CN112322698A - 一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112322698A
CN112322698A CN202011141174.1A CN202011141174A CN112322698A CN 112322698 A CN112322698 A CN 112322698A CN 202011141174 A CN202011141174 A CN 202011141174A CN 112322698 A CN112322698 A CN 112322698A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sucrose invertase
nano silver
bacteria
sucrose
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011141174.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112322698B (zh
Inventor
郑来宝
董雯佳
楼永良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN202011141174.1A priority Critical patent/CN112322698B/zh
Publication of CN112322698A publication Critical patent/CN112322698A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112322698B publication Critical patent/CN112322698B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种利用纳米银‑蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒。其中细菌检测方法包括以下步骤：将纳米银溶液、待测液体、蔗糖转化酶混合反应后，加入蔗糖溶液进行反应，检测反应体系中的葡萄糖含量。纳米银对蔗糖转化酶具有抑制作用，而在细菌、纳米银、蔗糖转化酶三者的反应体系下，细菌与蔗糖转化酶形成竞争性反应，蔗糖转化酶的酶活性会相比纳米银和蔗糖转化酶二者的反应体系更高，最终检测的葡萄糖含量与待测液体中的细菌含量呈线性关系。本发明提出的基于纳米银‑酶的复合物和便携式血糖仪的细菌检测方法，可以实现对细菌的简单、快速、高灵敏检测。

Description

一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒。
背景技术
微生物的快速检测在食品安全、水环境监测、公共安全和医疗诊断等方面具有重要意义。传统的微生物检测的方法主要包括培养法、聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等，但这些方法往往具有耗时、灵敏度低和特异性差或者需要专业的设备和专业人员的弊端。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒。
本发明所采取的技术方案如下：一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，包括以下步骤：将纳米银溶液、待测液体、蔗糖转化酶混合反应后，加入蔗糖溶液进行反应，检测反应体系中的葡萄糖含量。
优选地，所述纳米银溶液为以水溶性高聚物为稳定剂的纳米银溶液。水溶性高聚物具体可以采用淀粉类衍生物、壳聚糖、纤维素衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙胺、聚乙烯亚胺中的一种或多种。
优选地，所述水溶性高聚物为聚乙烯亚胺。聚乙烯亚胺含有大量的氨基，水溶解后，带有大量的正电荷，对纳米银离子有很强的稳定作用。
优选地，所述纳米银溶液的制备过程如下：将水溶性还原剂与水溶性银盐反应得到含有纳米银的溶液，然后与聚乙烯亚胺溶液反应，得到聚乙烯亚胺修饰的纳米银溶液。水溶性还原剂具体可以采用柠檬酸、抗坏血酸、硼氢化钠、水合肼、葡萄糖、次亚磷酸钠中的一种或多种。
优选地，加入蔗糖溶液后反应时间为10-20min，反应温度为50-60℃，pH为4.5-5.5。
优选地，加入蔗糖溶液后反应时间为15min，反应温度为55℃，pH为5。
优选地，该方法用于检测大肠杆菌，大肠杆菌线性检测范围为102 cfu/mL-107cfu/mL。
优选地，该方法用于检测金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌线性检测范围为103cfu/mL-107 cfu/mL。
优选地，通过血糖仪检测反应体系中的葡萄糖含量。
一种细菌检测试剂盒，包括纳米银溶液、蔗糖转化酶。
本发明的有益效果如下：纳米银对蔗糖转化酶具有抑制作用，而在细菌、纳米银、蔗糖转化酶三者的反应体系下，细菌与蔗糖转化酶形成竞争性反应，蔗糖转化酶的酶活性会相比纳米银和蔗糖转化酶二者的反应体系更高，最终检测的葡萄糖含量与待测液体中的细菌含量呈线性关系。
本发明提出的基于纳米银-酶的复合物和便携式血糖仪的细菌检测方法，可以实现对细菌的简单、快速、高灵敏检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为基于纳米银-酶复合物体系的微生物快速检测方法原理图；
图2为不同溶液体系通过血糖仪测得的示数；
图3中，（a）为细菌与纳米银-酶复合物体系反应时间对蔗糖转化酶催化活性的影响，（b）为细菌与纳米银-酶复合物体系反应温度对蔗糖转化酶催化活性的影响，（c）细菌与纳米银-酶复合物体系的pH对蔗糖转化酶催化活性的影响;
图4为大肠杆菌（a）和金葡萄球菌（b）的检测性能。
具体实施方式
一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，包括以下步骤：将纳米银溶液、待测液体、蔗糖转化酶混合然后震荡反应反应后，加入蔗糖溶液进行反应，检测反应体系中的葡萄糖。
基于纳米银-蔗糖转化酶复合物和PGM的微生物快速检测原理如图1所示。纳米银-酶复合物体系中，酶的活性被抑制。利用细菌与酶的竞争性反应，使纳米银-蔗糖转化酶复合物中的蔗糖转化酶活性恢复，蔗糖水解产生葡萄糖，使用PGM检测其生成的葡萄糖浓度作为信号输出装置，构建一种微生物快速检测方法。
优选地，所述纳米银溶液为以水溶性高聚物为稳定剂的纳米银溶液。水溶性高聚物具体可以采用淀粉类衍生物、壳聚糖、纤维素衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙胺、聚乙烯亚胺中的一种或多种。
优选地，所述水溶性高聚物为聚乙烯亚胺（PEI）。聚乙烯亚胺含有大量的氨基，水溶解后，带有大量的正电荷，对纳米银离子有很强的稳定作用。
优选地，所述纳米银溶液的制备过程如下：将水溶性还原剂与水溶性银盐反应得到含有纳米银的溶液，然后与聚乙烯亚胺溶液反应，得到聚乙烯亚胺修饰的纳米银溶液。水溶性还原剂具体可以采用柠檬酸、抗坏血酸、硼氢化钠、水合肼、葡萄糖、次亚磷酸钠中的一种或多种。
优选地，加入蔗糖溶液后反应时间为10-20min，反应温度为50-60℃，pH为4.5-5.5。
优选地，加入蔗糖溶液后反应时间为15min，反应温度为55℃，pH为5。
优选地，该方法用于检测大肠杆菌，大肠杆菌线性检测范围为102 cfu/mL-107cfu/mL。
优选地，该方法用于检测金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌线性检测范围为103 cfu/mL-107 cfu/mL。
优选地，通过血糖仪检测反应体系中的葡萄糖。
一种细菌检测试剂盒，包括纳米银溶液、蔗糖转化酶。试剂盒中还可以设置便携式血糖仪。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
1. PEI-AgNPs的制备
取65 mg柠檬酸钠和2 mg单宁酸与50 mL水混合，煮沸并剧烈搅拌，再加入1 mL的4.2mg/mL硝酸银，搅拌20 min，停止加热。待溶液冷却后，取其1mL以4℃，10000 rpm离心40min，用超纯水洗涤2次，并将OD400调至1，再从中取200 µL与100 µL不同浓度（0-0.1、0.3、1mg/mL）的PEI溶液混合，室温下以400 rpm搅拌1 h。再以4℃，10000 rpm的条件离心40 min，弃上清，去除残留PEI，加入超纯水，调节至OD400=1。
2. 细菌培养
将大肠杆菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）接种至LB培养基，并以转速为200 rpm、37 ℃的条件振摇培养12 h。使用PBS缓冲液对其清洗、重悬，并调整其OD600=1，其浓度通过平板计数法确定。随后，使用PBS缓冲液对其进行稀释以获得浓度为101-109 cfu/mL的菌液。
3. 细菌检测
①50 µL浓度为0.8 µg/mL蔗糖转化酶稀释到150µL，然后加入50 µL的0.5 M蔗糖溶液，以55℃ ，400 rpm的条件振荡20 min。反应结束后，使用PGM测定其葡萄糖示数。
②3 µL的PEI - AgNPs稀释到150µL，然后加入50 µL的0.5 M蔗糖溶液，以55℃ ，400 rpm的条件振荡20 min。反应结束后，使用PGM测定其葡萄糖示数。
③97 µL浓度为102-109 cfu/mL的细菌稀释到150µL，然后加入50 µL的0.5 M蔗糖溶液，以55℃ ，400 rpm的条件振荡20 min。反应结束后，使用PGM测定其葡萄糖示数。
④将3 µL的PEI - AgNPs和50 µL浓度为0.8 µg/mL蔗糖转化酶混合。以25℃ 400rpm的条件振荡15 min。然后加入50 µL的0.5 M蔗糖溶液，以55℃ ，400 rpm的条件振荡20min。反应结束后，使用PGM测定其葡萄糖示数。
⑤将3 µL的PEI - AgNPs、97 µL浓度为107 cfu/mL的细菌和50 µL浓度为0.8 µg/mL蔗糖转化酶混合。以25℃ 400 rpm的条件振荡15 min。然后加入50 µL的0.5 M蔗糖溶液，以55℃ ，400 rpm的条件振荡20 min。反应结束后，使用PGM测定其葡萄糖示数。
如图2所示，为血糖仪对组①-⑤检测得到的示数，由图可知，大肠杆菌和纳米银无蔗糖转化酶活性。而蔗糖转化酶中加入PEI-AgNPs后，血糖仪示数明显降低，表明PEI-AgNPs对蔗糖转化酶有抑制作用。而在大肠杆菌存在下，其血糖仪示数得到恢复，这是由于大肠杆菌与蔗糖转化酶形成竞争性反应，从而由纳米银-酶复合体系中释放出来，使蔗糖转化酶的活性得到恢复，促进蔗糖水解为葡萄糖。
对细菌与纳米银-酶复合物体系反应时间, 反应温度和pH进行优化，结果如图3所示。其最优检测条件为细菌与纳米银-酶复合物体系反应时间为15min，反应温度为55℃，pH为5。
配制不同浓度的大肠杆菌溶液和不同浓度的金葡萄球菌，在最优检测条件下采用上述过程进行检测，结果如图4所示，大肠杆菌和金葡萄球菌的含量与血糖仪的示数形成很好地线性拟合关系，金黄色葡萄球菌线性检测范围为103 cfu/mL-107 cfu/mL，大肠杆菌线性检测范围为102 cfu/mL-107 cfu/mL。
进一步地，如表1所示，使用过滤后的自来水，作为模拟样品，其中加入103-105 cfu/mL细菌，使用上述检测流程对其进行检测。大肠杆菌回收率为94.73%-106.45%，金黄色葡萄球菌回收率为93.93%-113.33%。由此证实该方法具有潜在的实际应用价值。
表1 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的回收率
Figure 610592DEST_PATH_IMAGE001
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于包括以下步骤：将纳米银溶液、待测液体、蔗糖转化酶混合反应后，加入蔗糖溶液进行反应，检测反应体系中的葡萄糖含量。
2.根据权利要求1所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：所述纳米银溶液为以水溶性高聚物为稳定剂的纳米银溶液。
3.根据权利要求2所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：所述水溶性高聚物为聚乙烯亚胺。
4.根据权利要求3所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于，所述纳米银溶液的制备过程如下：将水溶性还原剂与水溶性银盐反应得到含有纳米银的溶液，然后与聚乙烯亚胺溶液反应，得到聚乙烯亚胺修饰的纳米银溶液。
5.根据权利要求1所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：加入蔗糖溶液后反应时间为10-20min，反应温度为50-60℃，pH为4.5-5.5。
6.根据权利要求5所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：加入蔗糖溶液后反应时间为15min，反应温度为55℃，pH为5。
7.根据权利要求6所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：该方法用于检测大肠杆菌，大肠杆菌线性检测范围为102 cfu/mL-107 cfu/mL。
8.根据权利要求6所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：该方法用于检测金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌线性检测范围为103 cfu/mL-107cfu/mL。
9.根据权利要求1-8任一项所述的利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法，其特征在于：通过血糖仪检测反应体系中的葡萄糖含量。
10.一种细菌检测试剂盒，其特征在于：包括纳米银溶液、蔗糖转化酶。
CN202011141174.1A 2020-10-22 2020-10-22 一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒 Active CN112322698B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011141174.1A CN112322698B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011141174.1A CN112322698B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112322698A true CN112322698A (zh) 2021-02-05
CN112322698B CN112322698B (zh) 2021-10-15

Family

ID=74311376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011141174.1A Active CN112322698B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112322698B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104490927A (zh) * 2014-12-12 2015-04-08 江苏大学 纳米银复合材料及其制备方法与应用
CN104970050A (zh) * 2014-04-04 2015-10-14 林鸿明 一种蛋白酶-纳米银配合物及其应用
CN106153876A (zh) * 2016-09-06 2016-11-23 南京农业大学 一种利用血糖仪定量检测生物标识物的方法
CN111758741A (zh) * 2020-08-25 2020-10-13 清华大学 一种酶-纳米银抗菌复合物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104970050A (zh) * 2014-04-04 2015-10-14 林鸿明 一种蛋白酶-纳米银配合物及其应用
CN104490927A (zh) * 2014-12-12 2015-04-08 江苏大学 纳米银复合材料及其制备方法与应用
CN106153876A (zh) * 2016-09-06 2016-11-23 南京农业大学 一种利用血糖仪定量检测生物标识物的方法
CN111758741A (zh) * 2020-08-25 2020-10-13 清华大学 一种酶-纳米银抗菌复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHENZHEN WANG等: "Transmutation of Personal Glucose Meters into Portable and Highly Sensitive Microbial Pathogen Detection Platform", 《SMALL》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112322698B (zh) 2021-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Silverman et al. Studies on the chemoautotrophic iron bacterium Ferrobacillus ferrooxidans: I. An improved medium and a harvesting procedure for securing high cell yields
Niknezhad et al. Production of xanthan gum by free and immobilized cells of Xanthomonas campestris and Xanthomonas pelargonii
Payne et al. Some observations on the physiology of Pseudomonas natriegens nov. spec.
CN111366727B (zh) 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试剂盒及其制备方法
CN106995811B (zh) 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用
CN102943113B (zh) 大肠杆菌o157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
Qiao et al. Rapid and sensitive detection of E. coli O157: H7 based on antimicrobial peptide functionalized magnetic nanoparticles and urease-catalyzed signal amplification
CN111458516B (zh) 一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器及其制备方法
CN109294950B (zh) 高活性结冷胶寡糖产生菌及其应用
CN102146429B (zh) 溶藻弧菌选择性鉴别培养基
CN114317642A (zh) 制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用
CN104962544B (zh) 一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法
CN101186894B (zh) 阪崎肠杆菌选择性分离培养基
CN112322698B (zh) 一种利用纳米银-蔗糖转化酶复合物的细菌检测方法及试剂盒
Natsir et al. Isolation and identification of chitinolytic bacteria of pohara river of South East Sulawesi and the optimization production of chitinase enzyme
Kovaleva et al. Characteristics of inulinases: methods for regulation and stabilization of their activity
CN112869172A (zh) 一种具有益生菌特异性的微胶囊壁材及其制备方法与应用
CN108949854B (zh) 固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺
CN108441440B (zh) 一种蜡状芽孢杆菌116及其应用
CN106754829B (zh) 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用
CN110093297B (zh) 硝酸盐还原菌mcda3-3及其产几丁质脱乙酰酶的方法
JPH0574357B2 (zh)
CN110079475B (zh) 利用多种抗生素抑制杂菌的微生物发酵降解琼脂的方法
Sundarraj et al. Breakdown of chitin by Cytophaga johnsonii
CN109294949B (zh) 结冷胶裂解酶产生菌及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant