CN112362594A - 一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法。包括以下步骤：1)对共聚焦显微高光谱成像设备进行黑白板校正；2)利用共聚焦显微高光谱成像设备采集原料凝胶薄片的高光谱图像并提取图像上的平均光谱；3)对光谱进行预处理及提取光谱特征；4)利用原料凝胶的光谱特征建立分类模型；5)将原料样品制备成混合凝胶后切成薄片，通过共聚焦显微高光谱采集混合凝胶的高光谱图像，将建立好的分类模型应用在混合凝胶的高光谱图像上实现各组分分布的可视化表达。本发明可快速有效地实现混合凝胶中各组分分布的直接检测，无需通过荧光探针对凝胶进行染色标记，简化了操作步骤，缩短了检测时间，提高了检测精度。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法。
背景技术
研究凝胶体系中混合凝胶的形成，分析凝胶三维网络结构的差异和凝胶的微观结构特性，能够进一步分析食品的口感及功能特性差异，同时可以为混合凝胶的结构及形成机理研究提供有效的技术支撑。因此，急需寻找一种快速检测方法为混合凝胶中不同组分分布情况的测定提供依据。
传统的混合凝胶分布的检测方法是先选择对应的荧光探针对单一组分凝胶进行染色标记，最后将已标记的所有组分配制成混合凝胶，再通过共聚焦显微镜荧光成像来观察不同组分的分布情况。中国专利CN107271419A公布了一种凝胶染色扫描成像装置及其染色成像方法，中国专利CN103981743A公布了一种制备假发用改性聚丙烯腈纤维的凝胶染色方法，中国专利CN 108593750 A公布了一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法，以上发明均采用了染色的方法来实现凝胶的标记，这些检测方法检测步骤繁琐，且在混合凝胶体系中存在并不是所有的凝胶都能找到对应的荧光染料，各种染料之间也可能会互相干扰串色，染色剂不稳定，染色组分不宜过多等情况。因此需要一种快速直接检测混合凝胶分布的方法。
共聚焦显微高光谱成像技术结合了共聚焦、光谱学和成像技术，通过共聚焦显微镜可对样品进行分层扫描和三维成像，再结合高光谱图像与光谱结合的特点，可以快速检测出混合凝胶内部不同组分的分布情况。其原理是利用各组分样品内部CH、OH和NH等基团在可见近红外光谱区不同的光谱吸收特性，确定光谱与不同组分之间的对应关系，从而实现混合凝胶中各组分分布情况的可视化表达。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，包括以下步骤：
S1对共聚焦显微高光谱成像设备进行黑白板校正，使反射值DN与入射光角度α满足以下关系：
α＝30*DN/16383+35；
S2用共聚焦显微高光谱成像设备在S1的条件下分别扫描各原料对应的单组分凝胶样品，获得各原料对应的单组分凝胶高光谱图像；
S3分别提取各原料对应的单组分凝胶高光谱图像的平均光谱，对平均光谱预处理，然后提取各原料对应的单组分凝胶的特征光谱；
S4用各原料对应的单组分凝胶的特征光谱建立分类模型；
S5将S2中各原料混合制备混合凝胶样品，用共聚焦显微高光谱成像设备在S1的条件下采集混合凝胶样品的高光谱图像；
S6采用S3预处理的方法对混合凝胶样品的高光谱图像上每个像素点的光谱进行预处理，然后提取特征光谱，将S4得到的分类模型应用在特征光谱上，对混合凝胶的高光谱图像上的像素点进行分类，并用伪彩图可视化表达，即可得到混合凝胶中各原料组分的分布情况。
优选的，S1所述黑白板校正时还需调整好设备的焦距。
优选的，S2所述原料为卡拉胶、乳球蛋白、葡聚糖、琼脂、大豆蛋白和明胶中的至少一种。
优选的，S2所述各原料对应的单组分凝胶样品为薄片状，其厚度不小于1mm，优选为1～2mm。
优选的，S2所述扫描的方式为逐点扫描。
优选的，S3在提取各原料对应的单组分凝胶高光谱图像的平均光谱之前，需要对各原料对应的单组分凝胶高光谱图像进行黑白板反射率校正，在校正后的高光谱图像上选取原料凝胶的区域，提取区域上的平均光谱。
优选的，S3所述平均光谱预处理的方法为导数法。
优选的，S3所述提取各原料对应的单组分凝胶光谱特征的方法为主成分分析。
优选的，S4所述分类模型为偏最小二乘法判别分析。
优选的，S4所述分类模型建立之后，需要用原料对应的单组分凝胶对分类模型进行盲测验证，以确保模型的精度和准确性。
优选的，S5所述混合凝胶样品为薄片状，其厚度不小于1mm，优选为1～2mm。
优选的，S5所述混合凝胶由S2中各原料通过加热、搅拌和均质中的至少一种方法混合得到。
优选的，S6所述提取特征光谱的方法与S3所述提取各原料对应的单组分凝胶的特征光谱的方法相同。
优选的，S6所述采用S3预处理的方法对混合凝胶样品的高光谱图像上每个像素点的光谱进行预处理之前，需要对混合凝胶的高光谱图像进行黑白板反射率校正。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明的基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，无需对凝胶组分进行染色处理，便可直接检测出混合凝胶中各组分的分布情况。
2、本发明的基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，克服了传统方法对凝胶染色效率低、多种染色剂相互干扰、操作步骤复杂等缺点，实现了快速、直接检测。
3、本发明的基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，克服了传统方法对两种组分以上的混合凝胶检测存在的困难，不受混合胶组分数量的影响，可实现多组分的混合凝胶的直接检测。
附图说明
图1为本发明所述基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法的流程图。
图2为实施例1所得大豆分离蛋白和卡拉胶的混合凝胶组分分布直接检测结果，左边为实物图，右边为共聚焦显微高光谱成像后可视化图。
图3为实施例2步骤1.3所得三种凝胶NIR光谱曲线。
图4为实施例2所得明胶、大豆分离蛋白和卡拉胶的混合凝胶组分分布直接检测结果，左边为实物图，右边为共聚焦显微高光谱成像后可视化图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请实施例中的高光谱图像的校正、平均光谱的提取均由美国Exelis VIS公司出售的图像分析软件ENVI4.8完成。
本申请实施例中光谱数据预处理、光谱特征提取、分类模型的建立和混合凝胶组分分布的可视化均由美国MathWorks公司出售的数学软件MatlabR2016b完成。
实施例1
本实施例提供一种基于共聚焦显微高光谱成像的两种混合凝胶组分分布的直接检测方法，该方法包括以下步骤：
1.1准备好制备混合凝胶的两组原料样品(大豆分离蛋白和卡拉胶)，将大豆分离蛋白溶于PH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液中配成质量浓度为10％的大豆分离蛋白溶液，置于锥形瓶中，以保鲜膜封口，在65℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌30min时间，快速冷却后在4℃下静置24h制成大豆蛋白凝胶。同时将卡拉胶溶于超纯水中配成质量浓度为0.60％的卡拉胶溶液，在80℃磁力搅拌水浴锅中加热15min时间，快速冷却后在4℃下静置24h制成卡拉胶凝胶。制备好凝胶样品后分别制成2mm厚薄片。
1.2根据公式α＝30*DN/16383+35，调试白板反射值DN＝10376，设置入射光的角度α＝54°，对共聚焦显微高光谱成像设备进行黑白板校正，用共聚焦显微高光谱获取1.1中的两组凝胶薄片的高光谱图像。
1.3分别提取1.2中两组凝胶样品高光谱图像的平均光谱，并通过二阶导数方法对平均光谱进行光谱预处理，同时利用主成分分析方法提取特征光谱。
1.4对1.1中的两组凝胶样品进行编号I(大豆分离蛋白)和II(卡拉胶)，利用1.3中的原料凝胶的光谱特征，使用偏最小二乘判别分析建立分类模型。
1.5制备混合凝胶，取两个干净的锥形瓶，在第一个锥形瓶中先加入120g的去离子水，放入80℃转速、1200r/min磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，再加入0.72g的卡拉胶粉末边加热搅拌。第二个锥形瓶中加入360g PH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液，置于65℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，再加入40g大豆分离蛋白粉末边加热边搅拌。待两锥形瓶内形成均匀的胶状溶液后冷却至50℃，将第一个锥形瓶的混合物与第二个锥形瓶中溶液混合后，再置于80℃、转速1600r/min的磁力搅拌水浴锅中加热搅拌30min，得到均匀的混合凝胶，倒入离心管中置于4℃下冷却待其完全凝固即得到大豆分离蛋白和卡拉胶的混合凝胶。
1.6将步骤1.5中的混合凝胶切成2mm左右的薄片，并用共聚焦显微高光谱按照1.2中的条件采集混合凝胶的高光谱图像。
1.7采用二阶导数方法对混合凝胶的高光谱图像上每个像素点的光谱进行预处理，然后利用主成分分析方法提取特征光谱，将步骤1.4中得到的分类模型应用在前面得到的混合凝胶的特征光谱上，对混合凝胶的高光谱图像上的像素点进行分类，并用红绿伪彩图可视化表达，红色像素点标记大豆分离蛋白(I)的分布，绿色像素点标记卡拉胶组分(II)的分布，实现对大豆分离蛋白和卡拉胶的混合凝胶组分分布的直接检测。
实施例2
本实施例提供一种基于共聚焦显微高光谱成像的三种混合凝胶组分分布的直接检测方法，该方法包括以下步骤：
1.1准备好制备混合凝胶的三组原料样品(明胶、大豆分离蛋白和卡拉胶)，将大豆分离蛋白溶于PH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液中配成质量浓度为10％的大豆分离蛋白溶液，置于锥形瓶中,以保鲜膜封口，在65℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌30min时间,快速冷却后在4℃下静置24h制成大豆蛋白凝胶。同时将卡拉胶溶于超纯水中配成质量浓度为0.60％的卡拉胶溶液，在80℃磁力搅拌水浴锅中加热15min时间，快速冷却后在4℃下静置24h制成卡拉胶凝胶。将40g的明胶与80g的超纯水混合，溶胀10h后，于65℃的磁力搅拌水浴锅加热搅拌30min，形成均匀的胶状溶液后快速冷却，在4℃下静置24h制成明胶凝胶。制备好凝胶样品后分别制成2mm厚薄片。
1.2根据公式α＝30*DN/16383+35，调试白板反射值DN＝10376，设置入射光的角度α＝54°，对共聚焦显微高光谱成像设备进行黑白板校正，用共聚焦显微高光谱成像设备获取1.1中的三组凝胶薄片的高光谱图像。
1.3分别提取1.2中三组凝胶样品高光谱图像的平均光谱，并通过二阶导数方法对平均光谱进行光谱预处理，同时利用主成分分析方法提取光谱特征。
1.4对1.1中三组凝胶样品进行编号I(大豆分离蛋白)、II(卡拉胶)和III(明胶)，利用1.3中的原料凝胶的光谱特征，使用偏最小二乘判别分析建立分类模型。
1.5制备混合凝胶，取三个干净的锥形瓶，在第一个锥形瓶中先加入120g的超纯水，置于80℃转速1200r/min磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，再加入0.72g卡拉胶粉末边加热搅拌。第二个锥形瓶中加入360g PH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液，置于65℃磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，再加入40g大豆分离蛋白粉末边加热边搅拌。第三个锥形瓶中加入40g明胶与80g的超纯水，混合均匀，溶胀10h后，置于75℃转速1200r/min磁力搅拌水浴锅中加热搅拌30min。待三个锥形瓶内均形成均匀的胶状溶液后冷却至50℃，将三个锥形瓶中的溶液混合后，再置于80℃转速1600r/min的磁力搅拌水浴锅中加热搅拌30min，得到均匀的混合凝胶，倒入离心管中置于4℃下冷却待其完全凝固即得到明胶、大豆分离蛋白和卡拉胶三种组分的混合凝胶。
1.6将步骤1.5中的混合凝胶切成2mm左右的薄片，并用共聚焦显微高光谱按照1.2中的条件采集混合凝胶的高光谱图像。
1.7采用二阶导数方法对混合凝胶的高光谱图像上每个像素点的光谱进行预处理，然后利用主成分分析方法提取特征光谱，将步骤1.4中得到的分类模型应用在前面得到的混合凝胶的特征光谱上，对混合凝胶的高光谱图像上的像素点进行分类，并用红绿蓝伪彩图可视化表达，红色像素点标记大豆分离蛋白(I)的分布，绿色像素点标记卡拉胶组分(II)的分布，蓝色像素点标记明胶组分(III)的分布，实现对明胶、大豆分离蛋白和卡拉胶的三种混合凝胶组分分布的直接检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1对共聚焦显微高光谱成像设备进行黑白板校正，使反射值DN与入射光角度α满足以下关系：
α＝30*DN/16383+35；
S2用共聚焦显微高光谱成像设备在S1的条件下分别扫描各原料对应的单组分凝胶样品，获得各原料对应的单组分凝胶高光谱图像；
S3分别提取各原料对应的单组分凝胶高光谱图像的平均光谱，对平均光谱预处理，然后提取各原料对应的单组分凝胶的特征光谱；
S4用各原料对应的单组分凝胶的特征光谱建立分类模型；
S5将S2中各原料混合制备混合凝胶样品，用共聚焦显微高光谱成像设备在S1的条件下采集混合凝胶样品的高光谱图像；
S6采用S3预处理的方法对混合凝胶样品的高光谱图像上每个像素点的光谱进行预处理，然后提取特征光谱，将S4得到的分类模型应用在特征光谱上，对混合凝胶的高光谱图像上的像素点进行分类，并用伪彩图可视化表达，即可得到混合凝胶中各原料组分的分布情况。
2.根据权利要求1所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S3所述平均光谱预处理的方法为导数法。
3.根据权利要求1所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S3所述提取各原料对应的单组分凝胶光谱特征的方法为主成分分析。
4.根据权利要求1所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S4所述分类模型为偏最小二乘法判别分析。
5.根据权利要求1或2或3或4所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S6所述提取特征光谱的方法与S3所述提取各原料对应的单组分凝胶的特征光谱的方法相同。
6.根据权利要求5所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S2所述各原料对应的单组分凝胶样品和S5所述混合凝胶样品均为薄片状，其厚度均不小于1mm。
7.根据权利要求6所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S2所述各原料对应的单组分凝胶样品和S5所述混合凝胶样品的厚度均为1～2mm。
8.根据权利要求1所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S2所述扫描的方式为逐点扫描。
9.根据权利要求1所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S3在提取各原料对应的单组分凝胶高光谱图像的平均光谱之前，需要对各原料对应的单组分凝胶高光谱图像进行黑白板反射率校正，在校正后的高光谱图像上选取原料凝胶的区域，提取区域上的平均光谱；
S4所述分类模型建立之后，需要用原料对应的单组分凝胶对分类模型进行盲测验证，以确保模型的精度和准确性；
S6所述采用S3预处理的方法对混合凝胶样品的高光谱图像上每个像素点的光谱进行预处理之前，需要对混合凝胶的高光谱图像进行黑白板反射率校正。
10.根据权利要求1所述一种基于共聚焦显微高光谱成像的混合凝胶组分分布的直接检测方法，其特征在于，S2所述原料为卡拉胶、乳球蛋白、葡聚糖、琼脂、大豆蛋白和明胶中的至少一种。
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