CN112322720B - 一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物技术领域的S1：心肌肥大相关候选miRNA的建立，从文献中筛选出影响心肌肥厚形成的关键miRNA，对候选的关键miRNA采取polyA尾法进行设计引物，并对设计引物进行后续鉴定；S2：待选靶标microRNA小样本筛选，对小样本使用试剂盒进行microRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上进行Real Time PCR反应液的配制，然后进行定量PCR反应；S3：待选靶标microRNA大样本验证，本方法所述心肌肥大相关microRNA鉴定方法效率高；本方法采用多条microRNA进行心肌肥大鉴定筛选，更为准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒。
背景技术
心肌肥厚是一个受多因素影响的心脏疾病，是公认的导致心肌猝死、心力衰竭的重要原因之一。自从Jarcho等首次报道了心脏肌球蛋白重链基因MYH6错义突变可导致心肌肥厚后，大量研究相继发现了与心肌肥厚相关的13个致病基因和900多个突变位点。遗传学证据表明编码控制肌小节收缩的肌丝蛋白的显性突变能够诱导心肌肥厚的产生。截至目前，70％的心肌肥厚患者携带有MYH7突变或肌蛋白结合蛋白MYBPC3；约5％的心肌肥厚患者携带肌钙蛋白TNNT2和另外几个致病基因突变。另外还有很多基因被证实与心肌肥厚发生有关但是缺少足够的病理学证据，包括肌联蛋白TTN、视松蛋白TCAP、黏着斑蛋白VCL、膜连接蛋白JPH2等。截止到当前，OMIM共收录了27种与心肌肥厚相关的基因。然而经过近20年的临床验证，人们发现通过检测心肌肥厚相关基因突变做临床诊断结果是不可靠的，主要原因是因为心肌肥厚患者展现出来的表型与基因型均具有明显的异质性。这就导致使用某种基因突变信息来判定心肌肥厚预后的概念当前是无法实现的。
miRNA(miRNA)是一类进化保守、大小约为21个核苷酸的小分子非编码RNA，普遍存在于真核生物中。一般通过非完全碱基互补配对方式识别靶基因mRNA的3’非翻译区(3’UTR)的序列元件，在转录后水平负调控靶基因的表达。miRNA作为一类最为庞大的基因表达调控因子，对个体的生长发育至关重要，同时与癌症、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等人类重大疾病发生发展密切相关[22-24]。大量的基因芯片分析miRNA表达图谱后发现了许多与心肌肥厚和心力衰竭中相关的miRNA，阻碍心肌肥厚形成的关键miRNA主要包括miR-1和miR-133；其中miR-1通过抑制其下游靶基因细胞骨架调控蛋白Twf1和胰岛素生长因子发挥作用；miR-133则通过抑制其下游基因Rho激酶家族RhoA和Cdc2、及RNA聚合酶II的负调控因子NelfA起作用。促进心肌肥厚形成的关键miRNA主要包括miR-195、miR-208、miR-499、miR-23、miR-100、miR-18b等；其中miR-208、miR-23、miR-100、miR-133分别通过影响各自的靶基因Myh6\Myh7、钙依赖磷酸酶NFAT、缺氧诱导因子HIF-1α和长寿因子Sirt1、肌肉泛素蛋白MuRF等调控心肌肥厚过程；miR-195、miR-499和miR-18b的靶基因尚不清楚。
目前研究者积累了大量的心肌肥厚实验证据，但是无论是致病基因突变水平还是转录调控方面均未能完全阐明其发病机理和调控方式。仅有70％的肥厚型心肌病患者中发现了关联基因突变，然而反过来这些基因突变并不能作为临床诊断的依据，因此这些基因突变应该被看作为心肌肥厚致病基因而非关键诊断标记物。
有研究表明，心肌梗死等心肌病变引起的原发性心肌肥厚患者血清中miR-208、miR-499、miR-23、miR-100、miR-18b等miRNA的水平显著升高，而无心肌梗死患者血清中该miRNA并未出现显著升高。我们检测的样品均来自继发性心肌肥厚患者(与已研究的原发性心肌肥厚类型不同)，患者由于心血管病变导致血流自心室流出的阻力(即压力负荷)增加，或流入心室的血量(即容量负荷)增加，或心排出血量下降所致代偿性肥大，产生心腔扩张(左心室房增大)和心壁(室间隔增厚)肥厚。因此，本专利研究继发性心肌肥厚患者血清中miRNA该生物标记的表达情况，对进一步探究心肌肥厚发生发展机制和转录组、表观遗传水平的调控奠定基础。
心肌肥厚的在转录水平上及表观遗传水平上的调控机制仍缺少足够的分子生物学及临床证据；另外相比于基因组学及分子生物学在肿瘤领域的广泛应用，心肌肥厚的研究和临床转化相对比较滞后。本研究寻找能够准确诊断心肌肥厚的生物标记物，对进一步探究心肌肥厚发生发展机制和转录组、表观遗传水平的调控奠定基础。
基于此，本发明设计了一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒，以解决上述提到的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒，以解决上述提到的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒，包括以下步骤：
S1：继发性心肌肥大相关候选miRNA的建立，
从文献中筛选出影响继发性心肌肥厚形成的关键miRNA，对候选的关键miRNA采取polyA尾法进行设计引物，并对设计引物进行后续鉴定；
S2：将S1鉴定后继发性心肌肥厚形成的关键miRNA作为待选靶标miRNA小样本进行筛选，
对小样本使用试剂盒进行miRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上进行Real Time PCR反应液的配制，然后进行定量PCR反应；
S3：将S2反应后继发性心肌肥厚miRNA进行大样本进行验证，
对在小样本中定量PCR鉴定到的hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，miR-20a，miR-212，miR-208a 7条miRNA进行了大样本验证；室温融化cDNA模板、上游引物、2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer，之后置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制；将配制的Real TimePCR反应液混合物分装至每个检测孔中，按混合物cDNA-ddH2O的顺序加样，配制体系，彻底混匀。
优选的，所述关键miRNA包括hsa-miR-200a-5p，hsa-miR-208a，hsa-miR-221，hsa-miR-20a，hsa-miR-212，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-195-5p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-150-5p。
优选的，所述关键miRNA通过影响各自的靶基因Myh6\Myh7、钙依赖磷酸酶NFAT、缺氧诱导因子HIF-1α和长寿因子Sirt1、肌肉泛素蛋白MuRF因子调控心肌肥厚过程。
优选的，所述Real Time PCR反应液的配制有如下组成成分：2×miRcute PlusmiRNA Premix、Forward Primer、Reverse Primer、miRNA第一链cDNA和ddH2O。
优选的，所述大样本包括MH4-8，NC 24-31，NC 35-39。
优选的，在所述定量PCR反应中，采用的对照组为血清样品，所述血清样品处理为：使用RNAiso blood，对血液样品进行处理制备RNA，将制备的RNA加入适量的RNase-free水溶解沉淀，置于-80℃保存。
优选的，还包括一种心肌肥大疾病相关生物标记检测的试剂盒，所述试剂盒使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本方法所述心肌肥大相关miRNA鉴定方法效率高
2、本方法采用多条miRNA进行心肌肥大鉴定筛选，更为准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p小样本筛选结果图；
图2为本发明hsa-miR-214-3p及hsa-miR-23b-5p小样本筛选结果图；
图3为本发明hsa-miR-208a，hsa-miR-20a及hsa-miR-212小样本筛选结果图；
图4为本发明hsa-miR-133a-5p大样品筛选结果图；
图5为本发明hsa-miR-1-3p大样品筛选结果图；
图6为本发明hsa-miR-214-3p大样品筛选结果图；
图7为本发明hsa-miR-23b-5p大样品筛选结果图；
图8为本发明hsa-miR-208a大样品筛选结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法，包括以下步骤：
S1：心肌肥大相关候选miRNA的建立，
大量阅读文献后发现，影响心肌肥厚形成的关键miRNA主要包括hsa-miR-200a-5p，hsa-miR-208a，hsa-miR-221，hsa-miR-20a，hsa-miR-212，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-195-5p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-150-5p等；可通过影响各自的靶基因Myh6\Myh7、钙依赖磷酸酶NFAT、缺氧诱导因子HIF-1α和长寿因子Sirt1、肌肉泛素蛋白MuRF等因子调控心肌肥厚过程。
miRNA的结构较为特殊，其长度只有19-24nt，不能够对其用普通引物进行逆转录，本研究采取加polyA尾法进行引物设计。16条引物信息见表1。
| miRNA | 引物 | 序列 |
| hsa-miR-200a-5p | hsa-miR-200a-5p-F | CATCTTACCGGACAGTGCTGGA |
| hsa-miR-208a | hsa-miR-208a-F | TAAGACGAGCAAAAAGCTTGT |
| hsa-miR-221 | hsa-miR-221-F | GCTACATTGTCTGCTGGGTTTC |
| hsa-miR-20a | hsa-miR-20a-F | CTGCATTATGAGCACTTAAAG |
| hsa-miR-212 | hsa-miR-212-F | AACAGTCTCCAGTCACGGCC |
| hsa-miR-92b-3p | hsa-miR-92b-3p-F | TATTGCACTCGTCCCGGCCT |
| hsa-miR-24-3p | hsa-miR-24-3p-F | GGCTCAGTTCAGCAGGAACA |
| hsa-miR-195-5p | hsa-miR-195-5p-F | TAGCAGCACAGAAATATTGGC |
| hsa-miR-214-3p | hsa-miR-214-3p-F | AGCAGGCACAGACAGGCA |
| hsa-miR-23a-3p | hsa-miR-23a-3p-F | ATCACATTGCCAGGGATTTC |
| hsa-miR-23b-5p | hsa-miR-23b-5p-F | GTTCCTGGCATGCTGATTT |
| hsa-miR-133a-5p | hsa-miR-133a-5p-F | AGCTGGTAAAATGGAACCAAAT |
| hsa-miR-1-3p | hsa-miR-1-3p-F | CGCGTGGAATGTAAAGAAGTATGTA |
| hsa-miR-29a-3p | hsa-miR-29a-3p-F | AGCACCATCTGAAATCGGTT |
| hsa-miR-30a-5p | hsa-miR-30a-5p-F | TGTAAACATCCTCGACTGGAAG |
| hsa-miR-150-5p | hsa-miR-150-5p-F | TCTCCCAACCCTTGTACCAGT |
| miRNA通用引物 | 通用下游引物 | GGCCAACCGCGAGAAGATGTTTTTTTTT |
| 内参 | hsa-miR-16-5p | TAGCAGCACGTAAATATTGGC |
S2：待选靶标miRNA小样本筛选，
对小样本使用试剂盒进行miRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上按表2进行Real Time PCR反应液的配制，然后按表3进行定量PCR反应；结果如下图1-3：与对照组相比，心肌肥大样品中hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-208a，hsa-miR-20a，hsa-miR-212的表达量出现显著上调.
S3：待选靶标miRNA大样本验证，
对在小样本中定量PCR鉴定到的hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，miR-20a，miR-212，miR-208a 7条miRNA进行了大样本验证；大样本包括MH4-8，NC 24-31，NC 35-39。
室温融化cDNA模板、上游引物、2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROXReference Dye和Reverse Primer，之后置于冰上按表2进行Real Time PCR反应液的配制；
表2Real Time PCR反应液的配制
反应程序
其中，在所述定量PCR反应中，采用的对照组为血清样品，所述血清样品处理为：使用RNAiso blood，对血液样品进行处理制备RNA，将制备的RNA加入适量的RNase-free水溶解沉淀，置于-80℃保存。
S3的结果如4-8所示，与对照血清相比hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-208a五条miRNA在心肌肥大样品血清中显著上调。
其中，还包括一种心肌肥大疾病相关生物标记检测的试剂盒，所述试剂盒使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒。
试剂盒效果验证：
为鉴定本试剂盒对心肌肥大鉴定效果，对来自医院的样品9-13使用本试剂盒进行鉴定。靶标基因表达量用相对表达量(2-ΔΔCT值表示)，与医院鉴定结果比较，证明本试剂盒的效果。结果表4所示，该试剂盒的整体准确率达到92％，较为准确，可用于心肌肥大疾病鉴定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (2)
1.一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：继发性心肌肥大相关候选miRNA的建立，
从文献中筛选出影响继发性心肌肥厚形成的关键miRNA，主要包括hsa-miR-200a-5p，hsa-miR-208a，hsa-miR-221，hsa-miR-20a，hsa-miR-212，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-195-5p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-150-5p，对候选的关键miRNA采取polyA尾法进行设计引物，并对设计引物进行后续鉴定；
S2：将S1鉴定后继发性心肌肥厚形成的关键miRNA作为待选靶标miRNA进行小样本筛选，
对小样本使用试剂盒进行miRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上进行RealTime PCR反应液的配制，然后进行定量PCR反应；
S3：将S2反应后继发性心肌肥厚miRNA进行大样本验证，
对在小样本中定量PCR鉴定到的hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，miR-20a，miR-212，miR-208a 7条miRNA进行了大样本验证；室温融化cDNA模板、上游引物、2×miRcute Plus miRNAPremix、50×ROX Reference Dye和ReversePrimer，之后置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制；将配制的Real Time PCR反应液混合物分装至每个检测孔中，按混合物cDNA-ddH2O的顺序加样，配制体系，彻底混匀；
所述关键miRNA通过影响各自的靶基因Myh6\Myh7、钙依赖磷酸酶NFAT、缺氧诱导因子HIF-1α和长寿因子Sirt1、肌肉泛素蛋白MuRF因子调控心肌肥厚过程；
所述Real Time PCR反应液的配制有如下组成成分：2×miRcute Plus miRNA Premix、Forward Primer、Reverse Primer、miRNA第一链cDNA和ddH2O；
在所述定量PCR反应中，采用的对照组为血清样品，所述血清样品处理为：使用RNAisoblood，对血液样品进行处理制备RNA，将制备的RNA加入适量的RNase-free水溶解沉淀，置于-80℃保存；所述检测方法不涉及疾病的诊断和治疗。
2.根据权利要求1所述的一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法，其特征在于：还包括一种心肌肥大疾病相关生物标记检测的试剂盒，所述试剂盒使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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