CN112315956A

CN112315956A - 9,10-脱水二氢青蒿素的预防和治疗多发性硬化症药物应用

Info

Publication number: CN112315956A
Application number: CN202011365761.9A
Authority: CN
Inventors: 杜昌升; 吕婕; 庄伟�; 谢玲
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-11-29
Publication date: 2021-02-05

Abstract

一种9,10‑脱水二氢青蒿素(9,10‑Anhydrodehydroartemisinin)在作为预防和治疗多发性硬化症药物中的应用。在研究中，我们发现9,10‑脱水二氢青蒿素(9,10‑Anhydrodehydroartemisinin)可以通过抑制Th17和Th1的分化缓解MS病理。通过EAE动物模型，我们发现与对照组相比，9,10‑脱水二氢青蒿素治疗组小鼠EAE症状明显缓解，包括具有更低的临床评分、减少的中枢神经系统白细胞浸润和减弱的脱髓鞘。并且，作为MS主要致病效应细胞的Th17和Th1在外周和中枢神经系统中比例均明显的降低。其外周血中IFN‑γ和IL‑17的分泌量也显著下降。综合结果表明9,10‑脱水二氢青蒿素是通过减少Th17和Th1的分化比例缓解EAE发病严重度。总而言之，我们的数据表明9,10‑脱水二氢青蒿素在调控MS病理中具有关键作用，可为MS治疗提供新可供选择的药物。

Description

9,10-脱水二氢青蒿素的预防和治疗多发性硬化症药物应用

技术领域

本发明涉及生物药技术领域，具体为9,10-脱水二氢青蒿素(9,10-Anhydrodehydroartemisinin)在作为预防和治疗多发性硬化症药物中的应用。

背景技术

多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)被认为是一种典型的由T细胞介导的中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)自身免疫性炎症性疾病，EAE是一种已知的因与MS具有相似的临床、组织和病理相似性而广泛使用的MS动物模型，CD4⁺自反应性T细胞的激活和分化成为Th1细胞在疾病的起始阶段为关键步骤，这些细胞同样在疾病的长期进化中扮演着重要角色，后续研究表明Th17细胞为另一种在EAE发病过程中具有重要致病性的T细胞。其所分泌的细胞因子如IL-17,IL-21,IL-22和IFN-γ可以直接作为炎症因子作用于靶细胞，最终导致炎症的产生和组织器官的损伤。虽然对于MS的发病机制的研究已经进行了相当漫长的时间，但是对其治疗的探索仍然是巨大的挑战。这更加促使我们找到一种更有效的疾病缓解疗法。

青蒿素是一种植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物。分子式为：C₁₅H₂₂O₅，分子量为282.33。目前研究人员已经陆续提取合成了多种青蒿素衍生物，如双氢青蒿素、青蒿琥脂等。青蒿素主要用于治疗疟疾，具有疗效高、起效快、不良反应小等优势。据文献报道，青蒿素及其衍生物可通过改善胰岛素抵抗、诱导胰岛α细胞转变为类β细胞，减少尿蛋白排泄,减轻肾脏及心肌纤维化程度，缓解糖尿病及肾脏、心脏等重要器官并发症。同时，越来越多的证据表明青蒿素及其衍生物除具有抗病毒、抗菌、抗炎性反应、调节免疫等作用，还可抑制肿瘤增殖、诱导细胞凋亡、抑制血管再生、抑制肿瘤细胞的转移或侵袭,发挥肿瘤抑制作用。现有多项研究发现青蒿素家族药物对T细胞有免疫调节作用，但如何开发针对性强、特异性高、作用机制明确、毒副作用小的青蒿素类抗自身免疫病新药成为研究重点。

发明内容

本发明目的在于公开一种9,10-脱水二氢青蒿素(9,10-Anhydrodehydroartemisinin)在作为预防和治疗多发性硬化症药物中的应用。

在该研究中，我们发现青蒿素的新型衍生物—9,10-脱水二氢青蒿素治疗组小鼠明显缓解了EAE临床症状和减少的炎症细胞对中枢神经系统的浸润。进一步研究表明，9,10-脱水二氢青蒿素以剂量依赖的方式减少Th17和Th1的分化比例。总而言之，我们的研究数据表明9,10-脱水二氢青蒿素作为来源于植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物可以为治疗MS提供一种新的药物选择。

本发明中，所述9,10-脱水二氢青蒿素为一种已知小分子化合物。该化合物可以从商业渠道购买获得(http://www.zzsrm.com/product.asp)

所述9,10-脱水二氢青蒿素，也可以通过人工合成来得到此小分子化合物，合成方法已为现有技术。合成方法参考文献(Li,Ying；Yu,Peilin；Chen,Yixin；Li,Liangquan；Gai,Yuanzhu；Wang,Desheng；Zheng,Yaping.Studies on analogs ofartemisinine.I.The synthesis of ethers,carboxylic esters and carbonates ofdihydroartemisinine(author's transl)，July 1981 Yao xue xue bao＝Actapharmaceutica Sinica 16(6):429-39)进行。

附图说明

图1为实施例1中9,10-脱水脱氢青蒿素抑制离体Th1和Th17细胞分化

图2为实施例1中9,10-脱水脱氢青蒿素缓解EAE小鼠临床症状

图3为实施例1中9,10-脱水脱氢青蒿素抑制体内Th1和Th17细胞分化

具体实施方式

多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)及其动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)，是一种中枢神经系统(CNS)的慢性神经炎和脱髓鞘疾病。其中，免疫系统中多种成分与中枢神经系统中复杂元素之间的相互作用决定了MS的发病机理。IL-17分泌细胞(Th17)和IFN-γ分泌细胞(Th1)在多种自身免疫疾病包括多发性硬化症中均具有致病性。在此研究中，我们发现9,10-脱水二氢青蒿素(9,10-Anhydrodehydroartemisinin)可以通过抑制Th17和Th1的分化缓解MS病理。通过EAE动物模型，我们发现与对照组相比，9,10-脱水二氢青蒿素治疗组小鼠EAE症状明显缓解，包括具有更低的临床评分、减少的中枢神经系统白细胞浸润和减弱的脱髓鞘。并且，作为MS主要致病效应细胞的Th17和Th1在外周和中枢神经系统中比例均明显的降低。其外周血中IFN-γ和IL-17的分泌量也显著下降。综合结果表明9,10-脱水二氢青蒿素是通过减少Th17和Th1的分化比例缓解EAE发病严重度。总而言之，我们的数据表明9,10-脱水二氢青蒿素在调控MS病理中具有关键作用，可为MS治疗提供新可供选择的药物。

以下结合实施例和附图对本发明技术方案做进一步说明。

实施例1

材料与方法

动物

C57BL/6小鼠购自南京模式动物中心(南京，中国)。所用C57BL/6小鼠为8-10周龄，饲养于同济大学实验动物中心SPF级实验室，自由食用水和饲料。所有实验均获得批准，并按照同济大学的动物保护委员会的指导进行。

EAE诱导及治疗

C57BL/6小鼠(8-10周)皮下注射200μg完全溶于完全弗氏佐剂并包含有热灭活结核杆菌(H37Ra，5mg/ml，BD Diagnostics)的MOG_35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)。免疫第0天及第2天每只小鼠腹腔注射200ng/只百日咳毒素(Calbiochem)。每天根据临床症状为小鼠评分，评分标准如下：0分，无临床症状；1分，尾部瘫痪；2分，轻度瘫痪(单侧或双侧后肢无力，不完全瘫痪)；3分，截瘫(双侧后肢完全瘫痪)；4分，截瘫并前肢无力或瘫痪；5分，濒死状态或死亡。药物治疗，9,10-脱水二氢青蒿素溶于0.5％CMC-Na中并按照(10mg/kg,30mg/kg,100mg/kg)剂量在免疫前3天灌胃给药直至实验结束，相同体积的200μL 0.5％CMC-Na溶液作为对照。

组织病理和免疫组织化学分析

每只小鼠用200μL 10％水合氯醛进行深度麻醉，然后0.9％NaCl心脏灌流去除各器官中的外周血，4％(w/v)多聚甲醛灌流进行固定。取腰髓组织样品4％多聚甲醛4℃固定过夜。石蜡包埋后H&E染色分析炎症浸润，快蓝染色分析脊髓脱髓鞘，Image-Pro软件进行统计分析。

细胞染色和流式分析

脾脏细胞或体外CD4⁺T分化实验细胞用PMA(50ng/ml；Sigma-Aldrich)、ionomycin(750ng/ml；Sigma-Aldrich)和brefeldin A(5μg/ml；Sigma-Aldrich)37℃刺激5小时。细胞表面标记CD4(1994141,1:100；Invitrogen)用抗体4℃避光染色30min，然后细胞用固定通透液重悬，分别进行胞内IL-17A(BioLegend，506904，1:100)和IFN-γ(BioLegend，505810，1:100)染色。流式分析为BD FACS Verse系统，并用Flow Jo V10软件进行分析。

中枢神经系统浸润细胞分离和分析

脑和脊髓用预冷的组织匀浆器进行匀浆，70μm细胞滤网过滤收集至15ml离心管中，500g 4℃离心10min获得细胞，然后将细胞重悬在8ml 37％Percoll中。在15ml离心管中先轻轻加入4ml 70％Percoll，瞬时离心去除离心管壁上残留的70％Percoll，避免与后面加入的37％Percoll互溶；沿着管壁缓缓加入37％Percoll细胞悬液，避免破坏界面层。780g25℃密度梯度离心25min，收集位于37/70％Percoll界面处的细胞，进行分析。

CD4⁺ T细胞分离和体外分化

磁珠(Invitrogen,11415D)分离7-8周C57BL/6小鼠脾中CD4⁺T细胞，4×10⁵细胞/孔接种至96孔板中，加入200μL包含10％FBS、2mML-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇的1640完全培养基进行培养，加入anti-CD3(2μg/ml；BD Pharmingen)和anti-CD28(2μg/ml；BDPharmingen)抗体激活细胞，加入IL-12(10ng/ml；Peprotech)和anti-IL-4(10μg/ml；BDPharmingen)诱导Th1细胞分化。对于Th17细胞分化，除了加入anti-IL-4(10μg/ml)andanti-IFN-γ(10μg/ml，BD Bioscience，551216)抗体外还需加入Th17“细胞因子混合物”，包括IL-6(30ng/ml)、TGF-β1(3ng/ml),TNF-α(10ng/ml)和IL-1β(10ng/ml)。不同浓度的9,10-脱水二氢青蒿素与细胞因子一同加入，培养3天后收集培养上清和细胞，评估其对各种T细胞亚型分化的影响，

ELISA检测外周血中炎症因子表达

9,10-脱水脱氢青蒿素(100mg/kg体重)或溶媒(0.5％CMC-Na)处理小鼠构建EAE模型。在建模第6天时，从眼眶静脉血中收集血清约150μl。眼眶静脉血在室温静置30分钟。30分钟后，通过在4℃下以4000rpm离心10分钟，仔细收集上清，尽可能不要吸到下方的沉淀，获得血清。根据制造商的说明，使用特定的ELISA试剂盒(eBioscience)测量血清中IL-17A和IFN-γ的浓度。

统计分析

EAE小鼠处理组间统计学差异用two-way ANOVA test分析，两组间特定某一天的临床评分统计学差异用Mann–Whitney U-test分析，其他数据统计用Student’s t-test分析，数据表示为mean±SEM，P＜0.05被认为有统计学意义。

结果

一、9,10-脱水脱氢青蒿素抑制离体Th1和Th17细胞分化

9,10-脱水脱氢青蒿素的化学结构式如Fig1A所示，为一种青蒿素的衍生物，对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用，能迅速控制临床发作及症状。但是对多发性硬化症是否有治疗效果尚未知晓。通常认为分泌IFN-γ的Th1细胞和分泌IL-17A的Th17细胞是引起EAE的主要病理性效应T细胞。CD4⁺T细胞在EAE发病的病理过程中不可或缺的作用使我们推测9,10-脱水脱氢青蒿素能否影响T细胞亚型的分化。我们取6-8周的C57BL/6小鼠的脾脏，通过CD4⁺T细胞的分选，得到未经分化的Th0细胞，再在Th1和Th17细胞的分化条件下进行培养，同时给予不同剂量的9,10-脱水脱氢青蒿素(100nM,300nM,1μM,3μM,10μM)。离体培养3天后，经流式分析发现，9,10-脱水脱氢青蒿素治疗组与对照组相比Th1和Th17细胞比例明显下降，进一步分析结果发现：9,10-脱水脱氢青蒿素浓度越高，其抑制T细胞向h1和Th17细胞分化的程度也越明显，如图1B和图1C所示。

图1A：9,10-脱水脱氢青蒿素化学结构

图1B，图1C：从6-8周大的C57BL/6小鼠脾脏分离得到的幼稚CD4⁺T细胞在体外以不同的分化条件诱导分化为Th1和Th17细胞，并加入不同浓度(100nM,300nM,1μM,3μM,10μM)的9,10-脱水脱氢青蒿素或溶媒，培养3天。Th1(见图1B)和Th17(见图1C)细胞通过FACS进行细胞内IFN-γ和IL-17A染色监测和分析。IFN-γ⁺和IL-17A⁺T细胞百分比的统计分析。*p<0.05，***p<0.01(Student's t test).

二、9,10-脱水脱氢青蒿素缓解EAE临床症状

多发性硬化症为一种常见的自身免疫疾病，同时也是一种免疫介导脱髓鞘和中枢神经系统的退行性疾病。其发病与Th1和Th17细胞分化比例增高有关。而我们的结果发现9,10-脱水脱氢青蒿素可有效抑制Th1和Th17细胞分化比例。因此，我们进一步评估9,10-脱水脱氢青蒿素是否对多发性硬化症具有一定的治疗作用。首先，8-10周C57BL/6雄鼠用MOG_35-55诱导EAE模型，然后分别用不同剂量的9,10-脱水脱氢青蒿素(10mg/kg,30mg/kg,100mg/kg)在免疫后第三天灌胃给药，对照组给予相同体积200μL0.5％CMC-Na溶液作为对照。

每天评估EAE临床评分直至实验结束，结果如Fig2A所示，结果表明9,10-脱水脱氢青蒿素可在EAE发病后期显著缓解疾病的严重程度、降低EAE临床评分。分析三种不同浓度的9,10-脱水脱氢青蒿素的抑制效果发现，浓度越高，抑制效果越明显。

在免疫小鼠的第18天取白细胞浸润最明显、脱髓鞘最严重的中腰段脊髓进行组织学分析，检测中枢神经系统白细胞的浸润及髓鞘损伤情况，如Fig2B所示，HE染色结果表明9,10-脱水脱氢青蒿素治疗组与对照组相比脊髓中白细胞浸润明显降低，Fig2C所示，快蓝染色结果同样表明治疗组脱髓鞘程度明显减弱，Image-Pro软件进行统计分析，结果见Fig2D和2E，治疗组和对照组之间具有统计学意义。

总之，研究数据表明9,10-脱水脱氢青蒿素对EAE具有一定的疗效和保护作用。

图2A：10mg/kg,30mg/kg,100mg/kg体重9,10-脱水脱氢青蒿素免疫后第3天200μL/只小鼠灌胃给药，相同体积的0.5％CMC-Na溶液做对照，检测EAE临床评分，数据表示为mean±SEM(n＝10)，***p<0.001(two-way ANOVA test)。

图2B：在EAE免疫小鼠的第18天取中腰段脊髓，石蜡包埋切片，进行H&E染色和快蓝染色Scale bars,200μm，并对中枢细胞浸润和脱髓鞘情况进行统计分析(图2C和图2D)，每组取3只小鼠颈椎脱臼处死，每只小鼠切15张片子，进行统计学分析。**p<0.01，***p<0.001(Student's t test).

三、9,10-脱水脱氢青蒿素抑制体内Th1和Th17细胞分化

免疫构建EAE模型的第18天，取小鼠的脊髓和脑，通过胞内染色和流式分析检测浸润至脊髓和脑中的与疾病活性有关的Th1、Th17细胞比例。经流式分析发现，中枢神经系统浸润细胞中，9,10-脱水脱氢青蒿素治疗组与对照组相比CD4⁺T细胞数量整体下降，对CD4⁺T细胞中的Th1和Th17细胞进行染色，结果发现比例明显下降，如图3A-图3D所示。多发性硬化症作为一种外周免疫系统中免疫细胞引发的一种自身免疫疾病，据文献报道T细胞、B细胞和单核细胞参与多发性硬化症的病理过程。为进一步分析外周免疫系统中Th1和Th17细胞分化比例，我们取淋巴结并利用流式分析其中Th1和Th17细胞分化比例。结果显示9,10-脱水脱氢青蒿素治疗组的淋巴结中Th1和Th17细胞分化比例明显降低，如图3E-图3F所示。

IL-17A是Th17细胞所分泌的主要炎症效应因子，IFN-γ是Th1细胞所分泌的主要炎症效应因子。因此，我们进一步通过ELISA检测外周血中IFN-γ和IL-17A的分泌情况，结果表明9,10-脱水脱氢青蒿素治疗组与对照组相比IFN-γ和IL-17A分泌量明显降低，具有统计学差异。见图3G-图3H所示。

以上数据表明9,10-脱水脱氢青蒿素通过在外周和中枢神经系统中抑制Th1和Th17分化，减少IFN-γ和IL-17A分泌量而发挥治疗EAE的作用。

图3：9,10-脱水脱氢青蒿素抑制体内Th1和Th17细胞分化

图3A-图3D：在免疫构建EAE模型的第14天，用37/70％Percoll分离浸润至中枢神经系统中的细胞，流式细胞仪分析定量，Th1和Th17细胞比例的代表性流式图及统计数据。

图3E-图3F：100mg/kg体重9,10-脱水脱氢青蒿素给药治疗组和对照组EAE小鼠淋巴结中Th1和Th17细胞比例统计数据。

图3G-图3H：ELISA检测外周血清中的IFN-γ和IL-17A。数据用mean±SEM表示，每组n＝5-10，^*p<0.05(Student's t test)。

四、讨论

多发性硬化症是一种常见的神经系统的炎症性和脱髓鞘疾病，其中高加索人有较高患病率，比例大概为0.05–0.15％，多发性硬化症病人常伴有行走困难、痉挛和认知障碍，通常中青年起病，年龄一般在20-40岁之间，而且女性发病率通常高于男性。目前比较公认的是T细胞在多发性硬化各发展过程中均起到关键性作用包括慢性炎症、初始脱髓鞘和轴突脱髓鞘。Th1细胞一直被认为是介导多发性硬化发病的主要效应性T细胞，最近研究结果表明分泌IL-17的Th17同样具有致病性，这促使我们推测封闭Th1或/和Th17细胞分化也许对治疗多发性硬化症具有一定的作用。尽管抗原本身的性质、对细胞表面受体的亲和力以及共刺激分子的有效性均调控起始细胞因子的产生并影响T细胞分化命运，但影响T细胞分化主要决定因素是抗原呈递中细胞因子微环境。进一步的临床试验启动以评估封闭IL-17细胞因子对人自身免疫疾病的治疗作用，欧洲风湿病防治联合会议报道称两种靶向于IL-17A的人源化单克隆抗体在类风湿关节炎中发挥了令人意想不到的效果，因此，封闭参与病理性CD4⁺T细胞分化和功能的细胞因子也许为治疗多发性硬化症提供一种新的选择。

目前为止，尚没有一种药可以完全治愈多发性硬化症，美国食品和药品管理局批准的药物仅可以缓解疾病的进程或者降低疾病的活性，并伴有一系列副作用。治疗多发性硬化症代表性的一线药物为I型干扰素和醋酸格拉替雷，它们被认为是通过干扰T细胞激活和降低T细胞数量来发挥作用，然而它们并不能恢复已经损伤的中枢神经系统，并伴有注射疼痛、心跳加快、气短和流感样症状。富马酸二甲酯及其活性代谢产物据报道可降低氧化应激，保护轴突免受炎性介质的影响，但其同样也伴有潮红、头痛、腹痛和疲劳的副作用。米托蒽醌因引起心肌病、白细胞减少、白血病和感染而退居为治疗多发性硬化症的二线药物，克拉屈滨治疗的患者也同样经历轻微的感染，因此，这极大的促使患者寻找可供替代的药物，一种具有明确疗效和更少副作用的治疗多发性硬化症的药物是急需的。

MS是机体神经系统的炎症性脱髓鞘疾病，属于CD4⁺T细胞介导的一种自身免疫病。有研究表明青蒿素腹腔注射可以降低EAE小鼠Th1细胞比例和促炎细胞因子IFN-γ的分泌，提高Th2细胞比例和抑炎细胞因子IL-4的分泌，使Th1/Th2平衡向Th2移动，缓解小鼠EAE症状。另有研究表明青蒿素通过抑制Th1、Th17细胞，提高Treg细胞比例，改善小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的症状，具有免疫调节作用。目前对于青蒿素的研究主要是在保留过氧键的基础上，引入一些亲水亲脂基团进行结构修饰，合成新的青蒿素衍生物。通过这种改良方式得到治疗效果更迅速、毒副作用更小的新型青蒿素衍生物。

我们的研究数据表明9,10-脱水脱氢青蒿素可以缓解EAE病理，9,10-脱水脱氢青蒿素治疗后EAE小鼠临床评分降低、白细胞浸润情况降低以及脱髓鞘现象减弱。关于多发性硬化症免疫病理的大量研究表明在多发性硬化症中免疫反应涉及到一系列免疫细胞。多发性硬化症主要是CD4⁺T细胞介导的可影响中枢神经系统的自身免疫性疾病，已知Th1和Th17细胞在EAE病理中扮演着重要角色，我们的研究结果表明9,10-脱水脱氢青蒿素在体内和体外均可影响Th1和Th17的分化。更有趣的现象是不同浓度的9,10-脱水脱氢青蒿素对体外Th1和Th17的分化影响存在剂量相关性：9,10-脱水脱氢青蒿素浓度越高，抑制分化效果越好。而在体的动物实验也得出相同结论。外周血清的ELISA结果表明100mg/kg的9,10-脱水脱氢青蒿素治疗可显著降低外周血清中IFN-γ和IL-17A的含量，这进一步表明9,10-脱水脱氢青蒿素可抑制Th1和Th17细胞分化。这些实验结果为将来进一步研究提供了扎实的前期结果。

总而言之，我们证明了9,10-脱水脱氢青蒿素可以通过抑制体内中枢神经系统和外周免疫系统中Th1和Th17分化来缓解EAE临床和组织病理状况，为9,10-脱水脱氢青蒿素能够有效干预多发性硬化症患者及其他自身免疫性疾病和炎症性疾病进行的临床指标提供了理论依据。

Claims

1.一种9,10-脱水二氢青蒿素(9,10-Anhydrodehydroartemisinin)在作为预防和治疗多发性硬化症药物中的应用。

2.如权利要求1所示应用，其特征在于，为治疗MS提供一种新的药物选择。