CN112375072A - 吡唑啉酮衍生物、注射剂及其用途 - Google Patents

吡唑啉酮衍生物、注射剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了吡唑啉酮衍生物、注射剂及其用途，属于医药技术领域，含吡唑啉酮衍生物的注射剂，其活性成分为具有通式7的结构的吡唑啉酮衍生物，
Figure DDA0002705717360000011
其中，R1选自(CH2)nCl，n＝1‑6；R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。该具有通式7的结构的吡唑啉酮衍生物有抑制β‑分泌酶活性、抑制α‑葡萄糖苷酶活性、抗菌活性。因此，本发明注射剂的用途，为如下(A1)‑(A3)中的至少一种：(A1)抑制β‑分泌酶活性；(A2)抑制α‑葡萄糖苷酶活性；(A3)抗菌活性。

Description

吡唑啉酮衍生物、注射剂及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及吡唑啉酮衍生物、注射剂及其用途。
背景技术
吡唑啉酮结构和并杂环的吡唑啉酮衍生物由于其合成的多样性和有效的生 理活性，成为令人关注的杂环体系。吡唑啉酮，是一种五元环的内酰胺，结构中 包含酮羰基，是吡唑的一种衍生物。其结构有三种可能的互变形式：3-吡唑啉酮 (A)、5-吡唑啉酮(B)和1H-吡唑-5-醇(C)，其结构式如下：
Figure BDA0002705717350000011
可见，吡唑啉酮衍生物都含有一个吡唑环，属于五元杂环，吡唑环即l,2-二 氮杂茂，2位上的氮原子属于sp2杂化类型，还有一个p电子占据另外一个p轨 道，并且参与共轭；吡唑环具有(4n+2)个π电子的封闭环状的结构，因此具有 一定的芳香性。另外，2位上的氮原子有一个sp2杂化轨道被一对孤电子占据， 没有参于成键，具有一定的碱性，可以跟质子相结合，不过这对电子的s成分比 较多，靠近原子核，故碱性比一般的胺要弱(通常胺的氮原子上的孤对电子占 sp3上的杂化轨道)。吡唑啉酮衍生物因其特殊的结构特征而备受科学家们的关 注，在医药、农药、染料等领域有着广泛的应用，尤其是在医药技术领域，其所起到的药用活性包括镇痛、止热、抗菌、抗真菌、抗炎、抗焦虑药活性等，比如 氨基比林、安替比林等是重要的解热镇痛药物，依达拉奉是神经保护剂；乙烯硫 脲结构是维生素H等活性分子的重要组成部分；同时，羟吲哚结构更是广泛存 在于众多天然产物及药物当中，如抗精神病药物齐拉西酮和治疗帕金森的罗平尼 咯等。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有抑制β-分泌酶活性、抑制α-葡萄糖苷 酶活性、抗菌活性的吡唑啉酮衍生物。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种吡唑啉酮衍生物，具有通式7的结构：
Figure BDA0002705717350000021
其中，
R1选自(CH2)nCl，n＝1-6；
R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。
本发明吡唑啉酮衍生物具有如下作用：1)具有抑制β-分泌酶活性的作用， 抑制β-分泌酶的IC50值≤1μM，且具有透过血脑屏障能力，可用于制备β-分泌 酶抑制剂，为开发新型阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)预防或治疗药物 提供新的途径；2)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值≤10μM，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，为开发新型糖尿病(diabetes mellitus,DM)预防或治疗药物提供新的途径；3)具有抗菌活性，对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌均有不同程度 的抑制作用，可用于制备抗菌剂，为开发新型抗菌药物提供新的途径。
本发明还提供一种上述吡唑啉酮衍生物的合成方法，包括以下工序：
第1工序，使3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和化合物2反应得到化合物3；
第2工序，使化合物3和DL-焦谷氨酸反应得到化合物5；以及
第3工序，使化合物5和化合物6反应得到具有通式7结构的吡唑啉酮衍生 物；
化合物2为
Figure BDA0002705717350000031
化合物3为
Figure BDA0002705717350000032
化合物5为
Figure BDA0002705717350000033
化合物6为
Figure BDA0002705717350000034
其中，R1选自(CH2)nCl， n＝1-6；R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。
优选地，第1工序在氢氧化钙存在的条件下进行，3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、化合物2和氢氧化钙的用量比为1mol:1.2-1.4mol:2.5-3.5mol。
优选地，第2工序在EDCI和HOBT存在的条件下进行，化合物3、DL-焦 谷氨酸、EDCI和HOBT的用量比为1mol:1.05-1.20mol:1.1-1.3mol:2.0-2.1mol。
优选地，第3工序在冰醋酸存在的条件下进行，化合物5、化合物6和冰醋 酸的用量比为1mol:1.05-1.20mol:0.05-0.06mol。
本发明还提供一种上述吡唑啉酮衍生物的用途，为如下(A1)-(A3)中的至少 一种：
(A1)抑制β-分泌酶活性；
(A2)抑制α-葡萄糖苷酶活性；
(A3)抗菌活性。
优选地，吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶的IC50值≤1μM。
优选地，吡唑啉酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值≤10μM。
本发明还提供含上述吡唑啉酮衍生物的注射剂，其活性成分为具有通式7 结构的吡唑啉酮衍生物。
上述注射剂的用途，为如下(A1)-(A3)中的至少一种：
(A1)抑制β-分泌酶活性；
(A2)抑制α-葡萄糖苷酶活性；
(A3)抗菌活性。
本发明吡唑啉酮衍生物具有如下有益效果：1)具有抑制β-分泌酶活性的作 用且具有透过血脑屏障能力，可用于制备β-分泌酶抑制剂，为开发新型阿尔茨海 默症预防或治疗药物提供新的途径；2)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，可 用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，为开发新型糖尿病预防或治疗药物提供新的途 径；3)具有抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草 芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑 制剂，为开发新型抗菌药物提供新的途径。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施 方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要 求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的装置和方法的例子。
本公开一种吡唑啉酮衍生物，具有通式7的结构：
Figure BDA0002705717350000041
其中，
R1选自(CH2)nCl，n＝1-6；
R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。
该吡唑啉酮衍生物具有如下作用：1)具有抑制β-分泌酶活性的作用，抑制 β-分泌酶的IC50值≤1μM，且具有透过血脑屏障能力，可用于制备β-分泌酶抑制 剂，为开发新型阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)预防或治疗药物提供新 的途径；2)具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值≤ 10μM，可用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，为开发新型糖尿病(diabetes mellitus, DM)预防或治疗药物提供新的途径；3)具有抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌均有不同程度的抑制 作用，可用于制备抗菌剂，为开发新型抗菌药物提供新的途径。
在一可选的实施方式中，吡唑啉酮衍生物选自化合物7A-7I：
Figure BDA0002705717350000051
本公开一种上述吡唑啉酮衍生物的合成方法，其合成路线为：
Figure BDA0002705717350000061
其中，R1选自(CH2)nCl，n＝1-6；
R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。
上述合成方法包括以下工序：
第1工序，使3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和化合物2反应得到化合物3；
第2工序，使化合物3和DL-焦谷氨酸反应得到化合物5；以及
第3工序，使化合物5和化合物6反应得到具有通式7结构的吡唑啉酮衍生 物。
在一可选的实施方式中，第1工序在氢氧化钙存在的条件下进行，3-氨基-1- 苯基-2-吡唑啉-5-酮、化合物2和氢氧化钙的用量比为1mol:1.2-1.4mol: 2.5-3.5mol。
在一可选的实施方式中，第2工序在EDCI和HOBT存在的条件下进行，化 合物3、DL-焦谷氨酸、EDCI和HOBT的用量比为1mol:1.05-1.20mol: 1.1-1.3mol:2.0-2.1mol。
在一可选的实施方式中，第3工序在冰醋酸存在的条件下进行，化合物5、 化合物6和冰醋酸的用量比为1mol:1.05-1.20mol:0.05-0.06mol。
更优选地，吡唑啉酮衍生物的合成方法，包括以下工序：
第1工序，以1,4-二氧六环为溶剂，在氢氧化钙存在的条件下使3-氨基-1- 苯基-2-吡唑啉-5-酮和化合物2反应，3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、化合物2、 氢氧化钙和1,4-二氧六环用量比为1mol:1.2-1.4mol:2.5-3.5mol:1300-1600mL， 反应温度为80-110℃，时间为30-60min，得到化合物3，产率为54.0-60.0％；
第2工序，以二甲基甲酰胺为溶剂，在EDCI和HOBT存在的条件下使化合 物3和DL-焦谷氨酸反应，化合物3、DL-焦谷氨酸、EDCI、HOBT和二甲基甲 酰胺用量比为1mol:1.05-1.20mol:1.1-1.3mol:2.0-2.1mol:3000-5000mL，反应温 度为50-70℃，时间为3-5h，得到化合物5，产率为66.0-70.0％；以及
第3工序，以无水乙醇为溶剂，在冰醋酸存在的条件下使化合物5和化合物 6反应，化合物5、化合物6、冰醋酸和无水乙醇用量比为1mol:1.05-1.20mol: 0.05-0.06mol:4000-6000mL，反应温度为80-100℃，时间为4-7h，得到具有通式 7结构的吡唑啉酮衍生物，产率为70.0-73.0％。
本公开一种上述吡唑啉酮衍生物的用途，为如下(A1)-(A3)中的至少一种：
(A1)抑制β-分泌酶活性；
(A2)抑制α-葡萄糖苷酶活性；
(A3)抗菌活性。
在一可选的实施方式中，吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶的IC50值≤1μM。
在一可选的实施方式中，吡唑啉酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值≤ 10μM。
本公开吡唑啉酮衍生物在制备预防或治疗阿尔茨海默症药物中的用途。
本公开吡唑啉酮衍生物在制备预防或治疗糖尿病药物中的用途。
本公开吡唑啉酮衍生物在制备预防或治疗抗菌药物中的用途。
本公开含上述吡唑啉酮衍生物的注射剂，其活性成分为具有通式I结构的吡 唑啉酮衍生物。
在一可选的实施方式中，注射剂为冻干注射剂。
在一可选的实施方式中，注射剂还包括冻干赋形剂。优选地，冻干赋形剂为 甘露醇、葡萄糖、乳糖和甘氨酸中的一种或多种。
在一可选的实施方式中，赋形剂与活性成分的重量比为5-500:1。
在一可选的实施方式中，注射剂还包括pH调节剂，其种类不受特别限制， 只要其可以将注射剂和/或在配制该注射剂过程中将中间物的pH值调节至期望 的范围即可。在一个实施方案中，pH调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二 氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸、 枸橼酸、枸橼酸钠、酒石酸、马来酸或其组合。此外，pH调节剂的量也是不受 限制的，例如本领域技术人员通常将待调节物料的pH值调节到预期的值或范 围即可；更例如pH调节剂的用量是使注射剂和/或在配制该注射剂过程中的中间 物的pH值为4.0-6.0，优选4.5。
在一可选的实施方式中，注射剂还包括黄芩素，黄芩素能增益吡唑啉酮衍生 物的生物活性，尤其是能增益吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶活性的效果，进一步 提高吡唑啉酮衍生物透过血脑屏障的能力，提高吡唑啉酮衍生物的应用范围。优 选地，吡唑啉酮衍生物和黄芩素的重量比为1:0.20-0.30。
在一可选的实施方式中，含上述吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将吡唑啉酮衍生物与原料药溶媒，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，然后用pH调节剂调节pH至4-6；加入冻干赋形剂，溶解，过滤，灌装于 西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。优选地，原料药溶媒为乙醇、甘油、丙二醇 和聚乙二醇中的一种或多种。
上述注射剂的用途，为如下(A1)-(A3)中的至少一种：
(A1)抑制β-分泌酶活性；
(A2)抑制α-葡萄糖苷酶活性；
(A3)抗菌活性。
在一可选的实施方式中，含上述吡唑啉酮衍生物的注射剂在预防或治疗阿尔 茨海默症中的用途。
在一可选的实施方式中，上述吡唑啉酮衍生物的注射剂在预防或治疗糖尿病 中的用途。
在一可选的实施方式中，上述吡唑啉酮衍生物的注射剂在预防或治疗抗菌中 的用途。
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
吡唑啉酮衍生物(化合物7A)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，称取0.03mol 3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮置于250mL的三口烧 瓶中，加入60mL的1,4-二氧六环，加热溶解，于60℃下加入的0.12mol氢氧化 钙细粉，搅拌5min，撤去油浴锅，在强烈搅拌下快速滴加0.038mol氯乙酰氯， 5min后反应稍微缓和，再于95℃搅拌回流反应50min，反应完后，冷却至室温， 加入120mL浓度为2mol/L的HCl溶液，有固体析出，产物抽滤，用稀盐酸溶液 洗涤得到粗产物，粗产物用无水乙醇重结晶两次，真空干燥后得到白色针状晶体， 为化合物3，产率为58.6％。1H NMR(CDCl3)δ/ppm：8.37(s,2H,NH2),7.82(d,2H, ArH),7.44(t,2H,ArH),7.28(t,1H,ArH),4.47(s,2H,CH2),3.25(s,1H,CH)；MS (ESI,pos,ion)m/z:253.51[M+H]+。
第2工序，将0.01mol化合物3和0.011mol DL-焦谷氨酸加入35mL二甲基 甲酰胺中，搅拌5min，然后加入0.012mmol EDCI和0.02mmol HOBT，在65℃ 搅拌反应3.5h后，冷却至室温，并用350mL水和7mL EtOAc稀释，反应混合物 冷却至0℃并搅拌过夜，过滤，滤饼在60℃真空干燥6h，得化合物5，产率为 67.3％。1H NMR(CDCl3)δ/ppm：8.11(s,2H,NH),7.86(d,2H,ArH),7.41(t,2H, ArH),7.23(t,1H,ArH),4.46(s,2H,CH2),4.29(t,1H,CH),3.36(t,H,CH), 2.15-2.27(s,4H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:362.86[M+H]+。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 2- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7A)，产率为72.3％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000101
分子式为：C24H23ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.13(s,3H,NH),7.97(d,2H,ArH),7.69(t,1H,ArH),7.46(t,2H,ArH), 7.33(s,1H,CH),7.22(t,1H,ArH),7.13(t,1H,ArH),7.04(t,2H,ArH),6.41(s,2H, NH2),4.40(t,H,CH),4.11(s,2H,CH2),3.22(t,H,CH),2.19-2.50(s,4H,CH2)； MS(ESI,pos,ion)m/z:495.06[M+H]+。
实施例2：
吡唑啉酮衍生物(化合物7B)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，同实施例1。
第2工序，同实施例1。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 3- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7B)，产率为71.6％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000102
分子式为：C24H23ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.10(s,3H,NH),7.95(d,2H,ArH),7.52(t,2H,ArH),7.45(t,2H,ArH), 7.36(s,1H,CH),7.27(t,1H,ArH),6.95(t,2H,ArH),6.34(s,2H,NH2),4.41(t,H, CH),4.09(s,2H,CH2),3.18(t,H,CH),2.15-2.50(s,4H,CH2)；MS(ESI,pos,ion) m/z:495.45[M+H]+。
实施例3：
吡唑啉酮衍生物(化合物7C)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，同实施例1。
第2工序，同实施例1。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 4- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7C)，产率为72.1％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000111
分子式为：C24H23ClN6O4。1H NMR(CDCl3)δ/ppm： 8.07(s,3H,NH),7.96(d,2H,ArH),7.57(t,2H,ArH),7.44(t,2H,ArH),7.37(s,1H, CH),7.24(t,1H,ArH),6.63(t,2H,ArH),6.33(s,2H,NH2),4.38(t,H,CH),4.07(s, 2H,CH2),3.11(t,H,CH),2.18-2.49(s,4H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:494.83 [M+H]+。
实施例4：
吡唑啉酮衍生物(化合物7D)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，称取0.03mol 3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮置于250mL的三口烧 瓶中，加入60mL的1,4-二氧六环，加热溶解，于60℃下加入的0.12mol氢氧化 钙细粉，搅拌5min，撤去油浴锅，在强烈搅拌下快速滴加0.038mol 2-氯丙酰氯， 5min后反应稍微缓和，再于95℃搅拌回流反应50min，反应完后，冷却至室温， 加入120mL浓度为2mol/L的HCl溶液，有固体析出，产物抽滤，用稀盐酸溶液 洗涤得到粗产物，粗产物用无水乙醇重结晶两次，真空干燥后得到白色针状晶体， 为化合物3，产率为56.7％。1H NMR(CDCl3)δ/ppm：8.48(s,2H,NH2),7.86(d,2H, ArH),7.41(t,2H,ArH),7.26(t,1H,ArH),3.74(s,2H,CH2),3.34(s,1H,CH),2.86 (s,2H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:266.08[M+H]+。
第2工序，将0.01mol化合物3和0.011mol DL-焦谷氨酸加入35mL二甲基 甲酰胺中，搅拌5min，然后加入0.012mmol EDCI和0.02mmol HOBT，在65℃ 搅拌反应3.5h后，冷却至室温，并用350mL水和7mL EtOAc稀释，反应混合物 冷却至0℃并搅拌过夜，过滤，滤饼在60℃真空干燥6h，得化合物5，产率为 67.9％。1H NMR(CDCl3)δ/ppm：8.07(s,2H,NH),8.01(d,2H,ArH),7.50(t,2H, ArH),7.26(t,1H,ArH),4.32(t,1H,CH),3.71(s,2H,CH2),3.34(t,H,CH),2.85(s, 2H,CH2),2.17-2.36(s,4H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:377.35[M+H]+。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 2- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7D)，产率为71.8％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000121
分子式为：C25H25ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.06(s,3H,NH),7.95(d,2H,ArH),7.67(t,1H,ArH),7.45(t,2H,ArH),7.22 (t,1H,ArH),7.14(s,1H,CH),7.11(t,1H,ArH),6.87(t,2H,ArH),6.33(s,2H,NH2), 4.36(t,H,CH),3.51(s,2H,CH2),3.14(t,H,CH),2.19-2.36(s,6H,CH2)；MS(ESI, pos,ion)m/z:508.27[M+H]+。
实施例5：
吡唑啉酮衍生物(化合物7E)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，同实施例1。
第2工序，同实施例1。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 3- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7E)，产率为71.8％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000131
分子式为：C25H25ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.05(s,3H,NH),7.94(d,2H,ArH),7.47(t,2H,ArH),7.38(t,2H,ArH),7.23 (t,1H,ArH),7.09(s,1H,CH),6.97(t,2H,ArH),6.30(s,2H,NH2),4.39(t,H,CH), 3.56(s,2H,CH2),3.15(t,H,CH),2.17-2.41(s,6H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z: 508.35[M+H]+。
实施例6：
吡唑啉酮衍生物(化合物7F)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，同实施例1。
第2工序，同实施例1。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 4- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7F)，产率为72.5％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000141
分子式为：C25H25ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.09(s,3H,NH),8.02(d,2H,ArH),7.58(t,2H,ArH),7.52(t,2H,ArH),7.24 (t,1H,ArH),7.11(s,1H,CH),6.62(t,2H,ArH),6.33(s,2H,NH2),4.41(t,H,CH), 3.54(s,2H,CH2),3.18(t,H,CH),2.20-2.49(s,6H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z: 508.35[M+H]+。
实施例7：
吡唑啉酮衍生物(化合物7G)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，称取0.03mol 3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮置于250mL的三口烧 瓶中，加入60mL的1,4-二氧六环，加热溶解，于60℃下加入的0.12mol氢氧化 钙细粉，搅拌5min，撤去油浴锅，在强烈搅拌下快速滴加0.038mol 2-氯丁酰氯， 5min后反应稍微缓和，再于95℃搅拌回流反应50min，反应完后，冷却至室温， 加入120mL浓度为2mol/L的HCl溶液，有固体析出，产物抽滤，用稀盐酸溶液 洗涤得到粗产物，粗产物用无水乙醇重结晶两次，真空干燥后得到白色针状晶体， 为化合物3，产率为58.0％。1H NMR(CDCl3)δ/ppm：8.55(s,2H,NH2),8.09(d,2H, ArH),7.56(t,2H,ArH),7.25(t,1H,ArH),3.81(s,2H,CH2),3.37(s,1H,CH),2.72 (s,2H,CH2),2.63(s,2H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:281.34[M+H]+。
第2工序，将0.01mol化合物3和0.011mol DL-焦谷氨酸加入35mL二甲基 甲酰胺中，搅拌5min，然后加入0.012mmol EDCI和0.02mmol HOBT，在65℃ 搅拌反应3.5h后，冷却至室温，并用350mL水和7mL EtOAc稀释，反应混合物 冷却至0℃并搅拌过夜，过滤，滤饼在60℃真空干燥6h，得化合物5，产率为 68.4％。1H NMR(CDCl3)δ/ppm：8.03(s,2H,NH),7.95(d,2H,ArH),7.49(t,2H, ArH),7.32(t,1H,ArH),4.37(t,1H,CH),3.76(s,2H,CH2),3.35(t,H,CH), 1.92-2.53(s,8H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:391.07[M+H]+。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 2- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7G)，产率为72.5％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000151
分子式为：C26H27ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.14(s,3H,NH),8.02(d,2H,ArH),7.75(t,1H,ArH),7.46(t,2H,ArH),7.24 (t,1H,ArH),7.11(s,1H,CH),7.18(t,1H,ArH),6.95(t,2H,ArH),6.30(s,2H,NH2), 4.39(t,H,CH),3.77(s,2H,CH2),3.18(t,H,CH),2.20-2.41(s,4H,CH2),2.05(s, 2H,CH2),1.73(s,2H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:522.42[M+H]+。
实施例8：
吡唑啉酮衍生物(化合物7H)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，同实施例1。
第2工序，同实施例1。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 3- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7H)，产率为72.2％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000161
分子式为：C26H27ClN6O4。1H NMR(CDCl3) δ/ppm：8.13(s,3H,NH),8.00(d,2H,ArH),7.47(t,2H,ArH),7.41(t,2H,ArH),7.23 (t,1H,ArH),7.17(s,1H,CH),7.01(t,2H,ArH),6.33(s,2H,NH2),4.35(t,H,CH), 3.74(s,2H,CH2),3.16(t,H,CH),2.21-2.43(s,4H,CH2),2.02(s,2H,CH2),1.71(s, 2H,CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:522.45[M+H]+。
实施例9：
吡唑啉酮衍生物(化合物7F)的合成方法，包括以下工序：
第1工序，同实施例1。
第2工序，同实施例1。
第3工序，在250mL的三口烧瓶中，加入0.02mol化合物5和100mL无水 乙醇，加热至80℃使其溶解，另外在一个100mL的小烧杯中，取0.022mol 4- 氨基亚苯基肼溶于100mL的无水乙醇中，再缓慢滴加到250mL的三口烧瓶中， 并加入1.1mmol冰醋酸，在90℃下搅拌回流反应6h，再冷却至室温，静置过夜， 有固体析出，抽滤，洗涤后得到粗产物，再将粗产物用无水乙醇重结晶，真空干 燥后得到吡唑啉酮衍生物(7F)，产率为72.6％。其结构式为：
Figure BDA0002705717350000162
分子式为：C26H27ClN6O4。1H NMR(CDCl3)δ/ppm： 8.13(s,3H,NH),8.03(d,2H,ArH),7.65(t,2H,ArH),7.49(t,2H,ArH),7.23(t,1H, ArH),7.09(s,1H,CH),6.69(t,2H,ArH),6.26(s,2H,NH2),4.42(t,H,CH),3.74(s, 2H,CH2),3.13(t,H,CH),2.18-2.37(s,4H,CH2),2.08(s,2H,CH2),1.67(s,2H, CH2)；MS(ESI,pos,ion)m/z:522.45[M+H]+。
实施例10：
1.吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶活性的评价
吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶活性的测定用β-分泌酶检测试剂盒进行，方 法为：
将不同浓度受试药物溶液(溶剂为DMSO，受试药物溶液浓度均指吡唑啉 酮衍生物浓度)各2μL与15μL 0.67mU/μLβ-分泌酶置于384孔板混合，室温 孵育30min，然后加入15μL400nM/Lβ-分泌酶底物，室温孵育6h，加入终止液 10μL，用Envision多功能酶标仪(Ex340nm～Em 615nm)检测荧光强度。空 白对照组组分DMSO+β-分泌酶反应缓冲液+底物，阴性对照组组分DMSO+β- 分泌酶+底物。抑制率按下式计算：
抑制率(％)＝[1–(S–B)/(C–B)]×100；
其中，S-测试组荧光强度；B-空白组荧光强度；C-背景组荧光强度。
从而计算出吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶活性的IC50值，结果见表1，可以 看出吡唑啉酮衍生物(化合物7A-7I)抑制β-分泌酶的IC50值≤0.6μM，吡唑啉 酮衍生物(化合物7A-7I)和黄芩素混合物中抑制β-分泌酶的IC50值≤0.5μM， 黄芩素能增益吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶活性的效果。
表1吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶活性的IC50值
受试药物 IC<sub>50</sub>值(nM) 受试药物 IC<sub>50</sub>值(nM)
化合物7A 476.4 化合物7A:黄芩素＝1:0.24 382.6
化合物7B 373.7 化合物7B:黄芩素＝1:0.24 278.6
化合物7C 197.2 化合物7C:黄芩素＝1:0.24 87.8
化合物7D 514.0 化合物7D:黄芩素＝1:0.24 421.7
化合物7E 430.3 化合物7E:黄芩素＝1:0.24 336.8
化合物7F 252.2 化合物7F:黄芩素＝1:0.24 137.5
化合物7G 535.1 化合物7G:黄芩素＝1:0.24 444.1
化合物7H 446.6 化合物7H:黄芩素＝1:0.24 351.5
化合物7I 286.5 化合物7I:黄芩素＝1:0.24 166.8
2.吡唑啉酮衍生物透过血脑屏障能力的测定
2.1样品制备：选择试漏实验阳性的孔进行通透性实验，向供池中分别加入0.1mg/mL受试药物溶液300μL(受试药物溶液浓度均指吡唑啉酮衍生物浓度)， 受池中加600μL星型胶质细胞培养液。在第0、1h、2h、3h分别从受池中小心 收集滤液各100μL、50μL、50μL、50μL、50μL于-20℃保存，待所有取样结束后 做样品处理。其中0h为空白对照，向供池内加入的受试药物溶液为供池的起始 浓度。将各样品氮气吹干(37
Figure BDA0002705717350000182
)分别向其中加入甲醇，超声处理20min，离心 10min(4500rpm)，取上清液，作HPLC分析供试品溶液。
2.2 HPLC色谱条件：日本岛津LC-10A高效液相色谱仪；色谱柱:十八烷 基硅烷键合硅胶柱，依利特SinoChrom ODS-BP 5μm(250×4.6mm)，流动相采 用V(乙腈):V(水):V(三乙胺)＝74:25:1，流速0.5mL/min，检测波长为310nm。
2.3透过率计算：根据HPLC测定结果，按以下公式计算透过率：
P药物(％)＝(A受池×V受池)/(A供池×V供池)×100％；
其中，A受池-受池样品的峰面积，A供池-供池峰面积，V受池-受池体积，V供池- 供池体积。
表2为吡唑啉酮衍生物血脑屏障的透过率，可以看出化合物7C、7F、7I具 有透过血脑屏障能力，而黄芩素能提高吡唑啉酮衍生物透过血脑屏障的能力。
表2吡唑啉酮衍生物血脑屏障的透过率
Figure BDA0002705717350000181
3.吡唑啉酮衍生物抑制 α-葡萄糖苷酶活性的评价
吡唑啉酮衍生物抑制 α-葡萄糖苷酶活性的测定用用 α-葡萄糖苷酶试剂盒检 测进行，方法为：
(1)反应体系220μL：包含200μL主要反应混合物(200μL缓冲液和8μL PNPG)和20μL样品；其中20μL样品有三种形式：A-10μL磷酸盐缓冲溶液(PBS) 和10μLα-葡萄糖苷酶(0.17U/mL)；B-10μL受试药物溶液(受试药物溶液浓度 均指吡唑啉酮衍生物浓度)和10μLα-葡萄糖苷酶；C-10μL受试药物溶液和10μL PBS。
(2)反应体系混匀后，在405nm条件下检测初始吸光度，记作Ainitial；
(3)然后置于37℃下培养20min，检测最终吸光度，记作Afinal；
(4)空白对照孔：220μL蒸馏水；标准对照孔：20μL标准品和200μL蒸馏 水。
α-葡萄糖苷酶活力(单位/L)＝(Afinal-Aintial)/(A标准-A空白)×250单位/L；
α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝(1-(B2-B3)/B1)×100％；
其中，B1，B2和B3分别是样品A、B和C的α-葡萄糖苷酶活力。
从而计算出吡唑啉酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值，可以看出吡 唑啉酮衍生物(化合物7A-7I)抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值≤10μM，而黄芩素 对吡唑啉酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用几乎无影响。
表3吡唑啉酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值
受试药物 IC<sub>50</sub>值(μM) 受试药物 IC<sub>50</sub>值(μM)
化合物7A 8.3 化合物7A:黄芩素＝1:0.24 8.4
化合物7B 7.8 化合物7B:黄芩素＝1:0.24 7.9
化合物7C 7.0 化合物7C:黄芩素＝1:0.24 6.7
化合物7D 8.9 化合物7D:黄芩素＝1:0.24 8.7
化合物7E 8.0 化合物7E:黄芩素＝1:0.24 7.8
化合物7F 7.5 化合物7F:黄芩素＝1:0.24 7.3
化合物7G 9.4 化合物7G:黄芩素＝1:0.24 9.4
化合物7H 8.5 化合物7H:黄芩素＝1:0.24 8.4
化合物7I 8.1 化合物7I:黄芩素＝1:0.24 7.8
4.吡唑啉酮衍生物抗菌活性的评价
从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买菌种，分别为大肠杆菌(Escherichiacoli,保藏编号为CGMCC No.18486)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,保 藏编号为CGMCC No.14519)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,CMCC 50013)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,保藏编号为CGMCC No.19086)、蜡状芽 孢杆菌(Bacilluscereus,保藏编号为CGMCC No.17919)，培养基是购买商业化生 化试剂。
菌悬液制备：将菌种接种于M-H肉汤培养基中，置于37℃恒温振动培养箱 中复活6-8h(对数期)，接种在M-H琼脂平板上，平板划线后倒置于37℃恒温培 养箱中培养过夜。挑取3～5个典型菌落于装有0.85％生理盐水的玻璃瓶中，调 整麦氏比浊度至0.5麦氏比浊度(约1.5×108CFU/mL)。
半数抑菌浓度(IC50)值测定：取无菌96孔板，分别于每一排的第2孔加入受 试药物溶液150μL，其余各孔均加入M-H肉汤100μL，于第2孔取出药液50μL 加入第3孔中，充分混匀后再从第3孔取50μL于第4孔。以此类推，第9孔时 充分混匀后吸50μL丢弃。第10孔不加药液，作为阴性对照。每孔3个复孔。 将稀释至0.5麦氏比浊度的菌悬液再稀释100倍，并分别加入加了药液的96孔 板，每孔浓度100μL，使最终菌液浓度为5×105CFU。受试药物溶解在二甲亚砜 (DMSO)中，储存质量浓度为50g/L。每种药液加入到孔中的最终浓度为300、100、33.3、11.1、3.7、1.23、0.41、0.14、0μmol/L。DMSO的终浓度控制在0.5％以 内。放入37℃恒温培养箱培养，在24h于620nm测量吸光度(A)，计算其抑菌率 及IC50。
抑菌率＝(A对照菌浓度-A含药菌浓度)/A对照菌浓度×100％；
从而计算出吡唑啉酮衍生物对细菌的IC50值，结果见表4，可以看出吡唑啉 酮衍生物(化合物7A-7I)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯 草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌均有抑制作用。
表4吡唑啉酮衍生物抑制细菌活性的IC50值
Figure BDA0002705717350000201
Figure BDA0002705717350000211
实施例11：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7A与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例12：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7B与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例13：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7C与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例14：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7D与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例15：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7E与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例16：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7F与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤脱 炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例17：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7G与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例18：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7H与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤 脱炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
实施例19：
吡唑啉酮衍生物的注射剂的制备方法为：
将1g化合物7I与20g丙二醇，搅拌至溶解，再加入活性炭，搅拌，过滤脱 炭，缓慢加入氯化钠、酒石酸，调节pH至4.5；加入100g冻干赋形剂，溶解， 过滤，灌装于西林瓶中，冷冻干燥，压塞，即得。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘 述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所 述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所 做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.吡唑啉酮衍生物，具有通式7的结构：
Figure FDA0002705717340000011
其中，
所述的R1选自(CH2)nCl，n＝1-6；
所述的R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。
2.权利要求1所述的吡唑啉酮衍生物的合成方法，包括以下工序：
第1工序，使3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮和化合物2反应得到化合物3；
第2工序，使所述的化合物3和DL-焦谷氨酸反应得到化合物5；以及
第3工序，使所述的化合物5和化合物6反应得到具有通式7结构的吡唑啉酮衍生物；
所述的化合物2为
Figure FDA0002705717340000012
所述的化合物3为
Figure FDA0002705717340000013
所述的化合物5为
Figure FDA0002705717340000014
所述的化合物6为
Figure FDA0002705717340000015
其中，所述的R1选自(CH2)nCl，n＝1-6；所述的R2选自NH2或NHCH3或N(CH3)2。
3.根据权利要求2所述的吡唑啉酮衍生物的合成方法，其特征是：所述的第1工序在氢氧化钙存在的条件下进行，所述的3-氨基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、化合物2和氢氧化钙的用量比为1mol:1.2-1.4mol:2.5-3.5mol。
4.根据权利要求2所述的吡唑啉酮衍生物的合成方法，其特征是：所述的第2工序在EDCI和HOBT存在的条件下进行，所述的化合物3、DL-焦谷氨酸、EDCI和HOBT的用量比为1mol:1.05-1.20mol:1.1-1.3mol:2.0-2.1mol。
5.根据权利要求2所述的吡唑啉酮衍生物的合成方法，其特征是：所述的第3工序在冰醋酸存在的条件下进行，所述的化合物5、化合物6和冰醋酸的用量比为1mol:1.05-1.20mol:0.05-0.06mol。
6.权利要求1所述的吡唑啉酮衍生物的用途，为如下(A1)-(A3)中的至少一种：
(A1)抑制β-分泌酶活性；
(A2)抑制α-葡萄糖苷酶活性；
(A3)抗菌活性。
7.根据权利要求6所述的吡唑啉酮衍生物的用途，其特征是：所述的吡唑啉酮衍生物抑制β-分泌酶的IC50值≤1μM。
8.根据权利要求6所述的吡唑啉酮衍生物的用途，其特征是：所述的吡唑啉酮衍生物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值≤10μM。
9.含吡唑啉酮衍生物的注射剂，其活性成分为具有通式7结构的吡唑啉酮衍生物。
10.权利要求9所述的注射剂的用途，为如下(A1)-(A3)中的至少一种：
(A1)抑制β-分泌酶活性；
(A2)抑制α-葡萄糖苷酶活性；
(A3)抗菌活性。
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