CN112331269A - 一种针对待测样本构建n-连接糖链分支结构数据库的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提出一种针对待测样本构建N‑连接糖链分支结构数据库的方法。该方法包括如下步骤：1)模拟生成N‑连接糖链中所有理论分支结构的糖链组成，并构建理论B离子数据库；2)将理论B离子数据库中的B离子分子量与待测谱图匹配，初步确定待测谱图中的B离子组成；3)根据匹配得到的每一种B离子，分别生成对应的理论可能的分支结构，以及每一种候选分支结构对应的全部理论B离子和全部理论Y离子；4)B离子的验证；5)Y离子的验证。本申请能够实现N‑糖链分支结构的全面构建，找到现有糖链数据库中不存在的分支结构，从而有助于更准确地鉴定完整糖肽信息。

Description

一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法
技术领域
本申请主要涉及一种构建N-连接糖链分支结构数据库的方法。
背景技术
糖基化是蛋白质最复杂、最普遍的翻译后修饰之一，主要分为N-连接和O-连接糖基化两大类。N-连接糖基化作为糖基化修饰的主要类型之一，参与了包括细胞识别与黏附、信号传导、免疫反应以及蛋白质折叠等多个生物进程。N-糖链的分支结构一般指在N-糖链与核心五糖相连的非还原端的糖链结构部分，在N-糖链参与的进程中糖链的结构尤其是糖链的分支结构在其中起了重要的作用，例如在多种疾病中核心或者分支岩藻糖基化有明显的上调或者下调，一个典型的例子就是甲胎蛋白的核心岩藻糖显著上调可作为肝癌检测的标志。因此对于N-糖链糖链结构特别是分支结构的解析，对探索N-糖链的生物学功能以及疾病标志物的发现有重要意义。
目前N-糖链的一些特殊分支结构的鉴定依赖于凝集素，凝集素虽然可以检测糖链的一些特殊的分支结构，如分支岩藻糖、LacdiNAc等，但是凝集素只能检测已知特定结构的含量，灵敏度低且特异性差。质谱由于其高精度、高通量的特点，被广泛应用于鉴定位点特异性的蛋白质糖基化，并且由此衍生出一系列的完整糖肽鉴定软件比较常见的如Byonic、GPQuest、pGlyco2.0。Byonic和GPQuest仅依赖糖链的组成数据库匹配，pGlyco2.0则依赖糖链结构数据库生成理论的Y离子。目前N-糖链数据库还很不完善，因此扩展N-糖链的结构数据库对于完整糖肽的鉴定分析意义重大，由于N-糖链核心结构较为固定而其分支结构复杂，因此扩展糖链数据库的关键在于如何扩展N-糖链的分支结构数据库。
依靠手工解谱的方式虽然可以一定程度上能发现一些新的分支糖链结构，但是受限于解谱速度以及由于没有统一可靠的解析标准，解析的可靠性也存在一定的问题。因此，目前急需一套标准化的糖链分支结构数据库的构建流程用于糖链分支结构的手工以及自动化解析。
发明内容
本申请的目的是为了更准确地鉴定完整糖肽而扩展N-糖链的结构数据库，提出一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法。
本申请的技术方案如下：
一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特殊之处在于，包括如下步骤：
(1)模拟生成N-连接糖链中所有理论分支结构的糖链组成，并构建理论B离子数据库，其中包含理论B离子组成及对应的B离子分子量；
(2)获取待测糖肽二级质谱谱图，将理论B离子数据库中的B离子分子量与待测谱图匹配，根据匹配情况初步确定待测谱图中的B离子组成；
(3)根据匹配得到的每一种B离子，分别生成对应的理论可能的分支结构，以及每一种候选分支结构对应的全部理论B离子和全部理论Y离子；
(4)B离子的验证：将待测糖肽二级质谱谱图与所述全部理论B离子进行匹配，对所述理论可能的分支结构进行初步筛选；
(5)Y离子的验证：将待测糖肽二级质谱谱图与所述全部理论Y离子进行匹配，对步骤(4)初步筛选后的结果进一步筛选，确定唯一的分支结构；
(6)重复步骤(3)至(5)，最终构建得到涵盖待测样本N-连接糖链分支结构的数据库。
可选地，步骤(1)中所述的理论B离子数据库由以下五种单糖自由组合而成，五种单糖分别是：N-乙酰己糖胺、己糖、N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸和岩藻糖。
可选地，步骤(2)中获取的待测糖肽二级质谱谱图包含所有谱峰的质荷比、强度和电荷信息。
可选地，步骤(4)中B离子的验证方法具体如下：
4.1)记需要验证的结构为C；
4.2)生成C对应的理论B离子的分子量，记为GB＝{g1,g2,…,gm}；
4.3)遍历GB，判断gi在谱图中是否存在该离子对应的峰；
4.4)如果GB中所有的离子都能在谱图中找到其对应的峰，那么C通过B离子验证；否则，不通过。
可选地，步骤(5)中Y离子的验证方法具体如下：
5.1)记需要验证的结构为C；
5.2)获得C对应的理论Y离子的分子量，记为GY＝{g1,g2,…,gm}；
5.3)遍历GY，判断gi在谱图中是否存在该离子对应的峰；
5.4)如果GY中所有的离子都能在谱图中找到其对应的峰，那么C通过Y离子验证；否则，不通过。
进一步可选地，步骤5.2)中，获得C对应的理论Y离子的分子量的方法具体是：
基于已经获取的多肽以及核心糖链结构信息，设多肽+五糖核心结构即peptide+HexNAc*2+Hex*3的分子质量为m；假如还存在特定修饰，则将m重新定义为peptide+HexNAc*2+Hex*3+特定修饰；假定对应的分支结构与核心结构(也包含有特定修饰的情况)相连接，使之在多肽完整的前提下理论碎裂，所有分子量大于m的理论碎片的分子量即为分支结构的理论Y离子的分子量。
进一步可选地，所述特定修饰为核心岩藻糖修饰和/或平分型糖修饰。
相应的，结合本领域的常规技术手段，还可得出：基于上述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法得到的数据库在鉴定完整糖肽上N-糖链分支结构方面的用途。
相应的，本申请还提供一种智能终端，包括处理器和存储器，所述存储器存储有程序，其特殊之处在于：所述程序被处理器加载运行时实现上述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法的各个步骤。
相应的，本申请还提供一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，其特殊之处在于：所述计算机程序被处理器加载运行时实现上述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法的各个步骤。
相比现有技术，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，能够实现N-糖链分支结构的全面构建，找到现有糖链数据库中不存在的分支结构，从而有助于更准确地鉴定完整糖肽信息。
附图说明
图1为本申请的方法流程示意图。
图2为基于二级质谱谱图的分支结构鉴定示意图。
具体实施方式
以下结合附图以及实施例，对本申请作进一步详述。应当理解，这些实施例只用于更充分地解释说明本申请的特点，而并非对本申请权利要求的限制。
如图1所示，一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，包括如下步骤：
(1)模拟生成N-连接糖链中所有理论分支结构的糖链组成，，构建理论B离子数据库；具体由以下五种单糖自由组合而成：N-乙酰己糖胺、己糖、N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸和岩藻糖；
(2)获取待测糖肽二级质谱谱图，谱图包含所有谱峰的质荷比、强度和电荷信息；将理论B离子数据库中的B离子分子量与待测谱图匹配，根据匹配情况初步确定待测谱图中的B离子组成；
(3)根据匹配得到的每一种B离子，分别生成对应的理论可能的分支结构，以及每一种候选分支结构对应的全部理论B离子和全部理论Y离子；
(4)B离子的验证：将待测糖肽二级质谱谱图与所述全部理论B离子进行匹配，对所述理论可能的分支结构进行初步筛选；
4.1)记需要验证的结构为C；
4.2)生成C对应的理论B离子的分子量，记为GB＝{g1,g2,…,gm}；
4.3)遍历GB，判断gi在谱图中是否存在该离子对应的峰；
4.4)如果GB中所有的离子都能在谱图中找到其对应的峰，那么C通过B离子验证；否则，不通过；
(5)Y离子的验证：将待测糖肽二级质谱谱图与所述全部理论Y离子进行匹配，对步骤(4)初步筛选后的结果进一步筛选，确定唯一的分支结构；
5.1)记需要验证的结构为C；
5.2)获得C对应的理论Y离子的分子量，记为GY＝{g1,g2,…,gm}；
5.3)遍历GY，判断gi在谱图中是否存在该离子对应的峰；
5.4)如果GY中所有的离子都能在谱图中找到其对应的峰，那么C通过Y离子验证；否则，不通过；
(6)重复步骤(3)至(5)，最终构建得到涵盖待测样本N-连接糖链分支结构的数据库。
上述步骤5.2)中，获得C对应的理论Y离子的分子量的方法具体是：
基于已经获取的多肽以及核心糖链结构信息，设peptide+HexNAc*2+Hex*3设为第一类核心结构(m)；
若谱图中糖链核心结构包含核心岩藻糖修饰，则将peptide+HexNAc*2+Hex*3+Fucose设为第二类核心结构(m)；
若谱图中糖链核心结构包含平分型糖修饰，则将peptide+HexNAc*2+Hex*3+HexNAc设为第三类核心结构(m)；
若谱图中糖链核心结构既包含核心岩藻糖修饰又包含平分型糖修饰，则将peptide+HexNAc*2+Hex*3+Fucose+HexNAc设为第四类核心结构(m)；
假定对应的分支结构与核心结构相连接，使之在多肽完整的前提下理论碎裂，所有分子量大于m的理论碎片的分子量即为分支结构的理论Y离子的分子量。
如图2所示，谱图左侧所示的是分支结构的B离子，右侧的结构为验证该分支结构Y离子，B、Y离子结合最后验证得出下方的分支结构，该分支结构可能并不在现有的N-糖链的分支结构数据库中。
基于上述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法得到的数据库，可应用于鉴定完整糖肽上N-糖链分支结构；例如：
首先，根据建立的该糖链分支结构数据库，构建已知多肽序列和全部糖链分支结构的理论完整糖肽，在其糖链部分进行理论碎裂，得到每一种候选糖链分支结构对应的完整糖肽的理论Y离子集合、理论B离子集合和可能的B离子进一步理论碎片离子集合；
其次，将目标二级质谱数据(预处理得到包含待测糖肽数据的二级质谱谱图)与理论数据进行匹配；具体涉及：
针对每一张二级质谱谱图，将所述理论B离子集合和所述进一步碎片离子集合分别与二级质谱谱图在预设误差范围内进行分子量匹配；若二级质谱谱图中的某一谱峰与理论B离子集合或所述进一步理论碎片离子集合中的某一分子量在误差范围内，则认为对应的B离子或进一步碎片离子匹配成功；
针对每一张二级质谱谱图，将所述理论Y离子的分子量集合与二级质谱谱图在预设误差范围内进行匹配；若二级质谱谱图中的某一谱峰与理论Y离子集合中的某一分子量在误差范围内，则认为对应的Y离子匹配成功；
再次，根据匹配结果鉴定每个糖链分支结构：对于每一张二级质谱谱图，结合B离子、Y离子的匹配结果，基于匹配成功的B离子、Y离子以及可能的B离子进一步碎片离子，若能够组成确定的某一种或多种候选糖链分支结构，则表明该张二级质谱谱图鉴定得出相应的一种或多种糖链分支结构；否则，表明该张二级质谱谱图鉴定失败；
然后，根据鉴定得到的糖链分支结构的集合，推定得出若干可能的糖链分支结构；
最后，根据糖链类型确定完整糖肽的糖链分支结构：确定完整糖肽上连接的糖链所属的糖链类型；根据特定糖链类型的固有特点，对二级质谱谱图鉴定得到的若干可能的糖链分支结构进行特定组合，最终得出鉴定结论，即目标完整糖肽包含哪些糖链分支结构。具体可以是：
将完整糖肽质量记为M，多肽加上N-糖链核心结构质量记为m；
a)如果糖链类型为复杂型糖链，则将前一步推定得出的若干可能的糖链分支结构进行任意组合，使之组合后的分子量与M-m在误差范围内匹配，如果有多个组合的分子量均匹配成功，则取Y离子匹配数量最多的一种组合作为鉴定结果；
b)如果糖链类型为杂合型糖链，在二级质谱谱图中寻找甘露糖分子量m+162的峰，如果存在则继续寻找m+162*2的峰，直至找到m+162*x的峰，即表明甘露糖分支的甘露糖数量为x；将步骤(5)得出的若干可能的糖链分支结构进行任意组合，使之组合后的分子量与M-(m+162*x)在误差范围内匹配，如果有多个组合的分子量均匹配成功，则取Y离子匹配数量最多的一种组合，确定该杂合型糖链的一侧分支结构；对于另一侧分支结构，根据x的值查询已知的杂合型糖链结构予以唯一匹配确定；
c)如果糖链类型为高甘露糖型糖链，则分支的高甘露糖数量为y＝(M-m)/162，根据y的值查询已知的高甘露糖型糖链结构予以唯一匹配确定。
另外，本申请的方案可以通过智能终端、计算机可读存储介质等形式实施或形成商业化产品，例如：
一种智能终端，包括处理器和存储器，所述存储器存储有程序，所述程序被处理器加载运行时实现上述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法的各个步骤。
一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器加载运行时实现上述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法的各个步骤。

Claims (10)

1.一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)模拟生成N-连接糖链中所有理论分支结构的糖链组成，并构建理论B离子数据库，其中包含理论B离子组成及对应的B离子分子量；
(2)获取待测糖肽二级质谱谱图，将理论B离子数据库中的B离子分子量与待测谱图匹配，根据匹配情况初步确定待测谱图中的B离子组成；
(3)根据匹配得到的每一种B离子，分别生成对应的理论可能的分支结构，以及每一种候选分支结构对应的全部理论B离子和全部理论Y离子；
(4)B离子的验证：将待测糖肽二级质谱谱图与所述全部理论B离子进行匹配，对所述理论可能的分支结构进行初步筛选；
(5)Y离子的验证：将待测糖肽二级质谱谱图与所述全部理论Y离子进行匹配，对步骤(4)初步筛选后的结果进一步筛选，确定唯一的分支结构；
(6)重复步骤(3)至(5)，最终构建得到涵盖待测样本N-连接糖链分支结构的数据库。
2.根据权利要求1所述的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的理论B离子数据库由以下五种单糖自由组合而成，五种单糖分别是：N-乙酰己糖胺、己糖、N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸和岩藻糖。
3.根据权利要求1所述的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，步骤(2)中获取的待测糖肽二级质谱谱图包含所有谱峰的质荷比、强度和电荷信息。
4.根据权利要求1所述的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，步骤(4)中B离子的验证方法如下：
4.1)记需要验证的结构为C；
4.2)生成C对应的理论B离子的分子量，记为GB＝{g1,g2,…,gm}；
4.3)遍历GB，判断gi在谱图中是否存在该离子对应的峰；
4.4)如果GB中所有的离子都能在谱图中找到其对应的峰，那么C通过B离子验证；否则，不通过。
5.根据权利要求1所述的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，步骤(5)中Y离子的验证方法如下：
5.1)记需要验证的结构为C；
5.2)获得C对应的理论Y离子的分子量，记为GY＝{g1,g2,…,gm}；
5.3)遍历GY，判断gi在谱图中是否存在该离子对应的峰；
5.4)如果GY中所有的离子都能在谱图中找到其对应的峰，那么C通过Y离子验证；否则，不通过。
6.根据权利要求5所述的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，步骤5.2)中，获得C对应的理论Y离子的分子量的方法具体是：
基于已经获取的多肽以及核心糖链结构信息，设多肽+五糖核心结构即peptide+HexNAc*2+Hex*3的分子质量为m；假如还存在特定修饰，则将m重新定义为peptide+HexNAc*2+Hex*3+特定修饰；假定对应的分支结构与核心结构相连接，使之在多肽完整的前提下理论碎裂，所有分子量大于m的理论碎片的分子量即为分支结构的理论Y离子的分子量。
7.根据权利要求6所述的一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法，其特征在于，所述特定修饰为核心岩藻糖修饰和/或平分型糖修饰。
8.权利要求1所述一种针对待测样本构建N-连接糖链分支结构数据库的方法得到的数据库在鉴定完整糖肽上N-糖链分支结构方面的用途。
9.一种智能终端，包括处理器和存储器，所述存储器存储有程序，其特征在于：所述程序被处理器加载运行时实现权利要求1所列的各个步骤。
10.一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，其特征在于：所述计算机程序被处理器加载运行时实现权利要求1中所列的各个步骤。
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