CN112316218A - 一种两性离子聚合物与肝素复合涂层和制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种两性离子聚合物与肝素复合涂层和制备方法及其应用，包括介导层、两性离子聚合物层和肝素抗凝血层。涂层构建包括：将需要涂覆改性的物体浸入仿生万能粘附分子的水溶液中，在物体表面形成具有表面氨基/羟基的介导层；然后浸入两性离子聚合物溶液中形成多重酰胺键锚定涂层；最后在肝素溶液中与表面剩余的氨基发生酰胺化反应接枝肝素。在仿生粘附的介导层表面使仿生粘附介导层形成交联结构，显著提高了复合涂层的稳定性及血液相容性。在多重酰胺键锚定的两性离子聚合物表面共价键锚定肝素分子，具有优异的抗凝血活性。本发明适用于多种材料及各种形状器件表面直接构建涂层，可获得长期稳定的抗凝血及抗生物污染性能。

Description

一种两性离子聚合物与肝素复合涂层和制备方法及其应用
技术领域
本发明属于抗凝血、抗生物污染材料及医疗器械表面改性领域，涉及一种抗凝血及抗生物污染的血液相容性涂层，具有抗血栓形成和抗生物成分粘附污染的功能材料涂层及其制备方法。
背景技术
由多种高分子材料构成的血液透析系统、体外膜肺氧合系统、人工血管及各种导管，在挽救生命的同时，也对血液及人体健康造成危害。这些材料与血液接触后，血液中的蛋白质很快在表面吸附变性、激活，诱导血小板粘附、聚集及激活，引发内源性凝血级联反应形成血栓，导致治疗失败并危害健康。另外，医用导管在介入、使用及留置过程中，常引起细菌粘附、增值形成细菌膜，发生医疗感染事故危及生命。因此，在生物医用高分子导管表面，特别是在氧合器及血液透析器的中空纤维膜表面构建抗凝血涂层，抑制血栓形成及细菌粘附意义重大。
在医用导管及中空纤维膜表面构建肝素抗凝血涂层，研究及应用的报道较多，其中肝素涂层及仿细胞膜磷酰胆碱聚合物涂层技术已经有商业应用。由于将水溶性好、在水溶液中带较多负电荷的肝素分子稳定结合在疏水性强、化学惰性的有机高分子材料表面非常困难，现有的肝素涂层方法是在这些材料表面先通过疏水作用吸附一层既有疏水性又有可反应基团或正电荷的聚合物过渡层，然后将肝素通过静电吸附或共价键结合形成肝素涂层。这些基于吸附作用较弱的过渡层结合的肝素涂层在导管插入或血流冲刷过程中因结合稳定性差容易发生溶解及脱落，导致抗凝性能在短时间内急剧降低。与此同时，这种快速溶解或脱落的肝素进入血液后，容易引起出血、血小板减少症等不良反应。另外，还包括涂层较厚会降低改性后真空纤维膜血液透析或氧合的效率；依靠疏水作用结合的过渡层在构建时使用低表面能溶液会渗入氧合膜孔道内部，从而降低膜孔憎水性而增加血液渗漏风险；带负电荷的肝素涂层及部分肝素脱落后涂层的血液相容性不理想，发生血液蛋白质及血小板粘附引发凝血及血栓。
目前报道及商业应用的仿细胞膜磷酰胆碱(PC)聚合物涂层技技术，是将具有亲水亲油的两亲性PC聚合物用有机溶剂溶解后涂覆在医用导管及中空纤维膜表面，溶剂挥发后形成不溶于水的PC聚合物涂层。这种涂层改性中空纤维膜表面时，因有机溶剂溶液会渗透到中空纤维膜的膜孔内部，形成PC聚合物涂层而降低膜孔的憎水性，从而增大血液氧合过程中血液经膜壁微孔渗漏的风险。
因此，如何实现在水溶液中构建超薄、结合稳定的抗凝血涂层，同时尽可能降低或阻止亲水性及两亲性聚合物对真空纤维膜管壁微孔通道憎水性的影响，已经成为膜式氧合器、血液透析器，特别是长期使用的体外膜肺氧合(ECMO)生命支持系统抗凝血涂层必须解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种具有良好血液相容性的抗生物污染两性离子聚合物与抗凝血效果良好的肝素形成的复合涂层，通过生物惰性的两性离子聚合物与生物活性的肝素两种抗凝血作用的结合，使复合涂层的抗凝血效果更高效持久。
本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法。通过两性离子聚合物与肝素复合涂层仅在材料表面结合，不会进入材料憎水性微孔中。
本发明所要解决的技术问题之三在于，提供一种两性离子聚合物与肝素复合涂层在生物医学工程领域的应用。
本发明是通过下述技术方案来实现的。
为解决上述技术问题之一，本发明的两性离子聚合物与肝素复合涂层，包括介导层、两性离子聚合物层和肝素抗凝血层。
所述介导层为被涂覆的材料表面粘附有由仿生万能粘附材料A与交联剂B按照质量比为10:1～3:2的聚合物层。
所述介导层表面多点锚定有两性离子聚合物层，在所述两性离子聚合物层层表面共价键结合有肝素抗凝血层。
具体的，所述介导层中仿生万能粘附材料A为多巴胺盐酸盐或多巴盐酸盐；交联剂B为γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙基硅烷、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸的一种或两种的混合物。
具体的，所述两性离子聚合物具有如下通式(I)结构：
Figure BDA0002743084180000031
式中R1和R2为H或CH3，R3为氧杂碳链连接的两性离子基团，R4为氧杂碳链连接的羧基；
所述两性离子包括磷酰胆碱(PC)、磺酸甜菜碱(SB)或羧酸甜菜碱(CB)。
具体的，所述两性离子聚合物层层厚度为2～10纳米。
具体的，所述肝素抗凝血层为肝素钠的水溶液在两性离子聚合物层表面结合形成的涂层，其中肝素钠的分子量为4000～10000，肝素抗凝血层表面肝素含量不低于0.2μg/cm2。
进而，为解决上述技术问题之二，本发明的两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法，包括以下步骤：
(1)将仿生万能粘附材料A与交联剂B按照质量比为A:B＝10:1～3:2混合配制为A+B水溶液，被改性材料浸没于所述水溶液中，得到介导层；
(2)按照质量比1:2:2～1:3:4将两性离子聚合物与催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS配制成聚合物锚定溶液，在25-60℃下将涂覆有介导层的改性材料浸没于聚合物锚定溶液中2-24小时；形成两性离子聚合物层；
(3)将步骤(2)形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于2-10mg/mL肝素钠与催化剂EDC和NHS质量比为1:2:2～1:3:4的水溶液中1-24小时；形成附着有肝素抗凝血层的改性材料。
具体的，所述步骤(1)中，介导层在室温下不添加氧化剂的pH 7～9的A+B水溶液中制备；或在含有氧化剂、pH 4～7的A+B水溶液中制备；所述氧化剂包括高碘酸钠、双氧水、过硫酸钠、高锰酸钾或次氯酸钠。
具体的，所述步骤(2)和(3)中，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS催化的水溶液或乙醇水溶液中制备。
具体的，所述步骤(2)和(3)中，浸入介导层改性的材料反应1～10分钟即可取出，将改性材料与涂层表面粘附少量反应液体一起密封在小容器或密封袋中，分别在50℃或20℃继续反应6～24小时，水洗后真空干燥。
为解决上述技术问题之三，本发明的仿生粘附介导两性离子聚合物与肝素复合涂层，由于其介导层具有仿贻贝万能粘附的特性，可以方便地应用于包括在医用导管、插管、血液透析器、氧合器、离心泵头、血管支架、心脏瓣膜等与体液及血液接触的生物医用材料及器件表面应用。在水溶液中完成对各种材料及形状大小器件的表面涂覆。在仿贻粘附牢固结合在材料表面的介导层表面，多点锚定两性离子聚合物及共价结合肝素形成的复合涂层具有良好的稳定性，可以在体内血流冲刷及组织挤压环境中长期稳定工作。
本发明特别适合对涂层厚度有严格限制的血液氧合器及血液透析器中空纤维膜表面的涂覆改性，获得超薄(10～20nm)、几乎不影响膜孔大小及物质交换效率、抗生物粘附效果及血液相容性良好的两性离子聚合物与肝素复合涂层。
本发明特别适合于聚丙烯(PP)及聚甲基戊烯(PMP)中空纤维膜血液氧合器抗凝血涂层制备。借助水溶液中构建的仿生粘附介导层共价结合亲水性两性离子聚合物与肝素复合涂层的方法，可彻底解决涂覆两亲性聚合物方法使用低表面能溶液对憎水性膜孔的渗透引起血液渗漏的问题。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为构建两性离子聚合物与肝素复合涂层的结构示意图。包括仿生万能粘附分子聚合粘附形成的介导层、多点锚定的两性离子聚合物涂层、以及其表面共价键接枝的肝素层。
图2为PVC管表面通过仿贻贝万能粘附的聚多巴胺-PEI介导层构建两性离子聚合物与肝素复合涂层(PVC/PDA-PEI/PMPCC10/Hep)样品，在苯甲胺蓝染色前后的颜色变化照片。
图3为肝素(Hep)、两性离子聚合物(PMPCC10)及PMPCC10/Hep复合涂层改性的PMP中空纤维膜样品在全血中浸泡不同时间后表面形成血栓的显微镜照片。
图4为PMP、PMP/Hep、PMP/PMPCC10及PMP/PMPCC10/Hep样品对凝血酶灭活的百分率。
图5为肝素(Hep)、两性离子聚合物(PMPCC10)及PMPCC10/Hep复合涂层改性的PVC导管表面粘附血小板的扫描电镜照片。
图6为聚丙烯中空纤维膜氧合器分别用PDA-PEI/PMPCC10在水溶液中涂覆及两亲性聚合物(PMBT)在乙醇溶液中涂覆改性后，发生水渗漏的压力差变化图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。所描述的实施例是本发明的一部分实施例，不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动所得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，为构建两性离子聚合物与肝素复合涂层的结构示意图，本发明的两性离子聚合物与肝素复合涂层，包括介导层、两性离子聚合物层和肝素抗凝血层三层结构。介导层是由仿生万能粘附分子聚合粘附形成的，在介导层表面多点锚定的两性离子聚合物层、以及在两性离子聚合物层表面共价键接枝有肝素抗凝血层。
其中，介导层为被涂覆的材料表面聚合粘附有由仿生万能粘附材料A与交联剂B按照质量比为10:1～3:2的聚合物层；仿生万能粘附材料A为多巴胺盐酸盐或多巴盐酸盐；交联剂B为γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙基硅烷、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸的一种或两种的混合物。
两性离子聚合物为含有羧基侧链及两性离子侧链的随机共聚物(I)，在含水溶液中与介导层表面氨基之间通过多个共价键锚定形成稳定的聚物(I)超薄层；其中的两性离子包括磷酰胆碱(PC)、磺酸甜菜碱(SB)和羧酸甜菜碱(CB)。多点锚定的两性离子聚合物超薄涂层，在含水环境中形成具有细胞外层膜卵磷脂层两性离子基团强亲水的水合结构及生物惰性界面，赋予仿细胞膜界面优异的抗污染性能及血液相容性。
介导层表面多点锚定的两性离子聚合物具有如下通式(I)结构：
Figure BDA0002743084180000061
式中R1和R2为H或CH3，R3为氧杂碳链连接的两性离子基团，R4为氧杂碳链连接的羧基。两性离子聚合物层为公开号为CN108822326A中记载的涂层。
两性离子聚合物涂层厚度为2～10纳米。
在两性离子聚合物层层表面共价键结合的肝素抗凝血层为肝素钠的水溶液在两性离子聚合物层表面结合形成的涂层，其中肝素钠的分子量为4000～10000，肝素抗凝血层表面肝素含量为≥0.2μg/cm2。
本发明的两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，提供介导层，将仿生万能粘附材料A与交联剂B按照质量比为A:B＝10:1～3:2混合配制为A+B水溶液，被改性材料浸没于水溶液中，得到介导层。
介导层中仿生万能粘附材料A的主要成分为含有邻苯二酚基团的多巴胺盐酸盐或多巴盐酸盐，容易被氧化聚合的仿生粘附分子。仿生粘附分子在水溶液中会被溶解的氧气或添加的氧化剂氧化聚合，自动形成粘附于材料表面并可以进行再修饰的涂层。在水溶液中因粘附分子难以进入材料憎水的微小孔道内部，不会影响微孔道内部的疏水性及化学惰性。交联剂B为γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙基硅烷、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸的一种或两种的混合物。
该介导层可粘附修饰的材料包括金属、玻璃、聚丙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚氨酯等不同组成及形状结构的材料表面。如常用的聚氯乙烯(PVC)导管在含多巴胺盐酸盐和聚乙烯亚胺(PEI)水溶液中于室温下在PVC表面自动形成具有交联结构的聚多巴胺PDA-PEI介导涂层(PVC/PDA-PEI)。
仿生粘附分子溶液中可加入γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸作为交联剂来增强介导层的稳定性，同时提高步骤(2)锚定反应的活性位点。如常用的聚氯乙烯(PVC)导管在含多巴胺盐酸盐和PEI水溶液中于室温下在PVC表面自动形成具有交联结构的聚多巴胺PDA-PEI介导涂层(PVC/PDA-PEI)。
在另一个实施例中，介导层在室温下不添加氧化剂的pH 7～9的A+B水溶液中制备；在另一个实施例中，介导层在含有氧化剂、pH 4～7的A+B水溶液中制备；氧化剂包括高碘酸钠、双氧水、过硫酸钠、高锰酸钾或次氯酸钠。
步骤2，按照质量比1:2:2～1:3:4将两性离子聚合物溶液中添加催化剂EDC和NHS，形成聚合物锚定溶液，在40-60℃下将涂覆有介导层的改性材料浸没于聚合物锚定溶液中2-24小时；形成两性离子聚合物层。两性离子聚合物(I)于水溶液中在介导层表面多点锚定形成结合稳定的两性离子抗生物污染涂层。
多点锚定两性离子聚合物(I)的反应在浓度为4～20mg/mL的水溶液及含有羧基活化剂EDC(12mg/mL)和NHS(16mg/mL)催化下进行。溶液中含有0～80％(v/v)乙醇、在40～60℃反应时效果较好，容易获得两性离子基团接枝密度更高、水化层结合紧密的生物惰性表界面。例如含有羧基反应侧链的两性离子聚合物PMPCC在PVC/PDA-PEI表面共价结合后形成PVC/PDA-PEI/PMPCC涂层。
含有多个羧基侧链的两性离子随机共聚物(I)在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)催化下与介导层涂层表面的氨基反应，生成多个酰胺键将共聚物(I)多点锚定形成稳定的超薄的两性离子聚合物层，其厚度为2～10纳米。
在另一个实施例中，浸入介导层的改性材料反应1～10分钟即可取出，将改性材料与涂层表面粘附少量反应液体一起密封在小容器或密封袋中，在50℃继续反应6～24小时，水洗后冷风吹干。
步骤3，将步骤2形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于2-5mg/mL肝素钠和EDC和NHS按照质量比1:2:2～1:3:4的水溶液中1-24小时；肝素共价键接枝在构建的两性离子抗生物污染涂层表面形成两性离子聚合物与肝素的复合涂层，形成附着有肝素抗凝血层的改性材料。
复合涂层表面剩余的少量暴露氨基与肝素分子中的羧基在EDC和NHS催化下酰胺化键合，形成共价键锚定的肝素抗凝涂层。具体的，步骤3接枝肝素(Hep)反应在活化剂EDC(12mg/mL)和NHS(16mg/mL)催化下与表/界面暴露的少数剩余氨基形成酰胺键，得到共价结合、运动自由、抗凝血活性高的表面锚定肝素，如PVC/PDA-PEI/PMPCC/Hep。表面接枝肝素的表面密度可用苯甲胺蓝染色法进行定量测定，也可由染色前、后吸附的苯甲胺蓝引起的颜色变化定性判断(如图2所示)。
在另一个实施例中，浸入介导层的改性材料反应1～10分钟即可取出，将改性材料与涂层表面粘附少量反应液体一起密封在小容器或密封袋中，在20℃继续反应6～24小时，水洗后真空干燥。
肝素层是位于两性离子聚合物涂层之上，通过肝素分子中的羧基与暴露在两性离子聚合物涂层上的氨基经酰胺化反应锚定形成。在两性离子聚合物涂层仿细胞膜界面上锚定的肝素分子链具有自由运动的能力，可最大程度地发挥其抑制凝血酶活性的生物活性。
本发明通过仿生粘附介导层构建的两性离子聚合物与肝素形成的复合涂层，通过生物惰性的仿细胞膜两性离子聚合物涂层提升血液相容性(抑制凝血系统激活，治本)，与生物活性的肝素涂层灭活其它刺激因素产生的凝血酶的活性(治标)两种抗凝血作用的结合，使复合涂层的抗凝血效果更高效持久。
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1
步骤1，将多巴胺盐酸盐与聚乙烯亚胺(PEI)按照质量比10:1溶于无水乙醇：pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液＝1:1(体积比为)的混合溶剂中，配制成含多巴胺盐酸盐2mg/mL，PEI 0.2mg/mL溶液，浸入表1中的不同材料片基于30℃水浴摇床以90rpm反应6h。取出用去离子水冲洗干净后，冷风吹干，测其接触角。表1中涂覆前、后表面水接触角的显著变化说明介导层构建成功。
表1.不同材料片基涂覆介导层前、后表面水接触角变化。
材料类型 涂覆前水接触角(°) 涂覆后水接触角(°)
玻璃片 30.3±2.0 33.5±1.3
聚碳酸酯片 78.4±4.6 53.3±3.5
聚丙烯片 105.0±1.4 57.3±1.9
热塑型聚氨酯片 98.8±2.5 58.1±4.2
硅橡胶片 112.8±2.4 84.4±5.6
聚氯乙烯片 80.1±4.4 62.8±1.9
不锈钢片 42.6±2.8 45.2±3.2
步骤2，按照质量比1:3:4将两性离子聚合物与EDC和NHS配制成聚合物(4mg/mL)锚定溶液，在50℃下将涂覆有介导层的聚丙烯片浸没于聚合物锚定溶液中2小时；形成两性离子聚合物层，其水接触角由57.3±1.9°降低到29.6±2.5°。
步骤3，将步骤2形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于2mg/mL肝素钠的水溶液(含EDC 6mg/mL和NHS 8mg/mL)中1小时；肝素共价键结合在构建的两性离子抗生物污染涂层表面形成两性离子聚合物与肝素的复合涂层，形成肝素含量0.65μg/cm2的抗凝血层改性材料。
实施例2
步骤1，按照质量比10:1～3:2混合配制表2所示的仿生万能粘附材料A与交联剂B水溶液，PVC导管用无水乙醇浸泡洗济后分别浸入表2所示的溶液中，于30℃反应4h构建介导涂层。取出导管用大量去离子水淋洗后，室温下吹风机干燥后测定水接触角。与改性前PVC管部门的水接触角比较，显著降低的水接触角表明PVC/PDA、PVC/PDA-PEI、PVC/PDA-PLys、PVC/PDA-APTMS、PVC/PDopa-PEI和PVC/PDopa-PLys介导涂层构建成功。
表2.PVC导管表面溶液浸涂构建介导涂层的水接触角及溶液组成。
Figure BDA0002743084180000101
步骤2，按照质量比1:2:2在5mg/mL两性离子聚合物PMPCC6溶液中添加催化剂EDC和NHS，形成聚合物锚定溶液，在40℃下将涂覆有介导层PDA-PEI的PVC导管浸没于聚合物锚定溶液中24小时；形成水接触角31.4±3.3°的两性离子聚合物层。
步骤3，将步骤2形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于5mg/mL肝素钠，含EDC12mg/mL和NHS 16mg/mL的水溶液中于20℃反应1小时；肝素共价键接枝在构建的两性离子抗生物污染涂层表面形成两性离子聚合物与肝素的复合涂层，形成结合肝素1.2μg/cm2的抗凝血层的改性材料。
实施例3
步骤1，同实施例2。
步骤2，将实施例2中的PVC/PDA-PEI样品，浸入含两性离子聚合物PMPCC104mg/mL、EDC 10mg/mL、NHS 12mg/mL，pH为5.6的PBS:无水乙醇＝1:3(v/v)混合溶剂溶液中，于60℃水浴摇床中反应2h，得到PMPCC10聚合物多点锚定改性的PVC管(PVC/PDA-PEI/PMPCC10)。
步骤3，最后将PVC/PDA-PEI/PMPCC10管浸入含肝素钠4mg/mL、EDC 10mg/mL、NHS12mg/mL，pH为5.6的PBS:无水乙醇＝1:1(v/v)混合溶剂溶液中，于4℃冷藏箱中反应12h，得到接枝PMPCC10两性离子聚合物及肝素的PVC管(PVC/PDA-PEI/PMPCC10/Hep)。用大量纯水浸泡清洗三次后室温下吹风机干燥后测定水接触角，PVC/PDA-PEI/PMPCC10和PVC/PDA-PEI/PMPCC10/Hep表面的水接触角分别为21.4±3.9°和24.4±3.1°。用甲苯胺蓝染色法检测涂层表面肝素含量为1.12±0.18μg/cm2。X-射线光电子能谱表面元素含量分析显示，PVC/PDA-PEI/PMPCC10/Hep表面含有1.33％磷元素及1.02％硫元素，证明含有磷酰胆碱两性离子的PMPCC10及含硫的肝素均被共价键固定在PMP膜表面。
实施例4
步骤1，同实施例2。
步骤2，将实施例2中的PVC/PDA-PEI样品，浸入含两性离子聚合物PMPCC10 5mg/mL、EDC 10mg/mL、NHS 14mg/mL，pH为5.6的PBS:无水乙醇＝1:3(v/v)混合溶剂溶液中于27℃分别反应3秒、1分钟及1小时。取出后用蒸馏水和无水乙醇交替淋洗2～3遍，冷风吹干后测其水接触角，分别为32.3±4.6°，29.8±3.9°和25.9±5.7°，显著低于反应前PVC/PDA-PEI表面的47.6±5.6°，表明PMPCC聚合物在室温下较短时间就可结合在含有氨基的介导层表面。
步骤3，将步骤2形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于4mg/mL肝素钠的水溶液(含EDC 12mg/mL和NHS 16mg/mL)中12小时；肝素共价键结合在构建的两性离子抗生物污染涂层表面形成两性离子聚合物与肝素的复合涂层，水洗后真空干燥，形成肝素含量分别为1.6±0.3μg/cm2，1.2±0.3μg/cm2，0.9±0.2μg/cm2抗凝血层的改性材料。
实施例5
步骤1，同实施例2。
步骤2，将实施例2中的PVC/PDA-PEI样品，浸入含PMPCC10 20mg/mL、EDC 40mg/mL、NHS 40mg/mL，pH为6.0的PBS溶液中于50℃分别反应3秒、1分钟及1小时。取出后连同粘附的反应液一起密封于塑料袋中，在50℃继续反应6小时。用蒸馏水浸泡、淋洗3遍后冷风吹干，测其水接触角，分别为27.6±4.6°，27.3±3.6°和26.9±4.2°，表明PMPCC聚合物短时间浸渍后介导层表面粘附的少量反应液在密封状态下就可完成反应，在减少99％反应液时也可获得较好的涂层效果。
步骤3，将步骤2形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于5mg/ml肝素钠的水溶液(含EDC 12mg/mL和NHS 16mg/mL)中2分钟，取出后连同粘附的反应液一起密封于塑料袋中，于室温(20℃)下继续反应24小时；肝素共价键结合在构建的两性离子抗生物污染涂层表面形成两性离子聚合物与肝素的复合涂层，水洗后真空干燥，形成结合有肝素(0.8±0.2μg/cm2)抗凝血层的改性材料。
实施例6
步骤1同实施例3。
步骤2，将实施例3中的PVC/PDA-PEI/PMPCC10样品浸入含有EDC 10mg/mL、NHS12mg/mL，PEI 4mg/mL pH为5.6的PBS:无水乙醇＝1:3(v/v)混合溶剂溶液中于50℃水浴摇床中反应6h。
步骤3，用纯水淋洗后浸入含肝素钠4mg/mL、EDC 8mg/mL、NHS 12mg/mL，pH为5.6的PBS:无水乙醇＝1:1(v/v)混合溶剂溶液中，于4℃冷藏箱中反应12h。用纯水淋洗后用甲苯胺蓝染色法检测涂层表面肝素含量为1.68±0.26μg/cm2。
实施例7
步骤1，将商品PMP中空纤维膜片两端热熔封端后，浸入含多巴胺盐酸盐2mg/mL，聚乙烯亚胺(PEI)0.5mg/mL，pH 8.5的Tris缓冲溶液中30°反应3h构建PMP/PDA-PEI涂层。PMP膜表面形成PDA-PEI介导层后的水接触角由106°降低到0°。
步骤2，将PMP/PDA-PEI膜浸入含PMPCC20 5mg/mL、EDC 12mg/mL、NHS 12mg/mL，pH为5.6的PBS溶液中，于50℃水浴摇床中反应2h，得到PMPCC20聚合物多点锚定改性的PMP膜(PMP/PDA-PEI/PMPCC20)。
步骤3，最后将PMP/PDA-PEI/PMPCC20膜再浸入含肝素钠4mg/mL、EDC 10mg/mL、NHS12mg/mL，pH为5.6的PBS溶液中，于4℃冷藏箱中反应12h，得到接枝PMPCC两性离子聚合物及肝素的PMP膜(PMP/PDA-PEI/PMPCC20/Hep)。X-射线光电子能谱表面元素含量分析显示，改性膜表面含有1.68％磷元素及0.41％硫元素，证明含有磷酰胆碱两性离子的PMPCC及含硫的肝素均被共价键固定在PMP膜表面。
实施例8
步骤1，同实施例7。
步骤2，将实施例7中的PMP/PDA-PEI样品浸入含PMPCC10 5mg/mL、EDC 10mg/mL、NHS 12mg/mL，pH为5.6的PBS水溶液中于50℃水浴摇床中反应12h制备PMP/PDA-PEI/PMPCC10涂层改性膜(简称PMP/PMPCC10)。用蒸馏水充分淋洗、冷风吹干后用X-射线光电子能谱测定表面元素含量显示，改性膜表面含有1.46％磷元素。
步骤3，然后将PMP/PMPCC10膜再浸入含肝素钠4mg/mL、EDC 10mg/mL、NHS 12mg/mL，pH为5.6的PBS溶液中，于20℃反应12h，得到接枝PMPCC10两性离子聚合物及肝素复合涂层的PMP膜(PMP/PMPCC10/Hep)。用蒸馏水及乙醇交替淋洗、冷风吹干后用X-射线光电子能谱测定表面元素含量显示，改性膜表面含有1.26％磷元素及0.94％硫元素。
实验例1
分别将PMP、PMP/PMPCC10、PMP/PMPCC10/Hep及PMP/Hep膜样品浸入新鲜的牛血(用钙离子平衡抗凝血剂)，于37℃的二氧化碳培养箱中保持一定时间后，用PBS缓冲液淋洗样品表面后用显微镜观察血栓粘附情况。
图3所示的显微镜照片说明，未改性的PMP膜表面在2小时内粘附了大量血栓；PMP/Hep和PMP/PMPCC10膜表面分别在24小时和36小时出现了少量微血栓；而PMP/PMPCC10/Hep复合涂层改性PMP膜表面则未粘附任何血栓，说明PMPCC10/Hep复合涂层抗血栓形成的效果优于单独的肝素涂层及单独的两性离子聚合物涂层。
实验例2
分别将PMP、PMP/PMPCC10、PMP/PMPCC10/Hep及PMP/Hep膜样品(0.5×0.5cm2)浸入含30nM抗凝血酶(AT III)Hepes缓冲液(20mM Hepes，190mM NaCl，0.5mg/mL BSA，0.02％NaN3)于37℃反应5min。加入20nM人凝血酶后开始计时，并在设定的时间点(10，15，20，30min)各取出0.10mL，加入含有20mM EDTA的Tris缓冲液(50mM Tris，175mM NaCl，0.5mg/mL BSA)。最后加入显色剂S-2238(最终浓度为0.2mM)与游离/残余的凝血酶反应释放对硝基苯胺，用酶标仪测定其在405nm处的吸光度。扣除PMP膜对凝血酶的灭活作用后，PMP/PMPCC10、PMP/PMPCC10/Hep及PMP/Hep膜对凝血酶灭活的百分率如图4所示。PMP/PMPCC10/Hep复合涂层对凝血酶灭活的百分率显著高于单独PMP/PMPCC10和PMP/Hep二者之和，证明复合涂层对凝血酶灭活的作用有意想不到的良好效果。
实验例3
与实验例1类似，将PVC导管分别用单独的肝素涂层、单独的两性离子聚合物涂层及复合涂层改性样品(PVC、PVC/Hep、PVC/PMPCC10、PVC/PMPCC10/Hep)置于24孔板中，用PBS缓冲液浸泡2小时后除去缓冲液，滴入富含血小板的血浆在37℃的二氧化碳培养箱中培养2小时。用PBS淋洗除去为粘附细胞后，用戊二醛固定粘附的血小板。分别用水及乙醇溶液淋洗、脱水后，观察粘附血小板的数量及形貌。图5结果显示，血小板在PVC表面大量粘附、并发生聚集及铺展变形；肝素涂层(PVC/Hep)表面虽有血小板粘附，但聚集及变形程度轻微，对血小板的激活程度若；PVC/PMPCC10表面几乎没有粘附完整的血小板细胞，仅有少量的细胞碎片出现；而复合涂层PVC/PMPCC10/Hep表面没有任何血小板或细胞碎片粘附，抗血小板粘附性能优异，血小板及其碎片均无粘附。表现出比Hep和PMPCC10涂层更优异的抗生物污染性能。
实验例4
将300mL含多巴胺盐酸盐2mg/mL，聚乙烯亚胺(PEI)0.5mg/mL，pH 8.5的Tris缓冲溶液按血液通路灌入聚丙烯中空纤维膜氧合器，于30°反应3h构建PP/PDA-PEI涂层。然后灌入含PMPCC10 5mg/mL、EDC 16mg/mL、NHS 12mg/mL，pH为5.6的PBS溶液，于50℃水浴摇床中反应12h，得到PMPCC20聚合物多点锚定改性的聚丙烯中空纤维膜氧合器(PP膜氧合器/PMPCC)。灌入纯水，缓慢加压测定PP膜氧合器/PMPCC耐渗漏压力,在压差高达150kPa时氧合器未发生水渗漏。
将300mL含磷酰胆碱两性离子的两亲性聚合物PMBT 4.0mg/mL的乙醇溶液按血液通路灌入PP膜氧合器，于室温吸附6h构建PMBT涂层得到两亲性聚合物吸附改性的PP膜氧合器/PMBT。然后灌入纯水，缓慢加压测定氧合器/PMBT耐渗漏压力。不同涂覆改性氧合器发生水渗漏的压力差测定结果如图6所示。
实验例5
经表面涂覆ATRP引发剂涂层的聚碳酸酯(PC)片基(PC/PDA-SiBr)浸入含甲基丙烯酸磺酸甜菜碱酯(SBMA)20mg/mL、左旋抗坏血酸2mg/mL、CuBr2 0.0144mg/mL、NaCl 0.1M以及Bpy 0.0608mg/mL的EtOH：PBS缓冲液＝1:1(体积比)水溶液中，50℃水浴摇床震荡反应12h，取出后用蒸馏水及乙醇交替淋洗，冷风吹干后得到PSBMA聚合物刷改性的PC片基。XPS元素含量结果显示，改性涂层中唯一含硫的PSBMA聚合物刷的硫元素含量高达3.86％，表明形成了致密的PSBMA聚合物刷涂层。水接触角测定结果显示，PC/PDA-SiBr表面水接触角为68+2°，而PSBMA聚合物刷改性后降低到0°。
实验例6
按实施例8的反应条件，在表面等离子体共振仪芯片表面形成介导层、PMPCC10及肝素涂层。分别测得PDA-PEI介导层为5.6纳米，PMPCC10为2.5纳米及肝素涂层为1.3纳米。
从以上实施例及实验例可以看出，本发明在水溶液中构建超薄、结合稳定的抗凝血涂层，通过生物惰性的两性离子聚合物与生物活性的肝素两种抗凝血作用物质的结合，使复合涂层的抗凝血效果更高效持久。同时将水对氧合器的渗漏压差由两亲性PMBT聚合物乙醇溶液中涂覆的20～80kPa提高到在PMPCC聚合物水溶液中涂覆的150kPa，可显著降低或阻止亲水性及两亲性聚合物涂层对氧合器真空纤维膜管壁微孔通道憎水性的降低引起的血液渗漏风险。另外，本发明利用仿贻贝万能粘附介导层，可将该两性离子聚合物涂层提高血液相容性与肝素涂层灭活凝血酶活性的复合涂层方便地应用于包括多种类型及形状大小生物医学材料及器件领域，具有广泛的推广使用价值。
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种两性离子聚合物与肝素复合涂层，其特征在于，包括介导层、两性离子聚合物层和肝素抗凝血层；
所述介导层为被涂覆的材料表面粘附有由仿生万能粘附材料A与交联剂B按照质量比为10:1～3:2的聚合物层；
所述介导层表面多点锚定有两性离子聚合物层，在所述两性离子聚合物层层表面共价键结合有肝素抗凝血层。
2.根据权利要求1所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层，其特征在于，所述介导层中仿生万能粘附材料A为多巴胺盐酸盐或多巴盐酸盐；交联剂B为γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙基硅烷、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸的一种或两种的混合物。
3.根据权利要求1所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层，其特征在于，所述两性离子聚合物具有如下通式(I)结构：
Figure FDA0002743084170000011
式中R1和R2为H或CH3，R3为氧杂碳链连接的两性离子基团，R4为氧杂碳链连接的羧基；
所述两性离子包括磷酰胆碱PC、磺酸甜菜碱SB或羧酸甜菜碱CB。
4.根据权利要求3所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层，其特征在于，所述两性离子聚合物涂层厚度为2～10纳米。
5.根据权利要求2所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层，其特征在于，所述肝素抗凝血层为肝素钠的水溶液在两性离子聚合物层表面结合形成的涂层，其中肝素钠的分子量为4000～10000，肝素抗凝血层表面肝素含量不低于0.2μg/cm2。
6.一种基于权利要求1-6所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将仿生万能粘附材料A与交联剂B按照质量比为A:B＝10:1～3:2混合配制为A+B水溶液，被改性材料浸没于所述水溶液中，得到介导层；
(2)按照质量比1:2:2～1:3:4将两性离子聚合物与催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS配制成聚合物锚定溶液，在25-60℃下将涂覆有介导层的改性材料浸没于聚合物锚定溶液中2-24小时；形成两性离子聚合物层；
(3)将步骤(2)形成的两性离子聚合物层改性材料浸没于2-10mg/mL肝素钠与催化剂EDC和NHS质量比为1:2:2～1:3:4的水溶液中1-24小时；形成结合有肝素抗凝血层的改性材料。
7.根据权利要求6所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，介导层在室温下不添加氧化剂的pH 7～9的A+B水溶液中制备；或在含有氧化剂、pH 4～7的A+B水溶液中制备；
所述氧化剂包括高碘酸钠、双氧水、过硫酸钠、高锰酸钾或次氯酸钠。
8.根据权利要求6所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中，在EDC和NHS催化的水溶液或乙醇水溶液中制备。
9.根据权利要求6所述的两性离子聚合物与肝素复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)中，浸入介导层改性的材料反应1～10分钟即可取出，将改性材料与涂层表面粘附少量反应液体一起密封在小容器或密封袋中，分别在50℃或20℃继续反应6～24小时，水洗后真空干燥。
10.一种权利要求7所述方法制备的两性离子聚合物与肝素复合涂层在医用导管、插管、血液透析器、氧合器、离心泵头、血管支架、心脏瓣膜等与体液及血液接触的生物医用材料及器件表面应用。
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