CN112321662A - 一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，该方法以复合中性蛋白酶酶解、多孔共价有机框架材料COF‑LZU1富集、多频超声辅助提取的工艺模式，通过优化上样液、洗脱液和超声频率等参数，实现了对灵芝中总三萜的高效选择性富集。该方法具有稳定性好、选择性高、吸附量大、操作简便可控等优点，可用于各种复杂样品中总三萜的纯化富集。
Description
技术领域
本发明涉及一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，属于天然有机化学领域。
背景技术
灵芝是孔菌科真菌灵芝的子实体，为我国传统的药食兼用的大型真菌，其孢子、菌丝和子实体均可利用。近20年来，国内外大量的研究结果证明灵芝具有广泛的药理作用，且毒性极低，这与中医药学和现代医学对灵芝的疗效和毒副作用的认识是一致的。灵芝三萜化合物是从灵芝中分离出来的一类具有生物活性的成分，具有较强的生理活性，能够增强免疫力、延缓衰老、抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇等。灵芝的三萜类成份复杂，有100多种，分为五环三萜和四环三萜，不同的三萜溶于不同质量分数的乙醇，现有技术中对于灵芝有效成份的提取方法比较单一，而且有效成分的提取不够全面。采用常规提取方法提取的灵芝提取物，三萜含量极低。要实现灵芝中三萜的提取浓缩，并且尽可能地去除无效杂质以纯化制剂，提取分离技术至关重要。
发明内容
本发明的技术任务是为了弥补现有技术的不足，提供一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，该方法耗时短、成本低、操作简单，具有很好的工业前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)将除杂后的灵芝在60℃下烘干后粉碎，过40目筛网，得到灵芝干粉；
(2)向灵芝干粉中加入去离子水，去离子水是桑黄干粉质量的5-10倍，混合均匀，再按灵芝干粉质量的0.2～1.0％加入复合中性蛋白酶，在45～55℃下酶解30～90分钟，酶解液经离心分离得到上清液和沉淀物；
(3)在步骤(2)中上清液中加入共价有机框架材料COF-LZU1，其添加量为桑黄干粉质量的1％，进行多频超声萃取，经离心分离得到COF-LZU1富集材料；
(4)COF-LZU1富集材料置于离心管中，加入洗脱液，超声振荡1分钟，经离心分离得到上清液和COF-LZU1；上清液经旋转蒸发仪减压浓缩后得到总三萜产品。
所述复合中性蛋白酶，由胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶质量比为3：1～1：3。
所述共价有机框架材料COF-LZU1，由1，4-对苯二胺与1，3，5-均三苯甲醛在醋酸催化下于120℃聚合得到,比表面积是410m2g-1，孔径为1.2nm，孔体积为0.54cm3g–1，在300℃高温条件下可以保持其组成和结晶度，其结构式如下：
所述多频超声萃取，超声频率为20-80kHz，两两组合或三种同时组合，超声处理功率为 100-1000W，萃取时间为30-300s。
所述离心分离，在700～2000rpm下离心10～30min。
所述洗脱液，由乙醇、碳酸二甲酯、柠檬烯、乙酸乙酯中的一种或二种及以上混合；洗脱液添加量为COF-LZU1富集材料质量的2～5倍。
所述超声振荡,超声频率为25kHz，超声处理功率为600W。
所述总三萜产品为含有灵芝萜酮三醇(图1a)、过氧化麦角甾醇(图1b)、麦角甾醇(图 1c)、灵芝醇A(图1d)、灵芝醇D(图1e)、灵芝醇F(图1f)的混合物；提取率为60-70％。
相对于现有技术，本发明所述的从灵芝中纯化提取总三萜的方法具有以下优势：
(1)本发明在灵芝的总三萜提取中加入了多频超声协同提取方法，显著缩短提取时间，减少溶剂用量，提高提取率；且得到的总三萜提取物纯度高，无需后续分离处理，提取物具有广阔的药用和食用的应用前景。
(2)COF-LZU1是由轻质元素C和N连接而成的高度有序多孔晶态材料，具有低的密度和高的比表面积(410m2g-1)，在300℃高温条件下也可以稳定存在，其作为富集材料可反复循环利用；孔体积为0.54cm3g–1，孔道内含有π电子共轭体系，对总三萜化合物具有高的选择性吸附性能；与其他多孔性吸附材料相比，具有无法比拟的优势。
附图说明
图1是提取的总三萜产品种类，图1a为灵芝萜酮三醇、图1b为过氧化麦角甾醇、图1c为麦角甾醇、图1d为灵芝醇A、图1e为灵芝醇D、图1f为灵芝醇F。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义，所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法
(1)将除杂后的灵芝在60℃下烘干后粉碎，过40目筛网，得到灵芝干粉；
(2)向灵芝干粉中加入去离子水，去离子水是桑黄干粉质量的5倍，混合均匀，再按灵芝干粉质量的0.2％加入复合中性蛋白酶，在55℃下酶解90分钟，酶解液经离心分离得到上清液和沉淀物；
(3)在步骤(2)中上清液中加入共价有机框架材料COF-LZU1，其添加量为桑黄干粉质量的1％，进行多频超声萃取，经离心分离得到COF-LZU1富集材料；
(4)COF-LZU1富集材料置于离心管中，加入洗脱液，超声振荡1分钟，经离心分离得到上清液和COF-LZU1；上清液经旋转蒸发仪减压浓缩后得到总三萜产品；
所述复合中性蛋白酶，由胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶质量比为3：1；
所述共价有机框架材料COF-LZU1，由1，4-对苯二胺与1，3，5-均三苯甲醛在醋酸催化下于120℃聚合得到,比表面积是410m2g-1，孔径为1.2nm，孔体积为0.54cm3g–1，在 300℃高温条件下可以保持其组成和结晶度，其结构式如下：
所述多频超声萃取，超声频率为20kHz和80kHz同时组合，超声处理功率为1000W，萃取时间为30s；
所述离心分离，在2000rpm下离心10min；
所述洗脱液，由乙醇和柠檬烯混合；洗脱液添加量为COF-LZU1富集材料质量的2倍；
所述超声振荡,超声频率为25kHz，超声处理功率为600W。
实施例2一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法
(1)将除杂后的灵芝在60℃下烘干后粉碎，过40目筛网，得到灵芝干粉；
(2)向灵芝干粉中加入去离子水，去离子水是桑黄干粉质量的10倍，混合均匀，再按灵芝干粉质量的1.0％加入复合中性蛋白酶，在45℃下酶解30分钟，酶解液经离心分离得到上清液和沉淀物；
(3)在步骤(2)中上清液中加入共价有机框架材料COF-LZU1，其添加量为桑黄干粉质量的1％，进行多频超声萃取，经离心分离得到COF-LZU1富集材料；
(4)COF-LZU1富集材料置于离心管中，加入洗脱液，超声振荡1分钟，经离心分离得到上清液和COF-LZU1；上清液经旋转蒸发仪减压浓缩后得到总三萜产品；
所述复合中性蛋白酶，由胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶质量比为1：3；
所述共价有机框架材料COF-LZU1，由1，4-对苯二胺与1，3，5-均三苯甲醛在醋酸催化下于120℃聚合得到,比表面积是410m2g-1，孔径为1.2nm，孔体积为0.54cm3g–1，在300℃高温条件下可以保持其组成和结晶度，其结构式如下：
所述多频超声萃取，超声频率为30kHz和70kHz同时组合，超声处理功率为100W，萃取时间为300s；
所述离心分离，在700rpm下离心30min；
所述洗脱液，由乙醇和碳酸二甲酯混合；洗脱液添加量为COF-LZU1富集材料质量的5 倍；
所述超声振荡,超声频率为25kHz，超声处理功率为600W。
实施例3一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法
(1)将除杂后的灵芝在60℃下烘干后粉碎，过40目筛网，得到灵芝干粉；
(2)向灵芝干粉中加入去离子水，去离子水是桑黄干粉质量的7.5倍，混合均匀，再按灵芝干粉质量的0.6％加入复合中性蛋白酶，在50℃下酶解60分钟，酶解液经离心分离得到上清液和沉淀物；
(3)在步骤(2)中上清液中加入共价有机框架材料COF-LZU1，其添加量为桑黄干粉质量的1％，进行多频超声萃取，经离心分离得到COF-LZU1富集材料；
(4)COF-LZU1富集材料置于离心管中，加入洗脱液，超声振荡1分钟，经离心分离得到上清液和COF-LZU1；上清液经旋转蒸发仪减压浓缩后得到总三萜产品；
所述复合中性蛋白酶，由胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶质量比为1：1；
所述共价有机框架材料COF-LZU1，由1，4-对苯二胺与1，3，5-均三苯甲醛在醋酸催化下于120℃聚合得到,比表面积是410m2g-1，孔径为1.2nm，孔体积为0.54cm3g–1，在 300℃高温条件下可以保持其组成和结晶度，其结构式如下：
所述多频超声萃取，超声频率为20kHz，50kHz和80kHz同时组合，超声处理功率为500W，萃取时间为180s；
所述离心分离，在1400rpm下离心20min；
所述洗脱液，由乙醇和乙酸乙酯中混合；洗脱液添加量为COF-LZU1富集材料质量的3.5 倍；
所述超声振荡,超声频率为25kHz，超声处理功率为600W。
实施例4共价有机框架材料COF-LZU1的制备方法
(1)将1，3，5-均三苯甲醛(0.3200g)溶解于1,4-二恶烷(20ml)中；然后加入 1，4-对苯二胺(0.3200g)，搅拌，超声处理，得到澄清的溶液；
(2)往溶液中加入醋酸(3M,0.4mL)，室温静置3天，得到沉淀；
(3)用丙酮和乙醇分别洗涤3次，在120℃真空条件下干燥12h；产率为80％；循环利用的共价有机框架材料COF-LZU1需要在120℃真空条件下活化12h。
Claims (7)
1.一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将除杂后的灵芝在60℃下烘干后粉碎，过40目筛网，得到灵芝干粉；
(2)向灵芝干粉中加入去离子水，去离子水是桑黄干粉质量的2-5倍，混合均匀，再按灵芝干粉质量的0.2～1.0％加入复合中性蛋白酶，在45～55℃下酶解30～90分钟，酶解液经离心分离得到上清液和沉淀物；
(3)在步骤(2)中上清液中加入共价有机框架材料COF-LZU1，其添加量为桑黄干粉质量的1％，进行多频超声萃取，经离心分离得到COF-LZU1富集材料；
(4)COF-LZU1富集材料置于离心管中，加入洗脱液，超声振荡1分钟，经离心分离得到上清液和COF-LZU1；上清液经旋转蒸发仪减压浓缩后得到总三萜产品。
2.根据权利要求1所述的一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，其特征在于：所述复合中性蛋白酶，由胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶组成，其中，胰蛋白酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶质量比为3：1～1：3。
3.根据权利要求1所述的一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，其特征在于：所述共价有机框架材料COF-LZU1，由1，4-对苯二胺与1，3，5-均三苯甲醛在醋酸催化下于120℃聚合得到,比表面积是410m2g-1，孔径为1.2nm，孔体积为0.54cm3g–1，在300℃高温条件下可以保持其组成和结晶度，其结构式如下：
4.根据权利要求1所述的一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，其特征在于：所述多频超声萃取，超声频率为20-80kHz，两两组合或三种同时组合，超声处理功率为100-1000W，萃取时间为30-300s。
5.根据权利要求1所述的一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，其特征在于：所述离心分离，在700～2000rpm下离心10～30min。
6.根据权利要求1所述的一种从灵芝中纯化提取总三萜的方法，其特征在于：所述洗脱液，由乙醇、碳酸二甲酯、柠檬烯、乙酸乙酯中的一种或二种及以上混合；洗脱液添加量为COF-LZU1富集材料质量的2～5倍。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超声振荡,超声频率为25kHz，超声处理功率为600W。
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| CN114716502A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-07-08 | 菏泽学院 | 一种桑黄三萜类化合物的提取方法 |
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