发明的抗体适合于诊断受试者中的戊型肝炎病毒感染。
因此，本发明的另一目的涉及用于检测样品中ORF2i蛋白的存在的方法，其包括在允许形成蛋白质和抗体的免疫复合物的条件下使样品与本发明的抗体接触，其中检测到免疫复合物表明样品中存在ORF2i蛋白(例如：免疫沉淀、免疫荧光和蛋白质印迹)。
如本文所用，术语“样品”包括任何固体或液体样品，其易于含有戊型肝炎病毒感染性颗粒。在一些实施方案中，样品选自腹水、尿液、唾液、汗液、乳汁、滑液、腹膜液、羊水、percerebrospinal fluid、淋巴液、肺栓塞、脑脊液和心包液。在一些实施方案中，样品是粪便样品。在一些实施方案中，样品是尿液样品。在一些实施方案中，样品是血液样品。如本文所用，术语“血液样品”是指源自受试者的任何血液样品。血液样品的收集可以通过本领域技术人员熟知的方法进行。例如，受试者的血液可以由受过训练的医务人员直接抽取到抗凝血剂如柠檬酸盐和EDTA中。通过在3500×G下冷冻离心2分钟，可以将全血分离成血浆部分、细胞和血小板部分。离心后，上清液为血浆。
更具体地，本发明的另一目的涉及用于检测样品中戊型肝炎病毒感染性颗粒的存在的方法，其包括在允许形成抗体和感染性颗粒的免疫复合物的条件下使样品与本发明的抗体接触，其中检测到免疫复合物表明样品中存在感染性颗粒。
在一些实施方案中，本发明的检测方法可以进一步包括使样品与识别ORF2g和/或ORF2c蛋白的抗体接触。
本发明的检测方法特别适用于诊断急性HEV感染、近期HEV感染、慢性HEV感染、弱活性HEV感染或清除的HEV感染。
用于检测免疫复合物的测定和条件是本领域技术人员已知的。此类测定包括例如竞争测定、直接反应测定、夹心型测定和免疫测定(例如ELISA)。测定可以是定量的或定性的。存在许多不同的用于检测包含本发明多肽的抗体-肽复合物的形成的常规测定法。例如，检测步骤可包括进行ELISA测定、进行侧流免疫测定、进行凝集测定、分析分析转子中的样品，或用电化学、光学或光电传感器分析样品。这些不同的测定法是本领域技术人员所熟知的。
例如，可以使用夹心测定技术的许多变体中的任何一种进行免疫测定。简言之，在典型的夹心测定中，将本发明的第一抗体固定在固体表面上，并在允许形成免疫复合物的条件下使待测样品与固定化抗体接触一段时间。孵育后，添加用可检测部分标记的本发明的第二抗体，并在允许任何免疫复合物和标记抗体之间形成三元复合物的条件下孵育。洗去任何未结合的物质，并通过观察/检测由可检测部分直接或间接产生的信号来确定样品中多肽的存在。检测可以是定性的或定量的。用于标记生物分子(例如抗体)的方法是本领域公知的(参见例如，"Affinity Techniques.Enzyme Purification:Part B",Methods inEnzymoL,1974,Vol.34,W.B.Jakoby and M.Wilneck(Eds.),Academic Press:New York,NY；and M.Wilchek and E.A.Bayer,Anal.Biochem.,1988,171:1-32)。免疫测定中最常用的可检测部分是酶和荧光团。在酶免疫测定(EIA或ELISA)的情况下，通常借助戊二醛或高碘酸盐将酶(诸如辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等)与第二抗体偶联。通常选择与特定酶一起使用的底物，以在相应酶水解时产生可检测的颜色变化。在免疫荧光的情况下，第二抗体与荧光部分化学偶联而不改变其结合能力。将荧光标记的抗体与免疫复合物结合并除去任何未结合的物质后，检测并任选地定量由荧光部分产生的荧光信号。或者，可以用放射性同位素、化学发光部分或生物发光部分标记第二抗体。在一些实施方案中，测定法使用直接或间接连接本发明抗体的固相或基质。因此，在一些实施方案中，本发明的抗体连接或固定在基质上，例如固体或半固体支持物。连接可以是共价的或非共价的，并且可以通过允许共价或非共价结合的与多肽连接的部分来促进，诸如对连接在载体、支持物或表面的组分具有高亲和力的部分。在一些实施方案中，基质是珠体，诸如胶体颗粒(例如，由金、银、铂、铜、金属复合物、其它软金属、核-壳结构颗粒或中空金纳米球制成的胶体纳米颗粒)或其它类型的颗粒(例如，磁珠或包含二氧化硅、胶乳、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯或PVDF的颗粒或纳米颗粒)。此类颗粒可包含标记(例如，比色、化学发光或荧光标记)，并且可用于在免疫测定期间观察多肽的位置。在一些实施方案中，基质是侧流免疫测定装置中的斑点印迹或流动路径。例如，本发明的抗体可以连接或固定在多孔膜上，诸如PVDF膜(例如，ImmobilonTM膜)、硝酸纤维素膜、聚乙烯膜、尼龙膜或类似类型的膜。在一些实施方案中，基质是分析转子中的流动路径。在一些实施方案中，基质是管或孔，例如适合用于ELISA测定的板(例如微量滴定板)中的孔。这种基质可包括玻璃、纤维素基材料、热塑性聚合物，如聚乙烯、聚丙烯或聚酯，由颗粒材料(如玻璃或各种热塑性聚合物)组成的烧结结构，或由硝化纤维、尼龙、聚砜等组成的铸膜等。基质可以是烧结的聚乙烯细颗粒，通常称为多孔聚乙烯，例如来自Chromex Corporation(Albuquerque，N.Mex.)的0.2-15微米的多孔聚乙烯。所有这些基质材料可以以合适的形状使用，例如膜、片材或板，或者它们可以涂覆或粘合或层压到合适的惰性载体上，例如纸、玻璃、塑料膜或织物。用于将肽固定在固相上的合适方法包括离子、疏水、共价相互作用等。
本发明的另一个目的涉及用于鉴定包含至少一种本发明的抗体(固定或不固定在如上所述的固体支持物上)的样品中感染性戊型肝炎病毒颗粒的存在的试剂盒或装置。在一些实施方案中，该试剂盒可包括产生可检测信号的本发明的第二抗体。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含对ORF2g和/或ORF2c蛋白具有特异性的抗体。试剂盒的实例包括但不限于ELISA测定试剂盒，以及包含测试条和试纸的试剂盒。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒还包含蛋白或感染性颗粒水平的参考值。参考值通常是来自健康个体群体的样品的平均水平。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒还包含至少一个用于收集样品的样品收集容器。收集装置和容器包括但不限于注射器、刺血针、BD
血液收集管。在一些实施方案中，本文描述的试剂盒还包含使用试剂盒和解释结果的说明书。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：使用肽GQPSGRRRGRRSGG(SEQ ID NO:4)产生针对ORF2i蛋白的特异性抗体。P1S5和对照(CTL)小鼠血清和1E6抗体的反应性和特异性(A)通过在固定的HEV感染的细胞上的免疫荧光检测，以及(B)通过在ORF2蛋白混合物(ORF2i和ORF2g/ORF2c)上的蛋白质印迹实验来分析。星号表示非特异条带。(C)通过在固定的HEV感染细胞上的免疫荧光分析以及在ORF2蛋白混合物(D)或HEV感染细胞提取物(E)上进行蛋白质印迹实验分析P1H1杂交瘤上清液和1E6抗体的反应性和特异性。
图2：用P1H1抗体对经洗涤剂处理的HEV颗粒进行免疫沉淀。(A-C)使用1E6抗体通过蛋白质印迹分析IP P1H1的灵敏度和特异性。
具体实施方式
结果：使用肽GQPSGRRRGRRSGG(SEQ ID NO:4)产生针对ORF2i蛋白的特异性抗体
N末端部分仅在ORF2i形式中存在，而不在ORF2g形式或ORF2c形式中存在。因此，所述部分可以代表用于获得ORF2i形式的高度特异性抗体的最佳策略。为了验证菌株/基因型之间的特异性，仅进行了氨基酸(a.a)1-50之间的序列比对(数据未显示)。进行二级结构和糖基化缺失的预测，以及免疫原性、亲水性和可及性的预测以确定免疫原的最佳序列。最后，选择肽GQPSGRRRGRRSGG(SEQ ID NO:4)进行免疫接种。为了使该序列在鼠免疫中更具免疫原性，通过在C端位置添加半胱氨酸，进行经由马来酰亚胺功能与蛋白质载体KLH的偶联。免疫接种按照常规方案进行。用肽(SEQ ID NO:4)以三周的间隔对五只小鼠进行至少三次免疫接种。免疫接种过程中使用了弗氏完全佐剂和不完全佐剂。通过皮下和腹膜内途径对动物进行免疫接种。第三次免疫接种后十天使小鼠出血，并测试了其血清的免疫反应性。首先通过间接ELISA在包被有肽(SEQ ID NO:4)的板上测定血清(数据未显示)。通过在固定的HEV感染的细胞上的免疫荧光(IF)分析了它们的反应性(图1A)。识别ORF2蛋白质三种形式的1E6单克隆抗体(抗体注册号#AB-827236)(Montpellier et al.,Gastroenterology,2018)用作阳性对照。将PBS免疫的小鼠的血清用作阴性对照(CTL小鼠)。如图1A所示，P1S5小鼠的血清在IF中显示出特异性反应性。接下来，在Western印迹实验中使用ORF2蛋白(ORF2i和ORF2g/ORF2c)的混合物作为抗原分析P1S5血清的特异性(图1B)。与识别这三种形式的1E6抗体相比，P1S5血清显示出对ORF2i蛋白的高度特异性识别，与ORF2g/c蛋白没有交叉反应。
最后一次加强免疫后，将P1S5小鼠处死。从脾脏中分离淋巴细胞，并使用聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。融合后，将细胞置于允许杂交瘤生长的培养基中。培养杂交瘤后，通过免疫荧光筛选细胞上清液。如图1C所示，P1H1杂交瘤上清液显示ORF2i特异性染色。接下来，在蛋白质印迹实验中以ORF2蛋白(ORF2i和ORF2g/ORF2c)的混合物(图1D)或HEV感染细胞的提取物(图1E)作为抗原分析了P1H1克隆的特异性。与识别这三种形式的1E6抗体相比，P1H1克隆显示出对ORF2i蛋白的高度特异性识别，与ORF2g/c蛋白没有交叉反应。
接下来扩增并纯化P1H1克隆。纯化的P1H1抗体用于免疫沉淀(IP)测定(图2)。将热灭活(80℃下20分钟)的HEV产生细胞(SN)的上清液与P1H1抗体或1E6抗体然后与蛋白质-G琼脂糖珠一起孵育。使用1E6抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀的ORF2蛋白。与表现出三种形式的ORF2和多个非特异性条带的IP 1E6相比，IP P1H1显示出对ORF2i蛋白的高度特异性识别，与ORF2g/c蛋白没有交叉反应且无背景(图2)。仅与蛋白质-G琼脂糖珠一起孵育的SN用作阴性对照(IP CTL)。这些结果表明P1H1抗体能够免疫沉淀热变性的HEV颗粒。
然后将SN在80℃热灭活20分钟，或用3％柠檬酸处理20分钟，然后用1M Tris pH 8缓冲，或用1％Triton X-100处理30分钟(图2B)。随后用P1H1抗体使SN进行IP。使用1E6抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀的ORF2蛋白。柠檬酸处理的SN上的IP P1H1仅显示ORF2i蛋白微弱的条带和非特异性条带。相反，对于热灭活的SN上的IP P1H1，经Triton X-100处理的SN上的IP P1H1显示出对ORF2i蛋白的高度特异性识别，与ORF2g/c蛋白没有交叉反应且无背景(图2B)。接着，在用P1H1进行IP之前，用0.1％、0.25％、0.5％或1％的Triton X-100处理SN 30分钟(图2C)。未处理的SN(TX 0％)和热变性的SN(80℃)分别用作阴性和阳性对照。使用1E6抗体通过蛋白质印迹分析免疫沉淀的ORF2蛋白。在所有使用Triton X-100(0.1至1％)处理的样品中，IP P1H1对ORF2i蛋白表现出高度敏感性和特异性识别，与ORF2g/c蛋白没有交叉反应且无背景(图2C)。综上所述，这些结果表明P1H1抗体能够特异性免疫沉淀经洗涤剂处理的HEV颗粒。
总之，这些结果表明可以产生针对ORF2i多肽(SEQ ID NO:4)的特异性抗体。该抗体将非常适合于确定样品中戊型肝炎病毒感染性颗粒的存在。更特别地，本发明的ORF2i多肽的检测适合于诊断受试者中的戊型肝炎病毒感染。
参考文献：
在整个本申请中，各参考文献描述了本发明所属的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开中。
Claims (15)
1.结合戊型肝炎病毒的ORF2i蛋白的抗体，其中所述抗体不结合戊型肝炎病毒的ORF2g蛋白或ORF2c，并且其中所述抗体的表位包含来自SEQ ID NO:1的氨基酸残基10-23(SEQ IDNO:4)的至少一个氨基酸残基。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ ID NO:4中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸残基或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的序列的表位。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少90％同一性的氨基酸序列的表位。
4.权利要求1的抗体，其是多克隆抗体或单克隆抗体。
5.权利要求1的抗体，其是Fab'、Fab、F(ab')2、scFv或单域抗体。
6.权利要求1的抗体，其与可检测的标记缀合。
7.权利要求6的抗体，其中所述可检测标记是放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记或生物发光标记。
8.权利要求6的抗体，其中所述标记选自以下的组：β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)和碱性磷酸酶。
9.权利要求1的抗体用于确定样品中戊型肝炎病毒感染性颗粒的存在的用途。
10.用于检测样品中ORF2i蛋白的存在的方法，其包括在允许形成蛋白质和抗体的免疫复合物的条件下使所述样品与权利要求1的抗体接触，其中检测到免疫复合物表明样品中存在ORF2i蛋白。
11.用于检测样品中戊型肝炎病毒感染性颗粒的存在的方法，其包括在允许形成抗体和感染性颗粒的免疫复合物的条件下使所述样品与权利要求1的抗体接触，其中检测到免疫复合物表明样品中存在感染性颗粒。
12.权利要求10或11的方法，其中所述样品选自以下的组：粪便、血液、腹水；尿液；唾液；汗液；乳汁；滑液；腹膜液；羊水；脑脊液；淋巴液；肺栓塞；脑脊液；和心包积液。
13.权利要求1的抗体用于诊断急性HEV感染、近期HEV感染、慢性HEV感染、弱活性HEV感染或清除的HEV感染的用途。
14.用于鉴定样品中感染性戊型肝炎病毒颗粒的存在的试剂盒或装置，其包含至少一种固定或不固定在固体支持物上的权利要求1中的抗体。
15.权利要求14的装置，其是流式免疫分析仪。
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