CN112305118A - L-辛酰基肉碱作为疾病诊断的生物标志物 - Google Patents

L-辛酰基肉碱作为疾病诊断的生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了L‑辛酰基肉碱作为疾病诊断的生物标志物，具体的涉及疾病为动脉粥样硬化性脑梗死。本发明公开了与动脉粥样硬化样本中的水平相比，L‑辛酰基肉碱在动脉粥样硬化脑梗死中的水平显著降低，能够有效的区分动脉粥样硬化群体和动脉粥样硬化性脑梗死群体。

Description

L-辛酰基肉碱作为疾病诊断的生物标志物
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及L-辛酰基肉碱作为疾病诊断的生物标志物。
背景技术
脑梗死(cerebral infarction，是由于各种原因引起的供血血管狭窄甚至闭塞，造成局部脑血流量减少或中断产生的血管供应区脑组织功能损害和神经症状。目前国内公认的中国缺血性卒中亚型(Chinese ischemic stroke subclassification,CISS)将脑梗死分5型。其中，动脉粥样硬化性脑梗死是最常见的一种亚型，往往病情发展迅速，后果严重，预后差。随着我国人口老龄化的加剧、经济的飞快发展以及生活节奏变快，脑梗死的发病率正逐年上升，其较高的致残、致死率，越来越受到人们的关注，及早发现及积极治疗与脑梗死有关的危险因素，及早的预防脑梗死的发生、发展，进而减少脑梗死的发病率。
代谢组学起源于基因组学、转录组学、蛋白组学之后的一门新兴组学技术，是“系统生物学”的组成的重要部分。代谢组学主要研究对象为生物有机体内体液、细胞、组织中质量小于1000的小分子化合物，主要分析平台有色谱-质谱联用技术、核磁共振技术等高分辨率、高灵敏度、高通量的现代仪器分析。其通过定性或定量研究生物体内被扰动的代谢产物(内源性代谢物质)种类、数量、含量等变化，来揭示体内代谢通路的改变。代谢组学处于转录、基因和蛋白质表达的终端，能够直接、准确地反映生物体目前处于的病理生理状态，广泛的应用于疾病诊断、药物研发、营养学、毒理学、运动医学等领域，尤其是为临床疾病诊断提供可靠的理论依据及手段。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与动脉粥样硬化性脑梗死相关的生物标志物，通过检测生物标志物的水平，可以判断患者是否患有动脉粥样硬化性脑梗死，从而为动脉粥样硬化性脑梗死的早期诊断提供一种新的手段。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:
本发明提供了检测样本中L-辛酰基肉碱(L-Octanoylcarnitine)的试剂在制备诊断动脉粥样硬化性脑梗死的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法检测用试剂。
进一步，所述质谱法为色谱-质谱法。
进一步，所述质谱法为液相色谱-质谱法。
进一步，所述质谱法为串联质谱法。
进一步，所述串联质谱法选自离子阱质谱法、四极杆飞行时间质谱法、三重四极杆质谱法、四极杆离子阱质谱法、离子迁移率-四极杆离子阱-飞行时间质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、离子迁移率谱仪-四极杆离子阱质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、三重四级杆-轨道阱质谱法、四极杆离子阱-轨道阱质谱法、飞行时间或离子阱-傅立叶变换质谱法。
进一步，所述样本选自血液、血清、血浆。
本发明提供了一种诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒，所述试剂盒包含检测样本中L-辛酰基肉碱的试剂；以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患动脉粥样硬化性脑梗死的说明书。
进一步，所述试剂检测L-辛酰基肉碱的含量和/或浓度。
进一步，所述试剂盒还包括处理样本的试剂。
本发明提供了L-辛酰基肉碱在构建预测动脉粥样硬化性脑梗死的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统或装置中的应用。
本发明提供了L-辛酰基肉碱在制备治疗动脉粥样硬化性脑梗死的药物中的应用。
进一步，所述药物包含增加L-辛酰基肉碱水平的试剂。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了与动脉粥样硬化性脑梗死相关的生物标志物：L-辛酰基肉碱，通过检测生物标志物的水平，可以判断受试者是否患有动脉粥样硬化性脑梗死以及患动脉粥样硬化性脑梗死的风险，以期实现动脉粥样硬化性脑梗死早期的诊断，从而在脑梗早期进行干预治疗，提高患者的生活和生存质量。
附图说明
图1是OPLS-DA统计分析图，其中图A是反向色谱正离子统计分析图；图B是反向色谱负离子统计分析图；图C是亲水色谱正离子统计分析图。
图2是L-辛酰基肉碱在不同群组中的水平图。
图3是以L-辛酰基肉碱作为检测变量的诊断效能图。
具体实施方式
本发明为了评估代谢物与动脉粥样硬化性脑梗死之间的相关性，通过收集动脉粥样硬化患者与动脉粥样硬化性脑梗死的样本，综合分析样本的代谢组学，筛选在两个群组中含量呈现显著性差异的代谢物，并进一步分析差异代谢物的诊断效能，从而发现适于动脉粥样硬化性脑梗死诊断和治疗的生物标志物。
术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液(follicular fluid)，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液(tissue culture medium)，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。作为优选的实施方式，所述样本选自血液、血清、血浆。
术语“受试者”意指任何动物，还指人类和非人类的动物。术语“非人类的动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。
本发明一般涉及质谱技术用于鉴定从受试者获得的样中的生物标志物的用途。
如本领域技术人员所知，质谱仪通常由三个部件组成：离子源、质量分析器和检测器。离子发生器将一部分样品转化为离子。如下所述，根据样品的相(固体、液体、气体)和未知物种的各种电离机制的效率，存在各种各样的电离技术。质谱仪通常还包括提取系统，该提取系统从样品中去除离子，然后将离子通过质量分析器并且到达检测器上。片段的质荷比(m/z)的差异允许质量分析器通过它们的质荷比对离子进行分类。最后，检测器测量指示物的量的值，从而提供用于计算存在的每种离子的丰度的数据。
在典型的质谱分析程序中，第一步包括样品的电离。在一个实施方案中，电离包括电子电离(E1)，其包括用电子轰击样品。在另一个实施方案中，电离包括化学电离(CI)，根据该化学电离，离子通过分析物与存在于离子源中的反应气体的离子的碰撞产生(合适的反应气体的实例包括甲烷、氨和异丁烷)。在另一个实施方案中，电离包括大气压化学电离(APCI)。在另一个实施方案中，电离包括大气压光子电离(APPI)。
当电离是电子电离时，这通常导致质量离子具有与母体分子相同的质量(M)，但是带电荷(M+或M-)。当电离是化学电离时，这通常导致具有母体分子质量的质量离子和用于电离分子的化学物质，众所周知的实例包括[M+H]+、[M-H]-、[M+NH4]+和[M+Na]+。这种分子离子在本说明书中也称为“假分子离子”。
在另一个实施方案中，电离包括电喷雾电离(ESI)，其中含有目标分析物的液体通过电喷雾分散成细气溶胶。在另一个实施方案中，电离包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI)，其通常包括三步法，如下：(1)将样品混合在合适的基质材料中并将其施加到表面，通常是金属板；(2)通常用脉冲激光照射样品，从而触发样品和基质材料的烧蚀和解吸；(3)通过在烧蚀气体的热羽流中质子化或去质子化使分析物分子电离，使离子加速进入用于分析它们的质谱仪。这些电离技术是本领域技术人员公知的。电离，特别是电子电离，可能导致一些样品的分子碎裂成带电碎片。
在电离之后，根据质量分析器中的质荷比(m/z)分离第一步中产生的离子。这通常通过以下一种或多种质荷比分离技术进行：通过四极质谱仪中使用的四极电场，通过离子阱质谱仪使用的离子阱四极电场，通过飞行时间质谱仪使用的纵向离子传播时间，以及通过电和磁扇区质谱仪传统上使用的电场和/或磁场偏转。最后一种技术涉及加速离子并使它们经受电场或磁场，使得电场或磁场使离子偏转。具有相同质荷比的离子将经历相同的偏转量。
在分离后，检测离子。通常，检测器记录感应的电荷或当离子通过或撞击表面时产生的电流。在扫描仪器中，在扫描过程中在检测器中产生的信号与仪器在扫描中的位置将产生质谱，作为m/z的函数的离子的记录。
在一个实施方案中，质谱法与色谱分离技术串联使用。在一个实施方案中，色谱技术是气相色谱，组合技术称为气相色谱-质谱法(GC/MS，GCMS或GC-MS)。如本领域技术人员所知，在该技术中，使用气相色谱仪分离不同的化合物。将该分离的化合物流送入质谱仪，如上所述进行电离、质量分析和检测。
在一个实施方案中，色谱技术是液相色谱，组合技术称为液相色谱-质谱法(LC/MS，LCMS或LC-MS)。如本领域技术人员所知，该技术使用液体流动相色谱分离化合物。通常，液相是水和有机溶剂的混合物。然后将分离的化合物流进料到质谱仪中，用于如上所述的电离、质量分析和检测。
使用质谱鉴定的生物标志物诊断疾病
在通过适当的质谱法分离和分析之后，在受试者的样本中鉴定的代谢物可用于检测受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死。通常，该步骤包括使受试者样本中生物标志物的水平与参考值进行比较，其中与所述参考值比较的所述生物标志物在所述样本中的水平指示在所述受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死。
作为可选择的实施方案，与所述参考值相比生物标志物在所述样本中的水平的减少指示在所述受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死。在一个实施方案中，与所述参考值相比，代谢物在所述样本中的水平的增加指示在所述受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死。与参考值相比的差异可以是如下面定义和例示的增加，或者如下面定义和例示的减少。
通常，样本中生物标志物的水平与参考值相比的增加或减少被测量为％平均差异。在本说明书中，术语“％平均差异”是指与参照受试者(即对照)中的总离子计数相比，患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者中每种质量离子的总离子计数的％差异。
在测量值包括患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者中适当质量离子的总离子计数增加的情况下，与参考值相比，％平均差异测量为(平均疾病/平均对照)×100％。在测量值包括患有疾病的受试者中适当质量离子的总离子计数减少的情况下，与参考值相比，％平均差异测量为(平均对照/平均疾病)×100％。因此，％平均差异总是超过100％，除了在患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者中适当质量离子的总离子计数与参考值完全相同的情况。
在其中样本中生物标志物的水平与参考值相比增加指示受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死的实施方案中，样本中一种或多种生物标志物的水平与参考值相比的％平均差异没有特别限制。在一个实施方案中，所述％平均差异为至少100％，例如至少101％，例如至少102％，例如至少103％，例如至少104％，例如至少105％，例如至少106％，例如至少107％，例如至少108％，例如至少109％，例如至少110％，例如至少112％，例如至少114％，例如至少116％，例如至少118％，例如至少120％，例如至少130％，例如至少140％，例如至少150％，例如至少160％，例如至少170％，例如至少180％，例如至少190％，例如至少200％，例如至少250％，例如至少300％，例如至少350％，例如至少400％，例如至少450％，例如至少500％，例如至少550％，例如至少600％，例如至少650％，例如至少700％，例如至少750％，例如至少800％，例如至少850％，例如至少900％，例如至少950％，例如至少1000％，例如至少1100％，例如至少1200％，例如至少1300％，例如至少1400％，例如至少1500％，例如至少1600％，例如至少1700％，例如至少1800％，例如至少1900％，例如至少2000％，例如至少2500％，例如至少3000％，例如至少3500％，例如至少4000％，例如至少4500％，例如至少5000％，例如至少5500％，例如至少6000％，例如至少6500％，例如至少7000％，例如至少7500％，例如至少8000％，例如至少8500％，例如至少9000％，例如至少9500％，例如至少10,000％，例如至少11,000％，例如至少12,000％，例如至少13,000％，例如至少14,000％，例如至少15,000％，例如至少16,000％，例如至少17,000％，例如至少18,000％，例如至少19,000％，例如至少20,000％，例如至少25,000％，例如至少30,000％，例如至少35,000％，例如至少40,000％，例如至少45,000％，例如至少50,000％，例如至少55,000％，例如至少60,000％，例如至少65,000％，例如至少70,000％，例如至少75,000％，例如至少80,000％，例如至少85,000％，例如至少90,000％，例如至少95,000％，例如至少100,000％。
在其中样本中生物标志物的水平与参考值相比增加指示受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死的实施方案中，％平均差异通常为101％至15,000％，例如105％至12,000％，例如110％至10,000％，例如110％至9000％，例如120％至8000％，例如130％至7000％，例如140％至6000％，例如150％至5000％，例如160％至4000％，例如170％至3000％，例如180％至2500％，例如190％至2250％，例如200％至2000％，例如250％至1900％，例如300％至1800％，例如350％至1700％，例如400％至1600％，例如450％至1550％，例如500％至1500％。
在其中样本中生物标志物水平与参考值相比降低指示受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死的实施方案中，样本中生物标志物水平与参考值相比的％平均差异没有特别限制。在一个实施方案中，所述％平均差异为至少100％，例如至少101％，例如至少102％，例如至少103％，例如至少104％，例如至少105％，例如至少106％，例如至少107％，例如至少108％，例如至少109％，例如至少110％，例如至少112％，例如至少114％，例如至少116％，例如至少118％，例如至少120％，例如至少130％，例如至少140％，例如至少150％，例如至少160％，例如至少170％，例如至少180％，例如至少190％，例如至少200％，例如至少250％，例如至少300％，例如至少350％，例如至少400％，例如至少450％，例如至少500％，例如至少550％，例如至少600％，例如至少650％，例如至少700％，例如至少750％，例如至少800％，例如至少850％，例如至少900％，例如至少950％，例如至少1000％，例如至少1100％，例如至少1200％，例如至少1300％，例如至少1400％，例如至少1500％，例如至少1600％，例如至少1700％，例如至少1800％，例如至少1900％，例如至少2000％，例如至少2500％，例如至少3000％，例如至少3500％，例如至少4000％，例如至少4500％，例如至少5000％，例如至少5500％，例如至少6000％，例如至少6500％，例如至少7000％，例如至少7500％，例如至少8000％，例如至少8500％，例如至少9000％，例如至少9500％，例如至少10,000％，例如至少11,000％，例如至少12,000％，例如至少13,000％，例如至少14,000％，例如至少15,000％，例如至少16,000％，例如至少17,000％，例如至少18,000％，例如至少19,000％，例如至少20,000％，例如至少25,000％，例如至少30,000％，例如至少35,000％，例如至少40,000％，例如至少45,000％，例如至少50,000％，例如至少55,000％，例如至少60,000％，例如至少65,000％，例如至少70,000％，例如至少75,000％，例如至少80,000％，例如至少85,000％，例如至少90,000％，例如至少95,000％，例如至少100,000％。
在其中样本中生物标志物的水平与参考值相比降低指示受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死的实施方案中，％平均差异通常为101％至15,000％，例如105％至12,000％，例如110％至10,000％，例如110％至9000％，例如120％至8000％，例如130％至7000％，例如140％至6000％，例如150％至5000％，例如160％至4000％，例如170％至3000％，例如180％至2500％，例如190％至2250％，例如200％至2000％，例如250％至1900％，例如300％至1800％，例如350％至1700％，例如400％至1600％，例如450％至1550％，例如500％至1500％。
优选地生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。
诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒
本发明提供了一种诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂；并且可包括使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患动脉粥样硬化性脑梗死的说明书。
当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以试剂盒形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的代谢物，以降低测定的复杂性和成本。
可使用本文所述的能够检测样本代谢物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中代谢物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本代谢物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。高于或低于预定阈值的代谢物的存在或不存在可以例如通过发色、发荧光、电化学发光或其他输出(例如如在酶免疫测定(EIA)，诸如酶联免疫测定(ELISA)中)来显示。
在一个实施方案中，试剂盒可包含固体基片诸如芯片、载玻片、阵列等，其具有能够检测和/或定量固定在基片上的预定位置处的一种或多种样本代谢物的试剂。作为说明性实例，可向芯片提供固定在离散的预定位置的试剂，以用于检测和定量样本中生物标志物的存在和/或浓度和/或量。如上所述，在患有动脉粥样硬化性脑梗死的受试者的样本中发现所述生物标志物的水平降低。芯片可被配置成使得仅当这些代谢物中的一种或多种的浓度超过阈值时才提供可检测的输出(例如颜色变化)，所述阈值被选择或区分指示对照受试者的生物标志物的浓度和/或量与指示患有或易患动脉粥样硬化性脑梗死的患者的生物标志物的浓度和/或量。因此，可检测到的输出(诸如颜色变化)的存在立即表明样本中包含显著降低水平的生物标志物，表明受试者患有或易患动脉粥样硬化性脑梗死。
当比较两个不同群体的测试结果时，很少观察到两组之间的完美分离。实际上，测试结果的分布会重叠，因此，当选择并应用区分两个群体的截断点或标准值时，在一些情况下该疾病会正确分类为阳性(真阳性分数)，但一些疾病病例将归类为阴性(假阴性分数)。另一方面，一些没有疾病的病例将被正确地分类为阴性(真阴性分数)，而一些没有疾病的病例将被分类为阳性(假阳性分数)。
可使用诸如ROC曲线分析之类的工具来评估这样的测试的性能，或测试将疾病组与健康组区分开的准确度。ROC曲线是使用灵敏度作为y轴，将1-特异性作为x轴，使用各种截断值生成的灵敏度和特异度谱图的图形表示。通过计算高于针对特性的值以上的病例数之后，除以总病例数来测定真阳性率。通过计算高于针对特性的值以上的对照组数之后，除以总对照组数来测定假阳性率。尽管该定义是指患者组的特性相对于对照组高的情况，但该定义还适用于患者组的特性相对于对照组低的情况(在这种情况下，可计算出低于上述特性的值的样本的数)。受试者工作特征曲线(ROC)可以针对其他单一计算，还可针对单一特性生成，为了提供单一和值，例如，可数学性地组合两个以上的特性(例如，加、减、乘等)，该单一和值可由受试者工作特征曲线(ROC)来表示。ROC曲线上的每个点代表对应于特定决策阈值的灵敏度/特异性对。具有完美判别力的测试(两个分布中没有重叠)的ROC曲线穿过左上角(灵敏度为100％，特异度为100％)。因此，从质量上讲，曲线图越靠近左上角，测试的总体准确度越高。ROC曲线(AUC)下面积反映了测试的准确度，并显示在曲线图的左下角。
本发明提供了L-辛酰基肉碱在构建预测动脉粥样硬化性脑梗死的计算模型或者嵌入所述计算模型的系统或装置中的应用。
所述系统包括：
(1)动脉粥样硬化性脑梗死评估装置，其包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有动脉粥样硬化脑梗死；和
(2)彼此通信地连接的信息通信终端装置，其提供关于来自受试者的样本中所述的生物标志物的存在和/或浓度和/或数量的数据；
其中所述动脉粥样硬化性脑梗死评估装置的控制单元包括：
(1)数据接收单元，其接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本的所述生物标志物的浓度和/或量的数据；
(2)判别值计算单元，其基于由所述数据接收单元接收的所述样本中所述生物标志物的浓度和/或量值以及具有存储在所述存储单元中的作为解释变量的所述生物标志物的浓度和/或量的判别来计算判别值；
(3)判别值基准评价单元，其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者中的动脉粥样硬化性脑梗死的情况进行评价；以及
(4)评估结果发送单元，其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
优选地，所述样本选自血液、血清、血浆。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例 动脉粥样硬化脑梗死相关代谢物的筛选及效能判断
1、样本收集
收集21例动脉粥样硬化脑梗死患者及21例动脉粥样硬化患者的血液样本。
动脉粥样硬化脑梗死组纳入标准：
1)受试者已签署知情同意书
2)符合《中国急性缺血性脑卒中诊疗指南(2014版)》急性脑梗死诊断标准。
3)病因分型为动脉粥样硬化型脑梗死。
4)年龄18-65周岁。
5)BMI 18.5-23.9kg/m2。
6)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。
7)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。
排除标准：
1)合并其他疾病：神经系统疾病(既往脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。
2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。
3)心电图异常的患者。
4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药。
5)3个月内服用益生菌制剂。
6)本次发病前应用抗血小板及他汀类药物。
7)进行静脉溶栓和血管内介入治疗的患者。
8)妊娠期或哺乳期妇女。
9)本研究期间，患者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。
动脉粥样硬化组纳入标准：
1)受试者已签署知情同意书。
2)颈部血管超声和/或颈部血管影像学表现为颅内外血管动脉粥样硬化。
3)年龄18-65周岁。
4)BMI 18.5-23.9kg/m2。
5)血常规：红细胞计数、MCHC、血红蛋白、白细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数在正常范围。
6)TG、TC、HDL-C、LDL-C、血糖、糖化血红蛋白在正常范围。
排除标准：
1)存在其他疾病：神经系统疾病(脑梗死、脑出血、多发性硬化等)；各种慢性消化系统疾病，3个月内患有急性消化系统疾病；循环系统疾病(冠心病、心力衰竭、房颤)；呼吸系统疾病(慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎、哮喘)；代谢性疾病(肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征、骨质疏松症)；泌尿系统疾病(慢性肾脏病、肾衰竭、肾结石)；血液系统疾病(贫血)；其他(痛风、抑郁、精神疾病、慢性疲劳综合征、纤维肌痛症、食物过敏、肿瘤)。
2)既往有输血史、消化系统疾病手术史及外伤史。
3)心电图异常。
4)3个月内服用以下药物：抗生素、泻药、氯硝西泮、性激素类药物、口服避孕药、美沙拉嗪、TNF-α抑制剂、免疫抑制剂、抗抑郁药、PPI、卢帕他定、阿片类、钙剂、维生素D、二甲双胍、叶酸、β-交感神经吸入剂、中药、抗血小板药物及他汀类药物。
5)3个月内服用益生菌制剂。
6)妊娠或哺乳期妇女。
7)本研究期间，受试者已入选或计划入选另一项临床药物或装置/干预性研究。
2、非靶向代谢组学检测
2.1血清样本制备
2.1.1反相色谱分析血清样本处理方法
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。
2)取40μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入300μl的甲醇和1ml甲基叔丁基醚。
3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
2.1.2亲水色谱分析血清样本处理方法：
1)血浆/血清样本在4℃的冰融化为30-60min。
2)取50μl血清至标记好标签的1.5ml离心管中，加入150μl的乙腈。
3)充分振荡15s，进行蛋白沉淀。12000rpm，4℃，离心10min，取上层溶液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
2.2色谱条件
色谱分离采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱和亲水色谱对血清样本进行分析。
2.2.1反相色谱分离条件
色谱柱:waters UPLC HSS T3(1.8μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(乙腈/水4:6，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；
洗脱程序：见表1；
流速：0.3ml/min；
进样量为1.0μL；
柱温：50℃。
表1 C18反相色谱测定洗脱程序
Figure BDA0002752772920000141
2.2.1亲水色谱分离条件
色谱柱:waters UPLC BEH Amide(1.7μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(乙腈，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)和B(水，0.1％甲酸，10mM乙酸铵)；
洗脱程序：见表2；
流速：0.3ml/min；
进样量：1.0μL；
柱温：40℃。
表2 HILIC测定极性小分子洗脱程序
Figure BDA0002752772920000142
Figure BDA0002752772920000151
2.3质谱条件
质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi，辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为：分辨率70000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50ms，质荷比扫描范围50-1500。液质系统由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。
3、靶向代谢组学检测
3.1血清样本处理方法
1)血浆样本于4℃放置30min解冻。
2)取50μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入150μl的甲醇(含有吲哚乙酸-D2500ppb，吲哚丙酸-D2 50ppb组成)，旋涡震荡30min。
3)12000rpm离心5min，取上清液100μl，置于200μl内衬管中，待测。
3.2色谱条件
色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高压液相色谱系统，色谱分离条件如下：
色谱柱:Waters UPLC BEH C8(1.7μm 2.1mm*100mm)；
流动相:A(水，0.5Mm NH4F)和B(甲醇)；
洗脱梯度：见表3；
流速：0.3ml/min；
进样量：1.0μL；
柱温：45℃。
表3 洗脱程序
Figure BDA0002752772920000161
3.3质谱条件
质谱分析仪器为Waters公司XEVO TQ-XS型串联四级杆质谱仪。正离子离子源电压为3kv，锥孔电压为20V。去溶剂温度550℃，源温度150℃。去溶剂气流速1000L/Hr，锥孔气流速7L/h。
3.4靶向代谢组数据处理
靶向代谢组数据峰面积计算采用masslynx定量软件，保留时间允许误差15s。浓度计算采用单点同位素内标法获取定量结果。
4、数据处理
4.1数据质控
为了评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性，使用了质控样本。质控样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物，三个因素需要考虑：1)保留时间，2)信号强度，3)质量准确度。本次实验首先采用5个空白样本平衡色谱柱，再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值，变异系数超过15％的代谢特征被删除。
4.2 PCA分析
所有采集好的数据，无论是何种分离模式或是正负离子模式，均采用ProgenesisQI软件处理，包括的步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理，最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为1至16和1至12min。各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配。
4.3 OPLS-DA分析
为了获得在动脉粥样硬化性脑梗死组(BL)和在动脉粥样硬化组(AS)组呈现显著差异的代谢物信息，进一步采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)对两组样本进行统计分析。
采用OPLS-DA模型的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p＜0.05)来寻找差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(HMDB)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01Da)。
4.4 ROC分析
根据代谢物的水平，绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算二项精确置信空间，分析差异代谢物的诊断效能。
5、结果
质控结果显示，质控样本相对聚集在一起，系统重复性较好，所采集的数据可以进行进一步的研究。
反向色谱正离子、反向色谱负离子、亲水色谱正离子的结果分别如表4和图1所示。
表4 OPLS-DA分析模型参数
Figure BDA0002752772920000171
生物信息学分析结果显示，与动脉粥样硬化组相比，L-辛酰基肉碱(L-Octanoylcarnitine)在动脉粥样硬化脑梗死组的水平显著降低(图2)。
以L-辛酰基肉碱的含量作为检测变量判断诊断效能，结果显示，曲线下面积为0.769，截断值为1061543.862，敏感性为0.810，特异性为0.714(图3)，具有较高的敏感性和特异性以及准确性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中L-辛酰基肉碱的试剂在制备诊断动脉粥样硬化性脑梗死的产品中的应用。
2.根据权利要1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括色谱法、光谱法、质谱法、化学分析法检测用试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述质谱法为色谱-质谱法。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述质谱法为串联质谱法。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述串联质谱法选自离子阱质谱法、四极杆飞行时间质谱法、三重四极杆质谱法、四极杆离子阱质谱法、离子迁移率-四极杆离子阱-飞行时间质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、离子迁移率谱仪-四极杆离子阱质谱法、四级杆-轨道阱质谱法、三重四级杆-轨道阱质谱法、四极杆离子阱-轨道阱质谱法、飞行时间或离子阱-傅立叶变换质谱法。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述样本选自血液、血清、血浆。
7.一种诊断动脉粥样硬化性脑梗死的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测样本中L-辛酰基肉碱的试剂；以及使用所述试剂盒评估受试者是否患有或易患动脉粥样硬化性脑梗死的说明书。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂检测L-辛酰基肉碱的含量和/或浓度。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括处理样本的试剂。
10.L-辛酰基肉碱在构建预测动脉粥样硬化性脑梗死的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统或装置中的应用。
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