CN112316214A - 一种重组胶原蛋白可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组胶原蛋白可注射水凝胶及其制备方法，目前软组织填充领域所使用的材料如动物胶原、透明质酸钠等虽具有良好效果但仍存在着慢性炎症、过敏等排异问题，所使用交联剂大多为化学交联剂，如1，4‑丁二醇二缩水甘油醚、β‑甘油磷酸钠等。如果交联剂残留量超过限值将对人体产生毒性。为解决上述现有水凝胶材料存在的问题，本发明构建了一种重组胶原蛋白可注射水凝胶，选用重组胶原蛋白为水凝胶主体，使用酶为催化剂。与传统的水凝胶相比，本发明所制备的水凝胶生物相容性优异、可原位成型且具有促细胞生长和抗炎的效果。

Description

一种重组胶原蛋白可注射水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种重组胶原蛋白可注射水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶是一种由亲水性聚合物链构成的三维网络生物材料，其亲水网络可以吸收并保留大量水分，且其具有良好的生物相容性和类细胞外基质等特性，被广泛应用于多种领域，包括作为生物医用材料应用于植入型医疗器械、医药伤口敷料、药物释放载体等生物制药领域。其中，水凝胶作为一种软组织填充材料可以修复软组织损伤或者病变造成空腔和缺损的组织以及在整形美容行业中祛除皱纹或改善面部轮廓等。
水凝胶是由具有水溶性或亲水性的高分子通过一定的化学或物理交联作用而形成的。其中，由天然高分子制备的水凝胶具有生物相容性、生物降解性及与天然组织相似的微环境等优点。目前制备水凝胶所使用的天然聚合物材料主要为动物胶原和透明质酸钠等。胶原蛋白是一种生物高分子，是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，所以在医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。但是，常用的胶原蛋白来自猪皮、牛皮和牛腱等动物组织，动物胶原蛋白可能具有病毒残留并引起免疫排斥。因此，对于部分使用者仍然存在着使用部位红肿、过敏和慢性炎症等排异问题。
中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1中公开了一种重组胶原蛋白，它是通过将人胶原蛋白mRNA反转录为cDNA，然后通过重组大肠杆菌BL21高表达发酵生产后分离纯化得到的。由于其结构和功能与人体自身的胶原蛋白极为近似，因此，使用这种胶原蛋白将可有效解决动物组织提取胶原蛋白的病毒隐患问题。
物理交联水凝胶是通过如静电作用、氢键等物理作用力形成的，在制备过程中无需使用对细胞造成毒性或影响生物分子活性的交联剂，但其稳定性较差，强度较低。而采用化学交联法制备的水凝胶具有更好的稳定性和较高的柔韧性。但由于在交联过程中需要使用如1，4-丁二醇二缩水甘油醚、β-甘油磷酸钠等化学交联剂，如果残脱不完全将对人体造成损伤。
酶作为一种生物大分子，广泛存在于生物体内，其安全无毒、催化效率高且可形成稳定的化学键。相比传统交联剂，酶更适合使用于人体。所以本申请选用过氧化物酶作为交联剂。过氧化物酶作为诸多酶催化剂之一，具有较高的催化速率和良好的稳定性。
发明内容
本申请的目的是构建一种重组胶原蛋白可注射水凝胶来补充现有水凝胶及软组织填充材料的不足。该水凝胶具体采用一种重组胶原蛋白为主要原料，并通过过氧化物酶进行交联，安全无毒、可生物降解、生物相容性优异、且无病毒隐患。具体采用如下技术方案：
1.一种重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别将一定浓度的对羟基苯丙酸、活化剂和重组胶原蛋白溶液加入溶剂中，形成混合液，在所述活化剂的作用下，重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸发生脱水缩合反应；
将上述反应后的混合液分离-去除未反应组分后冻干，得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
将上述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物分散在水相中得到前体溶液；和
加入过氧化氢和过氧化物酶催化所述前体溶液，原位形成水凝胶；
其中，所述重组胶原蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
2.根据项1所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述重组胶原蛋白溶液的浓度为5～15％(w/v)，所述对羟基苯丙酸的浓度为0.5～5％(w/v)。
3.根据项1～2中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或碳二亚胺或其盐类衍生物。
4.根据项3所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述碳二亚胺或其盐类衍生物选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺或其盐类衍生物。
5.根据项4所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1～2％(w/v)，所述碳二亚胺或其盐类衍生物的浓度为1～3％(w/v)。
6.根据项1～5中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述溶剂为选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃的一种或几种有机物的水溶液。
7.根据项1～6中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，在所述混合液中，重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸的的质量比为1～10:1，优选为2～5:1。
8.根据项1～7中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，通过透析法或超滤法分离-去除未反应组分。
9.根据项8所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述透析法包括使用截留分子量为8000～12000Da的透析袋进行透析。
10.根据项1～9中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水相选自超纯水、注射用水或磷酸盐缓冲液。
11.根据项1～10中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物在所述前体溶液中的浓度为1～10％(w/v)，优选为5～10％(w/v)。
12.根据项1～11中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，加入的所述过氧化氢的终浓度为1～2mmol/L，优选为1.5mmol/L，加入的所述过氧化物酶的终浓度为0.5～1.5U/mL，优选为1.0U/mL。
13.根据项1～12中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
14.通过项1～13中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法得到的重组胶原蛋白可注射水凝胶。
15.项14所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶在软组织填充、药物递送和医美整形等领域的应用。
采用本申请所述的方法制备重组胶原蛋白水凝胶，与传统化学交联的制备方法相比，制得的水凝胶无毒害，无残留。与传统酶交联(TG酶等)制备方法相比，具有更高的交联速率，并且可以原位成型水凝胶。通过本申请方法制备得到的重组胶原蛋白可注射水凝胶是一种可用于人体内的医用材料，外观呈乳白色凝胶状，可通过注射方式进入目标位置并在原位形成固态凝胶。其具有优异的生物相容性和生物降解性，非常适合应用于软组织填充、药物递送和医美整形等领域。
附图说明
图1是小鼠背部皮下组织的苏木精—伊红染色图。
图2是重组胶原蛋白水凝胶细胞活性示意图。
图3是重组胶原蛋白水凝胶成型速率示意图。
图4是重组胶原蛋白水凝胶机械性能测试实验示意图。
图5是水凝胶在小鼠皮下降解过程图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本申请做进一步的详细描述。
本申请提供一种重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别将一定浓度的对羟基苯丙酸、活化剂和重组胶原蛋白溶液加入溶剂中，形成混合液，在所述活化剂的作用下，重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸发生脱水缩合反应；
将上述反应后的混合液分离-去除未反应组分后冻干，得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
将上述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物分散在水相中得到前体溶液；和
加入过氧化氢和过氧化物酶催化所述前体溶液，原位形成水凝胶；
其中，所述重组胶原蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
具体的，本申请中氨基酸序列为SEQ ID NO:1的重组胶原蛋白为中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1所述的重组胶原蛋白，是通过将人胶原蛋白mRNA反转录为cDNA，然后通过重组大肠杆菌BL21高表达发酵生产后分离纯化得到的，其具有三链、三螺旋结构，可以采用例如该中国专利申请公开CN1371919A中公开的基因工程表达方法制备得到。此种类人胶原蛋白是由中国西北大学的范代娣教授发明的，因此又称作范氏重组胶原蛋白或范氏类人胶原蛋白(Fan’s Human-like Collagen，FHLC)。其结构和功能与人体自身的胶原蛋白极为近似，使用这种胶原蛋白将可有效解决动物组织提取胶原蛋白的病毒隐患问题。
具体的，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：
Figure BDA0002758247650000051
Figure BDA0002758247650000061
进一步的，本申请还涉及编码所述重组胶原蛋白的核酸、导入所述核酸的载体以及用上述载体转化宿主细胞而得到的转化体。
上述核酸、载体、转化体可以基于本申请所述重组胶原蛋白的氨基酸序列来制造，其制造方法是本技术领域所公知的，例如可以参见：分子克隆实验指南第三版[美]J.莎姆布鲁克著黄培堂等译科学出版社2002年9月。
在一个具体实施方式中，可先将所述对羟基苯丙酸及活化剂加入有机溶剂中进行搅拌，随后加入重组胶原蛋白溶液。进一步的，所述重组胶原蛋白溶液的浓度为5～15％(w/v)，例如可以为5％(w/v)、8％(w/v)、10％(w/v)、12％(w/v)、15％(w/v)等；对羟基苯丙酸的浓度为0.5～5％(w/v)，例如可以为0.5％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等。
在一个具体实施方式中，对重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸发生脱水缩合反应所使用的活化剂没有特别限定。在一个具体实施方式中，所述活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺与碳二亚胺或其盐类衍生物的混合物。进一步的，所述碳二亚胺盐类衍生物可以选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳二亚胺。碳二亚胺盐类衍生物作为脱水剂可以使重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸之间的脱水缩合反应在较温和的条件下进行，并可以获得较高的合成收率。
在一个具体的实施方式中，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1～3％(w/v)，优选为1.5～2.0％(w/v)；N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为1～2％(w/v)，优选为1.5～2.0％(w/v)。
本申请对所述水凝胶制备方法中所使用的溶剂没有特别限定，在一个具体实施方式中，所述溶剂可以选自二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃的一种或几种有机物的水溶液。优选的，为二甲基甲酰胺水溶液。在一个具体的实施方式中，所使用的溶剂为40％(v/v)二甲基甲酰胺水溶液。
在一个具体的实施方式中，所述混合溶液中所加入的重组胶原蛋白和对羟基苯丙酸的质量比为1～10：1，例如可以为1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1等，优选的，重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸在所述混合液中的质量比为2～5:1。
在一个具体的实施方式中，可以通过采用透析法或者超滤法分离-去除未交联组分。透析法是利用小分子在溶液中可以通过半透膜，而蛋白质等大分子物质不能通过半透膜的性质，使大分子与其他物质如无机盐、单糖等进行分离。超滤法是一种膜分离方法，在一定的外界压力和流量下，利用半透膜介质和不对称微孔结构，以膜两侧的压力差为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及其中的小分子物质通过，而大分子物质如蛋白质、水溶性高聚物等被滤膜阻流，从而达到分离或纯化目的的膜分离技术。
优选的，选用截留分子量为8000～12000Da的透析袋对重组胶原蛋白和对羟基苯丙酸脱水缩合反应后的溶液进行透析，以分离、去除其中未发生反应的组分。
在一个具体的实施方式中，将通过透析法或超滤法去除未反应组分后的溶液置于冻干机中进行冻干，得到所述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物。
在一个具体的实施方式中，将所述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以一定浓度溶于水相中得到前体溶液。本申请中对所述水相没有特别限定，在具体实施方式中，可以选自超纯水、注射用水或磷酸盐缓冲液。优选的，选用注射用水。
在一个具体的实施方式中，所述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物在前体溶液中的浓度为1～10％(w/v)，例如可以为1％(w/v)，2％(w/v)，3％(w/v)，4％(w/v)，5％(w/v)，6％(w/v)，7％(w/v)，8％(w/v)，9％(w/v)，10％(w/v)等，进一步优选的，重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物在前体溶液中的浓度为5～10％(w/v)。
本申请使用过氧化物酶作为制备所述水凝胶的交联剂。酶是广泛存在于生物体内的生物大分子，对人体安全无害，且具有较高催化效率，并能形成稳定的化学键，使制得的水凝胶更为稳定。
在一个具体的实施方式中，向所述前体溶液中加入过氧化氢和过氧化物酶进行催化，其中，所加入的过氧化氢的终浓度为1～2mmol/L，优选为1.5mmol/L，加入的过氧化物酶的终浓度为0.5～1.5U/mL，优选为1.0U/mL。
本申请中对所述过氧化物酶没有特别限定，在具体的实施方式中，优选为辣根过氧化物酶。
本申请还涉及一种通过采用所述重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法所制备得到的重组胶原蛋白可注射水凝胶。这种水凝胶以中国专利申请公开CN1371919A的权利要求1中公开的重组胶原蛋白为原料，以过氧化物酶为交联剂，经本申请中所述的制备方法制成，相比于传统动物胶原蛋白为原料或采用现有化学交联法制备得到的水凝胶，具有更为优异的生物安全性以及稳定性。
本申请还涉及所述重组胶原蛋白可注射水凝胶在软组织填充、药物递送和医美整形等领域的应用。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的重组胶原蛋白来自西安巨子生物技术有限公司，对羟基苯丙酸和辣根过氧化物酶购自西格玛。其他所使用的材料、制剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以2.5％(w/v)、3.0％(w/v)和1.3％(w/v)溶于250mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌12小时；
步骤二：在上述溶液中加入150mL的8.5％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以50mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物使其终浓度分别为1.5mmol/L和1.0U/mL，原位形成水凝胶。
实施例2
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以5.0％(w/v)、2.5％(w/v)和0.8％(w/v)溶于200mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌10小时；
步骤二：在上述溶液中加入150mL的10.0％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以50mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物酶使其终浓度分别为2.0mmol/L和1.0U/mL，原位形成水凝胶。
实施例3
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以5.0％(w/v)、2.5％(w/v)和0.8％(w/v)溶于200mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌10小时；
步骤二：在上述溶液中加入200mL的5.0％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以50mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物使其终浓度分别为1.0mmol/L和0.5U/mL，原位形成水凝胶。
实施例4
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以3.0％(w/v)、3.5％(w/v)和2.0％(w/v)溶于250mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌10小时；
步骤二：在上述溶液中加入200mL的8.5％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以100mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物使其终浓度分别为1.5mmol/L和1.0U/mL，原位形成水凝胶。
实施例5
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以3.0％(w/v)、3.5％(w/v)和2.0％(w/v)溶于150mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌10小时；
步骤二：在上述溶液中加入150mL的15.0％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以10mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物使其终浓度分别为1.0mmol/L和0.5U/mL，原位形成水凝胶。
对比例1
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以3.0％(w/v)、3.5％(w/v)和2.0％(w/v)溶于250mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌10小时；
步骤二：在上述溶液中加入200mL的8.5％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以100mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物使其终浓度分别为2.5mmol/L和2.0U/mL，原位形成水凝胶。
对比例2
步骤一：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和对羟基苯丙酸分别以3.0％(w/v)、3.5％(w/v)和2.0％(w/v)溶于150mL的40％(v/v)二甲基甲酰胺的水溶液中，在室温下搅拌10小时；
步骤二：在上述溶液中加入150mL的15.0％(w/v)重组胶原蛋白溶液，搅拌过夜；
步骤三：将上述反应液转移至截流分子量为8000～12000Da的透析袋中，透析后冻干得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
步骤四：将重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以10mg/mL的浓度溶于注射用水中，加入过氧化氢和辣根过氧化物使其终浓度分别为0.75mmol/L和0.2U/mL，原位形成水凝胶。
效果实验
实验例1重组胶原蛋白水凝胶的炎症反应测试
(1)将40只健康成年昆明小鼠随机分为8组，5只为一组，用脱毛剂进行背部脱毛备皮，用水清洁皮肤后用碘酒对小鼠备皮皮肤消毒，用75％酒精脱碘。对1-7组中的小鼠分别以实施例1-5、对比例1-2中制备的重组胶原蛋白可注射水凝胶进行注射，对第8组中的小鼠注射市售的泊洛沙姆聚合物(浓度为250mg/mL)作为阳性对照。每只小鼠皮下注射0.2mL。将注射过的小鼠置于相同的环境下饲养2周后，采用断颈法处死，取其背部注射过的表皮进行病理分析，观察其炎症反应。实验结果如表1所示。
表1炎症反应测试结果
Figure BDA0002758247650000111
上述实验结果显示，注射实施例1的重组胶原蛋白可注射水凝胶的小鼠基本没有产生炎症反应，其他实施例组炎症反应也较为轻微。而市售产品对照组出现了较严重的炎症反应。
(2)将40只健康成年昆明小鼠随机分为8组，5只为一组，用脱毛剂进行背部脱毛备皮，用水清洁皮肤后用碘酒对小鼠备皮皮肤消毒，用75％酒精脱碘。对其中4组中的小鼠以实施例1制备的重组胶原蛋白可注射水凝胶进行注射，另外4组中的小鼠注射市售的泊洛沙姆聚合物(浓度为250mg/mL)。每只小鼠皮下注射0.2mL。将注射过的小鼠置于相同的环境下饲养。分别于饲养后1周、2周、3周和5周时，每次处死实施例组和市售组小鼠各一组。处死采用断颈法，然后取其背部注射处表皮，将注射实验材料部位皮肤用手术刀切下于中性甲醛中固定。然后使用苏木精—伊红染色法染色并用普通光学显微镜拍照并作病理组织分析。实验结果如图1所示。
实验结果显示在对小鼠皮下进行相应注射1周、2周、3周和5周后，实施例组的小鼠均无明显的炎症反应，而市售组出现了较严重的炎症反应，注射后5周时仍未完全消除。这表明本申请所制备的重组胶原蛋白可注射水凝胶是一种更为安全、无毒、具有更好生物相容性的生物材料，可以有效解决传统生物材料生物相容性差和病毒隐患的问题。
实验例2重组胶原蛋白水凝胶的细胞活性测试
实验方法：将L929细胞在补充有10％(v/v)FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基中培养。将实施例1中的重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸(HLC-HPA)缀合物溶液通过0.22μm滤膜过滤进行灭菌；将实施例1中得到的水凝胶用新鲜的1640培养基浸泡72h，即得到水凝胶浸提液；用0.61U/mL I型胶原酶溶液彻底消化实施例1中得到的水凝胶，即得到水凝胶降解产物。然后将L929细胞以104个细胞/孔的密度接种在96孔板中。将细胞在5％CO2、37℃的培养箱中培养24h。吸出上清液后，分别加入上述准备好的不同待测组分，即HLC-HPA缀合物溶液、水凝胶浸提液、水凝胶降解产物，另以空白培养基作为对照组。在孵育24、48和72h后将MTT加入孔板，2h后弃去孔板中的液体，然后添加150μL DMSO，摇动孔板10min，用酶标仪测量溶液在570nm处的吸光值。实验结果如图2所示。
实验结果：HLC-HPA缀合物或水凝胶浸提液均未显示出细胞毒性，并且显示出明显的促进细胞生长的作用。其中，HLC-HPA缀合物具有最显著的促进细胞生长的作用，在培养72h后细胞增殖率高达161.8％。这说明HLC-HPA的制备过程未对HLC的生物活性造成影响，HLC-HPA水凝胶同样具有显著的促细胞生长作用。
实验例3凝胶成型速率实验
将实施例1步骤三中得到的重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物以50/mL的浓度溶于注射用水中，加入不同浓度的过氧化氢和辣根过氧化物酶，测试水凝胶的成型时间。实验结果如图3所示。其中，图(a)为辣根过氧化物酶(HRP)浓度为1U/mL条件下凝胶成型时间随H2O2变化的示意图，图(b)为H2O2浓度为1.5mmol/L条件下凝胶成型时间随HRP变化的示意图。实验结果显示，H2O2浓度在1-1.5mmol/L时水凝胶的成型速率较快。
实验例4水凝胶机械性能测试实验
实验方法：向实施例1中制备得到的HLC-HPA溶液中分别滴加不同量的HRP酶液和H2O2溶液，搅拌均匀后倒入立方体硅胶模具中，等水凝胶完全胶凝后脱模，即得到正方体形状的测试样品。使用万能材料试验机进行测试，压缩速率设为5mm/min，在水凝胶断裂时停止测试，记录断裂时的压缩模量。每组样品准备三个平行样本，取平均值。实验结果如图4所示。其中图(A)为HRP酶液的终浓度为1.0U/mL时，H2O2的终浓度与水凝胶压缩应力关系的示意图，图(B)为H2O2的终浓度为1.5mmol/L时，HRP酶液的终浓度与水凝胶压缩应力关系的示意图。
实验结果：机械性能是水凝胶最重要的指标之一，可表明水凝胶的性能是否可以与细胞质基质的组织特异性相匹配。水凝胶的机械强度可能会影响细胞生长的质量和细胞增殖的速度。
实验结果显示，随着H2O2浓度的上升，水凝胶的压缩应力先上升后下降。当H2O2浓度从0.5mmol/L增加到1.5mmol/L，水凝胶断裂压缩应力上升趋势明显，从77kpa上升到了147kpa。H2O2浓度为1.5mmol/L时水凝胶压缩应力基本稳定在最高值。这种现象是由于反应中H2O2先氧化HRP形成中间产物，然后中间产物与HPA作用使HPA之间发生交联，所以H2O2含量增加会使更多的HPA发生交联从而增强了HLC-HPA水凝胶的交联强度。然后随着H2O2浓度的进一步增加，即从1.5mmol/L增加到2.5mmol/L，HLC-HPA水凝胶的压缩应力反而开始下降。这是由于过量的H2O2会破坏HRP的生物活性，导致HLC-HPA水凝胶的交联强度降低。
HRP的浓度从0.2U/mL增加到0.7U/mL时，水凝胶的压缩应力并没有发生明显变化。说明HRP的浓度可能不是水凝胶机械性能的影响因素。这是由于HRP作为一种酶，其本质是一种生物催化剂，催化剂只能加快反应的速率，并不能改变反应的平衡常数。所以对增加水凝胶的交联强度影响不大。
综上可以看出，H2O2可使更多的HPA之间发生交联，但过多的H2O2会使HRP变性失活，所以H2O2浓度增大，水凝胶机械性能先增强后减小。
实验例5水凝胶降解测试
在上述实验例1(2)的实验中，对实施例1组中小鼠分别于饲养后1周、2周、3周和5周处死后，取其背部注射处表皮，观察并测定凝胶的尺寸。实验结果如图5所示。
实验结果显示，将本申请的重组胶原蛋白可注射水凝胶注射于小鼠皮下1周、2周、3周和5周后，随着时间的延长，材料在皮下有一定程度降解，在5周的时候仍能起到填充作用。可见，实施例1中的凝胶具有较为适宜的降解速率，可以有效解决传统凝胶填充物不能降解或降解过快的问题，并可以有效解决传统生物材料生物相容性差的问题。
以上通过具体实施方式和实施例对本申请进行了说明，但本领域技术人员应该理解的是，这些并非意图对本申请的范围进行限定，本申请的范围应由权利要求书确定。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
序列表
<110> 陕西巨子生物技术有限公司
<120> 一种重组胶原蛋白可注射水凝胶及其制备方法
<141> 2020-11-03
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1071
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
His Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val
1 5 10 15
Thr Gln Leu Asn Arg His Leu Ala His Ala His Pro Pro Phe Ala Ser
20 25 30
Asp His Pro Met Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro
35 40 45
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
50 55 60
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala
85 90 95
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
100 105 110
Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
115 120 125
Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala
130 135 140
Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly
145 150 155 160
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala
165 170 175
Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
195 200 205
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala
210 215 220
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala
225 230 235 240
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
245 250 255
Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
260 265 270
Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala
275 280 285
Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly
290 295 300
Pro Ala Gly Ala Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Pro
305 310 315 320
Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Ala His Gly Pro Ala
325 330 335
Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly
340 345 350
Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro
370 375 380
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
385 390 395 400
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala
405 410 415
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala
420 425 430
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
435 440 445
Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
450 455 460
Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala
465 470 475 480
Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly
485 490 495
Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala
500 505 510
Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro
515 520 525
Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
530 535 540
Pro Pro Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro
545 550 555 560
Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His
565 570 575
Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gly
580 585 590
Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser
595 600 605
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro
610 615 620
Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
625 630 635 640
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro
645 650 655
Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro
660 665 670
Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly
675 680 685
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro
690 695 700
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro
705 710 715 720
Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
725 730 735
Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser
740 745 750
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro
755 760 765
Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly
770 775 780
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly Pro
785 790 795 800
Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His
805 810 815
Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly
820 825 830
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro
835 840 845
Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro
850 855 860
Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly
865 870 875 880
Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser
885 890 895
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro
900 905 910
Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
915 920 925
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala
930 935 940
Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala
945 950 955 960
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly
965 970 975
Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
980 985 990
Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala
995 1000 1005
Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly
1010 1015 1020
Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala
1025 1030 1035 1040
His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala Met Gly Ala Pro Gly Ala Thr
1045 1050 1055
Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr His Gly Leu Val Thr Cys Gly Leu
1060 1065 1070

Claims (10)

1.一种重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别将一定浓度的对羟基苯丙酸、活化剂和重组胶原蛋白溶液加入溶剂中，形成混合液，在所述活化剂的作用下，重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸发生脱水缩合反应；
将上述反应后的混合液分离-去除未反应组分后冻干，得到重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物；
将上述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物分散在水相中得到前体溶液；和
加入过氧化氢和过氧化物酶催化所述前体溶液，原位形成水凝胶；
其中，所述重组胶原蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述重组胶原蛋白溶液的浓度为5～15％(w/v)，所述对羟基苯丙酸的浓度为0.5～5％(w/v)。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，在所述混合液中，重组胶原蛋白与对羟基苯丙酸的质量比为1～10:1，优选为2～5:1。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，通过透析法或超滤法分离-去除未反应组分。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水相选自超纯水、注射用水或磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述重组胶原蛋白-对羟基苯丙酸缀合物在所述前体溶液中的浓度为1～10％(w/v)，优选为5～10％(w/v)。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，加入的所述过氧化氢的终浓度为1～2mmol/L，优选为1.5mmol/L，加入的所述过氧化物酶的终浓度为0.5～1.5U/mL，优选为1.0U/mL。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶。
9.通过权利要求1～8中任一项所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶的制备方法得到的重组胶原蛋白可注射水凝胶。
10.权利要求9所述的重组胶原蛋白可注射水凝胶在软组织填充、药物递送和医美整形等领域的应用。
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