CN112335688B - 双叶细辛及其提取物在防治植物病原真菌上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了双叶细辛及其提取物在防治植物病原真菌上的应用，本发明中采用甲醇浸泡双叶细辛，再用石油醚、乙酸乙酯萃取双叶细辛甲醇提取物，对双叶细辛各相萃取物进行抑菌活性检测。研究发现，双叶细辛甲醇提取物对水稻稻瘟菌、火龙果黑斑病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果炭疽病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、橡胶炭疽病菌、香蕉枯萎病菌12种植物病原真菌菌丝生长有明显的抑制作用，由此可见双叶细辛甲醇提取物对病原真菌的抑制效果具有一定的广谱性，具有开发成为植物源杀菌剂的潜力。

Description

双叶细辛及其提取物在防治植物病原真菌上的应用

技术领域

本发明属于植物领域，具体涉及一种双叶细辛及其提取物在防治植物病原真菌上的应用。

背景技术

细辛属植物作为中药材，具有解表散寒、祛风止痛、通窍温肺化饮的功效，常用于治疗风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛、痰饮喘咳等症。其中众多细辛属植物中，作为中药细辛应用的主要是辽细辛(Asarum heterotropoides Fr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag)和华细辛(Asarum sieboldii Miq.i)的干燥全草。有研究报道辽细辛的乙醇提取物具有较好体外抗炎活性。在农业防治上，刘南南等发现辽细辛精油对瓜类果斑病菌具有一定的抑菌效果。刘海燕等发现细辛挥发油对对白菜叶斑病菌(Alternaria brassicae)、葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、茄立枯病菌(Rhizoctoniasolani)表现完全抑制作用，对人参疫霉菌(P.cactorum)、绿色木霉菌(Trichodermaviride Pers.)、烟草赤星病菌(A.longipes)、燕麦镰孢(F.avenaceum)抑制作用相对较强。在杀虫方面，刘南等发现辽细辛精油具有很高的生物活性，杀虫抑菌谱广泛，作用方式多样，靶标位点丰富，具备研制开发成新型植物源农药的潜质。但是辽细辛和华细辛生长缓慢，炮制工艺复杂，价格偏贵，因此其他多种地产细辛亦可入药，这类细辛统称为土细辛，双叶细辛就是土细辛的一种。双叶细辛(Asarum caulescens Maxim)为马兜铃科(Aristolochiaceae)细辛属(Asarum)植物，别名：土细辛、乌金草，主要分布于我国陕西、甘肃、湖北、四川、贵州。民间手抄本记载双叶细辛具有行气镇痛之功效,鄂西北山区民间常用于治疗胃痛、腹痛、胸疼痛等痉挛性疼痛病症。目前关于双叶细辛的研究主要集中在药用价值以及医学研究方面，张树祥等发现双叶细辛具有明显抗肿瘤活性，而在农业方面的研究应用未见报道。

目前世界各国都在大力提倡绿色农药，用无公害的原材料和不生成有害副产品的生产工艺制备出的选择性好、与环境相容、无公害、作用机理独特、活性高、使用方便、价格适宜的农药产品。在众多的新型农药中，植物源农药以其在自然环境中自身易降解、无公害的优势已成为绿色农药的首选之一。从植物中分离纯化具有农药活性的新物质,以此先导化合物为结构模板，进行结构的多级优化，创制高效低毒新农药是植物农药的研究重点。双叶细辛由于分布广泛，价格相较华细辛和辽细辛便宜，因此本研究通过对双叶细辛甲醇提取物对12种热带常见农业病原真菌展开抑菌活性研究，以期为热带农业植物病原菌防治提供理论基础及技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种具有防治植物病原真菌的功能的植物的用途。

本发明的技术方案为：双叶细辛及其提取物在防治植物病原真菌上的应用。

进一步地，本发明中，所述植物病原真菌为：苹果轮纹病菌Botryosphaeriadothidea、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、番茄早疫病菌Alternaria solani、芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioidesPenz、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、火龙果黑斑病菌Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn、水稻稻瘟菌Pyricularia oryae Cavara、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense、香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 4或椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae。

进一步地，本发明中，所述提取物为双叶细辛的甲醇提取物，所述植物病原真菌为火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn、小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum Schwabe、芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae、番茄早疫病菌Alternaria solani、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae或苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea。双叶细辛的甲醇提取物对上述病原真菌的抑菌率均在90％以上。优选为火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn，抑菌率为100％，EC₅₀为0.093mg/mL。

进一步地，本发明中，所述提取物为双叶细辛的甲醇提取物的石油醚萃取物，所述植物病原真菌为香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe或水稻稻瘟病菌Pyriculariaoryae Cavara。双叶细辛的甲醇提取物的石油醚萃取物对上述病原真菌的抑菌率均在90％以上，优选为香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae，抑菌率为99.51％，EC₅₀为0.118mg/mL。

进一步地，本发明中，所述提取物为双叶细辛的甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物，所述植物病原真菌为香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae或橡胶炭疽病菌Colletotrichumsiamense。双叶细辛的甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物对上述病原真菌的抑菌率均在90％以上。优选为香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae，抑菌率为99.95％，EC₅₀为0.099mg/mL。

采用生长速率法测定双叶细辛对12种植物病原真菌的抑制活性，结果表明在1mg/mL浓度下，双叶细辛甲醇提取物对12种病原真菌表现出不同程度的抑制活性，并且测定了双叶细辛甲醇提取物对抑菌率在70％以上的病原菌的EC₅₀。其中，甲醇粗提取物对火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn抑制效果最为明显，抑菌率为100％，EC₅₀为0.093mg/mL。石油醚萃取相对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae抑制效果最好，抑菌率为99.51％，EC₅₀为0.118mg/mL。乙酸乙酯萃取相对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae抑制效果最好，抑菌率为99.95％，EC₅₀为0.099mg/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明中采用甲醇浸泡双叶细辛，再用石油醚、乙酸乙酯萃取双叶细辛甲醇提取物，对双叶细辛各相萃取物进行抑菌活性检测。研究发现，双叶细辛甲醇提取物对火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn、芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides Penz、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae、番茄早疫病菌Alternaria solani、香蕉枯萎病菌F.oxysporum f.sp.cubense Race 4、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cavara、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae等12种植物病原真菌菌丝生长有明显的抑制作用，由此可见双叶细辛甲醇提取物对病原真菌的抑制效果具有一定的广谱性，具有开发成为植物源杀菌剂的潜力。

附图说明

图1双叶细辛各相萃取物对12种植物病原菌的抑制效果；

注：A-L依次为:火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz、小麦赤霉病菌Fusarium graminearumSchwabe、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense、苹果轮纹病菌Botryosphaeriadothidea、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae、番茄早疫病菌Alternaria solani、香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporumf.sp.cubense Race 4、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cavara、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae。A中A1-A5依次为空白培养基对照、双叶细辛甲醇粗提物、双叶细辛石油醚相、双叶细辛乙酸乙酯相、双叶细辛水相，其余相同。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

1材料和方法

1.1材料

双叶细辛：双叶细辛中药材购自安徽毫州皖北赵氏药业。

供试菌种：苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、芒果蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioidesPenz)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、火龙果黑斑病菌(Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn)、水稻稻瘟菌(Pyricularia oryae Cavara)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum Schwabe)、橡胶炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、香蕉枯萎病菌4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense Race 4)、椰子可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)。以上菌种均由海南大学植物保护学院提供，菌种保存于4℃冰箱，活化后备用。

1.2方法

1.2.1双叶细辛粗提物的制备采用冷浸提法，将采购于安徽毫州皖北赵氏药业的1Kg双叶细辛置于电热恒温鼓风干燥箱中，控温(50±2)℃烘干后，经粉碎机粉碎，将粉碎后粉末置于甲醇中浸泡，溶剂:干粉＝5:1(体积/质量)，3d后抽滤，滤液在60℃减压蒸馏浓缩，即得到甲醇粗提取浸膏，残渣再加入同量的甲醇继续浸泡，反复三次，合并三次浸提膏，得到双叶细辛甲醇粗提取浸膏。将甲醇浸膏加适量的超纯水溶解，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将各相旋转蒸发至膏状即得到石油醚相、氯仿相以及乙酸乙酯相，剩下即为水相，置于冰箱4℃保存，备用。

1.2.2双叶细辛各相萃取物对植物病原真菌菌丝生长抑制活性测定采用生长速率法，测定双叶细辛提取物对供试病原真菌的抑菌活性。称取2g的双叶细辛各相萃取物分别溶解于4mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后在超净工作台中各取400μL溶解后各相萃取物分别融于199.6mL已冷却至50℃的PDA培养基中，配置终浓度为1mg/mL的带药培养基，倒入直径9cm的培养皿中冷却凝固，以仅加入等量N，N-二甲基甲酰胺的PDA培养基作为空白对照。取在PDA培养基上预先培养好的病原菌，在菌落边缘用直径5mm的打孔器切取生长一致的菌饼，移植到培养皿的中心，每个处理重复三次，28℃倒置培养。待菌落长至培养皿直径2/3后，用十字交叉法测量并记录菌落直径，并用以下公式计算抑菌率：

1.2.3双叶细辛各相萃取物对植物病原真菌菌丝生长的EC₅₀测定选取抑制率在70％以上的供试病原菌测定EC₅₀。将各相待测萃取物用一定量N，N-二甲基甲酰胺溶解，用0.5％吐温-80水溶液稀释成1000、500、250、125、62.5mg/mL一系列浓度梯度的母液，将配置好的母液用0.22μm针头过滤器过滤，然后在超净工作台中取0.1mL母液加入49.9mL已冷却至50℃的PDA培养基中，配成浓度为2mg/mL,1mg/mL,0.5mg/mL,0.25mg/mL,0.125mg/mL的带药培养基，接种方法同1.2.2。

1.3数据处理

使用SPSS.25、Excel.2019软件分析处理数据并计算毒力回归方程及EC₅₀。

2结果与分析

2.1双叶细辛各相提取物抑菌活性粗筛

通过甲醇浸泡得到甲醇粗提物125.64g，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到石油醚相32.39g、乙酸乙酯相16.53g、水相79.44g。从图1和表1可以看出双叶细辛各相萃取物在1mg/mL的浓度下对供试病原菌均具有一定抑菌活性。双叶细辛甲醇粗提物对各种病原真菌的抑菌率从大到小依次为火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn 100％、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe 99.75％、芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae 99.72％、番茄早疫病菌Alternaria solani 95.17％、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae 93.13％、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea 92.20％、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cavara 89.31％、芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides 83.99％、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz83.46％、椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae 75.17％、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense 72.73％、香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporumf.sp.cubense Race 4 59.10％。双叶细辛石油醚相对各种病原真菌的抑菌率从大到小依次为香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae 99.51％、芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae 97.84％、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe 92.37％、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cavara 91.23％、芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides Penz85.35％、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides85.26％、火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn81.16％、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense 80.68％、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea 79.73％、番茄早疫病菌Alternaria solani 78.68％、椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae 74.29％、香蕉枯萎病菌4号生理小种F.oxysporum f.sp.cubense Race 455.77％。双叶细辛乙酸乙酯相抑菌活性在70％以上的是香蕉炭疽病菌Colletotrichummusae 99.95％、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense 97.09％、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea 81.46％、番茄早疫病菌Alternaria solani 76.90％，对芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae抑制效果最弱，抑菌率为0.39％。可以看出双叶细辛甲醇粗提物以及石油醚相对各植物病原菌具有较好抑制活性，特别是对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、芒果蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum Schwabe的抑制活性最好，甲醇粗提物和石油醚相的抑制率都在90％以上，乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense抑制活性最好，均在90％以上。

表1双叶细辛各相萃取物对12种植物病原菌的抑菌活性

注：表中不同小写字母表示不同萃取相对同一种病菌菌丝生长抑制率在0.05水平上差异显著，不同大写字母表示不同萃取相对同一种病菌菌丝生长抑制率在0.01水平上差异显著。

2.2双叶细辛各相提取物对11种病原真菌的EC₅₀测定

通过SPSS.25计算出双叶细辛提取物对11种病原真菌的EC₅₀值，结果如表2所示。双叶细辛甲醇粗提物对11种病原菌的EC₅₀从小到大依次为：番茄早疫病菌Alternaria solani0.096mg/mL、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense 0.121mg/mL、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz 0.122mg/mL、小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum 0.129mg/mL、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae 0.143mg/mL、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides 0.158mg/mL、芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae 0.166mg/mL、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cavara 0.184mg/mL、火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn 0.188mg/mL、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea 0.199mg/mL、椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae0.437mg/mL。双叶细辛石油醚相对11种病原菌的EC₅₀从小到大依次为：火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn 0.117mg/mL、芒果蒂腐病菌Botryodiplodiatheobromae 0.138mg/mL、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum 0.157mg/mL、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea 0.177mg/mL、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense0.177mg/mL、番茄早疫病菌Alternaria solani 0.193mg/mL、香蕉炭疽病菌Colletotrichummusae 0.202mg/mL、芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides Penz0.217 mg/mL、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cavara 0.247mg/mL、椰子可可毛色二孢菌Lasiodiplodia theobromae 0.299mg/mL、芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides 0.318mg/mL。双叶细辛乙酸乙酯相对香蕉炭疽病菌Colletotrichummusae、橡胶炭疽病菌Colletotrichum siamense、火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea、番茄早疫病菌Alternariasolani的EC₅₀依次为0.099mg/mL、0.199mg/mL、0.252mg/mL、0.447mg/mL、0.789mg/mL。实验结果表明，双叶细辛各相提取物对11种病原菌的菌丝生长均具有一定抑制效果，且不同萃取相对同一病原菌的抑菌效果不一样，甲醇粗提物和石油醚相抑菌活性较好，因此推测杀菌活性成分主要集中在甲醇粗提物及石油醚相中。

表2双叶细辛各相提取物对11种植物病原菌的EC₅₀值

3结论

采用生长速率法测定双叶细辛对12种植物病原真菌的抑制活性，结果表明在1mg/mL浓度下，双叶细辛甲醇提取物对12种病原真菌表现出不同程度的抑制活性，并且测定了双叶细辛甲醇提取物对抑菌率在70％以上的病原菌的EC₅₀。其中，甲醇粗提取物对火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora(Petrak)Alcorn抑制效果最为明显，抑菌率为100％，EC₅₀为0.093mg/mL。石油醚萃取相对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae抑制效果最好，抑菌率为99.51％，EC₅₀为0.118mg/mL。乙酸乙酯萃取相对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae抑制效果最好，抑菌率为99.95％，EC₅₀为0.099mg/mL。研究表明，双叶细辛甲醇提取物对多种植物病原菌具有较强的抑菌活性，特别是双叶细辛甲醇提取物石油醚和乙酸乙酯萃取相都对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae表现出优良的抑制效果，证明双叶细辛中存在对香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae具有较强拮抗活性的物质，这一发现对将来双叶细辛开发成为防治香蕉炭疽病Colletotrichum musae的有效杀菌剂提供了一定的理论基础。

Claims (1)

1.双叶细辛提取物在防治植物病原真菌上的应用，

当所述提取物为双叶细辛的甲醇提取物，所述植物病原真菌为火龙果黑斑病菌Bipolaris cactivora (Petrak) Alcorn；

当所述提取物为双叶细辛的甲醇提取物的石油醚萃取物，所述植物病原真菌为香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae。

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