CN112359065B - 一种提高基因敲入效率的小分子组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高基因敲入效率的小分子组合物；所述小分子组合物包括非同源末端连接修复途径的抑制剂(NHEJ抑制剂)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)。最佳的小分子组合物为：M3814+Trichostatin A。本发明还提供了在人原代细胞中实现高效基因敲入的方法，所述方法包括：将基因组编辑组合物引入人原代细胞中，加入所述小分子组合物，使染色质结构松散并且抑制非同源末端连接，提高基因敲入效率。该方法的效率比采用CRISPR/Cas9等RNA引导的核酸内切酶的传统基因组编辑方法的效率显著更高。

Description

一种提高基因敲入效率的小分子组合物
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于提高基因敲入效率的小分子组合物和一种在人原代细胞中实现高效的精确基因敲入的方法。
背景技术
人诱导多能干细胞(iPSC)由于具有无限的自我更新和多向分化能力，已在基础研究和再生医学中实现应用。为了充分发挥iPSC的应用潜能，通常需要对这些细胞进行基因修饰，例如矫正病患基因以进行替代治疗，创建突变以进行疾病模型建立或精确插入嵌合人工受体(CAR)进行免疫治疗。随着CAR-T技术的发展，人类原代T细胞最近已成为基于免疫治疗癌症的主导者。编辑的T细胞已在临床试验中被证明具有良好的安全性和有效性。然而在这些具有临床意义的细胞中，基因编辑效率特别是同源重组指导的修复(HDR)介导的精确基因敲入效率较低，已经成为这些细胞在临床上广泛应用的瓶颈。因此，研究用于进行高效精确基因敲入的新方法是当前的一个重要课题。
化脓性链球菌(Sp)中发现的CRISPR-Cas9(成簇的规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9)系统现已广泛应用于基因组编辑中。CRISPR-Cas9是细菌中的一种免疫系统，可以靶向并切割外源DNA来防御病毒。在该系统中，在指导RNA(gRNA)的指导下，核酸内切酶SpCas9切割同源DNA的两条链。gRNA由两部分组成：与目标DNA互补的约20个核苷酸序列的crisprRNA(crRNA)、以及反式激活crisprRNA(tracrRNA)。商业化的tracrRNA和crRNA经过化学修饰，具有很好的电转稳定性，并且经过简单操作就可在体外退火形成gRNA。工程改造的sgRNA(单指导RNA)已被广泛用于编辑所有类型的哺乳动物细胞。
CRISPR编辑元件可以以各种形式递送到细胞中发挥作用。我们和其他课题组先前已经将Cas9核酸酶和gRNA作为质粒或慢病毒载体的DNA表达盒递送，但是这种方法会导致Cas9和gRNA的持续高水平表达，容易造成产生脱靶效应(off-target)。此外，编辑质粒的电转会激活iPSC、造血细胞或T细胞的先天性免疫应答，造成细胞大量死亡。这些问题限制了CRISPR基因组编辑用于安全的临床治疗。通过用Cas9-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物替代传统质粒或慢病毒载体，不仅提高了编辑效率，而且降低了脱靶的可能性。此外，通过RNP递送编辑元件可以避免质粒引起的免疫反应和细胞毒性，这使得敏感的人类干细胞和原代细胞成为临床治疗应用的首选。
DNA双链断裂(DSB)后，细胞募集并激活多种DNA修复机制促进DNA连接。这些包括典型的非同源末端连接(c-NHEJ/NHEJ)、替代末端连接或微同源介导的末端连接(alt-EJ/MMEJ)和同源定向修复(HDR)。在无合适模板的条件下，利用NHEJ或MMEJ途径可能会在打靶位点引入可变插入或缺失(indels)，破坏基因的开放阅读框并产生基因敲除(KO)。在存在与同源臂(HA)侧翼连接的供体模板时，HDR途径可以用于整合HA之间的序列以形成精确的DNA缺失、取代或插入，从而修正患病基因或靶向的整合目的基因。遗憾的是，HDR介导的基因敲入的效率通常较低。NHEJ是修复双链DNA损伤的主要和快速的反应途径，有利于细胞存活。但是强力的NHEJ修复会阻碍HDR的发生，不利于实现精确的基因敲入。因此，NHEJ抑制剂已被广泛用于提高HDR效率。但是，在临床相关的iPSC和原代T细胞的RNP-AAV编辑系统中，哪种NHEJ抑制剂最有效仍不明确。
最近，我们报道了使用双切质粒供体和瞬时BCL-XL过表达的方法，大大提高了CRISPR-Cas9在多种人类细胞中介导的基因编辑效率。然而，这些研究都是通过编辑开放状态的染色质或在iPSC中高度表达的基因上进行的。这些基因座往往比未表达的基因或染色质关闭区域具有更高的编辑效率。不同于原核生物中松散的DNA，真核细胞基因组DNA紧密包装并包裹在组蛋白周围，然后进一步压实形成更高级的染色质结构。这种复杂结构可能会阻碍Cas9与其作用的DNA靶点结合。考虑到编辑iPSC及原代T细胞的关闭基因座的临床意义，筛选染色质调节剂来进一步提高人类细胞基因敲入效率是当前的重要课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于提高基因敲入效率的小分子组合物和一种在人原代细胞中实现高效的精确基因敲入的方法。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种用于提高基因敲入效率的小分子组合物，所述小分子组合物包括非同源末端连接修复途径的抑制剂(NHEJ抑制剂)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)。
优选地，所述非同源末端连接修复途径的抑制剂(NHEJ抑制剂)为NU7026、NU7441或M3814；所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC抑制剂)为Sodium Butyrate(NaB，丁酸钠)、vorinostat(SAHA，伏瑞斯特)、Trichostatin A(TSA，曲古柳菌素)、valproic acid(VPA，丙戊酸)、Entinostat(恩替诺特)、Panobinostat(帕比司他)、Mocetinostat(MGCD0103)、Belinostat(PXD101)、Romidepsin(FK228,Depsipeptide)、MC1568、Tubastatin A HCl或Givinostat(ITF2357)。
优选地，所述的小分子组合物为以下组合中的一种：NU7026+Sodium Butyrate(NaB，丁酸钠)；NU7026+vorinostat(SAHA，伏瑞斯特)；NU7026+Trichostatin A (TSA，曲古柳菌素)；NU7026+valproic acid(VPA，丙戊酸)；NU7026+Entinostat(恩替诺特)；NU7026+Panobinostat(帕比司他)；
优选地，所述的小分子组合物为以下组合中的一种：NU7441+Sodium Butyrate(NaB，丁酸钠)；NU7441+vorinostat(SAHA，伏瑞斯特)；NU7441+Trichostatin A(TSA，曲古柳菌素)；NU7441+valproic acid(VPA，丙戊酸)；NU7441+Entinostat(恩替诺特)；NU7441+Panobinostat(帕比司他)。
优选地，所述的小分子组合物为以下组合中的一种：M3814+Sodium Butyrate(NaB，丁酸钠)；M3814+vorinostat(SAHA，伏瑞斯特)；M3814+Trichostatin A(TSA，曲古柳菌素)；M3814+valproic acid(VPA，丙戊酸)；M3814+Entinostat(恩替诺特)；M3814+Panobinostat(帕比司他)。
更优选地，所述的小分子组合物为：M3814+Trichostatin A。能够在T细胞和iPSC细胞中实现80％的基因编辑效率。
本发明还提供了所述的小分子组合物在制备用于提高人原代细胞基因敲入效率的药物中的应用。
所述人原代细胞包括为人诱导多能干细胞、人原代T细胞、人造血干细胞。
本发明还提供了一种用于人原代细胞中实现高效基因敲入的组合，包括基因编辑组合物和所述的小分子组合物；所述基因编辑组合物为基因组编辑核酸内切酶，所述基因组编辑核酸内切酶在细胞的基因组DNA的所需目标序列内进行切割，并编辑目标基因组DNA。
进一步，所述基因组编辑组合物包括RNA-引导的核酸内切酶、引导RNA和同源重组模板(Donor)。
进一步：所述RNA-引导的核酸内切酶为Cas9；更进一步，所述RNA-引导的核酸内切酶Cas9可以通过三种方式提供：Cas9 mRNA、Cas9蛋白和表达Cas9的质粒。
进一步：所述引导RNA包括成簇的规律间隔的短回文重复RNA和tracrRNA；更进一步，所述引导RNA可有以下三种方式生成：直接合成sgRNA；将商品化的crRNA和tracrRNA在体外退火形成gRNA；sgRNA质粒。
进一步，所述同源重组模板(Donor)为包含供体序列的供体DNA(Donor)，可通过同源定向修复在插入位点将所述供体序列插入基因组中；更进一步，所述供体DNA(Donor)通过以下三种方式提供：单链DNA模版供体SSODN；AAV腺相关病毒模版供体；质粒模板供体；更进一步，所述AAV腺相关病毒模版供体的AAV血清型为AAV6，单链或者双链AAV。
本发明还提供了一种在人原代细胞中实现高效基因敲入的方法，所述方法包括：将基因组编辑组合物引入人原代细胞中，加入上述小分子组合物(即将小分子组合物添加入所述编辑后的人类原代细胞培养基中)，使染色质结构松散并且抑制非同源末端连接，提高基因敲入效率。
所述小分子化合物Trichostatin A正式名称为7-[4-(二甲基氨基)苯基]-N-羟基-4,6R-34二甲基-7-氧代-2E,4E-庚二烯酰胺，分子式C17H22N2O3，分子量为302.4，纯度>98％。
所述小分子化合物M3814正式名称为(S)-(2-氯-4-氟-5-(7-吗啉代喹唑啉-4-基)苯基(6-甲氧基哒嗪-3-基)甲醇，分子式C24H21ClFN5O3，分子量为481.9，纯度>98％。
在一些实施方案中，所述方法还包括将商品化的crRNA和tracrRNA在体外退火形成gRNA。
在一些实施方案中，所述gRNA与Cas9蛋白孵育形成可以稳定电转的核糖核蛋白(RNP)复合物。
在某些实施方案中，所述同源指导修复模版包括质粒模版供体和腺相关病毒模版供体。
在一些实施方案中，所述腺相关病毒同源指导修复模版在RNP电转细胞后被立刻加入细胞培养基中。
在一些实施方案中，所述小分子药物M3814和NaB(Butyrate),TSA,SAHA,VPA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他)在电转细胞接种后立刻加入细胞培养基中。
在一些实施方案中，小分子的作用浓度范围为M3814：0.5～4μM；TSA(曲古柳菌素)：0.01～0.2μM；NU7026：5～30μM；NU7441：1～4μM；NaB(丁酸钠)：10μM～2mM；VPA，丙戊酸：50μM～2mM；SAHA(伏瑞斯特)：1～10μM；Entinostat(恩替诺特)：10～50μM；Panobinostat(帕比司他)：0.1～1μM。
在一些实施方案中，所述小分子的作用时间为0h-8h，0h-16h，0h-24h，8h-24h，0h-48h。
本发明还提供了M3814用于制备提高人原代T细胞的HDR基因敲入效率的药物中的应用；
本发明还提供了M3814+TSA用于制备提高人原代T细胞的HDR基因敲入效率的药物中的应用；
本发明还提供了一种在人原代T细胞中实现高效的精确基因敲入的方法，所述方法包括：将上述基因组编辑组合物引入人原代T细胞中，加入小分子(即将小分子添加入所述编辑后的人类原代T细胞培养基中)，使染色质结构松散并且抑制非同源末端连接，提高基因敲入效率。
优选地，该方法中所述小分子为M3814。更优选地，该方法中，所述小分子还包括TSA。
本发明还提供了M3814在用于制备人原代细胞的CRISPR-Cas9 RNP介导的双链断裂后NHEJ介导的+T的DNA修复的抑制作用的药物中的应用。
上述应用中，所述人原代细胞为人诱导多能干细胞、人原代T细胞、人造血干细胞。
本发明所具有的有益效果：
本发明提供了一种新的提高基因敲入编辑的小分子药物组合物，该方法的效率比采用CRISPR/Cas9等RNA引导的核酸内切酶的传统基因组编辑方法的效率显著更高。本申请的方法采用细胞凋亡调节因子BCL-XL。通过在iPSC转染期间过表达BCL-XL，可以在电穿孔后提高iPSC的存活率，并且还能提高HDR KI效率和KO效率。在该系统的基础上增加提高基因编辑效率的小分子组合物，进一步大幅度提高了在人类细胞中的基因编辑效率。改进的基因组编辑系统为从操纵人iPSC基因组到创建基因修饰的动物模型的应用提供有用的工具。
附图说明
图1是在iPS细胞或T细胞中进行RNP AAV6基因编辑的示意图。
图2示出了在基因组上HDR基因敲入和敲入目的片段的PCR扩增策略。
图3示出了所述小分子药物TSA和M3814的化学结构式。
图4示出了TSA、M3814以及其他小分子药物在人iPSC中对HDR效率的影响。
图5示出了各种小分子药物对编辑之后不同类型的DNA修复事件形成频率的影响。
图6示出了iPS细胞中M3814对两个不同gRNA编辑的影响。
图7是M3814和TSA混合物对iPS细胞RNP AAV编辑的HDR效率的影响。
图8示出了TSA、M3814、TSA和M3814混合物对iPS细胞编辑后不同DNA修复类型的影响。
图9是M3814和TSA混合物对人原代T细胞RNP AAV编辑的HDR效率的影响。
图10出了TSA、M3814、TSA和M3814混合物对人原代T细胞编辑后不同DNA修复类型的影响。
图11示出了指示iPS细胞中EEF1A1处的绿色荧光报告基因敲入效率的流式细胞术分析。
图12示出了指示人原代T细胞EEF2处的绿色荧光报告基因敲入效率的流式细胞术分析。
图13示出了iPSC在4h、8h、12h、24h和48h各个时间点代表性DNA修复事件所占的比例。
图14示出了样本中各个代表性DNA修复事件发生速度T50的计算。
图15示出了iPSC中各种DNA修复事件的T50。
图16示出了T细胞中中各种DNA修复事件的T50。
图17展示在人iPSC细胞进行CRISPR-Cas9电转进行基因编辑的流程。
图18示出在人iPSCs中MYH6、MESP1、GATA4、PRDM14、EEF2、GAPDH和EEF1A1的TPM值。
图19示出了组蛋白乙酰化抑制剂NaB(Butyrate),TSA,SAHA,VPA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他)促进iPSC细胞中染色质开放位点(PRDM14、EEF2、GAPDH和EEF1A1)基因编辑效率。
图20示出了组蛋白乙酰化抑制剂NaB(Butyrate),TSA,SAHA,VPA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他)显著促进iPSC细胞中染色质非开放位点(MESP1,MYH6,和GATA4)基因编辑效率。
图21示出了组蛋白乙酰化抑制剂SAHA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他)显著优先提高非开放位点的HDR编辑效率。
具体实施方式
在一些实施方案中，将RNA引导的核酸内切酶以蛋白质的形式或者以信使RNA(mRNA)或cDNA等编辑RNA引导的核酸内切酶的核酸的形式引入真核细胞中。核酸可作为质粒或病毒载体等较大构建体的一部分输送，或者例如直接通过电穿孔、脂质囊泡、病毒转运蛋白和显微注射输送。可通过包括转染、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染、使用基因枪、使用DNA载体转运子和生物弹(例如，粒子轰击)在内的各种本领域已知的手段将RNA介导的核酸内切酶引入细胞中。
在一些实施方案中，可通过转染(包括，例如，通过电穿孔的转染)将编辑RNA引导的核酸内切酶的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，可通过注射将编辑RNA引导的核酸内切酶的核酸引入细胞中。
在一些实施方案中，例如，可引入作为RNA或作为质粒或其他编辑引导RNA的核酸载体的引导RNA(gRNA)。RNA引导的核酸内切酶与gRNA和与之连接的目标DNA结合并在设计的特殊位点切割染色体。例如，可通过包括转染、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染、使用基因枪、使用DNA载体转运子和生物弹(例如，粒子轰击)在内的各种本领域已知的手段将引导RNA(gRNA)引入细胞中。
在一些实施方案中，RNA引导的核酸内切酶为序列特异性核酸酶。本文所用的术语“序列特异性核酸酶”是指一种识别并与特殊核酸序列处的多核苷酸结合以及催化该多核苷酸内的双链断裂的蛋白质。在某些实施方案中，RNA引导的核酸内切酶仅切割染色体一次，即，在本文所述的方法中，在设计的特殊位点引入单一的双链断裂。
可与本文所述方法和组合物一起使用的RNA引导的核酸内切酶系统的示例包括Cas/CRISPR系统。Cas/CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)系统采用目标DNA的RNA引导的DNA结合与序列特异性切割。引导RNA(gRNA)含有大约20-25(如20)个与位于基因组PAM(原间隔基序)位点上游的目标基因组DNA序列和恒定RNA支架区互补的核苷酸。在某些实施方案中，目标序列与PAM有关，PAM是由CRISPR复合物识别的短序列。PAM的精确序列和长度要求会依据所使用的CRISPR酶而不同，但PAM通常为与前间隔序列(即，目标序列)相邻的2-5bp序列。PAM序列的示例在本领域是公知的，本领域的技术人员将能进一步识别用于给定的CRISPR酶的PAM序列。例如，具有PAM序列NGG的化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9的目标位点可通过在输入序列和输入端的反向补体上搜索5'-nx-ngg-3'来识别。在某些实施方案中，本文所用的基因组PAM位点为NGG、NNG、NAG、NGGNG或NNAGAAW。在具体的实施方案中，使用S.pyogenes Cas9(SpCas9)，对应的PAM为NGG。在某些方面，来自不同菌株的不同Cas9酶采用不同的PAM序列。Cas(与CRISPR相关的)蛋白质与gRNA和与之连接的目标DNA连接并在PAM位点上游的限定位置引入双链断裂。在一方面，CRISPR/Cas、Cas/CRISPR或者CRISPR-Cas系统(这些术语在整个应用中可互换使用)不要求生成定制的蛋白质来靶向特定序列，而是由短RNA分子编程单个Cas酶以识别特定的DNA靶标，即，使用短RNA分子将Cas酶招募到特定的DNA靶标中。
在一些实施方案中，RNA引导的核酸内切酶为II型Cas蛋白质。在一些实施方案中，RNA引导的核酸内切酶为Cas9，其同系物或其经修饰的版本。在一些实施方案中，可以使用两个或两个以上Cas蛋白质的组合。在一些实施方案中，CRISPR酶为Cas9，也可以是来自S.pyogenes或肺炎链球菌S.pneumoniae的Cas9。在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用Cas9。Cas9含有两个与HNH和RuvC核酸内切酶同源的独立的核酸酶结构域，并且能在gRNA的引导下切割DNA的双链，生成钝头双链断裂(DSB)。
在一些实施方案中，引导RNA是包含5’区和3’区的RNA，所述5’区含有来自CRISPR基因座的至少一个重复序列，所述3’区与染色体上的预定插入位点互补。在某些实施方案中，5’区含有与染色体上的预定插入位点互补的序列，3’区含有来自CRISPR基因座的至少一个重复序列。在某些方面，引导RNA的3’区还含有crRNA和/或tracrRNA的一个或多个结构序列。在一些实施方案中，引导RNA包括crRNA和tracrRNA，这两条RNA通过杂交形成复合物。
在一些实施方案中，基因组编辑组合物还包括含有供体序列的供体质粒。可通过包括转染、磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染、使用基因枪、使用DNA载体转运子和生物弹(例如，粒子轰击)在内的各种本领域已知的手段将供体质粒引入细胞中。
在一些实施方案中，供体序列侧翼连接有5’同源臂和3’同源臂，其中5’同源臂与位于基因组上插入位点上游的5’目标序列同源，3’同源臂与位于基因组上插入位点下游的3’目标序列同源，其中可通过同源定向修复在插入位点将供体序列插入基因组中。
在一些实施方案中，采用本领已知的任意方法评估供体序列的插入。例如，可以设计与位于5’同源臂上游的序列对应的5’引物和与供体序列中的一区域对应的3’引物来评估插入物的5’连接。类似地，可以设计与位于3’同源臂下游的序列对应的3’引物和与供体序列中的一区域对应的5’引物来评估插入物的3’连接。
在一些实施方案中，插入位点可以位于任意所需的位点，只要设计RNA引导的核酸内切酶以影响在该位点处的切割即可。在一些实施方案中，插入位点位于目标基因座。在一些实施方案中，插入位点不是基因座。
在一些实施方案中，供体核酸为不存在于宿主细胞中的序列。在一些实施方案中，供体序列为存在于除了预定目标位点以外的位点处的核酸内切酶序列。在一些实施方案中，供体序列为编码序列。在一些实施方案中，供体序列为非编码序列。在一些实施方案中，供体序列为突变的基因座。
在一些实施方案中，供体序列的大小为大约1bp至大约100kp。在某些实施方案中，供体序列的大小在大约1bp与大约10bp之间、在大约10bp与大约50bp之间、在大约50bp与大约100bp之间、在大约100bp与大约500bp之间、在大约500bp与大约1kb之间、在大约1kb与大约10kb之间、在大约10kb与大约50kb之间、在大约50kb与大约100kb之间，或在大约100kb以上。
在一些实施方案中，供体序列为待插入染色体中的外源基因。在一些实施方案中，供体序列为经修饰的序列，所述经修饰的序列可替换目标位点处的外源序列。例如，供体序列可以是具有所需突变的基因，并且可以用于存在于替换染色体上的外源基因。在一些实施方案中，供体序列为调控元件。在一些实施方案中，供体序列为编码报道蛋白质和/或RNA的标签或编码序列。在一些实施方案中，在框架中将供体序列插入目标基因的编码序列中，所述目标基因将允许融合蛋白的表达，所述融合蛋白包含融合至目标蛋白的N或C末端的外源序列。
在一些实施方案中，在细胞内切割本文所述的供体质粒，产生线性核酸。本文所述的线性核酸包含5’同源臂、供体序列和3’同源臂。换言之，供体序列与5’同源臂和3’同源臂侧翼连接。
在一些实施方案中，同源臂的长度为至少大约50bp，例如，长度为至少大约50bp、100bp、200bp、300bp、600bp、900bp、1kb、1.5kb、2kb、4kb、6kb、10kb、15kb和20kp中的任意一者。在一些实施方案中，同源臂的长度为至少300bp。在某些实施方案中，同源臂长度可以为大约50bp至大约2000bp、大约100bp至大约2000bp、大约150bp至大约2000bp、大约300bp至大约2000bp、大约300bp至大约1500bp、大约300bp至大约1000bp。在一些实施方案中，5’同源臂的长度与3’同源臂的长度相同。在一些实施方案中，5’同源臂的长度与3’同源臂的长度不同。
在一些实施方案中，5’同源臂与位于基因组上的插入位点上游的5’目标序列同源，3’同源臂与位于基因组上的插入位点(例如，DSB)下游的3’目标序列同源，从而允许同源定向修复。在一些实施方案中，5’和/或3’同源臂可与距插入位点(例如，DNA切割位点)小于200bp的对应目标序列同源。在一些实施方案中，5’和/或3’同源臂可与距DNA切割位点小于0bp的目标序列同源。在一些实施方案中，5’目标序列与3’目标序列之间的间隔小于200bp。
在一些实施方案中，在细胞内切割供体质粒(例如，通过识别质粒上的切割位点的RNA引导的核酸内切酶)，产生本文所述的线性核酸。例如，供体质粒可包含位于5’同源臂上游和3’同源臂下游的侧翼序列。宿主细胞的基因组序列中不存在一些实施方案中的这些侧翼序列，从而允许仅在供体质粒上进行切割。引导RNA可识别5’侧翼序列和3’侧翼序列。然后，可相应地设计RNA引导的核酸内切酶以在引导RNA的指导下影响在5’侧翼序列和3’侧翼序列处进行切割，所述引导RNA可释放线性核酸，但不影响宿主序列。侧翼序列可以，例如，为大约20至大约23bp。
在一些实施方案中，经过化学修饰的商品化crRNA和tracrRNA经过无RNase的TE缓冲液溶解，按照crRNA(200μM):tracrRNA(200μM):退火缓冲液:无RNase纯水为6:3:4:7的比例进行退火形成gRNA，按照如下降温程序：78℃孵育10min，37℃30min，室温15min。退火完成的gRNA与商品化Cas9蛋白孵育形成RNP复合物用于人类细胞的电转。
在一些实施方案中，使用Lonza人干细胞核转染试剂盒2和程序B-016通过电穿孔转染人iPSC。将制备好的RNP复合物以及瞬时过表达BCL-XL的保护治理共同电穿孔人iPSC。
在一些实施方案中，在初始T细胞激活3天后，去除磁珠，根据制造商的说明，采用人T细胞转染试剂盒(VPA-1002)和程序B-016电穿孔转染细胞。
在一些实施方案中，按照如下步骤构建HDR腺相关病毒AAV载体：使用KAPA HiFi聚合酶通过PCR从人类基因组或质粒钟扩增目的片段并用GeneJET凝胶提取试剂盒进行纯化。然后使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒组装PCR产物。挑选多个菌落进行Sanger测序鉴定正确克隆。用AAV6衣壳载体、AAV辅助质粒和上述方法构建的AAV HDR载体转染HEK293T细胞。转染5天后处理和收获上清液。使用切向流过滤系统将含病毒的上清液浓缩20倍，通过梯度离心进一步纯化。通过实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析确定AAV6载体滴度。
在一些实施方案中，电穿孔后的细胞被收集用于提取基因组DNA。收集的细胞用含蛋白酶K的缓冲液混匀，56℃裂解60min后95℃灭火蛋白酶10min。简短离心后取1μl上清液作为PCR鉴定的DNA模版。
在一些实施方案中，使用两轮PCR扩增去除残余AAV6 HDR载体的扩增假象。使用靶向基因组上位于左右同源臂外侧的1st引物进行第一步PCR，30个循环，产物为1500bp左右。第一轮PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证PCR扩增。确认后，将第一轮PCR产物用纳米纯水稀释100倍，作为第二轮PCR的模版。第二轮PCR产物进行凝胶电泳验证扩增(200～300bp)。
在一些实施方案中，来自每个样品的100ng二次PCR的产物被混合进行150PEIllumina双端测序。
在一些实施方案中，Illumina高通量测序得到的clean data进行FLASH合并和Barcode splitter分流处理，然后将得到的独立PCR扩增样本数据上传到基于网页的CRISPR分析工具Cas-Analyzer对每个样本进行分析，获得每个样品的编辑效率、HDR精确基因敲入效率以及各种DNA修复事件的频率。
在一些实施方案中，人iPSC或T细胞在电穿孔后立刻向培养基中加入AAV HDR载体和一定浓度的新型小分子化合物组合。24小时后，更换新鲜培养基，AAV HDR载体和小分子药物均被去除。48小时后，分析各个样本的HDR效率。新型小分子组合M3814+TSA对HDR精确基因敲入的促进作用最为明显，可提高至3倍以上。
在一些实施方案中，人iPSC或T细胞在电穿孔后立刻向培养基中加入AAV HDR载体和一定浓度M3814。24小时后，更换新鲜培养基，AAV HDR载体和小分子药物均被去除。48小时后，分析各个样本的具体DNA修复事件细节。小分子药物M3814对NHEJ+T这种DNA修复事件表现出了强烈的抑制作用。
在一些实施方案中，新型小分子药物组合M3814+TSA显著提高了人iPSC和T细胞中的长片段绿色荧光报告基因的HDR精确敲入效率。在iPSC中和T细胞中，新型小分子组合将敲入绿色荧光报告基因的精确整合分别提高至4倍和3倍。
在一些实施方案中，人iPSC或T细胞在电穿孔后48小时后，分析各个样本的细节DNA修复事件的频率。“NHEJ+T”DNA修复事件在所有的DNA修复图谱中表现出占有绝对优势的相对比例。
在一些实施方案中，人iPSC或T细胞在电穿孔后的4h、8h、12h、24h、48h，分别收取RNP电穿孔基因编辑样本，分析各个时间点样本的细节DNA修复事件的组成和频率。计算每个代表性DNA修复事件的半衰期T50，“NHEJ+T”DNA修复事件表现出最小的T50，及“NHEJ+T”与其他DNA修复事件相比发生速度最快。
在一些实施方案中，组蛋白乙酰化抑制剂NaB(Butyrate),TSA,SAHA,VPA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他)显著促进染色质非开放位点(MESP1,MYH6,和GATA4)基因编辑效率。
下面将参考实施例更详细地描述上述实施方案。然而，这些实施例不应视为在任何意义上限制本发明的范围。
实施例1：CRISPR-Cas9 RNP电转进行基因编辑
图1示出了人iPSC以及原代T细胞进行CRISPR-Cas9 RNP电转进行基因编辑的流程。在本实验中，编辑后的细胞培养两天后收获基因组DNA，用PCR扩增和Illumina高通量测序检测基因编辑的效率(图2)。
在CRISPR sgRNA设计网站(CHOPCHOP，http://chopchop.cbu.uib.no)上设计针对人B细胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)、真核翻译延伸因子1a1(EEF1A1)和真核生物延伸因子2(EEF2)基因位点的高效crRNA或sgRNA。化学修饰的合成crRNA和tracrRNA购自Synthego。
按照如下步骤构建HDR腺相关病毒AAV载体，进行BCL11A基因位点的短序列片段敲入和EEF2基因位点的绿色荧光蛋白报告基因敲入。AAV HDR载体由一个带有AAV血清型2(AAV2)反向末端重复(ITR)序列的骨架和一个6～15bp的短插入片段(用于测序分析)或一个绿色荧光蛋白(用于通过流式细胞术检测HDR效率)以及600bp的同源臂组成。使用KAPAHiFi聚合酶(KAPA Biosystems)通过PCR从人类基因组DNA或质粒中扩增所有片段，并使用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后按照制造商的说明，使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒组装PCR产物。挑选多个菌落克隆用于Sanger测序(MCLAB)以鉴定序列正确的克隆。
使用聚乙烯亚胺(PEI)MAX 40K(Polysciences)包装生产重组AAV载体。用AAV血清型6(AAV6)衣壳载体、AAV辅助质粒(Cell Biolabs)和入上述方法所述构建的AAV HDR载体转染HEK293T细胞。转染五天后，用500mM NaCl(氯化钠)(Sigma)和20U/mL Benzonase(SCBT)处理后收获上清液。使用具有300K分子量截断(MWCO)膜的Minimate(PALL)切向流过滤系统将含病毒的上清液浓缩20倍。通过碘克沙醇梯度离心进一步纯化AAV6载体。通过实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析确定AAV6载体的滴度。
将crRNA和tracrRNA按照Synthego公司推荐方法退火，形成用于制备RNP复合物的gRNA。将RNA粉末融于提供的无RNA酶氨基丁三醇-乙二酸四乙酸(Tris-EDTA，TE)缓冲液，终浓度为200μM。将充分溶解的crRNA和tracrRNA用无RNA酶水稀释成30μM，按照12μl crRNA、6μl tracrRNA、8μl Annealing buffer(公司提供退火缓冲液)和14μl无RNA酶水的配方进行加热和降温退火处理：78℃孵育10min，37℃30min，室温15min。使用前，120pmol的gRNA与60pmol Cas9蛋白(购自Intergrated DNA Technologies，IDT)在30μl电转缓冲液中室温放置10min形成RNP复合物。将制备好的RNP复合物以及瞬时过表达BCL-XL的保护质粒共同电穿孔iPSC或人原代T细胞，然后立刻加入MOI 3000至10000的AAV HDR donor，从而通过HDR途径将上述6～15bp短序列片段精确整合在BCL11A处。对于人iPSC的电穿孔，根据制造商的说明，采用人干试剂盒2和程序B-016电通过穿孔转染细胞。对于T细胞的电穿孔，在初始T细胞激活3天后，去除CD3/CD28磁珠，根据制造商的说明，采用人T试剂盒(VPA-1002)和程序B-016电通过穿孔转染细胞。
实施例2：精确HDR效率的Illumina高通量检测
细胞电穿孔48小时后，收集大约2×105个细胞用于提取基因组DNA。对于iPSC，用Accutase消化液消化贴壁细胞。将收集的细胞用含蛋白酶K的缓冲液重悬混匀，该缓冲液含有100mM氯化钠、10mM pH＝8 Tris、5mM EDTA、0.5％吐温20(Sigma)和1％蛋白酶K(ABM，10mg/ml)。使用如下程序使细胞充分裂解释放基因组DNA：56℃60min和95℃10min。简短离心后，取1μl上清液用于PCR扩增。为了防止残余AAV6 HDR模版扩增导致的假象，使用靶向基因组上位于左右同源臂外侧的1st引物进行第一步PCR(图2)。使用KAPA HiFi DNA聚合酶(罗氏测序)，程序为98℃2min；98℃5s、64℃5s、68℃5s和72℃30s，30个循环。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证PCR扩增(1～2kb)。确认后，将第一轮PCR产物用纳米纯水稀释100倍，以1μl稀释液为模版进行第二轮PCR。我们利用第二轮PCR的正向引物引入Illumina测序后用于数据分流的条形码。第二轮PCR热循环程序如下：98℃2min；98℃5s、64℃5s、68℃5s和72℃15s，20个循环。第二轮PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证扩增(200～300bp)。混合来自每个样品的100ng PCR产物，使用150PE Illumina HiSeq×10双端测序技术(Novogene)进行PCR扩增子高通量测序(图2)。
Illumina测序完成后返回双端测序的clean data。将150bp的配对末端高通量测序数据用FLASH工具合并，然后使用Barcode splitter工具进行独立PCR扩增样本数据分流。然后我们使用基于网页的CRISPR分析工具Cas-Analyzer对每个样本的编辑效率和各种DNA修复事件进行分析：将每个扩增子的.fastq文件上传到Cas-Analyzer网页上，将生成的文本文件加载到Microsoft Excel。然后我们使用内部VB(Visual Basic)脚本排除序列错误和对齐问题。得到总读数、每种不同的插入缺失的读数以及比例；若向网页输入HDR供体对比序列，可以得到HDR总读数和百分比，从而确定每个样本的精确HDR效率。
实施例3：测试添加小分子化合物对HDR效率的影响
iPSC或人T细胞电穿孔后立刻向培养基中添加AAV HDR供体和一定浓度的小分子化合物药物：Trichostatin A(TSA)(Cayman)0.01μM，M3814(MedKoo)2μM，1μl DMSO作为对照。加入小分子24小时后去掉药物更换新鲜培养基，防止严重的细胞毒性。图3示出了着重介绍的两种小分子化合物TSA和M3814的化学结构式。
电穿孔48小时后，按照实施例2所述样本处理和分析方法得到各种小分子药物对HDR基因敲入效率的影响(图4)。与对照组DMSO相比，TSA和M3814对HDR效率的促进作用最为明显，分别为1.7倍和2.9倍。这些结果表明，在所测试的小分子化合物中，HDAC抑制剂TSA和NHEJ抑制剂M3814对CRISPR-Cas9 RNP和AAV6介导的HDR基因敲入的促进作用最显著。
实施例4：TSA和M3814对CRISPR-Cas9 RNP介导的双链断裂后DNA修复事件细节的影响
iPSC细胞电穿孔后立刻向培养基中添加AAV HDR供体和一定浓度的所述小分子化合物，1μl DMSO作为对照。加入小分子24小时后去掉药物，防止严重的细胞毒性。图3示出了着重介绍的两种小分子化合物TSA 1μl DMSO作为对照。加入小分子24小时后去掉药物，更换新鲜培养基。电穿孔48小时后，按照实施例2所述样本处理和分析方法得到各种小分子药物对代表性的DNA修复事件(此处为NHEJ介导的+T和MMEJ介导的-4bp)频率的影响(图5)。与对照组及其他所测试的药物相比，M3814对NHEJ+T产生了强烈的抑制作用，NHEJ+T的相对频率从原来的46.1％下降到11.3％。TSA没有观察到明显的特殊作用。这些结果表明M3814对NHEJ具有强烈的抑制作用。
比较两种不同类型的gRNA进行HDR基因编辑时M3814对HDR效率的促进程度：其中一个gRNA打靶后不会产生压倒性的NHEJ+1bp事件(图6，上)，编辑后的DNA修复事件中最显著的NHEJ修复事件为+C且其相对频率仅有4.1％；另一个gRNA打靶后产生强烈的NHEJ+T，其相对频率为44.4％，在所有的DNA修复事件中占有绝对优势。对于这两种gRNA，M3814对它们的HDR促进作用表现出明显的区别：第一种gRNA在使用M3814后，HDR提高了146％；而对第二种产生强烈NHEJ+T的gRNA，M3814对其HDR效率提高到了386％。这些结果表明，M3814所表现出的HDR促进作用与其明显的NHEJ抑制作用有关。
实施例5：TSA和M3814药物组合进一步提高iPSC的CRISPR-Cas9 RNP AAV介导的HDR基因敲入效率
通过同时向RNP电穿孔并且加入AAV的iPSC中添加TSA和M3814这两种高性能抑制剂来研究它们的组合作用。作为对照，我们加入了已报道的一种组合CRISPY Mix(由20μMNU7026、0.01μM TSA和0.5μM MLN4924组成，NSC 15520不可用)。最近研究表明此组合可以提高iPSC的HDR效率近3倍，然而在RNP-AAV基因编辑系统中，仅观察到轻微的HDR效率提高。然而M3814将HDR效率从约25％提高至60％，并且同时使用TSA后，HDR效率进一步提高20％(图7)。统计这些药物对各类DNA修复事件(主要包括NHEJ+1、MMEJ-3～-5bp和MMEJ-8～-15bp)相对频率的影响，结果进一步表明M3814在iPSC中对NHEJ明显的抑制作用(图8)。
实施例6：TSA、M3814及这两种药物的组合在T细胞中促进CRISPR-Cas9 RNP-AAV介导的HDR基因敲入效率
通过向RNP电穿孔并且加入AAV的人类原代T细胞中添加TSA和M3814及这两种高性能抑制剂的组合物来研究它们对T细胞的HDR基因敲入是否有明显作用。同时加入CRISPYMix作为对照。图9示出了M3814将T细胞的HDR效率提高了3倍，而M3814+TSA的药物组合将HDR效率提高了3.1倍。图10示出了这些小分子药物对各类DNA修复事件(主要包括NHEJ+1、MMEJ-3～-5bp和MMEJ-8～-15bp)相对频率的影响。这些结果表明，在人原代T细胞中，M3814对NHEJ具有明显的抑制作用。
实施例7：TSA、M3814及这两种药物的组合对报告基因敲入效率的影响
通过创建EEF1A1的绿色荧光蛋白报告基因质粒HDR供体来检测小分子促进长片段基因敲入。构建以下质粒：pEF1-Cas9、pU6-sgEEF1A1、pD-EEF1A1-E2A-mNeonGreen-sg和pU6-sgDocut。
用NEBuilder HiFi组装试剂盒(新英格兰生物实验室)构建所有的Cas9 plasmid(pEF1-Cas9)和sgRNA plasmid(pU6-sgEEF1A1和pU6-sgDocut)。首先，用KAPA HiFi聚合酶(KAPA生物系)生产PCR产物并用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后，根据制造商的说明，在冰上，在DNA组装反应(20μl)将线性PCR产物组装为质粒。该反应中含有NEBuilder HiFi DNA组装主混合物(10μl)，等比例的PCR产物和水。在50℃孵育5～30min之前，简短地涡旋连接反应并离心。然后用组装的DNA产物转化NeB5-alpha-感受态大肠杆菌细胞，并用氨苄西林在LB琼脂平板上进行铺板。选择多个菌落进行Sanger测序(MCLAB)，确定正确的克隆。sgDocut序列为GGGTGCGAGATGAACTCA。sgEEF1A1序列为GTAGTCATCCTTACCCAA。设计sgEEF1A1以切割EEF1A1，设计sgDocut以切割双切供体质粒(pD-sg，即pD-EEF1A1-E2A mNeonGreen-sg)。
使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(新英格兰生物实验室)生成双切供体质粒(pD-sg，即pD-EEF1A1-E2A mNeonGreen-sg)，如上详述。简言之，采用KAPA HiFi聚合酶(KAPA生物系)由PCR来扩增pDonor-sg(左同源臂，基因敲入所需的片段，右同源臂)中包含的所有片段并用GeneJET凝胶提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific)纯化。从人gDNA中扩增长度为～600bp的HA序列，将sgDocut识别序列添加于左HA的上游和右HA的下游。所有载体通过Sanger测序来验证。
将包括pEF1-Cas9、pU6-sgEEF1A1、pD-EEF1A1-E2A-mNeonGreen-sg、pU6-sgDocut包含瞬时过表达BCL-XL的保护质粒在内的CRISPR质粒共电穿孔iPSC，从而通过HDR途径将E2A-mNeonGreen精确整合在EEF1A1处。由于EEF1A1可活跃地在iPSC中表达，其内源性转录机制驱动mNeonGreen的表达，这可在电穿孔后的第3天通过FACS分析来量化(图11、12)。电穿孔后3天，用FACS确定由mNeonGreen-阳性细胞的百分比反映的KI(基因敲入)效率。在iPSC中，EEF1A1处的HDR效率从对照组的18.3％增加至36.6％(TSA)、42.5％(M3814)和66.0％(M3814+TSA)，分别提高了2.2倍、2.9倍和4.0倍(图11，右)。这些结果表明，TSA和M3814均能够促进iPSC中报告基因的HDR精确敲入；同时使用M3814和TSA两种药物可以进一步提高报告基因的HDR效率。
图12示出了T细胞中EEF2处的RNP-AAV的报告基因敲入。在人类原代T细胞中，EEF2处的处的HDR效率从对照组的32.9％增加至47.1％(TSA)、72.2％(M3814)和79.0％(M3814+TSA)，分别提高了1.3倍、倍、2.0倍和2.1倍(图12，右)。这些结果表明，TSA和M3814均能够促进T细胞中报告基因的HDR精确敲入；同时使用M3814和TSA两种药物可以进一步提高报告基因的HDR效率。
综上所述，这些数据表明，TSA和M3814显著提高了iPSC和T细胞的CRISPR-Cas9RNPAAV介导的HDR效率；同时添加TSA和M3814可以进一步改善HDR精确基因敲入的效率。其中，M3814主要通过有效抑制强烈的NHEJ+A或+T来显著提高HDR的效率。
实施例8：进行CRISPR-Cas9 RNP编辑后，“NHEJ+T”在所有DNA修复事件中表现出极强优势
图13示出了人iPSC细胞进行CRISPR-Cas9电转进行基因编辑后一系列连续时间点4h、8h、12h、24h和48h的代表性DNA修复事件的频率。将iPSC或T细胞进行RNP电穿孔后，在上述时间点分别收获细胞样本，提取基因组DNA并进行PCR用于Illumina高通量测序。通过分析48h基因编辑效率达到饱和后各个DNA修复事件的频率，发现NHEJ+T事件在所有DNA修复事件占有极高的相对频率(可达80％)。
图14示出了根据上述时间点各个DNA修复事件的频率计算该DNA修复事件发生速度的方法。将每种代表性DNA修复事件在顺序时间点上的频率做成曲线，以时间为横轴、频率为纵轴。将频率达到最大值时作为100％，确定频率在达到最大频率的一半(50％)的时间，即T50。分别在iPSC及T细胞中按照上述计算流程统计多种DNA修复事件的T50进而反映它们的发生速度。图15示出了iPSC中NHEJ+T、NHEJ+A、NHEJ+G、NHEJ+C、NHEJ-1和MMEJ-C、MMEJ-G、MMEJ-2、MMEJ-3～5、MMEJ-6～9、MMEJ-10～23的T50。在所有的事件中，NHEJ+T表现出最小的T50(约5～8h)，这些数据表明了NHEJ+T的发生速度最快。在T细胞中，NHEJ+T的发生要慢于iPSC(约5～12h)，但与其他代表性DNA修复事件的发生速度相比仍然具有很大优势(图16)。
综上所述，这些数据表明，NHEJ+T在所有DNA修复事件中发生速度最快且容易产生压倒性的相对比例优势。这种明显的优势会妨碍HDR精确基因敲入的实现，进而解释了M3814这种强效的NHEJ抑制剂可以明显提高HDR效率的原因。M3814有效抑制了不利于HDR的NHEJ修复(特别是NHEJ+T)，为HDR的发生提供了更多机会。
实施例9：组蛋白乙酰化抑制剂NaB(Butyrate),TSA,SAHA,VPA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他)显著促进染色质非开放位点(MESP1,MYH6,和GATA4)基因编辑效率
图17展示在人iPSC细胞进行CRISPR-Cas9电转进行基因编辑的流程。首先构建基因编辑质粒，包括Cas9，sgRNA和供体质粒(Donor)等，质粒电转。其中在本实验中，编辑后的细胞培养两天后收获基因组DNA，用PCR扩增和Illumina高通量测序检测基因编辑的效率(图2)。
本案例中选择7个位点(MYH6、MESP1、GATA4、PRDM14、EEF2、GAPDH和EEF1A1)进行测试，根据基因表达的TPM值定义开放位点和非开放位点。图18展示了在人iPSCs中MYH6、MESP1、GATA4、PRDM14、EEF2、GAPDH和EEF1A1的TPM值。使用基于web的平台Galaxy分析人类iPSC RNA-seq数据(n＝6个生物重复)。通过将数据与人类转录组比对(Gencode Release19,GRCh37.p13)，利用Salmon软件来确定每百万转录量(TPM)。低TPM(<1)表明基因不表达，染色质区域是封闭的，而高TPM则与开放的染色质相关。因此MYH6、MESP1和GATA4被定义为非开放位点，而PRDM14、EEF2、GAPDH和EEF1A1被定义为开放位点。
sgRNA质粒设计：我们利用CHOPCHOP网站(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)设计针对GFP(sgDocut)、human PRDM14、GAPDH、EEF1A1、EEF2、MESP1、MYH6和GATA4的sgRNAs。如果sgRNA的第一个核苷酸不是鸟嘌呤(G)，我们在前面添加一个，因为U6启动子介导的转录从G开始。使用HiFi DNA组装克隆试剂盒(New England Biolabs)将sgRNA克隆到pU6-sgRNA主干载体中。载体经Sanger测序(MCLAB)验证。本文使用的sgRNAs列于补充表S1。
供体质粒构建：双切口供体(pDonor-sg)载体构建详流程如下，使用KAPA HiFi聚合酶(KAPA Biosystems)进行PCR扩增，将左右同源臂(HA)和期望的敲入片段重叠约20bp。使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(ZYMO Research)对其进行纯化。然后使用HiFi DNA组装克隆试剂盒(New England Biolabs)将片段与质粒主链组装，生成pDonor-sg载体。从人类基因组DNA中扩增左右同源臂(～600bp)，在左同源臂上游和右同源臂下游添加sgDocut(donor cut)识别序列。所有载体均通过Sanger测序(MCLAB)验证。
人诱导多能干细胞的电转：在电转之前，用Accutase消化iPSC细胞，以获得单细胞悬浮液。取0.8-1.5×106细胞进行电转，基因编辑质粒用量如下：Cas9 1μg,sgRNA(切割基因组)0.5μg，sgDocut(切割pDonor)0.5μg，pDonor1μg以及BCL-XL质粒0.5μg。使用Amaxa人类干细胞工具2(Lonza,)进行电转，电转程序为B-016。
HDAC抑制剂的使用：为了测试小分子对基因编辑效率的影响，将人诱导多能干细胞经编辑质粒电转后平均分成几个孔。先将丁酸钠(NaB,Sigma)、vorinostat或suberoylanilohydroxaminacid(SAHA,Selleckchem)、trichostatin A(TSA,Selleckchem)、丙戊酸(VPA,Selleckchem)、Entinostat(恩替诺特)(MS275,Selleckchem)和Panobinostat(帕比司他)(LBH589,Selleckchem)在50μl培养基中稀释，形成混和物。然后将稀释后的小分子按要求的工作浓度均匀地加入各孔。各个小分子的使用浓度为：NaB(1mM),SAHA(5μM),TSA(0.1μM),VPA(1mM),Entinostat(恩替诺特)(5μM),和Panobinostat(帕比司他)(100nM)。24小时后换新鲜培养基。对照组为只添加DMSO(0.1％)的平行对照。电转后3天，收集细胞进行PCR和深度测序，以确定编辑效率。
图19和图20说明6个小分子(NaB(Butyrate),TSA,SAHA,VPA,Entinostat(恩替诺特),和Panobinostat(帕比司他))都能促进7个位点(MYH6、MESP1、GATA4、PRDM14、EEF2、GAPDH和EEF1A1)的HDR效率，但对非开放位点(MYH6、MESP1、GATA4)作用更明显。最后，我们将三个最强的HDAC抑制剂：SAHA、Entinostat(恩替诺特)和Panobinostat(帕比司他)数据汇总分析，比较他们在开放位点和非开放位点影响编辑效率的差异(图21)。发现三个小分子能够显著促进非开放位点的HDR效率(277％比169％)，而对NHEJ效率影响不大。这些数据表明，HDAC抑制剂显著提高了人类诱导多能干细胞在开放和非开放染色质区域的HDR编辑效率，在非开放位点会产生更明显的效果。
表1

Claims (3)

1.小分子组合物在用于制备人原代细胞的CRISPR-Cas9 RNP介导的双链断裂后NHEJ介导的+T的DNA修复的抑制作用的药物中的应用，其特征在于，所述的小分子组合物为M3814+Trichostatin A(TSA，曲古柳菌素)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人原代细胞为人诱导多能干细胞、人原代T细胞、人造血干细胞。
3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，小分子组合物中各种组分的作用浓度范围为M3814：0.5～4μM；TSA(曲古柳菌素)：0.01～0.2μM。
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