JP2002171970A

JP2002171970A - 抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2002171970A
Application number: JP2000368336A
Authority: JP
Inventors: 慎治 ▲高▼田; Shinji Takada; 律子 ▲高▼田; Ritsuko Takada
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-12-04
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2002-06-18

Abstract

(57)【要約】【課題】発生学における分析試薬、乳癌等の癌の診断
薬として有用と考えられる抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナ
ル抗体、特に免疫沈降法やウエスタンブロット法のみな
らず、組織免疫染色法にも用いることができる抗Ｗｎｔ
−３ａモノクローナル抗体を提供すること。【解決手段】抗原として、組換えマウスＷｎｔ−３ａ
タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
分画物を大量に用いてマウスを免疫し、かかるマウスの
脾細胞とマウスミエローマを用いて常法により細胞融合
を行い、Ｗｎｔ−３ａタンパク質に対するモノクローナ
ル抗体を得る。得られる抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル
抗体を用いると、免疫沈降の他、Ｗｎｔ−３ａタンパク
質に対するウエスタンブロッティングや、組織に局所的
に発現したＷｎｔ−３ａタンパク質に対する免疫蛍光を
行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｗｎｔ−３ａタン
パク質に対するモノクローナル抗体、特に免疫沈降法や
ウエスタンブロット法のみならず、組織免疫染色法にも
用いることができる抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体
に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物の発生過程における様々な局面で、
細胞間・組織間の相互作用を行う分泌性シグナル分子が
数多く知られている。これらの細胞間シグナル分子の１
つであるＷｎｔファミリーに属するタンパク質は、線
虫、ショウジョウバエからマウス、ヒトにいたる種々の
動物種の発生過程において時間的、位置的に特異的に発
現し、形態形成の誘導因子、細胞の極性決定因子、増殖
分化の調節因子として重要な役割を果たすことが知られ
ている。また、Ｗｎｔという名称は、ショウジョウバエ
のセグメントポラリティ遺伝子の１つwinglessと、マウ
スで発見されたオンコジーンint-1に由来する。

【０００３】現在まで、マウスではＷｎｔ−３ａを含め
少なくとも１８種類のＷｎｔ遺伝子が存在することが知
られており、これら多くのＷｎｔ遺伝子の各々がマウス
初期胚の神経管等で局所的に発現しており、それぞれの
Ｗｎｔ遺伝子が形態形成に固有の役割を担っているとも
のと考えられている。例えば、体幹部の神経管では最も
背側ではＷｎｔ−１，Ｗｎｔ−３ａが、それより少し広
い背側の領域ではＷｎｔ−３が、腹側ではＷｎｔ−５
ａ，Ｗｎｔ−７ａ，Ｗｎｔ−７ｂが、また背側の一部と
最も腹側の底板と呼ばれる領域でＷｎｔ−４が発現して
いる。本発明者らにより作製されたＷｎｔ−３ａノック
アウトマウスでは前肢より後方の体節が神経管に変換す
ること（Genes Dev 8: 174-189, 1994、Dev. Biology 1
83, 234-242, 1997）から、これらの中でもＷｎｔ−３
ａ遺伝子は初期発生における細胞の分化経路の選択に重
要な役割を果たしているものと考えられているが、その
詳細については未だ明らかとなっていない。また、抗Ｗ
ｎｔ−３ａウサギ抗血清については、Burrusらによる免
疫沈降法にのみ使用可能な抗血清に関する報告（ExpCel
l Res , 220(2): 363-373, 1995）や、本発明者らによ
る免疫沈降法やウエスタンブロット法に使用可能な抗血
清に関する報告（Genes to Cells ; 3, 659-670, 199
8）がなされているが、抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル
抗体、特に免疫沈降法やウエスタンブロット法のみなら
ず組織免疫染色法にも用いることができる抗Ｗｎｔ−３
ａモノクローナル抗体は知られていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】脊椎動物のＷｎｔ−３
ａタンパク質の研究を行う上で、Ｗｎｔ−３ａタンパク
質に特異的に反応するモノクローナル抗体を作製するこ
とは、抗血清と異なり同質の抗体を継続的に入手する上
で必要不可欠である。従来、免疫沈降法やウエスタンブ
ロット法に使用可能なＷｎｔ−３ａタンパク質に対する
抗血清は知られているが、Ｗｎｔ−３ａタンパク質の機
能を正確に把握するには、抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナ
ル抗体、特に免疫沈降法やウエスタンブロット法のみな
らず組織免疫染色法にも用いることができる抗Ｗｎｔ−
３ａモノクローナル抗体が求められていた。しかし、現
在までに樹立された脊椎動物のＷｎｔに対する抗体に
は、抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体、特に免疫沈降
法やウエスタンブロット法のみならず組織免疫染色法に
も用いることができる抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗
体は存在しなかった。本発明の課題は、発生学における
分析試薬、乳癌等の癌の診断薬として有用と考えられる
抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体、特に免疫沈降法や
ウエスタンブロット法のみならず組織免疫染色法にも用
いることができる抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体を
提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討し、抗原として組換えマウス
Ｗｎｔ−３ａタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動分画物を大量に用いてマウスを免疫するこ
とにより、意外にも自己タンパク質に対するモノクロー
ナル抗体が得られることを見い出し、得られたモノクロ
ーナル抗体のうちの１つが免疫沈降法やウエスタンブロ
ット法のみならず組織免疫染色法にも用いることができ
るモノクローナル抗体であることを確認し、本発明を完
成するに至った。

【０００６】すなわち本発明は、Ｗｎｔ−３ａタンパク
質に対するモノクローナル抗体又はその可変領域からな
る抗体結合部位を含む抗体フラグメント（請求項１）
や、免疫沈降法、ウエスタンブロット法及び組織免疫染
色法のいずれにも用いることができる請求項１記載のモ
ノクローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結合部
位を含む抗体フラグメント（請求項２）や、請求項１又
は２記載のＷｎｔ−３ａタンパク質に対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに
由来する細胞株（請求項３）や、抗原として、組換えＷ
ｎｔ−３ａタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動分画物を用いることを特徴とする抗Ｗｎｔ−
３ａモノクローナル抗体の製造方法（請求項４）や、請
求項１又は２記載のモノクローナル抗体又はその可変領
域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用い
ることを特徴とするＷｎｔ−３ａの検出方法（請求項
５）や、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントを含むことを特徴とするＷｎｔ−３ａ検出用キット
（請求項６）に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントとしては、Ｗｎｔ−３ａと反応する抗Ｗｎｔ−３ａ
モノクローナル抗体や該モノクローナル抗体の可変領域
からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントであれば
どのようなものでもよいが、免疫沈降法やウエスタンブ
ロット法のみならず組織免疫染色法にも用いることがで
きるモノクローナル抗体や、これらモノクローナル抗体
の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメン
トが好ましい。また、これら抗体フラグメントとして
は、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られる
Ｆ(ａｂ′)₂、Ｆ(ａｂ′)₂を還元して得られるＦａ
ｂ′、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られ
るＦａｂなどを例示することができる。

【０００８】また、上記モノクローナル抗体の製造方法
としては、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1
975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（I
mmunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAP
Y, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方
法における慣用のプロトコールを用いて、動物（好まし
くはヒト以外）に組換えＷｎｔ−３ａタンパク質のＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分画物を大量に投
与することにより産生させる方法を挙げることができ、
この方法による場合、使用する抗原の由来動物種と免疫
する動物種が同じであっても、すなわち抗原として例え
ばマウスＷｎｔ−３ａタンパク質を用いてマウスを免疫
した場合であっても、過度な実験によることなく抗Ｗｎ
ｔ−３ａモノクローナル抗体を得ることができる。例え
ば、ハイブリドーマ法による場合、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動分画物とせず、夾雑物を含むＷｎ
ｔ−３ａタンパク質をそのまま抗原として用いた場合に
は、抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマを得ることが困難である。

【０００９】本発明のＷｎｔ−３ａタンパク質に対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又
はそれらに由来する細胞株としては、抗Ｗｎｔ−３ａモ
ノクローナル抗体を産生することができる細胞株であれ
ば特に制限されるものではなく、かかる抗Ｗｎｔ−３ａ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、組換
えＷｎｔ−３ａタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分画物を大量に投与した動物（好ましく
はヒト以外）の脾細胞と当該動物の由来の骨髄腫細胞と
を、常法により細胞融合させ、ＨＡＴ培地で選択し、そ
の中からＷｎｔ−３ａに対して特異的に免疫反応するこ
とができるものを標識化抗ＩｇＧ抗体等によりスクリー
ニングすることにより作出することができる。かかる抗
Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細
胞株又はそれらに由来する細胞株を、インビボ又はイン
ビトロで常法により培養することにより抗Ｗｎｔ−３ａ
モノクローナル抗体を生産することができ、例えば、イ
ンビボ系においては、マウス又はラット等の齧歯目動
物、好ましくはハイブリドーマと由来を同じくする齧歯
目動物の腹腔内で培養することにより、またインビトロ
系においては、動物細胞培養用培地で培養することによ
り、抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体を得ることがで
きる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための
培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗
生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養
培地を例示することができる。

【００１０】本発明のＷｎｔ−３ａの検出方法として
は、上記本発明のモノクローナル抗体や、該モノクロー
ナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フ
ラグメントを用いる方法であれば特に制限されるもので
はなく、これらモノクローナル抗体等を用いて、ＲＩＡ
法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の免疫学的測定
方法を行うことによりＷｎｔ−３ａを特異的かつ正確に
検出・測定することができる。例えば、固相化された上
記本発明のモノクローナル抗体及び／又はその可変領域
からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと、これ
らモノクローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結
合部位を含む抗体フラグメントとは認識部位を異にす
る、標識化された第２のモノクローナル抗体及び／又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントとを用いる方法や、組織において局所発現したＷｎ
ｔ−３ａタンパク質に特異的に結合することができる本
発明のモノクローナル抗体と該モノクローナル抗体に対
する標識化二次抗体（抗Ｉｇ抗体）とを用いる方法等を
挙げることができる。上記固相化用の担体としては、シ
リコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビー
ズ、マイクロプレート、試験管、フィルター、メンブレ
ン等を用いることができる。

【００１１】本発明において組織免疫染色法とは、標識
化抗体を用いる免疫反応により組織・細胞等を顕微鏡等
で観察することができるように染色する方法をいい、以
下、組織免疫染色法の一つである蛍光抗体法（免疫蛍光
法）を例にとって説明する。蛍光抗体法は、蛍光標識し
た抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体を用いて、組織や
細胞におけるＷｎｔ−３ａタンパク質の局在を蛍光顕微
鏡下に検出する方法であり、かかる蛍光抗体法として
は、パラホルムアルデヒド等で処理した組織において局
所発現したＷｎｔ−３ａタンパク質に蛍光標識した抗Ｗ
ｎｔ−３ａモノクローナル抗体を用いる直接蛍光抗体法
や、パラホルムアルデヒド等で処理した組織において局
所発現したＷｎｔ−３ａタンパク質に未標識の抗Ｗｎｔ
−３ａモノクローナル抗体（一次抗体）を結合させた後
に蛍光標識した二次抗体（抗Ｉｇ抗体）を結合させる間
接蛍光抗体法とを例示することができる。抗体の蛍光標
識には、緑色系のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシ
アネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソ
チオシアネート）、Ｃｙ３（シアニン−３）等の蛍光物
質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光
タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いるこ
ともできる。また、上記組織免疫染色法において、モノ
クローナル抗体に代えて、前記Ｆ(ａｂ′)₂、Ｆａｂな
どの該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合
部位を含むＷｎｔ−３ａに結合する抗体フラグメントを
使用することもできる。

【００１２】また、本発明のＷｎｔ−３ａの検出方法に
おいて、抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体や抗体フラ
グメントの標識物質としては、上記蛍光物質の他、β−
ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ等の酵素を例示することができ、これら酵素
は「酵素標識法(生物化学実験法 27 ) 」 (第1 版、石
川栄治著、学会出版センター、1991年)などに記載され
ている方法で標識することができる。またこれら酵素に
代えて、例えば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ等のラジオア
イソトープを用いることもできる。

【００１３】本発明のＷｎｔ−３ａ検出用キットとして
は、本発明のモノクローナル抗体や抗体フラグメントが
含まれている検出用キットであれば特に制限されるもの
でなく、例えば、本発明のモノクローナル抗体及び／又
は抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又は抗体
フラグメントとは異なる部位でＷｎｔ−３ａと反応する
少なくとも１種の第２の標識化モノクローナル抗体及び
／又は抗体フラグメントとが含まれている検出・測定用
キットや、本発明のモノクローナル抗体と該モノクロー
ナル抗体に対する標識化二次抗体（抗Ｉｇ抗体）とが含
まれている検出・測定用キットなどを挙げることができ
る。

【００１４】

【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。実施例１［マウスＷｎｔ−３ａタンパク質の調製］マウスＷｎｔ−３ａタンパク質（２９〜３５２アミノ酸
残基のタンパク質のアミノ末端にＨｉｓタグを融合した
融合タンパク質）をコードするＤＮＡを用いて大腸菌
（BL21(DE3)plys S）を形質転換した。この形質転換細
胞を培養することによってマウスＷｎｔ−３ａタンパク
質を発現させ、ニッケルアガロースレジン（Quiagen社
製「Ni-NTA Agarose」）を用いて精製した。さらにこの
精製物を文献（Nature : 227,, 680-685, 1970）記載の
方法に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分画し、Ｗｎｔ−３ａタンパク質に相当するバン
ド（３８ｋＤ）を調製した。すなわち、精製したマウス
Ｗｎｔ−３ａタンパク質を塩析法により濃縮し、ＳＤＳ
を含む１３％のアクリルアミド分離ゲル（１８０×２４
５×３ｍｍ）を用いて電気泳動的に分離し、マウスＷｎ
ｔ−３ａタンパク質に対応するバンドをゲルを染色固定
することなく切り出した。切り出したゲルバンドは０．
００１％ブロモフェノールブルー溶液に浸して１０分間
振盪後、ＳＤＳを含む８％アクリルアミドゲル（bottom
gel）と４％アクリルアミドゲル（upper gel）との間
に挟み込み、通常とは逆向きに電気泳動することによ
り、ゲル上部にマウスＷｎｔ−３ａタンパク質を溶出さ
せ、回収した。

【００１５】実施例２［動物への免疫］上記得られたマウスＷｎｔ−３ａタンパク質０．４ｍｇ
相当量の抗原溶液（０．８ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｌをＰ
ＢＳで１ｍｌとする）を、同容量のフロイント・コンプ
リート・アジュバンド（Difco Lab.社製）と共にエマル
ジョン化させ、生後６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本
クレア社製）４匹に等分して腹腔内に投与し免疫した。
この１次免疫から１４日後、０．４ｍｇ相当量の抗原溶
液（１ｍｌ容量）を０．１ｍｌの免疫増強剤（RIBI社製
「リビ・アジュバント・システム」）と混濁状態にし
て、各免疫マウス４匹に等分して腹腔内に投与し２次免
疫した。２次免疫から１２日後、各マウスの眼底より採
血し、Ｗｎｔ−３ａタンパク質に対する抗体が各マウス
の体内で作られていることを確認するためにＥＬＩＳＡ
法により抗体価の上昇について調べた。さらに１０日後
（２次免疫から２２日後）３次免疫を行った。３次免疫
は、０．４ｍｇ相当量の抗原溶液（１ｍｌ容量）のみを
各免疫マウス４匹に等分して腹腔内に投与することによ
り行った。

【００１６】実施例３［抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマ細胞株の樹立］最後の免疫から３日後に、抗体価の高かった２匹の免疫
マウスの脾臓から得られたリンパ球と、p3-X63-Ag8-U1
マウスミエローマ細胞とを５０％のポリエチレングリコ
ール４０００（Boehringer Mannheim製）に加えて細胞
融合させた。この融合により得られたハイブリドーマ細
胞を、１０％のＦＣＳを含むＨＡＴ培地で２週間培養し
た。ハイブリドーマ細胞を含む培地の上清画分０．１ｍ
ｌを、前記抗原として用いたマウスＷｎｔ−３ａタンパ
ク質をコーティングした９６ウエル培養プレートの各ウ
エルに加えて室温で６０分間培養した後、培養液を捨て
０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後に、
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化抗マウス
ＩｇＧ抗体（ZYMED社製）を用いて、マウスＷｎｔ−３
ａに対するモノクローナル抗体の有無を検出した。その
結果、９２０ウエル中、マウスＷｎｔ−３ａと反応性の
ある１２株を選択した。

【００１７】実施例４［二次スクリーニング］上記１２株の抗原反応性ハイブリドーマ細胞株から、Ｗ
ｎｔ−３ａタンパク質に特異性の強い反応を示すハイブ
リドーマ細胞株を二次スクリーニングするために、ウエ
スタンブロッティングを行った。Ｗｎｔ−３ａタンパク
質発現マウスL細胞とＷｎｔ−３ａタンパク質未発現マ
ウスL細胞の各細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法にかけ、分離したタンパク質をメンブレン
フィルター（MILIPORE社製「Immobilon transfer membr
anes」）にブロッティングした。このブロッティングし
た膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ（50mM Tris-HC
l,pH7.6−150mM NaCl）でブロッキングした後、上記１
２株のハイブリドーマ細胞株の各培養上清８０μｌを用
いて、室温で６０分間インキュベーションした。インキ
ュベーションした膜を０．０５％のツイーン２０を含む
ＴＢＳで洗浄後、５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈
したＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体のＦ(ａｂ′)₂フ
ラグメント（NA 9310；Amersham Pharmacia Biotech）
溶液に浸した。抗原特異的ＨＲＰ反応により生じた化学
ルミネッセンスをKodak Scientific Imaging Film（X-O
MAT AR, Kodak）とECL detection kit（Amersham Pharm
acia Biotech）により視覚化した。その結果、１２株の
うち、Ｗｎｔ−３ａタンパク質に対して特異性の強い反
応を示す３つのクローン、＃３、＃７、＃１１が得られ
た。また、＃３、＃７、＃１１等のクローンの産生する
免疫グロブリン抗体のサブクラスを、マウス・モノクロ
ーナル・アイソタイプ・キット（ＲＰＮ２９；Amersham
Pharmacia Biotech）により調べた結果、全てＩｇＧ１
であることがわかった。なお、上記ハイブリドーマ＃
３、＃７、及び＃１１株は、京都市左京区吉田河原町１
４にある財団法人近畿地方発明センター内の科学振興事
業団近藤誘導分化プロジェクト研究室において保存さ
れ、一定の条件の下で関係者に分譲される。

【００１８】実施例４［モノクローナル抗体の特異性］上記得られた抗マウスＷｎｔ―３ａモノクローナル抗体
のＷｎｔ−３ａに対する特異性を調べるために、ウエス
タンブロット分析を行った。Ｗｎｔ−３ａタンパク質を
発現させたマウスL細胞の細胞抽出液をＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動法により分離し、分離したタンパ
ク質をメンブレンフィルター（MILIPORE社製「Immobilo
n transfer membranes」）にブロッティングした。この
ブロッティングした膜を、５％スキムミルクを含むＴＢ
Ｓで５倍希釈した＃３、＃７又は＃１１クローンの産生
するモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ細胞株の
各培養上清中、室温で６０分間インキュベーションし
た。０．０５％のツイーン２０を含むＴＢＳで洗浄後、
５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈したＨＲＰ標識化
抗マウスＩｇＧ抗体のＦ(ａｂ′)₂フラグメント（NA 93
10；Amersham Pharmacia Biotech）溶液に上記インキュ
ベーションした膜を浸した。抗原特異的ＨＲＰ反応によ
り生じた化学ルミネッセンスをKodak Scientific Imagi
ng Film（X-OMAT AR, Kodak）とECL detection kit（Am
ersham Pharmacia Biotech）により視覚化した。その結
果を図１に示す。なお、コントロール（Ｌ）としては、
マウスＷｎｔ−３ａタンパク質未発現のマウスL細胞の
細胞抽出液を用いた。このことから、これら３つのクロ
ーンから産生されるモノクローナル抗体は、マウスＷｎ
ｔ−３タンパク質と特異的に反応することから、マウス
Ｗｎｔ−３ａタンパク質の発現を検出するのに有効であ
ることがわかった。

【００１９】実施例５［組織染色能］本発明の抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体が組織染色
に使用できるか否かを検討してみた。マウス９．５日胚
を、３．５％のパラホルムアルデヒドを添加したＰＢＳ
により４℃で１５分間振盪固定した後、O.C.T. compoun
d（Tissue-Tek社製）を用いて包埋しクライオスタット
（Leica社製）で１０μｍの厚さのtransverse切片を作
製し、ＡＰＳコートしたスライドガラスに固定した。こ
のtransverse切片を室温で２０分間乾燥させた後、ＴＢ
Ｓ中で室温にて５分間洗浄し、−２０℃のメタノールに
浸漬し、再度ＴＢＳで洗浄した後、２％のＢＳＡを含む
ＨＡＮＫＳ（Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺を含まない）中で室温にて
１０分間ブロッキングし、実施例３により得られた＃３
クローンの産生するモノクローナル抗体を含むハイブリ
ドーマ細胞株の培養上清を２％のＢＳＡを含むＨＣＭＦ
Ｓで希釈して調製した溶液を上記ブロッキングした切片
にのせ、室温で６０分間反応させた。これら反応させた
切片をＴＢＳ中で室温にて５分間×３回振盪して洗浄し
た後、２％のＢＳＡを含むＴＢＳで１００倍希釈したＣ
ｙ３標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Chemicon Internation
Inc.社製）を用いて室温にて３０分間染色した。これ
ら染色物を遮光したままＴＢＳ中で室温にて５分間×３
回振盪して洗浄した後、グリセリンで封入し、蛍光顕微
鏡で観察した。この結果を図２に示す。図２において神
経管の蓋板に染色が認められることから、＃３クローン
の産生する抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体は組織染
色に使用可能であることがわかった。

【００２０】

【発明の効果】本発明によると、発生学における分析試
薬として有用であり、乳癌等の癌の診断薬として有用と
考えられる抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体、特に免
疫沈降法やウエスタンブロット法のみならず、組織免疫
染色法にも用いることができる抗Ｗｎｔ−３ａモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体の
特異性に関するウエスタンブロットの結果を示す図であ
る。

【図２】本発明の抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナル抗体を
用いたマウス胚におけるＷｎｔ−３ａタンパク質の局在
に関する組織免疫蛍光の結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91） 5/00 ＢＦターム(参考） 4B024 AA12 BA43 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA04 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 DA14 4B065 AA26X AA91Y AA92X AB01 AB05 BA02 BA08 CA24 CA25 CA46 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 EA51 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｗｎｔ−３ａタンパク質に対するモノク
ローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結合部位を
含む抗体フラグメント。
【請求項２】免疫沈降法、ウエスタンブロット法及び
組織免疫染色法のいずれにも用いることができる請求項
１記載のモノクローナル抗体又はその可変領域からなる
抗体結合部位を含む抗体フラグメント。
【請求項３】請求項１又は２記載のＷｎｔ−３ａタン
パク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株。
【請求項４】抗原として、組換えＷｎｔ−３ａタンパ
ク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分画物
を用いることを特徴とする抗Ｗｎｔ−３ａモノクローナ
ル抗体の製造方法。
【請求項５】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フ
ラグメントを用いることを特徴とするＷｎｔ−３ａの検
出方法。
【請求項６】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フ
ラグメントを含むことを特徴とするＷｎｔ−３ａ検出用
キット。