CN112384204A - 致耐受性脂质体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于治疗与病理性免疫应答相关的疾病和状况的组合物(例如脂质体),以及用于配制和施用此类组合物的方法。
Description
发明领域
本发明的特点在于用于治疗与病理性免疫应答相关的疾病和状况的致耐受性脂质体(例如,纳米大小的脂质体),以及用于配制和施用此类组合物的方法。
序列表
本申请含有序列表,所述序列表已以ASCII格式电子提交,并且在此整体引入作为参考。于2019年2月26日创建的ASCII副本命名为51172-002WO3_Sequence_Listing_2.26.19_ST25,且大小为20,219字节。
背景
人免疫系统包括先天性臂和适应性臂,后者由体液(抗体介导的)和细胞组分组成。适应性免疫应答必须区分作为免疫应答的适当靶的与引起疾病的微生物(例如寄生虫、细菌和病毒)相关的抗原和不应由免疫系统靶向的与自身相关的抗原。适应性免疫系统的多样性生成机制并不作出这种区别。相反,称为耐受化的过程引起自身反应性免疫细胞在发育早期被缺失。对宿主(自身)抗原的耐受出现失败或随后丧失对宿主(自身)抗原的耐受,与自身免疫性疾病相关,所述自身免疫性疾病是可以影响一个或多个器官(例如,脑、外周神经系统、肝脏、肾脏、胰腺、胃肠道、关节、皮肤、眼和耳)的多样化状况集合。
患有自身免疫性疾病的患者中对自身抗原的耐受恢复是长期寻求,但迄今为止难以实现的治疗目标。以各种制剂和施用途径施用与疾病相关的自身抗原有效压制自身免疫性疾病的动物模型(例如,小鼠和大鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎;自身免疫性糖尿病的NOD小鼠模型)中的疾病,但在人患者中进行测试时令人失望。
致耐受性信号对免疫细胞的递送、或抗原和致耐受性信号的共递送,是有希望的方法,受到动物数据支持,但它们尚未在人中进行充分测试,以得出关于其潜在治疗效用的结论。
用于自身免疫性疾病的现有疗法整体压制免疫(例如抗增殖剂,如氨甲蝶呤、硫唑嘌呤或来氟米特),靶向适应性免疫系统的一臂(例如,B细胞耗竭抗体利妥昔单抗),或者整体压制促炎信号(例如,抗肿瘤坏死因子α抗体,如英夫利昔单抗和阿达木单抗)。因此,在该领域中需要改进的治疗策略,用于在致病性免疫,例如自身免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病的情况下,选择性地恢复对一种或多种自身抗原的耐受。
各种创新性医学治疗,包括肽和蛋白质治疗剂以及基因疗法(经常使用病毒载体递送),需要使患者的免疫系统暴露于经常被识别为外来的新抗原(新生抗原)。此类非天然治疗组合物对患者的重复施用可以引发免疫识别和治疗有效性的随后丧失,并且可能诱导危险的副作用,如过敏反应。需要改进的方法和组合物,以预防新生抗原的免疫识别和/或选择性地加强对此类免疫原性治疗组合物的免疫耐受。
概述
本发明的特点在于通过亲脂性芳香烃受体激动剂(例如ITE)的有效递送,用于治疗免疫系统的病理状况,例如自身免疫;用于预防或逆转与治疗性蛋白或基因治疗载体相关的新生抗原的免疫识别;以及用于诱导或维持对否则潜在免疫原性的治疗组合物的耐受的致耐受性脂质体(例如,纳米大小的脂质体),所述激动剂可以被配制用于由抗原呈递细胞(例如免疫系统的抗原呈递细胞,例如树突状细胞)摄取,或者与一种或多种抗原共递送,所述抗原根据待治疗的疾病、或者根据待针对其诱导免疫耐受以增强功效的治疗性蛋白或病毒载体进行选择。
在第一个方面,本发明的特点在于包括脂质体群体的组合物。脂质体群体可以具有50至250纳米(nm;例如50至250 nm、50至200 nm、50至150 nm、75至125 nm、80至120 nm、90至110 nm、或95至105 nm,例如约60 nm、约70 nm、约80 nm、约90 nm、约95 nm、约100 nm、约105 nm、约110 nm、约120 nm、或约125 nm)的平均直径。脂质体群体可以进一步具有0.3或更大(例如0.4或更大)的平均去饱和指数,以及200-15,000个2-(1H-吲哚-3-基羰基)-4-噻唑甲酸甲酯(ITE)或其盐的分子/脂质体的平均值。在一些实施方案中,脂质体群体具有0℃至70℃的平均相变温度。在一些实施方案中,脂质体群体包含脂质混合物,所述脂质混合物包含饱和脂质种类和不饱和脂质种类(例如,单不饱和脂质种类),其中所述不饱和脂质种类具有不饱和键,并且占脂质混合物的至少50%(例如,按摩尔百分比计至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%)。在一些实施方案中,不饱和脂质种类具有两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包括单个不饱和键。在一些实施方案中,不饱和脂质种类衍生自天然来源,例如蛋或大豆,并且可以包含脂质的混合物(例如,在脂肪酸链长方面不同)。在替代实施方案中,不饱和脂质种类是合成产生的,并且由单一限定的磷脂化合物组成。
在一些实施方案中,脂质体群体具有-60℃至80℃的平均相变温度。在一些实施方案中,脂质体群体包含脂质混合物,所述脂质混合物包含饱和脂质种类和不饱和脂质种类(例如,单不饱和脂质种类),其中所述不饱和脂质种类具有不饱和键,并且占脂质混合物的至少20%(例如,按质量或按摩尔百分比计至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%或更多)。在一些实施方案中,不饱和脂质种类具有两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包括单个不饱和键。在一些实施方案中,不饱和脂质种类衍生自天然来源,例如蛋或大豆,并且可以包含脂质的混合物。在替代实施方案中,不饱和脂质种类是合成产生的,并且由单一限定的磷脂化合物组成。
在另一个方面,本发明的特点在于包括脂质体群体的组合物,所述脂质体群体具有50至250 nm(例如75-125 nm或90-120 nm)的平均直径,其中所述脂质体群体具有0℃至70℃的平均相变温度;以及150-15,000(例如200-15,000)个ITE或其盐的分子/脂质体的平均值。在一些实施方案中,脂质体群体具有0.3或更大(例如0.4或更大)的平均去饱和指数。在一个实施方案中,脂质体群体由包含饱和脂质种类和不饱和脂质种类的脂质混合物产生,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占脂质混合物的至少20%(例如至少50%)。在一些实施方案中,不饱和脂质种类包含两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包含单个不饱和键。在一些实施方案中,至少一个磷脂种类的头基通过至少20个乙二醇单元的聚(乙二醇)链的共价附着进行修饰。
在另外一个方面,本发明的特点在于包括脂质体群体的组合物,所述脂质体群体具有50至250 nm(例如75-125 nm或90-120 nm)的平均直径。这种脂质体群体可以包括具有饱和脂质种类和不饱和脂质种类的脂质混合物,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占脂质混合物的至少50%。这种脂质体群体可以具有150-15,000个ITE分子/脂质体的平均值。在一些实施方案中,脂质体群体具有0℃至70℃的平均相变温度。另外地或可替代地,脂质体群体可以具有0.3或更大的平均去饱和指数。在一些实施方案中,不饱和脂质种类包含两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部具有单个不饱和键。在一些实施方案中,不饱和碳-碳键是从脂质的自由端(例如未与甘油共价结合的端部)开始的至少第三个碳-碳键(例如,第三个、第四个、第五个、第七个、第八个、第九个、第十个、第十一个或第十二个碳-碳键)。在一些实施方案中,如在卵PC中,不饱和碳-碳键是从脂质的自由端开始的第九个碳-碳键。
在任何前述方面的一些实施方案中,脂质体群体可以进一步包括抗原/ITE的质量比为1:10至100:1(例如1:10至10:1)的抗原。另外或可替代地,脂质体群体可以进一步包括抗原/ITE的摩尔比为25:1至1:200(如果抗原是长度8 – 50个氨基酸的肽)、或摩尔比为4:1至1:5000(如果抗原是蛋白质)的抗原。对于多蛋白组装(例如病毒衣壳),质量比和摩尔比可能超过这些范围。
在另一个方面,本发明的特点在于平均直径为50至250纳米(nm;例如75-125 nm或90-120 nm)的脂质体群体的组合物,其中所述脂质体群体具有(i)150-15,000个ITE或其盐的分子/脂质体的平均值,以及(ii)抗原/ITE的质量比为1:10至100:1(例如1:10至10:1)的抗原。在一些实施方案中,脂质体群体具有0.3或更大的平均去饱和指数。另外地或可替代地,脂质体群体包含0℃至70℃的平均相变温度。在一些实施方案中,脂质体群体包含具有饱和脂质种类和不饱和脂质种类的脂质混合物,其中所述不饱和脂质种类具有不饱和键,并且占脂质混合物的至少50%。在一些实施方案中,不饱和脂质种类包含两个脂质尾部,其中每个脂质尾部包含单个不饱和键。
在一些实施方案中,抗原是肽抗原(例如与自身免疫性病症相关的肽抗原,所述自身免疫性病症例如类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病或乳糜泻)。该肽可以包含一种或多种翻译后改变,例如糖基化、脂化或氨基酸侧变的修饰(例如,将精氨酸或赖氨酸改变为瓜氨酸)。例如,在一些实施方案中,肽抗原包括SEQ ID NO:1-81中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中,肽抗原包括与SEQ ID NO:1-81中任一个具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中,该肽与类风湿性关节炎相关(例如瓜氨酸化的β纤维蛋白原肽、瓜氨酸化的II型胶原肽、瓜氨酸化的丝聚蛋白肽或瓜氨酸化的波形蛋白肽,例如具有SEQ ID NO:1 -4中任一个的氨基酸序列)。在一些实施方案中,抗原和/或肽与1型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)相关(例如前胰岛素原肽、IA-2肽、phogrin肽、IGRP肽、GAD65肽或嗜铬粒蛋白A肽,例如具有SEQ ID NO:5-81中任一个的氨基酸序列的抗原)。
在一些实施方案中,本发明提供了使受试者耐受治疗试剂(例如重组蛋白,例如因子VIII)的方法。在一些实施方案中,本发明提供了降低针对治疗试剂的免疫应答(例如,细胞因子分泌、抗体生成等)的方法。在一些实施方案中,待针对其建立耐受的抗原是治疗试剂,例如治疗性重组蛋白或其一部分。
在一些实施方案中,抗原衍生自用于递送核酸的载体(即,基因治疗载体)。基因治疗载体包括天然和改造的病毒载体,以及非病毒蛋白、糖蛋白、脂质、多糖和其它天然或非天然聚合物,其用于包装且保护核酸免于核酸酶,和/或将核酸靶向特异性器官或细胞类型。核酸可以编码基因或基因的一部分,或者它可以包含用于校正内源基因的DNA片段,例如如CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)基因编辑技术中。可以被接受治疗的患者的免疫系统识别的基因治疗载体的任何组分(即,任何新生抗原)构成抗原,针对所述抗原的免疫耐受诱导可以改善基因疗法的效用。
在一些实施方案中,治疗试剂是免疫原性的。在一些实施方案中,治疗试剂是治疗性蛋白或肽。在一些实施方案中,治疗试剂是病毒或其衣壳蛋白。在其它实施方案中,治疗试剂是编码治疗性蛋白或肽和/或病毒或其衣壳蛋白的多核苷酸。
在一些实施方案中,治疗试剂是病毒载体,例如AAV或其衣壳蛋白。在一些实施方案中,病毒载体例如AAV包括DNA。在一些实施方案中,DNA是单链DNA(ssDNA),例如cDNA或其片段(例如人cDNA或其片段)。在其它实施方案中,病毒载体例如AAV包括RNA。在一些实施方案中,RNA是微小RNA(miRNA)。
在任何前述实施方案中,脂质体群体具有在-10和-50 mv之间的平均ζ电位。在替代实施方案中,脂质体群体具有在+10和+40 mv之间的平均ζ电位。可替代地,脂质体群体具有-50至+40 mv的平均ζ电位。
在另一个方面,本发明的特点在于治疗患有自身免疫性病症的受试者的方法。该方法可以包括向受试者施用治疗有效量的任何前述实施方案的组合物。施用可以是经口、静脉内、皮下、皮内(例如表皮内)、透皮、关节内、肺或粘膜施用。在一些实施方案中,所施用的组合物的剂量包含50 μg至15 mg ITE(例如,75 µg至10 mg、75 µg至7.5 mg、100 µg至7.5 mg、150 µg至5 mg、200 µg至5 mg、或250 µg至2.5 mg ITE,例如50 µg至100 µg、100 µg至150 µg、150 µg至200 µg、200 µg至250 µg、250 µg至300 µg、300 µg至350 µg、350 µg至400 µg、400 µg至450 µg、450 µg至500 µg、500 µg至600 µg、600 µg至700 µg、700 µg至800 µg、800 µg至900 µg、900 µg至1.0 mg、1.0 mg至5.0 mg、5.0 mg至10 mg、或10 mg至15mg ITE)。在一些实施方案中,受试者患有自身免疫性疾病或处于发展自身免疫性疾病的风险中(例如基于遗传倾向、家族史或血清学生物标记物),所述自身免疫性疾病例如I型糖尿病、类风湿性关节炎或乳糜泻,或者将用潜在抗原性治疗性肽、蛋白质、病毒载体、核酸或细胞组合物进行治疗。在这些实施方案的任一个中,脂质体或其组合物可以包括治疗性蛋白或肽(例如抗体)或其一部分(例如图13中描述的治疗性蛋白或其一部分)。
在一些实施方案中、所施用的组合物的剂量包含1 μg至10 mg ITE(例如10 µg至10 mg、50 µg至5 mg、100 µg至1 mg、150 µg至500 µg、200 µg至400 µg、或250 µg至250 µgITE,例如1 µg至10 µg、10 µg至50 µg、50 µg至100 µg、100 µg至150 µg、150 µg至200 µg、200 µg至250 µg、250 µg至300 µg、300 µg至350 µg、350 µg至400 µg、400 µg至450 µg、450 µg至500 µg、500 µg至600 µg、600 µg至700 µg、700 µg至800 µg、800 µg至900 µg、900 µg至1.0 mg、1.0 mg至5.0 mg、或5.0 mg至10 mg ITE)。在一些实施方案中,受试者患有类风湿性关节炎或1型糖尿病,或者处于发展类风湿性关节炎或1型糖尿病的风险中。
在另一个方面,本发明的特点在于这样的方法,其通过诱导针对与治疗组合物(例如,图13中列出的任何组合物)相关的一种或多种新生抗原的免疫耐受,用于改善肽、蛋白质或基因疗法的功效和安全性,并且从而改善治疗(例如,图13中列出的任何组合物)的药代动力学(例如延长半衰期)、递送(例如增加病毒转导的效率)、多剂量治疗方案的功效(其否则诱导阻断免疫应答)和安全性(例如预防过敏反应),以及其它益处。该方法可以包括以治疗有效量,经由任何前述实施方案的施用途径,向受试者施用任何前述实施方案的组合物。
在另一个方面,本发明的特点在于合成或制造致耐受性脂质体(例如,纳米大小的脂质体)群体的方法。该方法可以包括下述步骤:(i)混合两个或更多个脂质种类,以形成脂质混合物,其中所述脂质混合物具有(a)0.3或更大的平均去饱和指数;(b)0℃至70℃的平均相变温度;或(c)饱和脂质种类和不饱和脂质种类,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占脂质混合物的至少50%。步骤(ii)包括将ITE加入脂质混合物中,或者作为干粉,或者其中将ITE溶解于溶剂如二甲基亚砜(DMSO)中,并且以按脂质的质量计0.4%至1%,例如0.5%至1%、0.55%至0.95%、0.6%至0.85%、或0.65%至0.75%的量,加入脂质混合物(溶解于乙醇中)中。步骤(iii)包括将含有ITE的脂质混合物(溶解于乙醇溶液中)加入水相中,并且混合以形成粗制脂质体。接下来,步骤(iv)涉及挤出粗制脂质体(例如,通过选定孔径的滤器),以形成致耐受性纳米微粒脂质体(例如在限定的尺寸范围内,例如直径50 - 250 nm)的群体。在一些实施方案中,致耐受性纳米微粒脂质体的群体是任何前述方面的组合物。在一些实施方案中,脂质体的水性内部包含一种或多种抗原。
附图简述
图1A是显示了在各种浓度的PEG2000-DSPE下,在PEG2000-DSPE胶束中的ITE封装效率的图解。图1B是显示了不同胆固醇摩尔百分数和卵PC浓度对ITE装载的作用的图解(参见实施例5)。
图2是显示了在各种浓度的TPGS下,在TPGS胶束中的ITE封装效率的图。
图3A和3B是一组图,其显示了在从小鼠脾脏中分离的树突状细胞中,通过ITE诱导的来自卵PC脂质体或对照的CYP1a1 mRNA表达(图4A)和Cyp1b1 mRNA表达(图4B)。不含ITE的脂质体针对ITE脂质体在颗粒浓度方面进行标准化。
图4是显示了在体外用装载MOG的纳米颗粒刺激后,2D2小鼠的脾细胞增殖的图。不含MOG的脂质体针对其携带MOG的配对物在颗粒浓度方面进行标准化。
图5是显示了如实施例6中所述,用以下处理的小鼠中的EAE进展的图:空的(即,简单的)卵PC脂质体(黑色圆圈);携带ITE的卵PC脂质体(蓝色方块);或携带ITE和MOG的卵PC脂质体(绿色三角形)。简言之,将脂质体悬浮于Hepes缓冲液中,并且在第7天时以150 µL静脉内(眼眶后)施用于5只小鼠的组。装载ITE的脂质体含有7μg ITE/剂量。装载MOG35-55的脂质体含有4μg肽/剂量。就EAE的临床体征每天监测小鼠,从第10天开始,并且一直持续到第24天,实验的最后一天。EAE如下评分:0,无疾病体征;1,尾部中的张力丧失;2,后肢轻瘫;3,后肢瘫痪;4,四肢瘫痪;和5,垂死。对于每组5只小鼠计算平均评分和平均值的标准误差。
图6显示了如上文和实施例6中所述,在用空的卵PC脂质体(黑色圆圈)、携带ITE的卵PC脂质体(蓝色方块);或携带ITE和MOG的卵PC脂质体(绿色三角形)体内处理后,用MOG35-55离体再刺激后,来自脾脏的细胞增殖。
图7A和7B是一组图,其显示了如通过IL-17阳性T细胞(图7A)和IFNγ阳性T细胞(图7B)的百分比测量的,实施例6中所述的处理对效应T细胞浸润到CNS内的作用。
图8A和8B是一组图,其显示了如实施例6所述处理的小鼠的CNS中,抗原特异性Treg(图10A)和Tr1细胞(图10B)的增加。
图9A和9B是显示了具有胶原诱发性关节炎的小鼠,对在疾病引发的第-1天时(疾病预防模型)开始的、用脂质体(简单的、装载有II型胶原、装载有ITE和装载有ITE + II型胶原)的疾病预防的累积严重性评分和关节炎肢体数目的图。
图10A、10B、10C和10D是一组图,其分别显示了用装载有ITE+CII的脂质体处理对血清中的抗II型胶原IgG2a抗体滴度、在关节中通过qPCR定量的FoxP3和IL10的mRNA表达水平、以及在疾病引发的第-1天时(疾病预防模型)处理的小鼠的脾脏中的CII反应性CD4+效应T细胞频率的作用。
图11A、11B和11C是一组图,其显示了具有胶原诱发性关节炎的小鼠,对在疾病引发后的第32天时(疾病治疗模型)开始的、用脂质体(简单的、装载有II型胶原、装载有ITE和装载有ITE + II型胶原)的疗法的应答。显示了累积严重性评分(11A)、关节炎肢体数目(11B)和平均爪厚度(11C)。
图12A和12B是一组图,其显示了用装载有ITE+CII的脂质体处理对小鼠血清中的抗II型胶原IgG2a和IgG2b抗体滴度的作用,所述小鼠从疾病引发后的第32天(疾病治疗模型)开始治疗。
图13是各种批准的治疗性抗体的列表概括。
详述
本发明的特点在于可用作用于疾病的治疗的耐受性脂质体(例如,纳米微粒脂质体),所述疾病例如自身免疫性疾病(例如,类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病和乳糜泻)。进一步地,本发明提供了潜在地免疫原性治疗组合物的安全和有效施用(包括重复施用),所述治疗组合物包括治疗性肽和蛋白质、病毒基因治疗载体、核酸治疗剂和细胞疗法(例如,经由输血)。致耐受性脂质体还可以用于降低或预防移植器官(例如,肾脏、肝脏、肺、心脏或骨髓移植)的排斥,并且预防或治疗移植物抗宿主病。特别地,本发明的特点在于具有脂质组合物的脂质体,所述脂质组合物被配置为将诱导耐受的芳香烃受体配体2-(1H-吲哚-3-基羰基)-4-噻唑甲酸甲酯(ITE)或其盐,连同有关抗原一起有效地携带至抗原呈递细胞例如树突状细胞。
定义
除非另有定义,否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义,并且通过参考公开的文本,其向本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。在本文阐述的定义与参考出版物的定义之间的任何冲突定义的情况下,以本文提供的定义为准。
如本文使用的,术语“纳米大小的脂质体”和“脂质体”指直径在50至250纳米(nm)之间的球形膜结合囊泡。在特定实施方案中,脂质体是单层的;然而,多层脂质体也是有用的并且由本发明涵盖。脂质体的直径可以使用本领域已知的任何合适方法来测量,所述方法例如动态光散射(DLS;例如,使用ZetaSizer仪器;Malvern Panalytical,Malvern,UK)、布朗运动分析(例如,纳米颗粒跟踪分析,如通过NanoSight仪器提供的;MalvernPanalytical,Malvern,UK)等。
如本文使用的,术语“胶束”指基本上球形的颗粒,其特征在于通过两亲分子(例如,两亲聚合物)的组装形成的疏水核和亲水壳。在某些实施方案中,当两亲聚合物在合适的溶剂(例如水溶液)中超过临界阈值浓度时,胶束自组装成核-壳构型。外部(亲水)部分可以是聚乙二醇(例如,PEG-500、PEG-1000、PEG-2000、PEG-3000、PEG-5000,其中数字指近似分子量。(聚[乙二醇]的每个乙二醇单元贡献44道尔顿,加上非重复的末端基团,因此PEG-1000含有约22个乙二醇单元)。两亲物的内部部分可以是脂质、聚合物、氨基酸、芳香族化合物或组合。胶束的实例包括聚合物-脂质胶束(例如,在外部上具有聚乙二醇,而在内部上具有脂肪酸,例如油酸)、聚合物-磷脂-胶束(例如,杂化聚合物胶束(例如,在外部上具有亲水性聚合物例如聚乙二醇,而在内部中具有相对疏水性的聚合物例如聚(D,L-丙交酯)。两亲物的亲水部分和疏水部分可以通过各种化学基团,使用标准附着化学进行连接。例如,PEG可以经由磷酸甘油与脂质连接。酰胺、酯和其它键合也是本领域已知的。适合于形成胶束的两亲物从各个供应商(例如,Avanti Polar Lipids、Millipore-Sigma)商购可得。
如本文使用的,术语“胆固醇”泛指胆固醇、其有关固醇及衍生物,其可以与磷脂组合以形成脂质体。即,“胆固醇”涵盖了胆固醇样分子,例如植物甾醇(例如β-谷甾醇或豆甾醇)。术语“胆固醇”还涵盖了固醇修饰的磷脂,其中甘油的sn-1或sn-2位置共价附着至胆固醇(经由接头),而另一个位置附着至脂肪酸链。参见Huang和Szoka,J. Am. Chem. Soc.2008,130(46):15702-15712,其在此随同整体引入。适合于形成脂质体的甾醇改性的磷脂从Avanti Polar Lipids(Alabaster,Alabama)商购可得。
如本文使用的,术语“脂质混合物”指脂质体配方中使用的单酰基磷脂和/或二酰基磷脂(统称为磷脂)与胆固醇的混合物。具有不同头基(附着至甘油)或不同酰基链(酯化为甘油)的磷脂可以与胆固醇以不同比率组合,以产生具有所需特征(例如有效和稳定的ITE装载)的脂质体。脂质混合物中的脂质组分可以按照以百分比项(即,其中脂质体的脂质组分总和为100%)表述的脂质种类的摩尔比来表征。例如,由39 mM磷脂A(65%)、3 mM磷脂B(5%)和18 mM胆固醇(30%)组成的脂质体混合物是65:5:30混合物。本文提供了关于有用的脂质混合物的范围。
如本文使用的,术语“去饱和指数”指考虑到所有磷脂种类以及胆固醇(即,脂质混合物的所有组分),每个脂肪酸的双键数目的加权平均值。脂肪酸链中的第一个双键分配完全权重(1)。如果存在于同一磷脂的第二脂肪酸中,则第二个双键分配0.4权重,或者如果存在于不同的磷脂中,则分配0.5权重。同一脂肪酸中的另外双键给予第一个不饱和键的权重的1/4、1/8、1/16,依此类推(即1、0.5或0.4的1/4、1/8、1/16等)。例如,具有等摩尔量的两个磷脂种类的脂质体,其中一个种类具有两个饱和脂肪酸尾部,而另一个种类具有一个饱和尾部和一个单不饱和尾部(即,4个脂肪酸尾部中的1个在单键处是不饱和的),具有0.25的去饱和指数。与以30%的胆固醇组合,制备35:35:30的摩尔比,由相同的两种磷脂制备的脂质体具有0.175的去饱和指数。具有等摩尔量的两个脂质种类的脂质体,其中一个种类具有两个饱和脂肪酸尾部,而另一个种类具有两个单不饱和尾部,具有0.35(0.25 + 0.10;即,第一个不饱和脂肪酸尾部贡献1 x 0.25权重,而第二个贡献0.4 x 0.25权重)的去饱和指数。具有等摩尔量的两个脂质种类的脂质体,其中一个种类具有两个饱和脂肪酸尾部,而另一个种类具有一个单不饱和尾部和一个双不饱和尾部,具有0.375(0.25 + 0.10 + 0.025)的去饱和指数。详述中提供了另外的实例。
如本文使用的,术语“受试者”包括需要本文所述的治疗或预防方法的任何哺乳动物。在一些实施方案中,受试者是人。需要此类治疗或预防的其它哺乳动物包括犬、猫或其它驯养动物、马、家畜、实验动物,包括非人灵长类动物等。受试者可以是雄性或雌性。在一个实施方案中,受试者患有自身免疫性疾病。在其它实施方案中,受试者将接受潜在地免疫原性肽、蛋白质或基因疗法。受试者可以是在此期间治疗或预防性疗法可能是有益的任何年龄。例如,在一些实施方案中,受试者是0-5岁、5-10岁、10-20岁、20-30岁、30-50岁、50-70岁、或超过70岁。
如本文使用的,术语“新生抗原”指与治疗试剂(例如肽、蛋白质或基因疗法)相关的分子或分子的一部分,其被免疫系统识别并且能够诱导免疫应答。免疫应答的性质可以是体液的(例如,针对新生抗原的中和抗体,其抑制功能、缩短半衰期或触发降解)、细胞的(例如,衍生自新生抗原的肽的T细胞受体识别)或两者。对新生抗原的免疫应答一般干扰治疗功效。
如本文使用的,术语“基因治疗”指任何基于核酸的治疗剂(无论是由天然核苷酸还是非天然核苷酸组成),其设计为替换、校正(例如,通过基因编辑或靶向重组)或改变内源基因的表达(例如,通过寡核苷酸诱导的外显子跳跃或RNA干扰),或者在癌症治疗的情况下,提供设计为利用癌细胞的弱点的新型功能。
如本文使用的,术语“基因治疗载体”指基因治疗组合物的组分,其设计为保护基因治疗(例如,免于核酸酶)、操纵基因治疗(例如,至靶细胞或组织)、增强基因治疗的细胞渗透性(例如,通过病毒转导)、或以其它方式改善基因治疗的功效。基因治疗载体的一种或多种组分经常包含能够诱导免疫应答的非天然成分。病毒基因治疗载体包含一类重要的基因治疗载体。最广泛使用的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、逆转录病毒和牛痘病毒,所有这些都具有多重变体。
如本文使用的,其组合物的“有效量”或“有效剂量”指这样的量,例如当根据选定的施用形式、途径和/或时间表递送至细胞或生物时,所述量足以实现所需生物学(例如免疫学)和/或药理学效应。如本领域普通技术人员将了解的,有效的特定组合物的绝对量可以根据此类因素而变,所述因素如所需的生物学或药理学终点(例如,改善的治疗功效或疗效的延长)、待递送的试剂、靶组织、施用途径、待治疗受试者的年龄和大小、疾病阶段等。本领域普通技术人员将进一步理解,“有效量”可以与细胞接触,或者在单剂量中或通过使用多剂量而施用于受试者。
如本文使用的,术语“治疗”或其语法派生定义为降低疾病的进展、降低疾病症状的严重性、延缓疾病症状的进展、消除疾病症状或延迟疾病的发作等等。
如本文使用的,术语疾病或病症的“预防”或其语法派生定义为降低疾病发作的风险、延迟疾病的发作、或降低疾病的严重性、或其任何组合。预防性治疗通常施用于这样的受试者,其处于发展病症例如自身免疫性病症的增加风险中(与一般群相比),但尚未满足关于疾病诊断的标准。根据本领域已知或本文所述的任何合适方法,通过鉴定与病症(例如HLA单倍型)相关的DNA变体(包括突变),受试者可以表征为处于发展病症的“风险中”。可替代地,如果受试者对于与病症的未来发展相关的任何生物标记物(例如自身抗体)呈阳性,则该受试者可以表征为处于发展病症的“风险中”。另外地或可替代地,如果受试者具有病症的家族史,则该受试者可以表征为处于发展病症的“风险中”。针对治疗性肽、蛋白质、病毒基因治疗载体、核酸或细胞的免疫应答的“预防”意指阻断、降低或延迟针对治疗试剂的免疫应答、或其任何组合。
术语“药学上可接受的”意指对于施用于哺乳动物如人是安全的。在一些实施方案中,药学上可接受的组合物由联邦政府(例如,美国食品和药物管理局(United StatesFood and Drug Administration))或州政府的监管机构批准,或者在美国药典或其它一般公认的药典中列出,用于在动物且更特别是人中使用。
术语“载体”指本发明的脂质体组合物与其一起贮存和/或施用的稀释剂、佐剂、防腐剂或其它赋形剂或媒介物。合适的药物载体的实例在“Remington's PharmaceuticalSciences,” Mack Publishing Co.,Easton,PA.,第2版,2005中描述。
术语“一个”和“一种”意指“一个或多个/一种或多种”。例如,“基因”应理解为代表一种或多种此类基因。像这样,术语“一个”和“一种”、“一个或多个(或一种或多种)、以及“至少一个(或至少一种)在本文中可互换使用。
如本文使用的,除非另有说明,否则术语“约”指与参考值在±10%变化性内的值。
对于各种来源或参考文献之间的定义中的任何冲突,以本文提供的定义为准。
组合物
本发明提供了具有脂质组合物的在纳米大小范围内的脂质体,所述脂质组合物被配置用于有效装载ITE用于受试者的免疫系统的耐受化,所述脂质体可以携带待针对其诱导耐受的一种或多种抗原。在一些实施方案中,相对于如通过不同手段(例如,作为游离药物)递送的治疗上有效的那种相比,本发明的组合物使得能够将较少的总ITE递送给受试者。在一些实施方案中,脂质体群体具有150-15,000个ITE分子/脂质体(例如,200-12,500个ITE分子、250-10,000个ITE分子、300-7,500个ITE分子、350-5,000个ITE分子、400-2,500个ITE分子、或450-1,000个ITE分子,例如100-200个ITE分子、200-500个ITE分子、500-1,000个ITE分子、1,000-2,500个ITE分子、2,500-5,000个ITE分子、5,000-7,500个ITE分子、7,500-10,000个ITE分子、或10,000-15,000个ITE分子)的平均值。
本发明的脂质体可以是纳米大小的脂质体。在特定实施方案中,脂质体群体具有50至500 nm(例如60至250 nm、70至200 nm、80至150 nm、85至125 nm、90至110 nm、或95至105 nm,例如约60 nm、约70 nm、约80 nm、约90 nm、约95 nm、约100 nm、约105 nm、约110nm、约120 nm、或约125 nm)的平均(例如,均值或中值)直径。
致耐受性脂质体可以具有-10 mv至-50 mv(例如,-15 mv至-45 mv、-20 mv至-40mv、或-25 mv至-35 mv,例如-10 mv至-15 mv、-15 mv至-20 mv、-20 mv至-25 mv、-25 mv至-30 mv、-30 mv至-35 mv、-35 mv至-40 mv、-40 mv至-45 mv、或-45 mv至-50 mv,例如约-10 mv、约-15 mv、约-20 mv、约-25 mv、约-30 mv、约-35 mv、约-40 mv、约-45 mv、或约-50 mv)的表面电荷(即ζ电位)。可替代地,致耐受性脂质体可以具有+10 mv至+50 mv(例如,+15 mv至+45 mv、+20 mv至+40 mv、或+25 mv至+35 mv,例如+10 mv至+15 mv、+15 mv至+20mv、+20 mv至+25 mv、+25 mv至+30 mv、+30 mv至+35 mv、+35 mv至+40 mv、from+-40 mv至+45 mv、或+45 mv至+50 mv,例如约+10 mv、约+15 mv、约+20 mv、约+25 mv、约+30 mv、约+35mv、约+40 mv、约+45 mv、或约+50 mv)的正表面电荷。致耐受性脂质体也可以在中性范围内,具有在-10 mv至+10 mv之间的ζ电位。
脂质
本发明的脂质体的特征在于脂质组合物,其使得能够有效装载和递送ITE(例如,至免疫系统的树突状细胞)。本发明人已发现,由具有以下的脂质混合物制备的脂质体:(i)高比值的一个或多个不饱和(例如,单不饱和)脂肪酸尾部(例如,其中一个或两个尾部含有至少一个碳-碳双键),以及(ii)在窄浓度范围内的胆固醇,独特地提供了在脂质双层内的治疗有效浓度的ITE,同时还与延长的(例如,三个月或更长时间)脂质体稳定性相容。具有不饱和脂肪酸尾部的此类脂质包括例如卵磷酸胆碱(卵PC),大豆磷酸胆碱(大豆PC),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC),1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS),以及含有例如油酸、棕榈油酸和顺式-异油酸的磷脂。卵PC具有在其两个脂肪酸尾部之一上的一个双键,而DOPC、DOPS、油酸、棕榈油酸和顺式-异油酸各自具有在其两个脂肪酸尾部两者上的一个双键。大豆PC具有在一条脂肪酸链上的两个双键。卵PC、DOPC和DOPS的代表性结构显示于下文。
可用于合成装载ITE的致耐受性脂质体的脂质包括具有长度10-25个碳(例如长度10-20、12-18或14-16个碳,例如长度10-12、12-14、14-16、16-18、18-20或20-25个碳,例如长度大于10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳)的脂肪酸尾部的脂质。在一些实施方案中,本文脂质体的脂质具有各自长度大于14个碳的一个或两个脂肪酸尾部。在优选实施方案中,至少50%的脂质混合物包含不饱和脂质(即,在其脂肪酸尾部的至少一个中具有至少一个碳-碳双键)。此类不饱和脂质包括例如卵PC、大豆PC、DOPC和DOPS。
不饱和单脂肪酸链磷脂也可用于配制ITE,包括例如单不饱和溶血磷脂酰胆碱(溶血PC)种类,例如1-(10Z-十七碳烯酰基)-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(17:1溶血PC)和1-羟基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(2-18:1溶血PC)。
脂质体的去饱和指数是基于存在的所有脂质,包括磷脂(单酰基或二酰基)和胆固醇或胆固醇替代物,在本文中用于定量脂质混合物中的不饱和脂质量的术语。去饱和指数基于混合物中存在的不饱和键的分数,但是:(i)第一个不饱和键的权重重于随后的不饱和键;(ii)同一磷脂的两个脂肪酸中的单个不饱和键的权重重于同一脂肪酸链中的两个不饱和键;并且(iii)在不同磷脂中的不饱和键的权重重于单个磷脂中。下表中概括了用于计算磷脂对去饱和指数的贡献的加权因子。磷脂1和2指以1:1比率组合以制备脂质体的两种假设的二酰基磷脂(忽略来自胆固醇的任何贡献)。FA1和FA2指每种磷脂的两条脂肪酰基链。单酰基磷脂(例如溶血PC)用FA2=0进行评分。表中的评分权重可以扩展到其它磷脂组合物。
去饱和指数考虑了用于制备脂质体的脂质混合物的所有脂质组分。在优选实施方案中,除一种或多种磷脂之外,脂质体还含有胆固醇。下表显示了如何计算关于几种示例性脂质体配方的去饱和指数,所有配方都以30%胆固醇(摩尔比)。上文显示了关于不饱和C=C键的加权因子。例如,在表的第一行中,DSPE没有不饱和键(评分:0),卵PC具有在两条脂肪酸链之一中的单个不饱和键(评分1 x 0.5 = 0.5),并且以65%的摩尔比存在,而胆固醇计入脂质总量,但对去饱和指数没有贡献(评分:0)。乘以0.5(卵PC评分)x 0.65(卵PC摩尔比)= 0.325,其为第1行中的脂质混合物的去饱和指数。
下文概括了可用作本文所述脂质体的部分的单不饱和脂肪酸的概述。
可以用于配制本发明的脂质体的其它脂质包括1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC);1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC);1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2000-DSPE);以及D-α-生育酚聚(乙二醇)-1000琥珀酸酯(TPGS-1000)。
面向外部的磷脂头基可以影响与免疫细胞的相互作用。例如,以L-丝氨酸终止的磷脂(磷脂酰丝氨酸种类)可以诱导免疫细胞中的耐受。这种特性反映了磷酸-L-丝氨酸磷脂在细胞凋亡中的天然作用。通常,磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的内部小叶(层)中。然而,它出现在凋亡细胞或细胞碎片的外部小叶中,在其中它诱导吞噬细胞中的致耐受性应答。因此,在某些实施方案中,以L-丝氨酸终止的磷脂,例如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)是致耐受性脂质体的有用组分。
某些溶血磷脂(溶血PL,例如溶血磷脂酰胆碱或溶血PC)可以对DC提供致耐受性信号(Kabarowski等人,Biochem. Pharmacol. 2002,64:161-167;Peter等人,J. Biol. Chem. 2008,283:5296-5305,其各自整体引入本文作为参考)。因此,在某些实施方案中,溶血PL也可用于配制致耐受性脂质体,特别是具有不饱和侧链的溶血PL。
一个或多个不饱和(例如,单不饱和)脂质种类可以占总脂质的至少50%(在摩尔基础上)。在一些实施方案中,不饱和(例如,单不饱和)脂质种类可以占脂质体的总脂质的至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%(例如,脂质体的总脂质的50%至60%、60%至65%、65%至70%、70%至75%、或75%至80%,例如约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%或约80%)。在一些实施方案中,不饱和脂质种类占总脂质的至少25%。
去饱和指数是脂质混合物中的不饱和键程度的替代量度。在一些实施方案中,脂质体群体具有0.3或更大(例如至少0.3、至少0.35、至少0.4、至少0.45、至少0.5、至少0.55、至少0.6或至少0.65,例如0.3至0.4、0.4至0.5、0.5至0.6、0.6至0.7,例如约0.3、约0.35、约0.4、约0.45、约0.5、约0.55、约0.6或约0.65)的平均去饱和指数。
另外或可替代地,脂质体可以具有特征在于特定相变温度的脂质组合物,所述相变温度顺应ITE的装载和递送、以及装载ITE的脂质体的长期稳定性。在一些实施方案中,脂质体群体的脂质组合物的平均相变温度为0℃至70℃(例如0℃至5℃、5℃至10℃、10℃至20℃、20℃至30℃、30℃至40℃、40℃至50℃、50℃至60℃、或60℃至65℃,例如约0℃、约5℃、约10℃、约20℃、约30℃、约40℃、约50℃、约60℃、约65℃或约70℃)。
致耐受性脂质体可以使用本领域已知或本文所述的任何合适方法进行制备。在一些实施方案中,通过胶束转移(例如,如实施例2中所述),将ITE装载到脂质体内。在其它实施方案中,通过乙醇注射(例如,如实施例3中所述),将ITE配制到脂质体中。例如,在将ITE加入DMSO中之前,可以将脂质以所需比率混合并且溶解于乙醇中。在一些实施方案中,添加的ITE体积不超过脂质/乙醇溶液体积的10%(例如,不超过9%、8%、7%、6%或5%)。通过伴随搅拌在35-65℃(基于脂质混合物选定的温度)下加热,ITE能够在10-30分钟内溶解到脂质混合物内。然后可以将所得到的脂质/ITE/乙醇溶液转移到含有抗原的预热的HBS溶液内(例如,浓度为0.001至10mg/mL,例如0.005至5 mg/mL,例如约0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0mg/mL、7.0 mg/mL、8.0 mg/mL、9.0 mg/mL或10 mg/mL)。在35-65℃(基于脂质混合物)下搅拌,同时允许脂质体在抗原水溶液周围形成(即封装)之后,使用常规挤出技术使混合物通过一系列聚碳酸酯膜,以将多层膜转换成限定大小(基于膜的孔径)和大小分布均匀的单层脂质体。使脂质体相继通过多重200 nm和/或100 nm孔径的膜,可以产生直径约90-110 nm的具有窄分布(多分散性指数<0.05)的纳米微粒脂质体。可以通过任何合适的方法(例如,过滤、透析或离心),从脂质体悬浮液中洗去位于脂质体核外部的可溶性抗原。
关于自身免疫性疾病的抗原
在一些实施方案中,本文提供的脂质体包括与ITE共配制的抗原(例如,在脂质体的水性核内),以将耐受性集中于一种或几种特异性抗原。引起疾病或在其它方面不期望的免疫应答的抗原由肽或蛋白质(包括翻译后修饰)、脂质、病毒基因治疗载体和核酸组成。一种或多种抗原可以在脂质体中与ITE共配制,或可替代地,如果两种抗原是化学上不相容的,则可以产生两个或更多个脂质体群体,各自具有至少一种抗原,并且全部具有ITE。
类风湿性关节炎抗原
脂质体可以包括与该组合物配置为治疗其的病原性免疫应答相关的任何抗原。例如,在类风湿性关节炎患者中引发自身免疫T和B细胞反应的蛋白质包括波形蛋白(包括突变的波形蛋白)、纤维蛋白原、α烯醇化酶和胶原,其中任一种都可以含有翻译后产生的瓜氨酸来代替精氨酸或赖氨酸。免疫应答频繁针对这些蛋白质的翻译后修饰变体。这些最常见的蛋白质修饰起因于精氨酸的酶促脱亚胺(通过肽基精氨酸脱亚胺酶)为非标准氨基酸瓜氨酸、或赖氨酸的氨基甲酰化。瓜氨酸化肽用于诊断类风湿性关节炎的用途是众所周知的。例如,WO 2007/123976公开了用于诊断类风湿性关节炎的波形蛋白肽,包括瓜氨酸化肽,WO2007/017556公开了用于诊断类风湿性关节炎的II型胶原肽,包括瓜氨酸化肽,并且WO2008/090360公开了使用烯醇化酶肽,包括瓜氨酸化肽,用于诊断类风湿性关节炎。可以用作本发明的抗原的类风湿性关节炎相关抗原包括蛋白质聚集蛋白聚糖、α烯醇化酶、II型胶原、β纤维蛋白原、丝聚蛋白和波形蛋白。作为配制这些蛋白质的替代方法,可以在致耐受性脂质体中配制被鉴定为T细胞应答靶的免疫原性肽。有关肽序列在文献(例如美国专利公开号2016/0024183)中提供。前述公开各自整体引入本文作为参考。
US 2016/0024183中公开的特异性类风湿性关节炎肽包括瓜氨酸化的β纤维蛋白原肽CitPAPPPISGGGYCitACit(SEQ ID NO:1)、瓜氨酸化的II型胶原肽ACitGLTGCitPGDAK(SEQ ID NO:2)、瓜氨酸化的丝聚蛋白胶原HQCHQESTCitGRSRGRCGRSGS(SEQ ID NO:3)、瓜氨酸化的波形蛋白肽SAVRACitSSVPGVRK(SEQ ID NO:4)、以及其片段和组合。
1型糖尿病抗原
与1型糖尿病和成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)相关的抗原,包括蛋白质前胰岛素原及其加工形式胰岛素原和胰岛素;谷氨酸脱羧酶65和67(GAD65和GAD67);imogen-38;胰岛特异性葡萄糖6磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP);酪氨酸磷酸酶,如自身抗原或胰岛素瘤抗原2(同义词:IA-2;ICA512,PTPRN);IA-2β(同义词:Phogrin,ICA512,PTPRN2);胰岛细胞抗原69(ICA69);羧肽酶H;锌转运蛋白8(ZnT8);嗜铬粒蛋白A。
除上文列出的蛋白质之外,或作为上文列出的蛋白质的替代物,可能难以在重组系统中表达、或难以在脂质体中配制的一些肽可以用于致耐受性脂质体中,用于治疗1型糖尿病和LADA。
有用的前胰岛素原肽公开于US 6,562,943中,并且包括QPLALEGSLQK(SEQ ID NO:5),以及与该序列重叠的肽,例如GGGPGAGSLQPLALEGSLQK(SEQ ID NO:6)、称为C19-A3的GSLQPLALEGSLQKRGIV(SEQ ID NO:7)、或QPLALEGSLQKRGIVEQ(SEQ ID NO:8)。
另外的前胰岛素原肽公开于美国专利2007/0129307中,并且包括ALWMRLLPL(SEQID NO:9);HLVEALYLV(SEQ ID NO:10);称为B9-23的SHLVEALYLVCGERG(SEQ ID NO:11);或DLQVGQVEL(SEQ ID NO:12)。
有用的IA-2肽公开于美国专利6,562,943中,并且包括VSSQFSDAAQASP(SEQ IDNO:13),以及含有侧翼为至多5个N末端氨基酸和/或至多11个C末端氨基酸的VSSQFSDAAQASP(SEQ ID NO:13)的肽,例如SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST(SEQ ID NO:14);SSVSSQFSDAAQASP(SEQ ID NO:15);SVSSQFSDAAQASPS(SEQ ID NO:16);SVSSQFSDAAQASPSSHSS(SEQ ID NO:17);SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC(SEQ ID NO:18);VSSQFSDAAQASPSS(SEQ ID NO:19);VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS(SEQ ID NO:20);VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE(SEQ ID NO:21)。
IA-2肽可以可替代地是TQETRTL(SEQ ID NO:22),或者侧翼为至多8个N末端氨基酸和/或至多5个C末端氨基酸的TQETRTL(SEQ ID NO:22),例如SFYLKNVQTQETRTLTQFH(SEQID NO:23);FYLKNVQTQETRTLTQFHF(SEQ ID NO:24);YLKNVQTQETRTL(SEQ ID NO:25);YLKNVQTQETRTLTQ(SEQ ID NO:26);LKNVQTQETRTLTQF(SEQ ID NO:27);KNVQTQETRTLTQFH(SEQ ID NO:28);VQTQETRTLTQFHF(SEQ ID NO:29);或TQETRTLTQFHF(SEQ ID NO:30)。
IA-2肽可以可替代地是AYQAEPNT(SEQ ID NO:31),或者侧翼为至多9个N末端氨基酸和/或至多11个C末端氨基酸的AYQAEPNT(SEQ ID NO:31),例如LAKEWQALCAYQAEPNT(SEQID NO:32);LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE(SEQ ID NO:33);WQALCAYQAEPNTCATAQ(SEQ IDNO:34);LCAYQAEPNTCATAQG(SEQ ID NO:35);AYQAEPNTCATAQ(SEQ ID NO:36);或AYQAEPNTCATAQGEGNIK(SEQ ID NO:37)。
IA-2肽可以可替代地是CTVIVMLT(SEQ ID NO:38),或者侧翼为至多10个N末端氨基酸和/或至多8个C末端氨基酸的CTVIVMLT(SEQ ID NO:38),例如DFWQMVWESGCTVIVMLT(SEQ ID NO:39);FWQMVWESGCTVIVMLTPLV(SEQ ID NO:40);WQMVWESGCTVIVMLT(SEQ ID NO:41);MVWESGCTVIVMLTPL(SEQ ID NO:42);MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV(SEQ ID NO:43);ESGCTVIVMLTPLVEDG(SEQ ID NO:44);ESGCTVIVMLTPLVEDGV(SEQ ID NO:45);SGCTVIVMLTPLVEDGVK(SEQ ID NO:46);GCTVIVMLTPLVED(SEQ ID NO:47);或CTVIVMLTPLVEDG(SEQ ID NO:48)。
IA-2肽可以可替代地是FEFALTAVAEE(SEQ ID NO:49),或者侧翼为至多4个N末端氨基酸和/或至多7个C末端氨基酸的FEFALTAVAEE(SEQ ID NO:49),例如SKDQFEFALTAVAEEVNA(SEQ ID NO:50);SKDQFEFALTAVAEEVNAILK(SEQ ID NO:51);DQFEFALTAVAEE(SEQ ID NO:52);DQFEFALTAVAEEVNAI(SEQ ID NO:53);或FEFALTAVAEEVNAILKA(SEQ ID NO:54)。
IA-2肽可以可替代地是KVESSPSRSDY(SEQ ID NO:55),或者侧翼为至多2个N末端氨基酸和/或至多11个C末端氨基酸的KVESSPSRSDY(SEQ ID NO:55),例如KLKVESSPSRSDYINAS(SEQ ID NO:56);KLKVESSPSRSDYINASPIIEHDP(SEQ ID NO:57);LKVESSPSRSDY(SEQ ID NO:58);LKVESSPSRSDYINASPII(SEQ ID NO:59);KVESSPSRSDYI(SEQID NO:60);以及KVESSPSRSDYINASPIIEHDP(SEQ ID NO:61)。
IA-2肽可以可替代地是U.S. 2007/0129307A1中公开的肽之一,包括SLSPLQAEL(SEQ ID NO:62);LLPPLLEHL(SEQ ID NO:63);GLLYLAQEL(SEQ ID NO:64);VLAGYGVEL(SEQID NO:65);TLLTLLQLL(SEQ ID NO:66);SLAAGVKLL(SEQ ID NO:67);或VLLTLVALA(SEQ IDNO:68)。
该肽还可以是phogrin肽、IGRP肽、IAPP肽、GAD65肽或嗜铬粒蛋白A肽。有用的phogrin肽公开于U.S. 2007/0129307A1中,并且包括LLLLLLLLL(SEQ ID NO:69);LLLLLPPRV(SEQ ID NO:70);GMAELMAGL(SEQ ID NO:71);LMAGLMQGV(SEQ ID NO:72);RLYQEVHRL(SEQ ID NO:73)和SLLDFRRKV(SEQ ID NO:74)。有用的IGRP肽公开于U.S. 2007/0129307A1中,并且包括FLWSVFMLI(SEQ ID NO:75);FLFAVGFY(SEQ ID NO:76);以及RLLCALTSL(SEQ ID NO:77)。有用的IAPP肽公开于U.S. 2007/0129307A1中,并且包括KLQVFLIVL(SEQ ID NO:78)和FLIVLSVAL(SEQ ID NO:79)。有用的GAD65肽公开于WO2016162495:TVYGAFDPLLAVAD(SEQ ID NO:80)中,以及称为WE-14的嗜铬粒蛋白A肽WSKMDQLAKELTAE(SEQ ID NO:81)。
前述公开各自在此整体引入作为参考。
抗原也可以是含有与上述抗原中任一种至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%等同的多肽的蛋白质,或其片段。
上文抗原(也在下表中列出)可以与ITE在脂质体中共配制,并且用于治疗处于发展1型糖尿病的高风险中、或具有1型糖尿病的近期发作或患有LADA的患者。
肽 | 序列 | SEQ ID NO: |
瓜氨酸化的β纤维蛋白原肽 | CitPAPPPISGGGYCitACit | SEQ ID NO:1 |
瓜氨酸化的II型胶原肽 | ACitGLTGCitPGDAK | SEQ ID NO:2 |
瓜氨酸化的丝聚蛋白肽 | HQCHQESTCitGRSRGRCGRSGS | SEQ ID NO:3 |
瓜氨酸化的波形蛋白肽 | SAVRACitSSVPGVRK | SEQ ID NO:4 |
前胰岛素原肽 | QPLALEGSLQK | SEQ ID NO:5 |
前胰岛素原肽 | GGGPGAGSLQPLALEGSLQK | SEQ ID NO:6 |
前胰岛素原肽 | GSLQPLALEGSLQKRGIV | SEQ ID NO:7 |
前胰岛素原肽 | QPLALEGSLQKRGIVEQ | SEQ ID NO:8 |
前胰岛素原肽 | ALWMRLLPL | SEQ ID NO:9 |
前胰岛素原肽 | HLVEALYLV | SEQ ID NO:10 |
前胰岛素原肽 | SHLVEALYLVCGERG | SEQ ID NO:11 |
前胰岛素原肽 | DLQVGQVEL | SEQ ID NO:12 |
IA-2肽 | VSSQFSDAAQASP | SEQ ID NO:13 |
IA-2肽 | SRVSSVSSQFSDAAQASPSSHSST | SEQ ID NO:14 |
IA-2肽 | SSVSSQFSDAAQASP | SEQ ID NO:15 |
IA-2肽 | SVSSQFSDAAQASPS | SEQ ID NO:16 |
IA-2肽 | SVSSQFSDAAQASPSSHSS | SEQ ID NO:17 |
IA-2肽 | SVSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWC | SEQ ID NO:18 |
IA-2肽 | VSSQFSDAAQASPSS | SEQ ID NO:19 |
IA-2肽 | VSSVSSQFSDAAQASPSSHSS | SEQ ID NO:20 |
IA-2肽 | VSSQFSDAAQASPSSHSSTPSWCE | SEQ ID NO:21 |
IA-2肽 | TQETRTL | SEQ ID NO:22 |
IA-2肽 | SFYLKNVQTQETRTLTQFH | SEQ ID NO:23 |
IA-2肽 | FYLKNVQTQETRTLTQFHF | SEQ ID NO:24 |
IA-2肽 | YLKNVQTQETRTL | SEQ ID NO:25 |
IA-2肽 | YLKNVQTQETRTLTQ | SEQ ID NO:26 |
IA-2肽 | LKNVQTQETRTLTQF | SEQ ID NO:27 |
IA-2肽 | KNVQTQETRTLTQFH | SEQ ID NO:28 |
IA-2肽 | VQTQETRTLTQFHF | SEQ ID NO:29 |
IA-2肽 | TQETRTLTQFHF | SEQ ID NO:30 |
IA-2肽 | AYQAEPNT | SEQ ID NO:31 |
IA-2肽 | LAKEWQALCAYQAEPNT | SEQ ID NO:32 |
IA-2肽 | LAKEWQALCAYQAEPNTCATAQGE | SEQ ID NO:33 |
IA-2肽 | WQALCAYQAEPNTCATAQ | SEQ ID NO:34 |
IA-2肽 | LCAYQAEPNTCATAQG | SEQ ID NO:35 |
IA-2肽 | AYQAEPNTCATAQ | SEQ ID NO:36 |
IA-2肽 | AYQAEPNTCATAQGEGNIK | SEQ ID NO:37 |
IA-2肽 | CTVIVMLT | SEQ ID NO:38 |
IA-2肽 | DFWQMVWESGCTVIVMLT | SEQ ID NO:39 |
IA-2肽 | FWQMVWESGCTVIVMLTPLV | SEQ ID NO:40 |
IA-2肽 | WQMVWESGCTVIVMLT | SEQ ID NO:41 |
IA-2肽 | MVWESGCTVIVMLTPL | SEQ ID NO:42 |
IA-2肽 | MVWESGCTVIVMLTPLVEDGV | SEQ ID NO:43 |
IA-2肽 | ESGCTVIVMLTPLVEDG | SEQ ID NO:44 |
IA-2肽 | ESGCTVIVMLTPLVEDGV | SEQ ID NO:45 |
IA-2肽 | SGCTVIVMLTPLVEDGVK | SEQ ID NO:46 |
IA-2肽 | GCTVIVMLTPLVED | SEQ ID NO:47 |
IA-2肽 | CTVIVMLTPLVEDG | SEQ ID NO:48 |
IA-2肽 | FEFALTAVAEE | SEQ ID NO:49 |
IA-2肽 | SKDQFEFALTAVAEEVNA | SEQ ID NO:50 |
IA-2肽 | SKDQFEFALTAVAEEVNAILK | SEQ ID NO:51 |
IA-2肽 | DQFEFALTAVAEE | SEQ ID NO:52 |
IA-2肽 | DQFEFALTAVAEEVNAI | SEQ ID NO:53 |
IA-2肽 | FEFALTAVAEEVNAILKA | SEQ ID NO:54 |
IA-2肽 | KVESSPSRSDY | SEQ ID NO:55 |
IA-2肽 | KLKVESSPSRSDYINAS | SEQ ID NO:56 |
IA-2肽 | KLKVESSPSRSDYINASPIIEHDP | SEQ ID NO:57 |
IA-2肽 | LKVESSPSRSDY | SEQ ID NO:58 |
IA-2肽 | LKVESSPSRSDYINASPII | SEQ ID NO:59 |
IA-2肽 | KVESSPSRSDYI | SEQ ID NO:60 |
IA-2肽 | KVESSPSRSDYINASPIIEHDP | SEQ ID NO:61 |
IA-2肽 | SLSPLQAEL | SEQ ID NO:62 |
IA-2肽 | LLPPLLEHL | SEQ ID NO:63 |
IA-2肽 | GLLYLAQEL | SEQ ID NO:64 |
IA-2肽 | VLAGYGVEL | SEQ ID NO:65 |
IA-2肽 | TLLTLLQLL | SEQ ID NO:66 |
IA-2肽 | SLAAGVKLL | SEQ ID NO:67 |
IA-2肽 | VLLTLVALA | SEQ ID NO:68 |
phogrin肽 | LLLLLLLLL | SEQ ID NO:69 |
phogrin肽 | LLLLLPPRV | SEQ ID NO:70 |
phogrin肽 | GMAELMAGL | SEQ ID NO:71 |
phogrin肽 | LMAGLMQGV | SEQ ID NO:72 |
phogrin肽 | RLYQEVHRL | SEQ ID NO:73 |
phogrin肽 | SLLDFRRKV | SEQ ID NO:74 |
IGRP肽 | FLWSVFMLI | SEQ ID NO:75 |
IGRP肽 | FLFAVGFY | SEQ ID NO:76 |
IGRP肽 | RLLCALTSL | SEQ ID NO:77 |
IAPP肽 | KLQVFLIVL | SEQ ID NO:78 |
IAPP肽 | FLIVLSVAL | SEQ ID NO:79 |
GAD65肽 | TVYGAFDPLLAVAD | SEQ ID NO:80 |
嗜铬粒蛋白A肽 | WSKMDQLAKELTAE | SEQ ID NO:81 |
用于对肽、蛋白质和基因疗法耐受的抗原
在一些实施方案中,本文所述的组合物和方法的特点在于脂质体,其包括(例如,封装)抗原(例如与治疗试剂相关的抗原,所述治疗试剂例如治疗性蛋白、病毒载体或纳米颗粒)。此类实施方案可以用于例如使受试者对抗原耐受,该受试者否则可能发展针对所述抗原的不利免疫应答。
在一些实施方案中,封装在本文特征的脂质体中的抗原是新生抗原。在一些实施方案中,对新生抗原的免疫可能早于治疗性暴露。例如,腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)和疱疹病毒是无处不在的。因此,当这些病毒或其修饰形式用作基因治疗载体时,它们可能遇到预存免疫,其可以干扰病毒转导。另外,再暴露于病毒(以基因疗法的形式)经常引起更强的免疫应答。
在一些实施方案中,新生抗原可以衍生自治疗试剂的任何部分(例如,肽、蛋白质、基因疗法或纳米颗粒的任何部分)。当新生抗原的特异性结构(例如,肽序列)并未完全限定时,可以在脂质体中配制治疗试剂的较大片段,以提供新生抗原。可替代地,可以将整个治疗性肽、蛋白质、病毒外壳蛋白或病毒封装在脂质体内。
在一些实施方案中,可以通过本文所述的治疗试剂(例如,包含封装在本发明的脂质体中的抗原的治疗试剂,所述脂质体还携带ITE)治疗的疾病或病症,可以包括但不限于自身免疫性疾病、过敏性疾病(例如,对环境因子如动物皮屑、花粉、尘螨、昆虫叮咬等等的过敏,以及对坚果、蛋制品、海鲜、谷物等等的食物过敏)、遗传性疾病(通过蛋白质替代疗法或基因疗法进行治疗)、器官移植(与免疫排斥相关,或者在骨髓移植的情况下,与移植物抗宿主病相关)、以及通过肽或蛋白质治疗剂治疗的广泛多样的其它疾病(例如,糖尿病)。
在一些实施方案中,可以通过本文所述的治疗试剂(例如,包含封装在本发明的脂质体中的抗原的治疗试剂,所述脂质体还携带ITE)、组合物(例如,本发明的脂质体组合物)或方法治疗的自身免疫性疾病,包括但不限于影响关节和结缔组织的疾病(例如,强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮癣关节炎和混合性结缔组织疾病)、以及影响脑的疾病(例如,多发性硬化和视神经脊髓炎)、影响内分泌器官的疾病(例如,I型糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎和艾迪生氏病)、影响胃肠道的疾病(例如,自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、乳糜泻和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎))、影响皮肤的疾病(例如,牛皮癣、硬皮病、斑秃、特应性皮炎、寻常性天疱疮和大疱性类天疱疮)、影响肌肉的疾病(例如,重症肌无力、格巴二氏综合征和多发性肌炎/皮肌炎)、影响心脏的疾病(例如,风湿热)、影响肝脏的疾病(例如,自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎)、影响感觉器官的疾病(例如,自身免疫性葡萄膜炎和白塞氏病)、影响血液或骨髓的疾病(例如,自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜和特发性白血球减少症)、影响肺的疾病(例如,古德帕斯彻氏综合征)、影响肾脏的疾病(例如,自身免疫性肾炎,包括肾小球肾炎)、影响血管系统的疾病(例如,韦格纳氏肉芽肿)、影响周围神经系统的疾病(例如,慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病)、以及特征在于多器官受累的疾病(例如,系统性红斑狼疮和干燥综合征)。
用于基因疗法通过治疗的疾病
在一些实施方案中,可以通过基因疗法(例如,通过施用病毒基因治疗载体)治疗,并且因此可以获益于用包含ITE和抗原的致耐受性脂质体组合物的预治疗、或同时治疗、或疗法后治疗的疾病或病症,包括但不限于溶酶体贮积病/溶酶体贮积症,例如Santavuori-Haltia病(婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积症,1型)、詹比二氏病(Jansky-BielschowskyDisease)(晚期婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积症,2型)、巴滕病(幼年型神经元蜡样质脂褐质沉积症,3型)、库夫斯病(神经元蜡样质脂褐质沉积症,4型)、冯·吉尔克病(糖原贮积病,Ia型)、糖原贮积病Ib型、庞贝病(糖原贮积病,II型)、福布斯病或科里病(糖原贮积病,III型)、II型粘脂质贮积症(I细胞疾病)、III型粘脂质贮积症(假性哈伦多发性营养不良)、IV型粘脂质贮积症(唾液脂沉积(sialolipidosis))、胱氨酸病(成人非肾病型)、胱氨酸病(婴儿肾病型)、胱氨酸病(幼年或青少年肾病)、Salla病/婴儿型唾液酸贮积症和鞘脂激活蛋白缺乏症;脂质和鞘脂降解病症,例如GM1神经节苷脂贮积症(婴儿、晚期婴儿/幼年和成人/慢性),泰萨二氏病(Tay-Sachs disease),Sandhoff病,GM2神经节苷脂贮积症,Ab变体,法布里病,戈谢病I型、II型和III型,异染性脑白质营养不良,克拉伯病(早期发作和晚期发作),尼曼匹克病A、B、C1和C2型,法伯病和沃尔曼病(胆固醇酯贮积病);粘多糖降解病症,例如胡勒尔综合征(MPSI)、沙伊综合征(MPS IS)、胡勒尔-沙伊综合征(MPS IH/S)、亨特综合征(MPS II)、A型圣菲利波综合征(MPS IIIA)、B型圣菲利波综合征(MPS IIIB)、C型圣菲利波综合征(MPS IIIC)、D型圣菲利波综合征(MPS IIID)、A型莫尔奎综合征(MPS IVA)、B型莫尔奎综合征(MPS IVB)、马拉二氏综合征(MPS VI)和斯莱综合征(MPS VII);糖蛋白降解病症,例如α甘露糖苷贮积病、β甘露糖苷贮积病、岩藻糖苷贮积病、天冬氨酰葡糖胺尿症(asparylglucosaminuria)、粘脂质贮积症I(唾液酸贮积症)、半乳糖唾液酸贮积症、辛德勒病(Schindler disease)和辛德勒病II型/神崎病;以及脑白质营养不良疾病/脑白质营养不良病症,例如无β脂蛋白血症、新生儿肾上腺脑白质营养不良、卡纳万病、脑腱黄瘤病、佩梅二氏病、丹吉尔病、雷弗素姆病(Refum disease)(婴儿形式和经典形式)、酸性麦芽糖酶缺乏症(例如,庞贝病、2型糖原贮积症、溶酶体贮积病)、肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症(例如,科里病或福布斯病,3型糖原贮积症)、乳酸脱氢酶缺乏症(例如,11型糖原贮积症)、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症(例如,Tarui病、7型糖原贮积症)、磷酸甘油酸激酶缺乏症(例如,9型糖原贮积症)、磷酸甘油酸变位酶缺乏症(例如,10型糖原贮积症)、磷酸化酶缺乏症(例如,麦卡德尔病、肌磷酸化酶缺乏症、5型糖原贮积症)、戈谢氏病(例如,1号染色体、葡糖脑苷脂酶受影响)、软骨发育不全(例如,4号染色体、成纤维细胞生长因子受体3受影响)、亨廷顿氏病(例如,4号染色体、亨廷顿蛋白)、血色素沉着病(例如,6号染色体、HFE蛋白)、囊性纤维化(例如,7号染色体、CFTR)、弗里德赖希氏共济失调(9号染色体、共济蛋白)、贝斯特病(11号染色体、VMD2)、镰状细胞病(11号染色体、血红蛋白)、苯酮酸尿症(12号染色体、苯丙氨酸羟化酶)、马凡氏综合症(15号染色体、原纤维蛋白)、强直性肌营养不良(19号染色体、强直性肌营养不良蛋白激酶)、肾上腺白质营养不良(x染色体、过氧化物酶体中的二十四碳酰基(lignoceroy1)-CoA连接酶)、杜兴氏肌营养不良(x染色体、肌营养不良蛋白)、雷特综合征(x染色体、甲基CpG结合蛋白2)、雷伯氏遗传性视神经病(线粒体、呼吸蛋白质)、线粒体脑病、乳酸性酸中毒和中风(MELAS)(线粒体、转移RNA)、尿素循环酶缺乏症、镰状细胞性贫血、肌管性肌病、B型血友病、脂蛋白脂酶缺乏症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、克纳二氏综合征、IV型粘脂质贮积症、A型尼曼皮克、A型圣菲利波、B型圣菲利波、C型圣菲利波、D型圣菲利波、β地中海贫血、杜兴肌营养不良,以及其为脂质和鞘脂降解、粘多糖降解、糖蛋白降解、脑白质营养不良等中的缺陷的结果的疾病或病症。
病毒载体
由本发明提供的脂质体可以包括(例如,封装)一种或多种病毒(例如,病毒载体)或其一部分,例如衣壳蛋白或衣壳蛋白的免疫原性肽片段。可以使用(例如,在本发明的方法在受试者中提供对其的耐受的治疗试剂中)的病毒载体的实例是本领域已知的和/或在本文中描述的。合适的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、基于腺病毒的载体、基于腺病毒相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体、基于牛痘病毒的载体和基于仙台病毒的载体。
在一些实施方案中,本文所述的病毒载体可以基于逆转录病毒。逆转录病毒(例如,属于逆转录病毒科的病毒)具有单链正义RNA基因组,并且能够感染广泛多样的宿主细胞。在感染后,逆转录病毒基因组整合到其宿主细胞的基因组内,使用其自身的逆转录酶由其RNA基因组产生DNA。然后,病毒DNA连同宿主细胞DNA一起复制,所述宿主细胞DNA翻译并转录病毒和宿主基因。逆转录病毒载体可以被操纵为致使病毒复制无能。像这样,逆转录病毒载体被认为对于在体内稳定的基因转移是特别有用的。可用于本发明中的逆转录病毒载体的实例可以例如在美国公开号20120009161、20090118212和20090017543中找到,所述病毒载体及其制备方法整体引入本文作为参考。
慢病毒载体是可以用于产生如本文提供的病毒载体的逆转录病毒载体的实例。慢病毒具有感染非分裂细胞的能力,该特性构成基因递送载体的更有效方法(参见例如,Durand等人,Viruses. 2011 February;3(2):132-159)。慢病毒的实例包括HIV(人)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和绵羊髓鞘脱落病毒(绵羊慢病毒)。与其它逆转录病毒不同,已知基于HIV的载体将其过客基因掺入非分裂细胞内。可用于本发明中的慢病毒载体的实例可以例如在美国公开号20150224209、20150203870、20140335607、20140248306、20090148936和20080254008中找到,所述病毒载体及其制备方法整体引入本文作为参考。
在一些实施方案中,基于单纯疱疹病毒(HSV)的病毒载体适合于如本文提供的用途。许多复制缺陷型HSV载体含有缺失,以去除一个或多个中间-早期基因,以预防复制。疱疹载体的优点在于其进入潜伏期的能力(其可以导致长期DNA表达),以及其大型病毒DNA基因组(其可以容纳高达25 kb的外源DNA)。关于可用于本发明中的基于HSV的载体的描述,参见例如,美国专利号5,837,532、5,846,782、5,849,572和5,804,413,以及国际专利申请WO91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583,其中关于病毒载体及其制备方法的描述整体引入作为参考。
在一些实施方案中,本文所述的病毒载体可以基于腺病毒(Ad)。腺病毒是无包膜病毒,其可以将DNA体内转移到各种不同的靶细胞类型。通过缺失病毒复制所需的选择基因,病毒可以被制备为复制缺陷的。可消耗的非复制必需E3区也频繁被缺失,以允许用于更大的DNA插入片段的另外空间。腺病毒载体可以以高滴度生产,并且可以将DNA有效地转移至复制细胞和非复制细胞。与慢病毒不同,腺病毒DNA不整合到基因组内,并且因此在细胞分裂过程中不进行复制,相反,它们使用宿主的复制机制在宿主细胞的核中复制。
本文特征的病毒载体可以基于其的腺病毒可以来自任何起源、任何亚组、任何亚型、亚型混合物或任何血清型。例如,腺病毒可以是亚组A(例如,血清型12、18和31)、亚组B(例如,血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50)、亚组C (例如,血清型1、2、5和6)、亚组D(例如,血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-48)、亚组E(例如,血清型4)、亚组F(例如,血清型40和41)、未分类的血清群(例如,血清型49和51)、或任何其它腺病毒血清型。腺病毒血清型1到51可从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得。非C组腺病毒以及甚至非人腺病毒,都可以用于制备复制缺陷型腺病毒载体。可用于本发明中的非C组腺病毒载体、生产非C组腺病毒载体的方法、以及使用非C组腺病毒载体的方法公开于例如美国专利号5,801,030、5,837,511和5,849,561,以及国际专利申请WO 97/12986和WO98/53087中。任何腺病毒,甚至嵌合腺病毒,都可以用作腺病毒载体的病毒基因组的来源。例如,人腺病毒可以用作复制缺陷型腺病毒载体的病毒基因组的来源。可用于本发明中的腺病毒载体的进一步实例可以在美国公开号20150093831、20140248305、20120283318、20100008889、20090175897和20090088398中找到,其中关于病毒载体及其制备方法的描述整体引入作为参考。
在一些实施方案中,本文提供的病毒载体也可以基于AAV。AAV载体对于在治疗应用例如本文所述的那些中的用途是特别有利的。AAV是并不知道导致人疾病的DNA病毒。一般地,AAV需要与辅助病毒(例如,腺病毒或疱疹病毒)的共感染,或辅助基因的表达用于有效复制。AAV具有在特异性位点处稳定感染宿主细胞基因组的能力,使其比逆转录病毒更可预测;然而,一般地,载体的克隆容量为4.9 kb。基因治疗应用中已使用的AAV载体一般已缺失了大约96%的亲本基因组,使得仅保留了含有关于DNA复制和包装的识别信号的末端重复(ITR)。对于可用于本发明中的基于AAV的载体的描述,参见例如,美国专利号8,679,837、8,637,255、8,409,842、7,803,622和7,790,449,以及美国公开号0150065562、20140155469、20140037585、20130096182、20120100606和20070036757,其病毒载体及其制备方法整体引入本文作为参考。AAV载体可以是重组AAV载体。AAV载体还可以是自互补(sc)AAV载体,其例如在美国专利公开2007/01110724和2004/0029106,以及美国专利号7,465,583和7,186,699中描述,所述载体和生产方法引入本文作为参考。
在一些实施方案中,本文所述的方法和组合物中包括的病毒载体(例如,AAV载体)被配置为递送RNA分子。在一些实施方案中,病毒载体被配置为递送小干扰RNA(siRNA)。在其它实施方案中,病毒载体被配置为递送微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、mRNA或小激活RNA(saRNA)。在替代实施方案中,病毒载体被配置为递送DNA分子,包括单链DNA(ssDNA),其可以编码cDNA或其片段。
病毒载体可以基于其的AAV可以是任何血清型或血清型的混合物。AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11。例如,当病毒载体基于血清型的混合物时,病毒载体可以含有取自一种AAV血清型(例如,选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任何一种)的衣壳信号序列,以及来自不同血清型(例如,选自AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11中的任何一种)的包装序列。因此,在本文提供的任何一种方法或组合物的一些实施方案中,AAV载体是AAV 2/8载体。在本文提供的任何一种方法或组合物的其它实施方案中,AAV载体是AAV 2/5载体。
在一些实施方案中,本文提供的病毒载体可以基于α病毒。α病毒包括辛德毕斯(和VEEV)病毒、奥拉病毒、Babanki病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、犰狳病毒、基孔肯雅病毒、东方马脑炎病毒、大沼泽地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzylagach病毒、马亚罗病毒、Me Tri病毒、米德尔堡病毒、Masso das Pedras病毒、穆坎布病毒(Mucambo virus)、恩杜姆病毒、奥尼永尼永病毒、皮春纳病毒、Rio Negro病毒、罗斯河病毒、鲑鱼胰腺病病毒、塞姆利基森林病毒、南象海豹病毒、托纳特病毒、Trocara病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和沃达罗河病毒。一般地,此类病毒的基因组编码可以在宿主细胞的细胞质中翻译的非结构蛋白(例如,复制子)和结构蛋白(例如,衣壳和包膜)。罗斯河病毒、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)已全部用于开发用于转基因递送的病毒载体。假型病毒可以通过组合α病毒包膜糖蛋白和逆转录病毒衣壳而形成。α病毒载体的实例可以在美国公开号20150050243、20090305344和20060177819中找到;所述载体及其制备方法整体引入本文作为参考。病毒载体可以用于递送转基因用于各种目的,包括用于基因编辑,本文提供的方法和组合物也是如此适用的。
病毒载体:治疗性蛋白或其一部分
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码如本文提供的治疗性蛋白或其一部分的转基因。此类蛋白质的实例包括但不限于可输注或可注射的治疗性蛋白、酶、酶辅因子、激素、血液或凝血因子、细胞因子和干扰素、生长因子、脂肪因子、单克隆抗体等。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码酶的转基因(例如,用于酶替代疗法)。此类酶的实例包括但不限于溶菌酶、氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、糖苷酶、蛋白酶、核酸酶、胶原酶、透明质酸酶、肝素酶、乙酰肝素酶、激酶、磷酸酶、溶素和连接酶。酶的其它实例包括用于酶替代疗法的那些,包括但不限于伊米苷酶(例如,CEREZYME™)、α-半乳糖苷酶A(a-gal A)(例如,阿加糖酶β、FABRYZYME)、酸性α-葡糖苷酶(GAA)(例如,阿葡糖苷酶α、LUMIZYME™、MYOZYME™)、以及芳基硫酸酯酶B(例如,拉罗尼酶、ALDURAZYME™、艾杜硫酶、ELAPRASE™、芳基硫酸酯酶B、NAGLAZYME™)。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码血液因子或凝血因子的转基因。此类血液因子或凝血因子的实例包括但不限于因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V(促凝血球蛋白原、不稳定因子)、因子VII(稳定因子、前转化素)、因子VIII(抗血友病球蛋白)、因子IX(克雷司马斯因子或血浆凝血酶激酶组分)、因子X(斯图亚特因子)、因子Xa、因子XI、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(血纤维蛋白稳定因子)、血管性血友病因子、von Heldebrant因子、前激肽释放酶(Fletcher因子)、高分子量激肽原(HMWK)(Fitzgerald因子)、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶、抗凝血酶例如抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂I(PAIi)、纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI2)、癌症促凝物质和阿法依泊汀(Epogen、Procrit)。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码细胞因子的转基因。此类细胞因子的实例包括但不限于淋巴因子、白介素和趋化因子、1型细胞因子(如IFN-γ、TGF-b)和2型细胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13)。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码生长因子的转基因。此类生长因子的实例包括但不限于肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促移行因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)及其它神经营养蛋白、血小板源性生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-a)、转化生长因子β(TGF-b)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号传导途径、胎盘生长因子(PlGF)、[(胎牛促生长素]](FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码脂肪因子的转基因。此类脂肪因子的实例包括但不限于瘦素和脂联素。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码以下一种或多种的转基因:受体、信号蛋白、细胞骨架蛋白、支架蛋白、转录因子、结构蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、结合蛋白、核蛋白、分泌性蛋白、高尔基体蛋白、内质网蛋白、线粒体蛋白和囊泡蛋白等。
另外,病毒载体可以包括编码其它治疗性蛋白的转基因,所述治疗性蛋白例如与以下相关的蛋白质的功能形式:脂质和鞘脂降解病症(例如,半乳糖苷酶-1、己糖胺酶A、己糖胺酶A和B、GM2激活蛋白、8-半乳糖苷酶A、葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、半乳糖基神经酰胺酶、鞘磷脂酶、鞘磷脂酶、NPCl、酸性神经酰胺酶、溶酶体酸性脂肪酶);粘多糖降解病症(例如,L-艾杜糖苷酶、艾杜糖硫酸酯酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰基-CoA-氨基葡糖苷酶、乙酰基转移酶、乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖胺-6-硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、葡糖醛酸酶);糖蛋白降解病症(例如,甘露糖苷酶、甘露糖苷酶、1-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、神经氨酸酶、溶酶体保护蛋白、溶酶体8-N-乙酰半乳糖苷酶、溶酶体8-N-乙酰半乳糖苷酶);溶酶体贮积病症(例如,棕榈酰蛋白硫酯酶、至少4种亚型,溶酶体膜蛋白、未知,葡萄糖-6-磷酸酶,葡萄糖-6-磷酸转位酶,酸性麦芽糖酶,脱支酶淀粉-1,6葡糖苷酶,N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶,N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶,神经节苷脂唾液酸酶(神经氨酸酶),溶酶体胱氨酸转运蛋白,溶酶体胱氨酸转运蛋白,溶酶体胱氨酸转运蛋白,唾液酸转运蛋白鞘脂激活蛋白、A、B、C、D)和脑白质营养不良(例如,微粒体甘油三酯转运蛋白/载脂蛋白B、过氧化物酶体膜转运蛋白、过氧化物酶体蛋白、天冬氨酸酰酶、甾醇27-羟化酶、蛋白脂质蛋白质、ABC转运蛋白、过氧化物酶体膜蛋白3或过氧化物酶体生物发生因子1、植烷酸氧化酶)。
病毒载体:基因编辑
在一些实施方案中,本文所述的病毒载体(例如,可以用作治疗试剂的病毒载体,可以使用本发明的方法和组合物诱导针对所述治疗试剂的耐受)可以用于基因编辑。在此类实施方案中,病毒载体的转基因是基因编辑转基因。此类转基因编码涉及基因编辑过程的组分。一般地,此类过程导致对基因组DNA的持久或永久修饰,例如靶向DNA插入、替换、诱变或去除。基因编辑可以包括递送编码目的DNA序列的核酸,并且使用核酸内切酶,将目的序列插入基因组DNA中的靶向位点处。因此,基因编辑转基因可以包含编码用于插入的目的DNA序列的这些核酸。在一些实施方案中,用于插入的DNA序列是编码本文提供的任何一种治疗性蛋白或其一部分的DNA序列。可替代地或除此之外,基因编辑转基因可以包含编码进行基因编辑过程的多种组分之一的核酸。本文提供的基因编辑转基因可以编码核酸内切酶和/或引导RNA等。
核酸内切酶可以在基因组中的所需位置处的双链DNA中产生断裂,并且使用宿主细胞的机制,使用同源重组、非同源末端连接等来修复断裂。可以用于基因编辑的核酸内切酶类别包括不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)和归巢核酸内切酶。本文提供的病毒载体的基因编辑转基因可以编码本文提供的任何一种核酸内切酶。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码大范围核酸酶的转基因。大范围核酸酶一般特征在于其识别且切割DNA序列(14-40个碱基对)的能力。另外,已知技术例如诱变和高流通量筛选以及组合组装,可以用于产生定制的大范围核酸酶,蛋白质亚基可以在其中结合或融合。大范围核酸酶的实例可以在美国专利号8,802,437、8,445,251和8,338,157;以及美国公开号20130224863、20110113509和20110033935中找到,其大范围核酸酶引入本文作为参考。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码锌指核酸酶的转基因。锌指核酸酶通常包含结合核酸分子内的特异性靶位点的锌指结构域,以及在由结合结构域结合的靶位点内或附近切割核酸分子的核酸切割结构域。通常的改造锌指核酸酶包含结合结构域,其具有3至6个个别锌指基序、以及长度范围为9个碱基对至18个碱基对的结合靶位点。锌指核酸酶可以被设计为靶向给定核酸分子中的几乎任何所需序列用于切割。例如,可以通过组合具有已知特异性的各个锌指基序,来设计具有所需特异性的锌指结合结构域。与DNA结合的锌指蛋白Zif268的结构已为该领域的许多工作提供了信息,并且对于64种可能的碱基对三联体各自获得锌指,然后将这些模块锌指混合并匹配,以设计具有任何所需序列特异性的蛋白质的概念已得到描述(Pavletich N P,Pabo C O(May 1991). "Zinc finger-DNArecognition:crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252(5007):809-17,其全部内容引入本文)。在一些实施方案中,采用细菌展示或噬菌体展示来开发锌指结构域,所述锌指结构域识别所需的核酸序列,例如所需的核酸内切酶靶位点。在一些实施方案中,锌指核酸酶包含经由接头例如多肽接头,彼此融合或以其它方式缀合的锌指结合结构域和切割结构域。接头的长度可以限定与由锌指结构域结合的核酸序列的切割距离。锌指核酸酶的实例可以在美国专利号8,956,828;8,921,112;8,846,578;8,569,253中找到,其锌指核酸酶引入本文作为参考。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的转基因。TALEN是通过将特异性DNA结合结构域融合至通用的DNA切割结构域而产生的人工限制性酶。可以被设计为结合任何所需DNA序列的DNA结合结构域,来自转录激活因子样(TAL)效应物,由感染植物的某些细菌所分泌的DNA结合蛋白。转录激活因子样效应物(TALE)可以进行改造,以结合实际上任何DNA序列,或与DNA切割结构域组合一起连接到阵列内。TALEN可以类似地用于设计锌指核酸酶。TALEN的实例可以在美国专利号 8,697,853;以及美国公开号20150118216、20150079064和20140087426中找到,其TALEN引入本文作为参考。
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)/Cas系统也可以用作基因编辑的工具。在CRISPR/Cas系统中,引导RNA(gRNA)是基因组或附加体(例如在质粒上)编码的。在转录之后,gRNA与核酸内切酶如Cas9核酸内切酶形成复合物。然后,通过gRNA的特异性限定序列(SDS),将复合物引导至通常位于细胞的基因组中的DNA靶序列。Cas9或Cas9核酸内切酶指包含Cas9蛋白质或其片段(例如,包含Cas9的活性或失活的DNA切割结构域、或者Cas9的部分失活的DNA切割结构域(例如,Cas9切口酶)、和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白质)的RNA引导的核酸内切酶。Cas9识别CRISPR重复序列中的短基序(PAM或前间隔序列邻近基序),以帮助区分自我与非自我。Cas9核酸内切酶序列和结构是本领域技术人员众所周知的(参见例如,"Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J. J.,McShan W. M.,Ajdic D. J.,Savic D. J.,Savic G.,LyonK.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A. N.,Kenton S.,Lai H. S.,Lin S. P.,Qian Y.,Jia H. G.,Najar F. Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L. expand/collapse author listMcLaughlin R. E.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658- 4663(2001);"CRISPRRNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III."Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C. M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z. A.,Eckert M. R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);以及"Aprogrammable dual-RNA-guidedDNAendo- nuclease in adaptive bacterialimmunity." Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J. A.,CharpentierE. Science 337:816-821(2012))。可以这样改造单个引导RNA("sgRNA",或简单地"gNRA"),以便将crRNA和tracrRNA两者的各方面掺入单个RNA种类内。参见例如,Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J. A.,Charpentier E. Science 337:816-821(2012)。在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码Cas9核酸内切酶的转基因。
Cas9直向同源物已在各个物种中得到描述,所述物种包括但不限于化脓性链球菌(S. pyogenes)和嗜热链球菌(S. thermophilus)。另外的合适的Cas9核酸内切酶和序列对于本领域技术人员将是显而易见的,并且此类Cas9核酸内切酶和序列包括来自以下中公开的生物和基因座的Cas9序列:Chylinski,Rhun和Charpentier, "The tracrRNA and Cas9families of type II CRISPR-Cas immunity systems"(2013)RNA Biology 10:5,726-737。在一些实施方案中,基因编辑转基因编码野生型Cas9、片段或Cas9变体。“Cas9变体”是具有Cas9功能的任何蛋白质,其与当它在自然界中存在时的Cas9野生型核酸内切酶不同。在一些实施方案中,Cas9变体与野生型Cas9或其片段共享同源性。在一些实施方案中,Cas9变体与化脓性链球菌或嗜热链球菌Cas9蛋白具有至少40%的序列同一性,并且保留Cas9功能性。优选地,序列同一性为至少90%、95%或更高。更优选地,序列同一性是至少98%或99%的序列同一性。在用于本文提供的任何一种方法中的任何一种Cas9变体的一些实施方案中,序列同一性是氨基酸序列同一性。Cas9变体还包括Cas9二聚体、Cas9融合蛋白、Cas9片段、最小化的Cas9蛋白、不含切割结构域的Cas9变体、不含gRNA结构域的Cas9变体、Cas9重组酶融合物、fCas9、FokI-dCas9等。此类Cas9变体的实例可以例如在美国公开号20150071898和20150071899中找到,其Cas9蛋白和Cas9变体的描述引入本文作为参考。Cas9变体还包括Cas9切口酶,其包含使Cas9中的单个核酸内切酶结构域失活的突变。与双链断裂相对,此类切口酶可以诱导靶核酸中的单链断裂。Cas9变体还包括Cas9无效核酸酶,其中一个核酸酶结构域通过突变失活的Cas9变体。另外的Cas9变体和/或鉴定进一步Cas9变体的方法的实例可以在美国公开号20140357523、20150165054和20150166980中找到,其关于Cas9蛋白、Cas9变体及其鉴定方法的内容引入本文作为参考。
Cas9变体的另外其它实例包括仅具有切口酶活性的突变形式,称为Cas9D10A。当基因座通过设计为生成相邻DNA切口的成对的Cas9复合物靶向时,Cas9D10A在靶特异性方面很有吸引力。Cas9变体的另一个实例是核酸酶缺陷型Cas9(dCas9)。HNH结构域中的突变H840A和RuvC结构域中的突变D10A使切割活性失活,但并不阻止DNA结合。因此,这种变体可以用于序列特异性靶向基因组的任何区域,而无需切割。相反,通过与各种效应物结构域融合,dCas9可以用作基因沉默或激活工具。在一些实施方案中,基因编辑转基因可以编码本文提供的Cas9变体中的任何一种。
使用RNA可编程核酸内切酶如Cas9用于位点特异性切割(例如,以修饰基因组)的方法是本领域已知的(参见例如,Cong,L.等人Multiplex genome engineering usingCRISPR/Cas systems. Science 339,819-823(2013);Mali,P.等人RNA-guided humangenome engineering via Cas9. Science 339,823-826(2013);Hwang,W.Y.等人Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Naturebiotechnology 31,227-229(2013);Jinek,M.等人RNA-programmed genome editing inhuman cells. eLife 2,e00471(2013);Dicarlo,J.E.等人Genome engineering inSaccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research(2013);Jiang,W.等人RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cassystems. Nature biotechnology 31,233-239(2013))。
在一些实施方案中,病毒载体可以包括编码归巢核酸内切酶的转基因。归巢核酸内切酶可以在少数或单个位置处催化用于合成其的基因组DNA的水解,从而在宿主内水平上传递其基因,增加其等位基因频率。归巢核酸内切酶一般具有长识别序列,它们从而具有低概率的随机切割。一个等位基因在传递之前携带该基因(归巢核酸内切酶基因+,HEG+),而另一个则不携带(HEG-),并且易受酶切割影响。一旦合成,该酶就破坏HEG等位基因中的染色体,启动来自细胞DNA修复系统的应答,所述系统采取相反的模式,使用重组未受损的DNA等位基因,含有关于核酸内切酶的基因的HEG+。因此,该基因被拷贝到最初没有该基因的另一个等位基因,并且它连续地传播下去。归巢核酸内切酶的实例可以例如在美国公开号20150166969;以及美国专利号9,005,973中找到,其归巢核酸内切酶引入本文作为参考。
转基因的序列也可以包括表达控制序列。表达控制DNA序列包括启动子、增强子和操纵子,并且一般基于表达构建体待用于其中的表达系统加以选择。在一些实施方案中,启动子和增强子序列就增加基因表达的能力加以选择,而操纵子序列可以就调节基因表达的能力加以选择。转基因还可以包括促进并优选加速宿主细胞中的同源重组的序列。转基因还可以包括对于宿主细胞中的复制所必需的序列。
示例性表达控制序列包括启动子序列,例如巨细胞病毒启动子;劳斯肉瘤病毒启动子;和猿猴病毒40启动子;以及本文其它地方公开的或本领域另外已知的任何其它类型的启动子。一般地,启动子可操作地连接在编码所需表达产物的序列的上游(即,5’)。转基因还可以包括合适的多聚腺苷酸化序列(例如,SV40或人生长激素基因多聚腺苷酸化序列),其可操作地连接在编码序列的下游(即,3')。
抗原与ITE的化学计量学
取决于抗原和待治疗的疾病类型,可以使用各种抗原/ITE比。在一些情况下,抗原/ITE的质量比为1:10至100:1(例如1:5至50:1、1:4至20:1、或1:3至10:1,例如1:10至1:8、1:8至1:6、1:6至1:4、1:4至1:2、1:2至1:1、1:1至2:1、2:1至3:1、3:1至4:1、4:1至5:1、5:1至10:1、10:1至20:1、20:1至30:1、30:1至40:1、40:1至50:1、50:1至60:1、60:1至80:1、或80:1至100:1,例如约1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20:1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1)。在一些实施方案中,抗原/ITE的摩尔比为1:5000至25:1(例如1:2000至20:1、1:1000至15:1、或1:500至10:1,例如1:2000至1:1000、1:1000至1:500、1:500至1:200、1:200至1:50、1:50至1:30、1:30至1:20、1:20至1:10、1:10至1:5、1:5至1:4、1:4至1:3、1:3至1:2、1:2至1:1、1:1至2:1、2:1至3:1、3:1至4:1、4:1至5:1、5:1至10:1、10:1至20:1、20:1至50:1、50:1至100:1、100:1至500:1、500:1至2000:1、或2000:1至5000:1,例如约1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20:1:10、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1)。
治疗方法和预防方法
本文所述的组合物和方法具有用于治疗患者(例如,人)、或用于预防病症(例如,自身免疫性病症)的发展发作的特别用途,所述患者将获益于治疗性免疫调制(例如,需要压制免疫应答的患者,例如患有自身免疫性病症的患者)。在一些实施方案中,可以通过本文描述的组合物(例如,脂质体组合物)和方法治疗的疾病或病症,可以包括但不限于自身免疫性疾病、过敏性疾病(例如,对环境因子如动物皮屑、花粉、尘螨、昆虫叮咬等等的过敏,以及对坚果、蛋制品、海鲜、谷物等等的食物过敏)、遗传性疾病(通过蛋白质替代疗法或基因疗法进行治疗)、器官移植(与免疫排斥相关,或者在骨髓移植的情况下,与移植物抗宿主病相关)、以及通过肽或蛋白质治疗剂治疗的广泛多样的其它疾病(例如,糖尿病)。
在一些实施方案中,可以通过本文所述的组合物(例如,本发明的脂质体组合物)或方法治疗的自身免疫性疾病,包括但不限于影响关节和结缔组织的疾病(例如,强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、牛皮癣关节炎和混合性结缔组织疾病)、以及影响脑的疾病(例如,多发性硬化和视神经脊髓炎)、影响内分泌器官的疾病(例如,I型糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎和艾迪生氏病)、影响胃肠道的疾病(例如,自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、乳糜泻和炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎))、影响皮肤的疾病(例如,牛皮癣、硬皮病、斑秃、特应性皮炎、寻常性天疱疮和大疱性类天疱疮)、影响肌肉的疾病(例如,重症肌无力、格巴二氏综合征和多发性肌炎/皮肌炎)、影响心脏的疾病(例如,风湿热)、影响肝脏的疾病(例如,自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎)、影响感觉器官的疾病(例如,自身免疫性葡萄膜炎和白塞氏病)、影响血液或骨髓的疾病(例如,自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜和特发性白血球减少症)、影响肺的疾病(例如,古德帕斯彻氏综合征)、影响肾脏的疾病(例如,自身免疫性肾炎,包括肾小球肾炎)、影响血管系统的疾病(例如,韦格纳氏肉芽肿)、影响周围神经系统的疾病(例如,慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病)、以及特征在于多器官受累的疾病(例如,系统性红斑狼疮和干燥综合征)。
该方法包括选择需要治疗的患者,并且向该患者施用本文所述的一种或多种组合物。可以例如通过其医护人员来鉴定需要治疗的受试者。
治疗有效量的本文所述的一种或多种组合物可以通过标准方法进行施用,例如通过一种或多种施用途径,例如通过目前由美国食品和药物管理局(FDA;参见例如,万维网网址fda.gov/cder/dsm/DRG/drg00301.htm)批准的一种或多种施用途径。致耐受性脂质体或其药物组合物可以经由静脉内、皮下、皮内(包括表皮内)、关节内、肺或粘膜(包括鼻)途径,全身或局部地例如肠胃外施用。在一些实施方案中,组合物可以肝内、脑内、肌内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、瘤内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、经口、局部、透皮、通过吸入、通过雾化、通过注射、通过植入、通过输注(例如,通过连续输注)、通过导管、通过灌洗或在乳膏中施用。
施用于患者的脂质体的量可以根据抗原和/或ITE的浓度而变。在一些实施方案中,在单剂量的脂质体中的ITE量为约50 μg至15 mg(例如,75 µg至100 µg、100 µg至150 µg、150 µg至300 µg、300 µg至500 µg、500 µg至750 µg、750 µg至1500 µg、1500 µg至5000µg、或5000 µg至15000 µg)。例如,在单剂量的脂质体中的ITE量可以是100 μg至1000 μg(例如200 µg至800 µg,例如约200 µg、约300 µg、约400 µg、约500 µg、约600 µg、约700 µg、约800 µg、约1000 µg或约1500 µg)。
致耐受性脂质体的药物组合物对于预期的施用途径可以具有任何合适的浓度。
在一些实施方案中,单个单位剂量的致耐受性脂质体(例如,含有任何前述量的ITE的单剂量)可以包括1011至1016个脂质体(例如1011至1016个脂质体、1011至1015个脂质体、1012至1014个脂质体、或约1013个脂质体,例如1011至1012个脂质体、1012至1013个脂质体、1013至1014个脂质体、1014至1015个脂质体、或1015至1016个脂质体,例如1012至1015个脂质体、5.0× 1013至1.0 × 1014个脂质体,例如约8× 1013个脂质体)。
组合物可以在数周、数月或数年的治疗期过程中施用一次或多次(例如,直至诱导对疾病有关的自身抗原的耐受)。在一些情况下,组合物每天一次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每年五次、每年四次、每年三次、每年两次、或每年一次施用于受试者。
下述实施例并不限制本文描述的实施方案的范围。本领域技术人员将了解可以在下述实施例中进行修改,所述实施例预期由本发明的精神和范围涵盖。
实施例
将含有ITE和/或髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗原的纳米微粒脂质体的各种制剂合成、表征且在如下述实施例中所述的自身免疫的动物模型中进行测试:
实施例1. 装载ITE的胶束的配制和表征
2-(1H-吲哚-3-基羰基)-4-噻唑甲酸甲酯(ITE)是有效的芳香烃受体激动剂,其难以以纳米微粒形式(例如,包括金和PLGA纳米颗粒以及许多常规脂质体组合物)配制。一个促成因素是亲脂性ITE在许多常规溶剂中的低溶解度,所述常规溶剂包括水(~115微摩尔)、甲醇(~3毫摩尔)和乙醇(~3.3毫摩尔)。ITE也非常易于自聚集。
该实施例提供了使用DSPE-PEG、TPGS及其混合物,将ITE装载到胶束内的示例性方法,并且本文提供了各自的表征。
方法1:DSPE-PEG胶束
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2000-DSPE,Avanti Polar Lipids目录#880120),在硼硅酸盐玻璃管中的氯仿中溶解至15、20、25、30、35或40 mM的浓度(分别为分批1-6)。将ITE(1 mg粉末)加入0.5 ml的每种PEG2000-DSPE/氯仿溶液中,并且通过涡旋和在50℃下的间歇加热进行混合,直至ITE完全溶解并获得澄清溶液。然后在氮下蒸发氯仿,在玻璃管的内侧上留下薄膜。将试管冷冻干燥过夜,以去除所有痕量的氯仿。通过加入0.5 ml HEPES缓冲盐水(HBS;pH 6.5),使玻璃壁上的干燥的PEG2000-DSPE/ITE膜水合。脂质膜的完全悬浮通过在浴式超声波仪(FS20D,FisherScientific)中的涡旋和短暂超声处理来完成。所得到的胶束以10,000 g离心10分钟,并且通过0.2微米的聚醚砜(PES)滤器,以去除任何未封装或沉淀的ITE。然后使用MalvernZetasizer,就大小、多分散性和电荷来表征胶束。通过将胶束制剂溶解于甲醇:乙酸(99:1v/v)中,来确定装载ITE的量。ITE吸收在355纳米处的光(在其下脂质并不吸收的波长),使ITE浓度的分光光度法测量成为可能。产生将ITE浓度与在355纳米处的吸光度相关的标准曲线,并且用于测量ITE装载。ITE封装计算为封装在胶束中的起始ITE(1 mg)的分数。ITE装载计算为由ITE贡献的最终胶束质量的百分比。结果概括于下表1中,并且在图1中示出。
表1. 在PEG2000-DSPE胶束中的ITE封装
胶束大小并未随着PEG2000-DSPE浓度而显著变化,但多分散性在较高的脂质浓度下较低。目视观察显示,较高的PEG2000-DSPE浓度能够携带更多的ITE,因为在分批1中存在可见的ITE沉淀,但在分批6批中则没有。ITE测量确认了这一观察,因为分批1胶束(15 mM脂质)具有最低的封装效率(11.3%),而分批4(30 mM脂质)具有最高的封装效率(29.8%),如图1中所示。
方法2:TPGS胶束
D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS-1000;Millipore-Sigma目录#57668),以15、25、35、45、55、65和75 mg/ml的浓度(分别为分批1-7)溶解于硼硅酸盐玻璃管中的0.5 ml氯仿中。如下表2中所示,将1毫克ITE加入每个管中,得到从1.33%到6.67%(w/w)不等的ITE:TPGS-1000比率。通过涡旋将ITE和TPGS溶解于氯仿中。在氮流下蒸发氯仿,在玻璃管的壁上沉积ITE和脂质的薄膜。将样品冷冻干燥过夜,以去除任何痕量的氯仿。通过涡旋、间歇加热和超声处理,以完全溶解薄膜,将样品用1 ml HBS再水合。使样品在50℃下温育45分钟。胶束以10,000 g离心10分钟,然后通过0.22 µ PES滤器过滤,以去除任何未封装的ITE。如方法1中就大小、电荷和ITE装载来表征胶束。
表2. TPGS-1000胶束中的ITE封装
胶束大小(~12.5-17 nm直径)并未随着TPGS-1000浓度或ITE装载而显著改变,但多分散性随着TPGS-1000浓度增加而减少,如表2中所示。如图2中所示,胶束中装载的ITE量和百分比两者均随着TPGS-1000浓度而逐渐增加。在测试的最高TPGS-1000浓度(75 mg/mL;49.6mM)下,装载了703微克的ITE(起始量的70.3%)。
TPGS-1000胶束的总体特征(大小、ITE装载)与PEG2000-DSPE胶束相似。然而,最高的TPGS-1000脂质浓度得到任何胶束制剂中的最高ITE装载,且具有最低的分散度。
方法3:混合胶束
方法1和2中使用的两种脂质(PEG2000-DSPE和TPGS-1000)以各种比率组合,以合成混合胶束。总脂质浓度固定为50 mg/mL胶束。制备下述PEG2000-DSPE:TPGS-1000比率(w/w):0.1、0.25、0.5、1、1.5和2。首先,称重两种脂质,并且溶解于玻璃管中的0.5 mL氯仿中。接下来,将1 mg ITE加入氯仿溶液中,并且伴随剧烈涡旋、间歇加热至50℃、以及在需要时的超声处理而溶解。一旦ITE完全溶解,就在室温下在氮气流下蒸发氯仿,并且将干燥的玻璃管冷冻干燥过夜,以去除任何残留的痕量氯仿。如上文,将脂质/ITE膜在1.0 mL HBS中再水合。一小时后,将制剂以10,000 g离心10分钟,然后通过0.22 µm PES滤器过滤。如上所述执行胶束表征。
如下表3中所示,大小和分散度在分批中并未显著变化。存在在具有较高分数的TPGS-1000的胶束中朝向较大的ITE装载的趋势。在最高的两个TPGS-1000水平(分批1和2)达到两个最高的装载(40.1%和37%)。
表3. 混合胶束中的ITE封装
由PEG2000-DSPE和TPGS-1000组成的混合胶束与其单脂质配对物基本上并无不同。然而,考虑到脂质浓度(50 mg/ml),由两种(或更多种)脂质组成的胶束提供了在优化药物特性方面增加的灵活性,所述药物特性例如体内半衰期、药物释放速率、药物释放到不同的细胞区室(例如,细胞溶质相对于内体)内、以及与树突状细胞的表面的相互作用。
实施例2. 使用胶束转移的装载ITE的脂质体
在由饱和脂质(例如DMPC:胆固醇或DSPC:胆固醇)组成的脂质体中的ITE封装并未得到令人满意的结果,因为ITE(易于聚集的分子)在与水溶液接触时沉淀。即使当加入小体积的DMSO(小于最终体积的1%)中时,ITE也沉淀。测试了用于溶解ITE的各种措施,例如pH变化或牛血清白蛋白(作为ITE的结合表面)的添加,但这些方法无一可以溶解ITE。为了避免这个问题,尝试了装载ITE的胶束与预先形成的脂质体的融合。
胶束如实施例1(分批6,表1)中进行制备。如Batzri和Korn,Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes 1973,298(4):1015-19中所述,使用乙醇注射法,用DSPC:胆固醇(3:2 w/w)制备脂质体。将脂质溶解于0.250 mL乙醇中。然后将乙醇溶液注入(2 mL)pH 6.5的HEPES缓冲盐水中,并且搅拌30分钟。所得到的多层囊泡在65℃下序贯地通过400、200和100 nm聚碳酸酯滤器挤出,并且在PD-10柱上纯化。然后以基于脂质浓度的摩尔比(PEG:DSPC 12:1),将脂质体与装载ITE的PEG-DSPE胶束在65℃下混合,并且温育1小时。如实施例1中就大小和电荷来分析脂质体。通过将脂质体溶解于甲醇:乙酸(99:1 v/v)中,来测量ITE含量。ITE浓度使用在355纳米下的吸光度进行定量。将脂质体中的ITE量除以用于制备脂质体的胶束中的ITE量,并且将该分数乘以100,以获得ITE转移百分比(即,ITE胶束转移至脂质体的效率)。
在胶束转移到脂质体内之后,观察到平均大小为133.7 ± 34.5 nm的纳米颗粒的单个群体,指示了在转移程序后任何游离胶束的成功去除。脂质体的大小和大小分布通过胶束转移步骤基本上未改变。ITE从胶束转移到脂质体的效率为97.6%。在胶束转移之前脂质体的电荷为-4.28毫伏(mv),其在胶束添加后减少至28.2 mv,指示了在脂质体表面上带负电的PEG的存在。结果概括于下表4中。
表4. ITE胶束转移至脂质体的表征
在主要由饱和脂质组成的脂质体中的ITE封装是可行的。当尝试将ITE直接装载到此类脂质体内时观察到的ITE沉淀,可能反映了ITE自结合的快速动力学相对于通过脂质的ITE溶剂化的相对缓慢速率,可以通过胶束转移来避免的制造障碍。
实施例3. 装载有ITE +/- MOG35-55的卵磷脂酰胆碱(PC)脂质体
尽管ITE可以经由胶束转移程序而装载到胶束和脂质体内,提供了在脂质选择方面的灵活性,但用于将ITE直接装载到脂质体内的方法也具有优点。其中将ITE(按质量计1%的脂质)装载到脂质体内的早期实验得到不一致的ITE装载和频繁的ITE沉淀,所述脂质体主要(按质量计50%)由完全饱和的脂质(例如,1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱;DMPC或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱;DSPC)组成。卵磷脂酰胆碱(卵PC)由具有两种脂肪酸的异质分子群体组成,所述脂肪酸之一含有影响其理化特性的不饱和碳-碳双键。由于这个原因,与用饱和脂肪酸链制备的脂质体相比,含有卵PC的脂质体具有更大的膜流动性,并且趋于“更易漏的”。
使用摩尔比为30:15:2的三种脂质:卵PC、胆固醇和PEG2000-DSPE,通过乙醇注射来制备脂质体。称重总共92.61 mg以指示比率的脂质(61.61 mg卵PC、15.47 mg胆固醇和14.96 mg PEG2000-DSPE),然后加入干净的4 mL玻璃小瓶中。向脂质中加入无水乙醇(250µL),并且使用小型磁力搅拌棒,在37-45℃下的热板上将混合物搅拌约5分钟。从热板上取下混合物,并且再搅拌20 - 30分钟。一旦脂质溶解,就通过从DMSO中的储备溶液移液(添加15.34 µL),以等于脂质总重量(926 µg)1%的量添加ITE。最大的DMSO体积不超过起始乙醇体积的8%(在这种情况下为20 µL)。将脂质/ITE混合物在35-40℃下伴随间歇搅拌加热15分钟,或直至ITE溶解。在等待ITE溶解的同时,将2 mL HEPES缓冲盐水溶液(HBS,pH 6.5)加温至35-40℃。
为了在脂质体中共配制ITE和MOG35-55,将MOG35-55(氨基酸序列:MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)以0.05、0.2、0.5和1 mg/ml的浓度溶解于HBS中,以制备ITE/MOG35-55脂质体。
在搅拌的同时,用预温的巴氏移液管,将脂质/ITE/乙醇溶液迅速转移到加温的HBS(含有或不含MOG35-55)中。将混合物在37-45℃下搅拌30分钟。使用挤出机(Mini-Extruder,Avanti Polar Lipids),将脂质体减少至直径约100 nm的所需大小范围。在加温的挤出机(35-40℃)中,使脂质体溶液序贯地通过400、200和100 nm的单个聚碳酸酯(PC)膜,各11次。通过浸入冰水浴中,使挤出的脂质体冷却。45分钟后,使用PD-10柱(SephadexG25M,GE Healthcare),对脂质体进行层析纯化,以4 mL HBS的最终体积洗脱。脂质体通过0.2 µm PES滤器进行无菌过滤,并且在4℃下贮存于HBS中。
使用Malvern Zetasizer,就大小、大小分布和电荷来表征脂质体。制备了三个分批的脂质体(B1、B2、B3),各自包括四种类型的脂质体:不含ITE或MOG35-55的空白(简单的)脂质体(缩写:PL)、装载ITE的脂质体(ITE-L)、装载MOG35-55的脂质体(MOG-L)、以及装载ITE加上MOG35-55的脂质体(ITE-MOG-L)。分批1、2和3中脂质体的大小、大小分布和电荷是非常相似的,如下表5中所示。粒径范围为90-110 nm,具有在ITE-MOG-L中很小但持续的尺寸减少。ζ电位在装载有MOG的脂质体中也是适度地更负性的(后者中的-20至-24 mV相对于前者中的-25至-32 mV)。
表5. ITE + MOG35-55脂质体的物理表征
为了测量有效载荷分子(ITE、MOG35-55)的装载,将脂质体溶解于甲醇:乙酸(99:1 v/v)中,并且如实施例1中所述,用分光光度法来定量ITE。使用microBCA试剂盒(ThermoFisherScientific,目录号23235)或CBQCA Protein Quantitation Kit(ThermoFisherScientific,目录号C6667),来测量MOG35-55浓度。如表6中所示,ITE封装跨越分批是一致的(封装了起始ITE的17-24%),并且MOG35-55的共封装并不干扰ITE装载(ITE-L中的平均ITE封装:19.8%;ITE-MOG-L中的平均ITE封装:23.5%)。
表6. ITE + MOG35-55脂质体的ITE装载特征
执行稳定性评价,其中来自分批1的脂质体在4℃下贮存于HBS中一个月,并且重新测定。如下表7和8中所示,在贮存一个月后,分批1脂质体的重新分析揭示了在物理参数方面没有显著变化。
表7. 在贮存时分批1脂质体的表征
表8. 在1个月贮存后分批1脂质体的稳定性评价
评价了ITE的起始浓度对封装效率的作用,并且结果在下表9中提供。
表9. ITE封装效率
结论
将ITE直接封装在脂质体中的先前尝试(例如,使用DSPC、DMPC或HEPC和胆固醇)是不成功的,因为ITE封装的低效率(2%或更少),经常伴随在脂质体形成过程中或之后不久的ITE沉淀。然而,卵PC脂质体的特征允许ITE(和MOG35-55)的直接配制。每100微升(即,用于小鼠的典型剂量体积)装载的ITE量高于治疗阈值。进一步,当在2-8℃下冷藏时,卵PC脂质体在六个月内是稳定的。
实施例4. 装载有ITE的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)脂质体
由于卵PC中的一个不饱和碳-碳双键,用至少50%的卵PC制备的脂质体具有比用饱和磷脂制备的脂质体更大的膜流动性。为了确定使用具有两个不饱和键的磷脂制备的脂质体是否显示出甚至更大的流动性并且更有效地装载ITE,对于脂质体使用在每条脂肪酸链中具有单个不饱和键的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。使用实施例3中所述的方法,使用摩尔比为30:15:2的三种脂质:1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、胆固醇和PEG2000-DSPE),通过乙醇注射法来制备脂质体。
制备两个分批的DOPC脂质体,其中ITE以起始脂质的0.5%或1.0%(w/w)添加。平行制备两个分批的卵PC脂质体,以比较ITE装载。在两个ITE比率下,与卵PC脂质体中相比,更多的ITE封装在DOPC脂质体中,如下表10中所示。在0.75%的ITE:脂质(w/w)下,相对于DOPC脂质体中的51.8%,封装效率在卵PC脂质体中为34.1%。在0.5%的ITE:脂质(w/w)下,相对于DOPC脂质体中的66.7%,封装效率在卵PC脂质体中为54.1%。因此,膜流动性对ITE装载的积极影响扩展超出了具有一种单不饱和脂肪酸的磷脂的存在(占总脂质的>50%)与具有两条单不饱和脂肪酸链的磷脂的存在(占总脂质的>50%)。
表10. DOPC和卵PC之间的ITE装载比较
用卵PC作为不饱和磷脂的后续实验,显示了以按重量计0.5%的ITE可重现的60-65%的ITE装载效率。另外,60或65 mM(相对于较早实验中的40 mM)的脂质浓度目前允许生产更大的脂质体分批。
实施例5. 比较饱和脂质和不饱和脂质对脂质体中的ITE封装的作用
这项研究的目标是测试在限定的脂质浓度范围内的各种摩尔比,并且找到卵PC、胆固醇和mPEG2000-PE的组合,其得到用于药物装载和长期稳定性的最佳脂质体特征。进一步地,为了更好地理解使用饱和脂质相对于不饱和脂质对ITE封装的作用,使用卵PC (HEPC)(18:0)的氢化形式制备脂质体,所述氢化形式与卵PC的区别仅在于HEPC中的不饱和碳-碳键的不存在(即HEPC具有两条饱和脂肪酸链相对于卵PC中的一种单不饱和脂肪酸)。
研究设计:
脂质比在关于每种脂质的下述范围内变化:
卵PC或HEPC:~53-72摩尔%
胆固醇:~25-44摩尔%
PEG2000-PE:1.5至6.25摩尔%
对于测试的所有分批,ITE固定为按重量计总脂质质量的0.5%。ITE从DMSO贮液中添加。每天就沉淀/聚集的任何迹象观察分批。
表11
方法
为了消除另外脂质的任何效应,使用与标准配方(参见表)相同的摩尔比来配制HEPC脂质体,所述标准配方使用卵PC(HEPC:胆固醇:PEG2000PE(3:1.5:0.2)),使用40 mM的脂质浓度。对于使用卵PC制备的常规分批,ITE以0.5% w/w进行装载。使用LIPEX挤出机制备HEPC脂质体(3 mL,40 mM)。在挤出之后,检查聚碳酸酯膜在挤出过程中的ITE沉淀。
观察
尽管挤出顺利地进行,但发现大部分ITE沉淀在聚碳酸酯膜上。这个结果与我们用DSPC和DMPC的先前观察一致。在以相同方式制备的卵PC分批中,即使当使用60和65 mM的脂质浓度时,也不存在ITE沉淀的证据。在挤出之后,使HEPC脂质体经受PD-10纯化步骤,并且最后通过0.22 µm PES滤器进行过滤。在最后的过滤步骤中,当使用HEPC脂质体时,发现ITE沉淀在滤器上。再次,这对于以0.5% ITE(w/w)的卵PC脂质体并不发生。最后,测量HEPC脂质体中的ITE装载。虽然卵PC分批照常规显示约60%的ITE装载,但HEPC脂质体仅显示了2.37%的ITE装载。表11显示了观察的概括。
表12. 饱和脂质和不饱和脂质对脂质体中的ITE封装的作用
胆固醇的效应
胆固醇的摩尔比影响ITE装载效率。下表显示了表11中的9个脂质体分批的胆固醇和卵PC浓度(表示为百分比的摩尔比)。
表13:从每种组分的最高摩尔%到最低摩尔%排序的分批
结果
表14:分批的表征数据(大小、PDI、ζ电位和药物装载)
*在4C下贮存的脂质体中,在2周(CL-1)、3周(CL-7)和1个月(CL-4a)中观察到沉淀。
如表14和图1B中所示,药物装载在具有30% – 32%的胆固醇摩尔百分比的脂质体分批中是最高的;在具有最高胆固醇摩尔百分比(43.86%)的分批CL-1中是最低的,并且在具有第二高的胆固醇摩尔百分比(38.17%)的分批CL-7中是第二低的。ITE在一周内从这两个脂质体分批中沉淀。其中ITE沉淀的第三个分批是CL-4,具有36%的胆固醇摩尔比。即使ITE装载在这个分批中是相对有效的,但高胆固醇限制了脂质体稳定性。在以30.07%胆固醇的分批CL-3中观察到最有效的ITE装载,其也稳定了超过1个月(观察极限)。
结论
如由表11中概括的观察显而易见的,饱和脂质不利于ITE在脂质体中的封装。如果制剂中其它脂质的比率和相对量保持相同,则饱和脂质对于有效和稳定的ITE封装是优选的。
另外,胆固醇浓度影响ITE装载效率和稳定性(statibility),其中观察到的最佳结果接近于30%的胆固醇摩尔比。
实施例6. 装载有ITE的脂质体在体外诱导树突状细胞中芳香烃受体(AHR)调节的基因的表达
使用包被有针对CD11c的抗体的磁珠(Pan-DC分离试剂盒,Miltenyi Biotec),从健康C57Bl/6J小鼠的总脾细胞群体中分离树突状细胞(DC)。将DC计数并且以100,000-200,000个细胞/孔铺平板在塑料组织培养孔中。将脂质体(空白或装载ITE的)或游离ITE以1 nMITE的浓度加入DC中,并且在37℃下温育6小时。然后裂解DC,分离mRNA,并且通过RT-PCR测量其为AHR调节基因的Cyp1a1和Cyp1b1的表达。数据显示了6个样品的平均值 ± SEM。装载卵PC ITE的脂质体的结果显示于图3中。
实施例7. 装载有肽的脂质体在体外诱导T细胞增殖
从2D2小鼠中收获脾细胞,所述小鼠表达对于MOG35-55特异性的转基因2D2 T细胞储库(TCR),并且用10μg游离递送的MOG(游离MOG),单独装载在卵PC脂质体中的MOG(MOG-L),或装载在卵PC脂质体中,并且另外用装载ITE的卵PC脂质体刺激(以1μg ITE的剂量)的MOG进行体外刺激。在37℃下温育72小时后,使用Cell Titer Blue细胞增殖测定,来评价细胞增殖。数据显示了4个样品的平均值 ± SEM。结果显示于图4中。用游离MOG或仅MOG脂质体刺激的脾细胞诱导2D2细胞增殖,指示了MOG肽呈递给T细胞。与MOG脂质体和ITE脂质体一起温育的2D2脾细胞并未诱导T细胞增殖,指示了ITE可能正在压制增殖性T细胞应答。
实施例8. 用致耐受性脂质体治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的小鼠模型,所述多发性硬化与广泛范围的自身免疫性病症共享许多致病基础。该实施例示出了用本发明的纳米微粒脂质体治疗EAE,并且如“结论”部分中讨论的,揭示了与已知技术相比,通过生成以压制CD4 T效应细胞以及诱导调节性T细胞(Treg)和Tr1细胞为特征的免疫耐受,本发明提供了出乎意料的针对疾病进展的效力。
方法
通过皮下注射在完全弗氏佐剂(CFA)中的200 µg MOG35-55,在C57BL/6小鼠中诱发实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。另外,在第0天和第2天时,腹膜内(i.p.)施用200 ng百日咳毒素(Sigma-Aldrich)。
悬浮于Hepes缓冲液中的卵PC脂质体(空白的、装载ITE的或装载ITE + MOG35-55的),在第7天时以150 µL静脉内(眼眶后)施用于5只小鼠的组。这样施用装载ITE和ITE+MOG的脂质体,使得递送7μg ITE/剂量,并且装载ITE+MOG的脂质体含有4μg MOG35-55肽。就EAE的临床体征每天监测小鼠,从第10天开始,并且一直持续到第24天,实验的最后一天。EAE如下评分:0,无疾病体征;1,尾部中的张力丧失;2,后肢轻瘫;3,后肢瘫痪;4,四肢瘫痪;和5,垂死。对于每组5只小鼠计算平均评分和平均值的标准误差。在实验结束时,从最近实施安乐死的小鼠中收集脑、淋巴结和脾脏(除非另有说明,否则分析来自每组的所有小鼠),并且执行下述实验,以评价三种不同脂质体制剂的免疫学效应:
(i)将脾脏分解成单细胞悬浮液,并且用浓度为1、10或100 μg/mL的MOG35-55肽进行刺激,以测量免疫学回忆。在72小时后,使用MTT细胞增殖测定来测量细胞增殖。
(ii)收获脑和脊髓并分解成单细胞悬浮液。CD4+ T细胞使用磁珠进行分离,进行渗透化处理且固定,用针对白介素17(IL-17)和干扰素γ(IFNγ)的抗体进行染色,并且通过流式细胞术进行分析。分析来自4-5只小鼠/组的细胞。
(iii)来自上文(ii)的脑和脊髓衍生的CD4+ T细胞用MOG35-55特异性四聚体(装载有MOG35-55的多聚化MHCII蛋白),以及针对FoxP3、CD25、Lag3和CD49b的抗体进行染色,并且通过流式细胞术进行分析。分析来自4-5只小鼠/组的细胞。
结果
如图5中所示,与用空脂质体(简单-L)治疗的小鼠相比,用单独的ITE脂质体治疗仅显示了较小的效应,而用ITE+MOG脂质体治疗显著改善了EAE的症状。为了确认在用装载ITE和MOG35-55的脂质体治疗的小鼠中适应性免疫细胞的耐受,收获来自脾脏和淋巴结的淋巴细胞,并且用MOG35-55进行离体再刺激。如图6中所示,与来自用对照脂质体治疗的小鼠的淋巴细胞相比,从用装载ITE和MOG35-55的脂质体治疗的小鼠中收获的脾细胞增殖更少。
评价了来自各种组织的淋巴细胞的表型,以阐明装载ITE和MOG35-55的脂质体是否使淋巴细胞谱从效应表型偏向调节表型。与空脂质体治疗的小鼠和装载ITE的脂质体治疗的小鼠相比,用装载ITE和MOG35-55的脂质体治疗的小鼠显示了浸润到CNS内的效应IL-17+和IFNγ+ T细胞中的明显降低(图7A和7B)。进一步地,用装载ITE和MOG35-55的脂质体治疗的小鼠显示了在脑和脊髓中抗原特异性FoxP3+调节性T细胞和FoxP3- Tr1调节性T细胞的扩增。
结论
装载有ITE和MOG35-55的脂质体改善了小鼠中的EAE症状,其与中枢神经系统中效应T细胞浸润的压制和T调节细胞的扩增相关。在脂质体中的ITE封装比先前描述的金纳米颗粒基本上更有效。Yeste等人(PNAS 2012)使用装载ITE和MOG35-55的金纳米颗粒来治疗EAE。另外,Quintana等人(PNAS 2010)显示了,通过200 µg ITE/小鼠(其为目前使用的那种28倍的剂量)的每天施用(i.p.或经口),在同一小鼠模型中改善EAE。最后,Quintana等人(Nature2008)显示了,2,3,7,8-四氯二苯并-对二噁英(TCDD),最有效的已知AHR激动剂,在1 µg的剂量下改善EAE,但在100 ng下则没有。在比较ITE与TCDD的大多数体内研究中,后者是~1,000倍更有效的。因此,脂质体ITE相对于未配制的TCDD ~10倍的效力也是令人惊讶的,并且突出显示了本脂质体制剂的效力。
实施例9. 通过施用致耐受性纳米颗粒来预防小鼠中的胶原诱发性关节炎
胶原诱发性关节炎是人类风湿性关节炎的动物模型,由于其简单性和可重现性而被广泛使用。用II型胶原(CII)(通常在关节软骨中表达;在下文所述的实验中使用牛CII)来免疫动物。这种模型重现了特征在于人类风湿性关节炎的许多先天性和适应性免疫机制,并且已用于测试随后为发展为人疗法的治疗(如肿瘤坏死因子抗体)。
方法
在三个步骤中,在C57/B16小鼠中诱发关节炎的疾病预防模型。在第0天时,用皮下(s.c.)施用的在完全弗氏佐剂中的牛CII(bCII)来免疫小鼠。随后为在第21天时,用悬浮于不完全弗氏佐剂中的bCII的第二次s.c.免疫,并且在第24天时,经由腹膜内注射来施用脂多糖(25微克)。在两个步骤中,在C57/B16小鼠中诱发关节炎的疾病治疗模型。在第0天时,用皮下(s.c.)施用的在完全弗氏佐剂中的牛CII(bCII)来免疫小鼠。随后为在第21天时,用悬浮于不完全弗氏佐剂中的bCII的第二次s.c.免疫。
具有8-10只小鼠的四组(除非另有说明)经由尾静脉注射每周给药两次,所述尾静脉注射使用简单脂质体、仅装载有bCII的脂质体、仅装载有ITE的脂质体、以及装载有ITE和bCII的脂质体(组E)。首次用于实验的小鼠未用CII进行免疫,并且也未接受治疗。在第-1天时(疾病预防实验),或在第30-35天时,在20%至30%的小鼠已发展关节炎后(疾病治疗试验),起始治疗。
每天就疾病的存在(发病率/组)和累积疾病评分来评估小鼠。对于前三周,小鼠每周称重一次,然后从第24天时开始,每周称重两次。爪厚度每周测量两次。在两个实验中收集了相同的测量。
在疾病预防实验中,在第46天时,对小鼠实施安乐死,而在疾病治疗实验中,在第88天时,对小鼠实施安乐死。收获血液、淋巴结、脾脏和关节,用于组织病理学和免疫学分析,包括血液中的抗CII抗体滴度、在关节中的FoxP3表达水平、以及检测CII肽的Tr1(T调节)细胞数目(通过关于CII四聚体和Tr1标记物的组合染色测量的)。
组间(基于单因素ANOVA)的统计学显著差异用星号进行标记。一个星号指示在P <0.05水平上的显著性。两个星号指示在P <0.01水平上的显著性,而三个星号指示在P <0.001水平上的显著性。
结果
在疾病预防模型中,用装载有ITE和CII的脂质体治疗的小鼠经历了关节炎肢体的最小累积评分和数目(在所有测量间隔下统计学显著的)(图9A和9B)。用装载有ITE和CII的脂质体治疗的小鼠也显示了比其它治疗组更低的IgG2a抗体滴度(图10A),以及在关节中增加的FoxP3和IL10 mRNA表达(图10B和10C)。与空脂质体相比,在用装载有ITE和CII的脂质体治疗的小鼠的脾脏中,CII应答性效应CD4+ T细胞的频率也是降低的(图10D)。
在治疗模型中,在20-30%的小鼠发展关节炎后开始治疗。与预防模型一样,用装载有ITE和CII的脂质体的治疗改善了持续的胶原诱发性关节炎。具体地,用装载有ITE和CII的脂质体治疗的小鼠展示较低的累积严重性评分(图11A)、关节炎肢体数目(图11B)和平均爪厚度(图11C)。用装载有ITE和CII的脂质体治疗的小鼠也显示了比其它治疗组更低的IgG2a和IgG2b抗体滴度(图12A和12B)。
结论
装载有ITE和CII的脂质体在胶原诱发性关节炎的疾病预防和治疗模型中是有效的。作用机制涉及T调节细胞的刺激、T效应细胞和自身抗体水平的压制。
其它实施方案
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都引入本文作为参考,其程度如同每个独立出版物或专利申请特别地且个别地指出引入作为参考。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述,但应理解它能够进一步修改,并且本申请预期覆盖本发明的任何变化、用途或适应,其一般而言遵循本发明的原理,并且包括与本公开内容的此类偏离,所述偏离在本发明所属领域内的已知或惯常实践内,并且可以应用于上文阐述的基本特点,并且在权利要求的范围内。
其它实施方案在权利要求内。
Claims (76)
1.一种组合物,其包含平均直径为50至250纳米(nm)的脂质体群体,其中所述脂质体群体包含:
(i) 0.3或更大的平均去饱和指数;和
(ii) 200-15,000个2-(1H-吲哚-3-基羰基)-4-噻唑甲酸甲酯(ITE)或其盐的分子/脂质体的平均值。
2.权利要求1的组合物,其中所述脂质体群体包含脂质混合物,所述脂质混合物包含饱和脂质种类、不饱和脂质种类和胆固醇,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占所述脂质混合物的至少50%。
3.权利要求2的组合物,其中所述不饱和脂质种类包含两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包含至少一个不饱和键。
4.权利要求1-3中任一项的组合物,其中所述饱和脂质种类与聚(乙二醇)(PEG)缀合。
5.权利要求4的组合物,其中所述饱和脂质种类是PEG2000-DSPE。
6.权利要求5的组合物,其中所述PEG2000-DSPE包含长度为至少20个(乙二醇)单元的PEG链。
7.权利要求3-6中任一项的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含单个不饱和键。
8.权利要求3-6中任一项的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含多重不饱和键。
9.权利要求2的组合物,其中所述脂质混合物为26%至34%的胆固醇。
10.一种组合物,其包含平均直径为50至250 nm的脂质体群体,其中所述脂质体群体包含:
(i)其为26%至34%的胆固醇的脂质混合物;和
(ii) 200-15,000个ITE或其盐的分子/脂质体的平均值。
11.权利要求10的组合物,其中所述脂质体群体包含0.3或更大的平均去饱和指数。
12.权利要求10或11的组合物,其中所述脂质体群体包含脂质混合物,所述脂质混合物包含饱和脂质种类和不饱和脂质种类,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占所述脂质混合物的至少50%。
13.权利要求12的组合物,其中所述不饱和脂质种类包含:
(i)两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包含至少一个不饱和键;或
(ii)一个脂质尾部,其中所述脂质尾部包含至少一个不饱和键。
14.权利要求13的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含单个不饱和键。
15.权利要求13的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含多重不饱和键。
16.权利要求11-15中任一项的组合物,其中所述饱和脂质种类与PEG缀合。
17.权利要求16的组合物,其中所述饱和脂质种类是PEG2000-DSPE。
18.一种组合物,其包含平均直径为50至250 nm的脂质体群体,其中所述脂质体群体包含:
(i)包含饱和脂质种类、不饱和脂质种类和胆固醇的脂质混合物,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占所述脂质混合物的至少50%;和
(ii) 200-15,000个ITE或其盐的分子/脂质体的平均值。
19.权利要求18的组合物,其中胆固醇占所述脂质混合物的26%至34%。
20.权利要求18或19的组合物,其中所述脂质体群体包含0.3或更大的平均去饱和指数。
21.权利要求18-20中任一项的组合物,其中所述不饱和脂质种类包含两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包含至少一个不饱和键。
22.权利要求21的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含单个不饱和键。
23.权利要求21的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含多重不饱和键。
24.权利要求18-23中任一项的组合物,其中所述饱和脂质种类与PEG缀合。
25.权利要求24的组合物,其中所述饱和脂质种类是PEG2000-DSPE。
26.权利要求18-20中任一项的组合物,其中所述不饱和脂质种类包含一个脂质尾部,其中所述脂质尾部包含至少一个不饱和键。
27.权利要求1-26中任一项的组合物,其中所述脂质体群体进一步包含抗原/ITE的质量比为1:10至100:1的抗原。
28.权利要求1-27中任一项的组合物,其中所述脂质体群体进一步包含抗原/ITE的摩尔比为1:200至25:1的肽抗原。
29.权利要求1-28中任一项的组合物,其中所述脂质体群体进一步包含抗原/ITE的摩尔比为1:5000至4:1的蛋白质抗原。
30.一种组合物,其包含平均直径为50至250纳米(nm)的脂质体群体,其中所述脂质体群体包含:
(i) 200-15,000个ITE或其盐的分子/脂质体的平均值,和
(ii)抗原/ITE的质量比为1:10至100:1的抗原。
31.权利要求30的组合物,其中所述脂质体群体包含0.3或更大的平均去饱和指数。
32.权利要求30或31的组合物,其中所述脂质体群体包含具有26%至34%的摩尔胆固醇分数的脂质混合物。
33.权利要求30-32中任一项的组合物,其中所述脂质体群体包含脂质混合物,所述脂质混合物包含饱和脂质种类和不饱和脂质种类,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占所述脂质混合物的至少50%。
34.权利要求33的组合物,其中所述不饱和脂质种类包含两个脂质尾部,其中一个或两个脂质尾部包含至少一个不饱和键。
35.权利要求34的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含单个不饱和键。
36.权利要求34的组合物,其中所述一个或两个脂质尾部包含多重不饱和键。
37.权利要求30-33中任一项的组合物,其中所述不饱和脂质种类包含一个脂质尾部,其中所述脂质尾部包含至少一个不饱和键。
38.权利要求33-37中任一项的组合物,其中所述饱和脂质种类与PEG缀合。
39.权利要求38的组合物,其中所述饱和脂质种类是PEG2000-DSPE。
40.权利要求27-39中任一项的组合物,其中所述抗原是包含选自SEQ ID NO:1-81的氨基酸序列的肽抗原。
41.权利要求27-40中任一项的组合物,其中所述抗原与自身免疫性病症相关。
42.权利要求41的组合物,其中所述自身免疫性病症选自类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、重症肌无力、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和乳糜泻。
43.权利要求27-42中任一项的组合物,其中所述抗原是治疗性蛋白或其一部分。
44.权利要求27-40中任一项的组合物,其中所述抗原是病毒基因治疗载体的表面组分。
45.权利要求44的组合物,其中所述抗原是腺病毒相关病毒(AAV)衣壳、衣壳蛋白或其肽片段。
46.权利要求27-45中任一项的组合物,其中所述抗原包含治疗试剂,其中所述治疗试剂为:
(i)治疗性蛋白或肽;
(ii)病毒或衣壳蛋白或肽;和/或
(iii)编码(i)和/或(ii)的多核苷酸。
47.权利要求45或46的组合物,其中所述AAV包含DNA。
48.权利要求47的组合物,其中所述DNA是单链DNA(ssDNA)。
49.权利要求48的组合物,其中所述ssDNA编码cDNA或其片段。
50.权利要求49的组合物,其中ssDNA编码人cDNA或其片段。
51.权利要求45或46的组合物,其中所述AAV包含RNA。
52.权利要求51的组合物,其中所述RNA是微小RNA(miRNA)。
53.权利要求27-45中任一项的组合物,其中所述抗原是治疗性蛋白。
54.权利要求53的组合物,其中所述治疗性蛋白是抗体或其片段。
55.权利要求54的组合物,其中所述治疗性蛋白包含IgG1、IgG2、IgG4、单链可变片段(scFv)或其片段。
56.权利要求55的组合物,其中所述治疗性蛋白是IgG1/κ或其片段。
57.权利要求55的组合物,其中所述治疗性蛋白是IgG2/κ或其片段。
58.权利要求55的组合物,其中所述治疗性蛋白是IgG4/κ或其片段。
59.权利要求54-58中任一项的组合物,其中所述治疗性蛋白是双特异性抗体或其片段。
60.权利要求54-59中任一项的组合物,其中所述治疗性蛋白是嵌合抗体或其片段。
61.权利要求60的组合物,其中所述治疗性蛋白选自英夫利昔单抗、奥比妥昔单抗、司妥昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、巴利昔单抗、利妥昔单抗和阿昔单抗。
62.权利要求54-59中任一项的组合物,其中所述治疗性蛋白是人源化抗体或其片段。
63.权利要求54-59中任一项的组合物,其中所述治疗性蛋白是鼠抗体或其片段。
64.权利要求1-62中任一项的组合物,其中所述脂质体群体具有-10至-50 mv的平均ζ电位。
65.一种治疗患有自身免疫性病症的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-64中任一项的组合物。
66.权利要求65的方法,其中所述施用是静脉内、皮下、皮内、透皮、关节内、肺或粘膜施用。
67.权利要求65或66的方法,其中所施用的所述组合物的剂量包含50 μg至15 mg ITE。
68.权利要求67的方法,其中所施用的所述组合物的剂量包含500 μg至10 mg ITE。
69.权利要求65-68中任一项的方法,其中所述自身免疫性病症选自类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、重症肌无力、炎性肠病和乳糜泻。
70.权利要求69的方法,其中所述自身免疫性病症是类风湿性关节炎。
71.一种合成致耐受性脂质体群体的方法,所述方法包括:
(i)混合两个或更多个脂质种类,以形成包含以下的脂质混合物:
(a) 0.3或更大的平均去饱和指数;
(b) 26%至34%的摩尔胆固醇分数;和/或
(c)饱和脂质种类和不饱和脂质种类,其中所述不饱和脂质种类包含不饱和键,并且占所述脂质混合物的至少50%;
(ii)将ITE加入所述脂质混合物中,其中将所述ITE溶解于溶剂中,并且以按脂质的质量计0.4%至0.7%的量,加入所述脂质混合物中;
(iii)将含有ITE的脂质混合物溶解于乙醇溶液中,并且将其加入水相中,以形成粗制脂质体;和
(iv)通过两个或更多个滤器挤出所述粗制脂质体,从而合成致耐受性脂质体群体。
72.权利要求71的方法,其中所述致耐受性脂质体群体是权利要求1-64中任一项的组合物。
73.权利要求71或72的方法,其中在加入所述脂质混合物中之前,ITE溶解于其中的溶剂是DMSO,并且所述脂质混合物和ITE溶解于其中的溶剂是至少50%的乙醇。
74.权利要求71-73中任一项的方法,其中所述乙醇溶液中的脂质混合物的最终脂质浓度为40毫摩尔至80毫摩尔。
75.权利要求74的方法,其中所述水相包含抗原。
76.一种降低待用治疗试剂治疗的受试者中的干扰免疫应答风险的方法,所述方法包括向所述受试者施用一定量的权利要求43-64中任一项的组合物,所述量足以降低所述受试者中针对所述治疗试剂的免疫原性,从而降低了干扰免疫应答的风险。
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