CN113209299B

CN113209299B - Ep4受体激动剂和拮抗剂在调控滤泡辅助性t细胞分化中的应用

Info

Publication number: CN113209299B
Application number: CN202110495033.8A
Authority: CN
Inventors: 钮晓音
Original assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: CN113209299A

Abstract

本发明公开了一种EP4受体激动剂和拮抗剂在调控滤泡辅助性T细胞分化中的应用，具体地，EP4受体激动剂能诱导初始CD4⁺T细胞向Tfh细胞分化，而EP4受体拮抗剂能阻断初始CD4⁺T细胞向Tfh细胞分化，可用于Tfh细胞免疫调节功能失调的相关疾病。

Description

EP4受体激动剂和拮抗剂在调控滤泡辅助性T细胞分化中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及EP4受体激动剂和拮抗剂在调控滤泡辅助性T细胞分化中的应用。

背景技术

T细胞和B细胞是免疫系统的重要组成部分，是免疫应答的核心成员。当遭遇病毒、微生物感染或疫苗接种后，机体会产生保护性免疫应答以抵抗抗原入侵。分化成熟的T细胞和B细胞能特异性识别抗原而活化、增殖、分化、产生细胞免疫和体液免疫应答，并发挥重要的免疫调节作用。T细胞主要在对抗病原微生物的反应中发挥重要的作用，B细胞则主要通过分化为浆细胞并产生中和性抗体参与免疫应答。抗体的产生依赖生发中心(germinalcenter，GC)反应，有一类T细胞可以迁移到B细胞滤泡，通过提供辅助刺激信号参与GC反应的不同阶段，在B细胞活化成熟及抗体产生的过程中发挥重要的作用。这一类提供辅助刺激信号协助GC反应的T细胞亚群被定义为滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell，Tfh)。Tfh细胞不同于其他辅助性T细胞，它有着独特的表型，细胞膜表面高表达趋化因子受体5(CXCR5)、可诱导共刺激分子(ICOS)和程序性死亡蛋白-1(PD-1)，其细胞核内关键性转录因子是B细胞淋巴瘤家族基因6(Bcl6)。

Tfh细胞的分化通常开始于初始CD4⁺T细胞与髓样抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，APCs)的相互作用。Tfh分化是一个多阶段，多因素的过程，在很大程度上可以模型化为成为Tfh细胞和非Tfh效应细胞(例如Th1，Th2或Th17细胞)之间的早期细胞命运决定事件，Tfh与非Tfh细胞之间的命运选择主要是在前两个细胞分裂周期内决定出的。正常的Tfh细胞分化通常需要两个APC：树突状细胞(dendritic cell，DC)和B细胞，Tfh细胞分化初期通常需要DC细胞的辅助，而分化后期以及GC-Tfh细胞的完全成熟则需要B细胞。因为在免疫反应初期抗原特异性B细胞很少，分化初期B细胞通常无法启动CD4⁺T细胞应答；然而，B细胞可以在一定条件下引发Tfh细胞反应。B细胞可以产生多种细胞因子，包括可以对小鼠Tfh细胞分化起到促进作用的白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)。IL-6和共刺激分子ICOSL是早期参与小鼠Tfh分化的因子；T细胞受体(TCR)信号也在Tfh细胞分化中起重要作用；白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)是Tfh细胞分化最有效的抑制剂。非Tfh效应细胞分化成熟后注定主要离开淋巴样组织并向感染或炎症部位的迁移，因为大多数非Tfh细胞的主要功能是在炎症部位发挥抗炎或免疫调节等作用，而分化成熟后的Tfh细胞停留在淋巴结和脾脏中，因为它们的目的是辅助B细胞及GC反应。

Tfh细胞的主要功能是在感染性疾病中起到保护作用。在Tfh细胞缺乏的情况下，针对牛痘病毒感染的IgG反应降低了98％。Tfh细胞分泌的IL-21，与B细胞表面IL-21R结合后，起到促进B细胞活化增殖和诱导自身抗体产生的作用，进而参与体液免疫应答。在小鼠、非人类灵长类动物(NHP)和人类中，已证明感染性疾病中Tfh细胞在产生抗体的免疫应答中的重要性。Tfh细胞在小鼠和人类中均与多种自身免疫性疾病相关。在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中，Tfh细胞比例明显增加。在人类中，大多数产生自身抗体的B细胞发生体细胞突变，表明它们很可能是由GC反应产生的。在系统性红斑狼疮(SLE)患者血液中激活的Tfh细胞的频率增加。在类风湿关节炎患者体内，CD4⁺CXCR5⁺Tfh细胞比例和血清IL-21水平均明显增高；在胶原诱导性关节炎、系统性红斑狼疮等中均存在Tfh细胞的过度增殖。Tfh细胞功能亢进会过度激活其辅助的自身反应性B细胞，进而分化成大量的浆细胞及记忆性B细胞，诱导产生病理性的高亲和力自身抗体，介导自身免疫性疾病的发生。基于IL-2是Tfh细胞的有效抑制剂，低剂量IL-2被认为是SLE的治疗方法。此外，Tfh细胞也与I型糖尿病、桥本甲状腺炎等自身免疫性疾病有密切相关。Tfh细胞还在过敏反应、心脏疾病、器官移植排斥及癌症中发挥着重要的作用，因此，Tfh细胞广泛参与到自身免疫性疾病的发病机制中。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种调控滤泡辅助性T细胞分化的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种调控滤泡辅助性T细胞分化的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种EP4受体激动剂和拮抗剂在调控滤泡辅助性T细胞分化中的应用，所述EP4受体激动剂用于促进所述滤泡辅助性T细胞的分化，所述EP4受体拮抗剂抑制所述滤泡辅助性T细胞的分化。

进一步地，所述EP4受体激动剂包括PGE2、CAY10580、CAY10598、L-902,688、KMN-80、AFP 07、Misoprostol、激动型抗-EP4受体抗体中的一种或多种。

进一步地，所述EP4受体拮抗剂包括AH 23848、E7046、AAT-008、ONO-AE3-208、MF498、CJ-023423、L-161,982、GW 627368X、BGC 20-1531、CJ-42794、ASP7657、CJ-42794、抑制型抗-EP₄受体抗体中的一种或多种。

本发明第二方面提供了一种滤泡辅助性T细胞组合物，通过上述任一所述EP4受体激动剂和拮抗剂对CD4⁺T细胞调控得到。

本发明第三方面提供了一种制备滤泡辅助性T细胞组合物的方法，所述方法包括如下步骤：

在所述CD4⁺T细胞中加入上述任一所述的EP4受体激动剂或拮抗剂。

本发明第四方面提供了上述滤泡辅助性T细胞组合物在制备治疗或预防与滤泡辅助性T细胞免疫调节功能失调相关疾病药物中的应用。

进一步地，所述与滤泡辅助性T细胞免疫调节功能失调相关疾病包括肿瘤、病毒感染、类风湿关节炎、器官移植、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、Graves病、桥本氏甲状腺炎、自身免疫性肾炎、自身免疫性神经疾病、糖尿病、传染性疾病、变态反应性疾病中的一种或多种

进一步地，所述药物还包括药学上、免疫学上或保健品学上可接受的载体。

本发明第五方面提供了一种制备滤泡辅助性T细胞组合物的试剂盒，所述试剂盒包括CD4⁺T细胞以及上述任一所述的EP4受体激动剂和拮抗剂。

进一步地，所述CD4⁺T细胞来源于哺乳动物的白细胞分离物、血液、淋巴系统、骨髓、脾脏中的一种。

本发明提供了EP4受体激动剂或拮抗剂对Tfh细胞分化的调控方法，EP4受体激动剂能在体外培养中诱导初始CD4⁺T细胞向Tfh细胞分化，而EP4受体拮抗剂能在体外培养中阻断初始CD4⁺T细胞向Tfh细胞分化，可用于Tfh细胞免疫调节功能失调的相关疾病。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1为实施例1中CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞的流式代表图；

图2为实施例1中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞的流式代表图；

图3为实施例1中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞的流式代表图；

图4为实施例1中CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的流式代表图；

图5A为实施例1中CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞比例的流式统计图；

图5B为实施例1中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞比例的流式统计图；

图5C为实施例1中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞比例的流式统计图；

图5D为实施例1中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例的流式统计图；

图6为实施例2中CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞的流式代表图；

图7为实施例2中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞的流式代表图；

图8为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞的流式代表图；

图9为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的流式代表图；

图10A为实施例2中CD4+Bcl-6+Tfh细胞比例的流式统计图；

图10B为实施例2中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞比例的流式统计图；

图10C为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞比例的流式统计图；

图10D为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞比例的流式统计图；

图11为实施例3脾脏大小分析结果；

图12为实施例4各组小鼠脾脏CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的比例分析结果；

图13为实施例5的的关节评分结果；

图14为实施例6提供的分析结果。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

前列腺素E₂(prostaglandin E₂，PGE₂)是花生四烯酸的代谢产物，几乎所有类型的细胞和组织都能分泌PGE₂。作为一种类脂激素样信号分子，尽管PGE₂的半衰期短，产生后将被肺或肝迅速降解，肺是参与PGE₂代谢的主要器官，但它在介导炎症和多种生理过程中起着重要作用。在细胞质中合成好并分泌出后，PGE₂与膜受体结合从而激活下游信号通路并发挥生物学作用。PGE₂的受体为E类前列腺素(E prostanoid，EP)受体，是一种G蛋白偶联受体，共有四种亚型EP1，EP2，EP3和EP4，各EP受体在不同组织中表达水平不同，可以与不同的G蛋白偶联后产生不同信号，分别激活不同的下游信号通路，从而介导PGE₂的各种生物学功能。PGE₂在生理和病理生理状况中发挥着各种复杂的免疫调节作用。在T细胞膜上主要表达EP2和EP4受体，它们参与了调节T细胞免疫应答的功能，以下主要从体外实验和小鼠自身免疫性疾病模型两个大方面对EP4受体调控Tfh细胞的分化进行详细阐述。

(一)体外实验

实施例1

MACS磁珠分选

CD4⁺T细胞后，平行设置以下八组实验：空白组、IL-21组、neutral+PEG2组、IL-21+PEG2组、17-phenyl trinor Prostaglandin E2组、Butaprost组、Sulprostone组以及CAY10580组，诱导

CD4⁺T细胞向Tfh细胞分化，培养4天后收集细胞，并使用流式细胞术分别检测CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞、CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞、CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞以及CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的比例变化。

图1为实施例1中CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞的流式代表图，图2为实施例1中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞的流式代表图，图3为实施例1中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞的流式代表图，图4为实施例1中CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的流式代表图，图5A为实施例1中CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞比例的流式统计图，图5B为实施例1中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞比例的流式统计图，图5C为实施例1中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞比例的流式统计图，图5D为实施例1中CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例的流式统计图。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。独立重复实验3次。

根据图1-5可知，我们在体外诱导

CD4⁺T细胞向Tfh细胞分化的实验中分别加入四种EP受体激动剂，观察EP1、EP2、EP3、EP4四种受体激动剂对Tfh细胞分化的影响。实验中我们分别使用CD4⁺Bcl-6⁺、CD4⁺IL-21⁺、CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺以及CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺等标识组合进行流式染色，检测Tfh细胞。流式结果所示，在加入Butaprost(EP2受体激动剂)和CAY10580(EP4受体激动剂)后，Tfh细胞分化比例明显升高，与加入IL-21+PGE2诱导比例相近，而17-phenyl trinor Prostaglandin E2(EP1受体激动剂)和Sulprostone(EP3受体激动剂)则不能模拟这种调节作用，且Butaprost和CAY10580对于Tfh细胞比例影响的差异具有统计学意义，并且单独的EP4受体激动剂CAY10580对Tfh细胞分化比例影响最大。

因此，通过在诱导Tfh细胞分化条件中使用EP1-EP4受体激动剂发现，EP4受体激动剂可以单独最有效地促进Tfh细胞的分化。

实施例2

MACS磁珠分选

CD4⁺T细胞后，平行设置以下八组实验：neutral组、IL-21组、neutral+PGE2组、IL-21+PEG2组和四种EP受体拮抗剂，即SC-51322、AH 6809、L-798,106和AH 23848，诱导分化培养4天后收集细胞，流式细胞术分别检测CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞、CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞、CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞以及CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的比例变化。

图6为实施例2中CD4⁺Bcl-6⁺Tfh细胞的流式代表图，图7为实施例2中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞的流式代表图，图8为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞的流式代表图，图9为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的流式代表图，图10A为实施例2中CD4+Bcl-6+Tfh细胞比例的流式统计图，图10B为实施例2中CD4⁺IL-21⁺Tfh细胞比例的流式统计图，图10C为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺ICOS⁺Tfh细胞比例的流式统计图，图10D为实施例2中CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞比例的流式统计图。*，P<0.05；**，P<0.01。

通过激动剂诱导分化实验，我们得知EP4受体激动剂对Tfh细胞的分化有促进作用，下一步，我们验证EP受体拮抗剂对Tfh细胞分化的作用。我们在Tfh细胞分化的过程中分别加入EP1、EP2、EP3、EP4受体拮抗剂，观察它们对Tfh细胞分化的影响。如图所示，AH 23848(EP4受体拮抗剂)可以明显阻断Tfh细胞的分化，而其他三种受体拮抗剂，即SC-51322(EP1受体拮抗剂)、AH 6809(EP2受体拮抗剂)和L-798,106(EP2受体拮抗剂)则作用不明显，且AH23848的差异具有统计学意义。

根据图6-10可知，EP4受体拮抗剂可以阻断滤泡辅助性T细胞的分化，而EP1、EP2和EP3受体拮抗剂则不能。

(二)小鼠的自身免疫性疾病模型实验：

实施例3

采用OVA/Alum/LPS联合免疫与分组干预方法，取10mg OVA和1mg LPS溶解于10mLPBS溶液中。Alum佐剂按照1：1体积逐滴加入OVA/LPS溶液中并充分混匀30分钟制成混合物。免疫C57BL/6J(8-12周龄、雄性、近交系C57BL/6J)小鼠每只腹腔注射200μL OVA/Alum/LPS混合物(含有100μg OVA+10μg LPS)，并设置对照组，对照组小鼠腹腔注射200μL 1×PBS。第2天起，免疫小鼠随机分为PBS处理组(1×PBS)、EP2i处理组(EP2受体拮抗剂AH6809处理组，1mg/kg腹腔注射)和EP4i处理组(EP4受体拮抗剂E7046处理组，10mg/kg腹腔注射)，每只小鼠每天腹腔注射200μL相应药物，处理5天。7.5天后处死小鼠进行分析。构建OVA/Alum/LPS腹腔注射蛋白免疫模型是为了进行Tfh细胞的体内分化，在体内研究EP2和EP4受体拮抗剂对Tfh细胞的分化的影响。随后，对各组小鼠脾脏大小进行分析。图11为实施例3脾脏大小分析结果，如图11所示，EP4i处理组小鼠的脾脏明显小于PBS处理组和EP2i处理组。

实施例4

用流式细胞术对实施例3中的对照组小鼠、PBS处理组小鼠、EP2i处理组小鼠和EP4i处理组小鼠脾脏中免疫细胞进行分析，图12为各组小鼠脾脏CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞的比例及绝对细胞数分析结果，如图12所示，与对照组相比，PBS处理组与EP2i处理组脾脏CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例(PBS处理vs对照组，**，P<0.01；EP2i处理组vs对照组，**，P<0.01)和数量(PBS处理组vs对照组，***，P<0.001；EP2i处理组vs对照组，**，P<0.01)明显升高；EP4i处理组脾脏CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例升高不显著。与PBS处理组和EP2i处理组相比，EP4i处理组脾脏CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例(EP4i处理组vs PBS处理组，*，P<0.05；EP4i处理组vs EP2i处理组，*，P<0.05)和数量(EP4i处理组vs PBS处理组，***，P<0.001；EP4i处理组vs EP2i处理组，*，P<0.05)显著降低，比较差异有统计学意义，由此提示EP4受体拮抗剂可抑制Tfh细胞的分化。

实施例5

建立CIA模型，进行分组干预。用0.05mol/L冰乙酸溶解CII至4mg/ml，4℃搅拌过夜，次日取CII与等体积CFA充分乳化(冰上操作)至油包水状态，使胶原浓度为2mg/ml；初次免疫时，于DBA/1J小鼠(8-10周龄、雄性、近交系SPF级DBA/1J小鼠)尾根部皮下2～3cm处注射100μl乳化胶原，并设置对照组(Control组)；初次免疫后第11天，模型小鼠随机分为空白组(Neutral组，1×PBS)和EP4i处理组(EP4拮抗剂组，E7046腹腔注射10ml/kg)，每组3只，每只小鼠每天腹腔注射200μl相应药物，处理10天。初次免疫后第21天，取CII与等体积CFA充分乳化(冰上操作)至油包水状态，使胶原浓度为2mg/ml，于上次注射位置后移1厘米处注射100μl乳化胶原加强免疫。加强免疫后每天通过小鼠关节肿胀程度进行疾病评分。加强免疫后21天处死，进行分析。

CIA评分标准0分：无红肿；1分：局限的足或踝关节轻度红肿；2分：关节和足趾轻度肿胀；3分；足趾和踝关节全部肿胀；4分；踝关节至全爪红肿或关节畸形，每只小鼠四肢评分相加总评分为小鼠关节炎指数。

图13为实施例5的CIA小鼠模型关节评分结果，如图13所示，在CIA小鼠模型中，运用EP4受体拮抗剂处理发现，PBS处理组小鼠在加强免疫后第4天开始发病，而EP4i处理组在加强免疫后第5天发病，晚于PBS处理组。与PBS处理组相比，EP4i处理组小鼠CIA疾病评分显著降低(*，P<0.05)，提示EP4受体拮抗剂可减缓CIA的起病，并减轻疾病的严重程度。

实施例6

使用流式细胞检测术对小鼠脾脏细胞中Tfh细胞亚群比例进行检测。取实验小鼠脾脏进行研磨，通过70μm滤网之后裂解红细胞，制备成单个核细胞悬液。每只小鼠取1×10E6细胞于100μL FACS Buffer，与V450-抗小鼠-CD4、PE-Cy7-抗小鼠-CXCR5和APC-抗小鼠-PD-1孵育30min，之后用200μL FACS Buffer洗涤离心1500r/min 5min，洗涤后加200μLFACS buffer重悬细胞，使用FACS LSRFortessa X20检测，并用Flowjo软件进行分析。

用流式细胞术分析实施例5中对照组、PBS处理组和EP4i处理组小鼠脾脏中的Tfh细胞。图14为实施例6提供的分析结果，如图14所示，与对照组相比，PBS处理组和EP4i处理组小鼠脾脏CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺Tfh细胞比例(PBS处理vs对照组，****，P<0.0001；EP4i处理组vs对照组，***，P<0.001)和数量(PBS处理vs对照组，****，P<0.0001；EP4i处理组vs对照组，***，P<0.001)明显升高；与PBS处理组相比，EP4i处理组脾脏CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例(*，P<0.05)和数量(**，P<0.01)显著降低，比较差异有统计学意义，由此提示，在CIA发病过程中，脾脏Tfh细胞增加，而EP4受体拮抗剂可降低CIA小鼠模型中Tfh细胞的比例。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.EP4受体激动剂和拮抗剂在制备调控滤泡辅助性T细胞分化药物中的应用，其特征在于，所述EP4受体激动剂用于促进所述滤泡辅助性T细胞的分化，所述EP4受体拮抗剂用于抑制所述滤泡辅助性T细胞的分化；所述EP4受体激动剂为CAY10580；所述EP4受体拮抗剂为AH23848或/和E7046。

2.EP4受体拮抗剂在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用，其特征在于，所述EP4受体拮抗剂为E7046。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。