CN112322626A - 一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用 - Google Patents

一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG‑ODN及其应用，通过以筛选出11个CpG‑ODN片段，将筛选出的11个CpG‑ODN片段首尾相连形成含有许多以‑CG‑二核苷酸为一个CpG基元的DNA序列，命名为“Multi‑CpG”。将以‑GTCGTT‑作为一个CpG基元的DNA序列替换上述“Multi‑CpG”中长度相同的一段DNA序列，命名为“Multi‑CpG‑Mix”。将“Multi‑CpG”两个与“Multi‑CpG‑Mix”一个，进行首尾相连，获得含有两种免疫激活单元的DNA序列，命名为“Multi‑CpG‑Mixture”。将“Multi‑CpG‑Mixture”通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段构建重组质粒FVX‑Multi‑CpG‑Mixture。不仅能诱导猪体内天然免疫功能激活，还能激活猪体内对PRRSV的获得性免疫功能，提高猪体内对PRRSV的免疫反应诱发作用，降低PRRSV发病率，降低猪养殖成本。

Description

一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)的致病因子，是引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的新RNA病毒传染病病毒。PRRSV最早于1987年在美国发现，1991年荷兰人Wensvoot首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒，随后德国、美国、英国等也分离到了该病毒。目前，该病毒已遍及北美洲、欧洲，在全球范围内传播，且各地相继发生流行性感染，给养猪行业造成严重的经济损失。虽然，猪繁殖与呼吸综合征灭火病毒疫苗已经得到了广泛使用，但伴随有副作用，且仅有部分免疫保护作用，使得对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护效果不理想。
CpG基序(CpG motifs)是指一类以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤 (-CG-)二核苷酸为一个CpG基序的DNA序列，即就是免疫激活单元。大量研究表面：CpG基序是一种强有力的非特异性免疫刺激DNA序列，能够直接或间接激活T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞。将含有CpG基序的DNA称为CpG-DNA，将人工合成的含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核糖核苷酸(ODN)称为 CpG-ODN。经合成CpG-ODN进行试验研究，发现细菌DNA的免疫刺激作用，仅与其中具有特异性侧翼的非甲基化CpG核苷酸有关；与细菌DNA不同，哺乳动物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用。哺乳动物和其他脊椎动物DNA分子中CpG基序出现的频率很低，且 60-90％的CG基序中胞嘧啶第五碳原子发生甲基化。
在1995年，Arthur M.Krieg等人通过分析人工合成的不同序列 CpG-ODN的免疫刺激活性，得出：CpG-ODN需有一定的长度，在一个CpG-ODN中可以有一个或多个CpG基序，CpG基序两侧特异的嘌呤和嘧啶以及CpG基序之间相隔碱基的不同，都会影响CpG基序的免疫刺激类型和强度。因此，有研究者就猪先天性及获得性免疫的有效提升，提供了一种CpG-ODN以及含有该CpG-ODN的重组质粒、制剂，例如专利申请号为201910229571.5的对猪具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其作用中的报道，该报道中研究了CpG基序个数(含 -CG-基元个数)对CpG-ODN的免疫刺激作用和强度等。在“Zhu,H.F., Li,G.F.,Zhu,J.Z.,Lu,C.,Shao,G.Q.,Zhang,Z.S.,2003.Difference between immunostimulation activity of Kand D types of CpG oligodeoxynucleotides in peripheral blood mononuclearcells of porcine. Acta NanJing Med.Univ.23,542–544.”中报道：具有免疫激活作用的CpG基序还包括以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA序列： TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT。但是，对于同时含有两种免疫激活单元(-CG-基序和-GTCGTT-基序)的免疫刺激活性如何，目前还未见有相关报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种对 PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用。
具体是通过以下技术方案得以实现的：
本发明创造的目的之一在于提供对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对PRRSV具有特异性免疫刺激作用，能够诱导猪体内对猪繁殖与呼吸综合征的免疫免疫反应作用，降低猪繁殖与呼吸综合征发生率，降低养猪行业经济损失。
本发明创造的目的之二在于提供含有上述CpG-ODN的重组质粒，该重组质粒为FVX-CpG，其中所述FVX为载体，核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示，制备成本低，经XbaI和EcoRI两个酶切位点插入CpG-ODN，以基因合成手段构建而成。
本发明创造的目的之三在于提供上述CpG-ODN、重组质粒在制备治疗和/或预防PRRSV的制剂中的应用。
本发明创造的目的之四在于提供一种治疗和/或预防PRRSV的制剂，所述制剂含有上述重组质粒20-100ug/mL的PBS溶液。
为了实现上述各个目的，本发明创造是经以下操作方案予以实现的：
通过以筛选出11个CpG-ODN片段，将筛选出的11个CpG-ODN片段首尾相连形成含有许多以-CG-二核苷酸为一个CpG基元的DNA序列，命名为“Multi-CpG”。将以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA 序列：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT替换上述“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列，命名为“Multi-CpG-Mix”。
将“Multi-CpG”两个与“Multi-CpG-Mix”一个，进行首尾相连，获得含有两种免疫激活单元的DNA序列，命名为“Multi-CpG-Mixture”。
将“Multi-CpG-Mixture”通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段构建重组质粒FVX-Multi-CpG-Mixture。
将上述重组质粒与PBS溶液配制成制剂，该制剂不仅能够作为免疫激活剂，有效激活猪体内对PRRSV的天然免疫功能，替代或部分替代PRRSV治疗和/预防用抗生素；还能够有效地激活猪体内对PRRSV 的获得性免疫功能，可作为免疫佐剂，提高疫苗保护效果，减少PRRSV 的发病率，降低养殖成本。优选，所述制剂含有上述重组质粒40ug/mL 的PBS溶液。
优选地，所述制剂作为PRRSV免疫激活剂时，注射剂量为 0.3-0.5mL/kg；使用时，是在猪发病高峰期来临前一周，进行皮下注射给药，在一周后再给药一次。
优选地，所述制剂作为PRRSV免疫佐剂时，其注射剂量为 0.2-1mL/kg。直接与每一头猪使用疫苗混匀后给药，在给药一周后，再给药一次。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
①本发明创造的CpG-ODN能够对PRRSV具有特异性免疫刺激作用，不仅能诱导猪体内天然免疫功能激活，还能激活猪体内对PRRSV 的获得性免疫功能，提高猪体内对PRRSV的免疫反应诱发作用，降低 PRRSV发病率，降低猪养殖成本。
②本发明创造提供的含有CpG-ODN的制剂对机体毒副作用小，具有巨大潜力，能够广泛应用于生猪养殖业，降低生产成本，减少 PRRSV发病率，提高存活率和养殖效率。
附图说明
图1为CpG-ODN限制性酶切位点图。
图2为FVX载体限制性酶切位点图。
图3为CpG-ODN构建流程图。
图4为重组质粒构建流程图。
图5为双酶切验证结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，则是能够从商业途径直接获得的试剂或材料。
实施例
1、特异性CpG-ODN片段的筛选
筛选方法：按照常规技术，定向筛选CpG-ODN片段，结果如下表1所示。
表1筛选的CpG-ODN片段
Figure RE-GDA0002877205840000051
以上筛选的CpG-ODN片段是根据现有相关人员对相关序列研究基础上作出的筛选，例如：
C274参考文献为“Marshall,J.D.,Higgins,D.,Abbate,C.,et al. (2004).Polymyxin B enhances ISS-mediated immune responses across multiplespecies.Cellular Immunology,229,93–105.”和“Teleshova,N., Kenney,J.,Williams,V.,et al.(2006).CpG-C ISS-ODN activation of blood-derived B cells fromhealthy and chronic immunodeficiency virus-infected macaques.Journal ofLeukocyte Biology,79,257–267.”。
BCG-A4a参考文献为“Yamamoto,S.,Yamamoto,T.,Nojima,Y.,et al.(2002).Discovery of immunostimulatory CpG-DNA and its application to tuberculosisvaccine development.Japanese Journal of Infectious Disease,55,37–44.”。
ODN1681参考文献为“Jorgensen,J.B.,Johansen,L.H.,Steiro,K., et al.(2003).CpG DNA induces protective antiviral immune responses in Atlanticsalmon(Salmo salar L.).Journal of Virology,77, 11471–11479.”。
ODN K3和ODN2006P*参考文献为“Smith,R.L.,Chong,T.W., Hughes,M.G.,et al.(2004).Impact of immunomodulatory oligodeoxynucleotides on cytokineproduction in the lipopolysaccharide-stimulated human whole bloodmodel.Surgery,136, 464–472.”。
ODN2395参考文献为“Vollmer,J.,Weeratna,R.,Payette,P.,et al. (2004).Characterization ofthree CpG oligodeoxynucleotide classes with distinctimmunostimulatory activities.European Journal of Immunology, 34,251–262.”。
ODN1018P*参考文献为“Marshall,J.D.,Higgins,D.,Abbate,C., et al.(2004).Polymyxin B enhances ISS-mediated immune responses across multiplespecies.Cellular Immunology,229,93–105.”。
AACGTC-30参考文献为“Iho,S.,Yamamoto,T.,Takahashi,T.,et al. (1999).Oligodeoxynucleotides containing palindrome sequences with internal 50CpG-30act directly on human NK and activated T cells to induce IFN-gamma productionin vitro.Journal of Immunology,163, 3642–3652.”。
MB-4531-F14、MB-5519和MB-4531参考文献为“Lee,K.W.,Jung, J.,Lee,Y.,etal.(2006).Immunostimulatory oligodeoxynucleotide isolated from genome widescreening of Mycobacterium bovis chromosomal DNA.MolecularImmunology,43,2107–2118.”。
2、构建重组质粒
2.1替换对比构建
将筛选出来的CpG-ODN片段首尾相连以形成含有许多以-CG-二核苷酸为一个CPG基元的DNA序列为“Multi-CpG”，即免疫激活单元。
将在“Zhu,H.F.,Li,G.F.,Zhu,J.Z.,Lu,C.,Shao,G.Q.,Zhang,Z.S.,2003.Difference between immunostimulation activity of K and D types of CpGoligodeoxynucleotides in peripheral blood mononuclear cells of porcine.ActaNanJing Med.Univ.23,542–544.”中以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA序列： TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT替换上述“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列，命名为“Multi-CpG-Mix”。
将“Multi-CpG”两个与“Multi-CpG-Mix”一个，进行首尾相连，获得含有两种免疫激活单元的DNA序列，命名为“Multi-CpG-Mixture”。
将“Multi-CpG”、“Multi-CpG-Mix”和“Multi-CpG-Mixture”分别通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX(序列如SEQ ID NO：2所示)中，以基因合成的手段分别构建重组质粒：FVX-Multi-CpG、FVX-Multi-CpG-Mix和FVX- Multi-CpG-Mixture。
2.2筛选构建
将“Multi-CpG”、“Multi-CpG-Mix”经首尾相连形成含有两种CpG 基元的DNA序列，再将该CpG基元的DNA序列通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX中，以基因合成的手段构建重组质粒FVX-CpG，并通过测序验证。具体构建结果如下表2所示：
表2
Figure RE-GDA0002877205840000081
该构建以“Multi-CpG”和“Multi-CpG-Mix”交替首尾连接。
2.3配制制剂
将重组质粒：FVX-Multi-CpG、FVX-Multi-CpG-Mix和FVX-CpG1 至FVX-CpG9分别与无菌PBS溶液配制成对应重组质粒编号的制剂，其中重组质粒含量为40ug/mL；所采用的无菌PBS溶液含重量百分比计为0.4％NaCl，0.05％KCl，0.0213％Na2HPO4，0.029％KH2PO4，余量去离子水。无菌PBS溶液制备方法是将向水中加入氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾搅拌至溶解后，加水定量至1L，置于常压灭菌锅内，于120℃下灭菌处理30min，即可。
3、试验研究
3.1毒性研究
选择10日龄健康小白鼠55只，随机分为11组，每组5只，每只小白鼠注射含重组质粒的制剂0.5mL/kg，并对小白鼠按照常规饲养方法进行饲喂，饲喂50d后，观察小白鼠死亡率和组织病变情况，其结果如下表3所示：
表3
Figure RE-GDA0002877205840000082
Figure RE-GDA0002877205840000091
由表3结果显示：重组质粒：FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG 和FVX-CpG-1至FVX-CpG-9组小白鼠死亡率均为零，且经组织解剖未发现有明显的病变，各组小白鼠活泼好动，可见，各组对小白鼠安全无毒害。
3.2细胞学试验研究
以10-20日龄长白猪种的淋巴细胞作为试验细胞(PBMC)，采用编号为重组质粒：FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG和FVX-CpG-1 至FVX-CpG-9制剂作为免疫刺激制剂，以猪繁殖与呼吸综合征病毒作为病原菌，分析猪免疫活性因子IP-10和IFN-γ的表达情况，其结果如表4所示：
表4：PRRSV感染猪PBMC后FVX-CpG制剂对IP-10、IFN-γ诱导效果
Figure RE-GDA0002877205840000092
由表4结果显示，FVX-CpG-2组能够显著提升免疫活性因子IFN- γ和IP-10的表达，具备良好的抗PRRSV感染的作用，具有良好的先天性免疫提升能力。
3.3免疫性保护动物试验研究
3.3.1先天性免疫试验
取健康，且体重约5kg的长白猪种77头，随机分成11组，每组7 头，各组饲养情况均相同，并作为试验对象。采用编号为重组质粒： FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG和FVX-CpG-1至FVX-CpG-9制剂作为免疫刺激，皮下肌肉注射0.3mL/kg，7d后，再采用相同的制剂再次注射。在第二次注射结束后，采用PRRSV给每头仔猪皮下接种病毒，在接种一周后，测定每组特异抗体滴度值log2 (X)值，其结果如下表5所示：
表5 7d后的特异抗体滴度值log2 (X)值
Figure RE-GDA0002877205840000101
3.3.2获得性免疫试验
取健康，且体重约5kg的长白猪种33头，随机分成11组，每组3 头，各组饲养情况均相同，并作为试验对象。采用编号为重组质粒： FVX-Multi-CpG-Mix、FVX-Multi-CpG和FVX-CpG-1至FVX-CpG-9制剂作为疫苗佐剂，从市场上购买现有PRRSV活疫苗(VR2332株疫苗) 作为试验用疫苗，注射FVX-CpG+疫苗制剂，皮下肌肉注射0.3mL/kg， 7d后，抽取血样5mL，对阳性血清进行稀释，ELISA反应，测定每组特异抗体滴度值log2 (X)值，其结果如下表6所示：
表6 7d后的特异抗体滴度值log2 (X)值
Figure RE-GDA0002877205840000102
Figure RE-GDA0002877205840000111
3.3.3结论
从表5和表6结果显示可见，重组质粒FVX-CpG-2组制剂在预防和治疗方面具有较好的效果。
为了更大程度的探索两种免疫刺激活性单元的重组质粒中各种免疫刺激活性单元相对位置对免疫刺激活性的影响，研究者进一步作出了以下构建试验研究：
构建重组质粒：含两个Multi-CpG和一个Multi-CpG-Mix。具体顺序如表7所示：
表7
Figure RE-GDA0002877205840000112
将表7所述构建DNA序列通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入多拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX(序列如SEQ ID NO：2所示)中，以基因合成的手段分别构建重组质粒；将构建的重组质粒按照上述制剂配制方法，并按照上述试验研究进行毒性研究(表8)、细胞学试验研究(表9)、及免疫性保护动物试验研究(先天性免疫试验(表10)、获得性免疫试验(表11))，其试验结果分别见表8-11所示。
表8
Figure RE-GDA0002877205840000113
由表8结果显示：重组质粒：FVX-CpG-2、FVX-CpG-2.1和 FVX-CpG-2.2组小白鼠死亡率均为零，且经组织解剖未发现有明显的病变，各组小白鼠活泼好动，可见，各组对小白鼠安全无毒害。
表9
Figure RE-GDA0002877205840000121
由表9结果显示，FVX-CpG-2.2组能够一定程度提升免疫活性因子IFN-γ和IP-10的表达，且该组经测序：其核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示；表明：含核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的重组质粒 FVX-CpG-2.2具备良好的抗PRRSV感染的作用，具有良好的先天性免疫提升能力。
表10
Figure RE-GDA0002877205840000122
表11
Figure RE-GDA0002877205840000123
由表10和表11结果显示可见，FVX-CpG-2.2组制剂在预防和治疗方面具有较好的效果；且该组经测序：其核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示；表明：含核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的重组质粒 FVX-CpG-2.2具备良好的抗PRRSV感染的作用，具有良好的先天性免疫提升能力。
最后，需要说明的是，本发明创造是基于现有生物基因工程技术基础上，经人工筛选CpG-ODN片段，将筛选出来的11条CpG-ODN片段经首尾连接形成多个以-CG-二核苷酸为一个CPG基元的DNA序列的免疫激活单元(Multi-CpG)；再经现有技术研究所得的以-GTCGTT-作为一个CpG基元的DNA序列替换上述“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列的免疫激活单元；并对以-GTCGTT-作为一个CpG基元的 DNA序列替换“Multi-CpG”中长度相同的一段DNA序列不同基元个数形成含有不同数量的以-GTCGTT-作为一个CpG基元的免疫激活单元的DNA序列(Multi-CpG-Mix)；将一个或多个Multi-CpG与一个或多个Multi-CpG-Mix经首尾连接形成DNA序列，获得含有Multi-CpG 和Multi-CpG-Mix两种免疫激活单元的特异性免疫激活单元 (Multi-CpG-Mixture)；通过XbaI和EcoRI两个酶切位点插入高拷贝克隆载体Puc19衍生载体FVX(序列如SEQ ID NO：2所示)中，以基因工程合成手段构建含有相应免疫激活单元的重组质粒，并经试验研究获得。对于其他未尽事宜，本领域技术人员参照现有技术中所公开的技术手段，或者本领域技术人员所熟知的公知常识或者常规技术手段加以实现即可。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种对PRRSV具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的CpG-ODN。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为FVX-CpG，其中所述FVX为载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.如权利要求1所述CpG-ODN、权利要求2或3所述的重组质粒在制备治疗和/或预防PRRSV的制剂中的应用。
5.一种治疗和/或预防PRRSV的制剂，其特征在于，所述制剂含有如权利要求2或3所述重组质粒20-100ug/mL的PBS溶液。
6.如权利要求5所述制剂，其特征在于，所述制剂作为PRRSV免疫激活剂时，注射剂量为0.3-0.5mL/kg；所述制剂作为PRRSV免疫佐剂时，其注射剂量为0.2-1mL/kg。
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