CN112294763A

CN112294763A - 一种腹膜透析用脂质体分散液及其制备方法和用途

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Publication number: CN112294763A
Application number: CN201910696556.1A
Authority: CN
Inventors: 丁峰; 史媛媛; 王宜峰; 沈玥; 朱秋毓
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-02-02

Abstract

本发明涉及医疗领域，特别是涉及一种腹膜透析用脂质体分散液及其制备方法和用途。本发明提供一种脂质体分散液，包括脂质体，所述脂质体包括磷脂、流动性缓冲剂和弹性增强剂，所述脂质体分散液的渗透压为300～500mOsmol/L。本发明所提供的脂质体分散液作为腹腔透析液时，对某些蛋白结合类尿毒症毒素的清除效率与白蛋白腹透液相似，对PCS的清除效果甚至可以优于白蛋白腹透液。另外，本发明所提供的脂质体分散液具有合成原料经济易得、合成工艺简单、生物相容性好等优点，具有良好的产业化前景。

Description

一种腹膜透析用脂质体分散液及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医疗领域，特别是涉及一种腹膜透析用脂质体分散液及其制备方法和用途。

背景技术

除血液透析外，腹膜透析(腹透)也是终末期肾脏病(end stage renal disease，ESRD) 患者的主要肾脏替代治疗方式之一。迄今为止，全球约有272 000余ESRD患者接受腹透治疗，约占透析总人数的11％。近年来，我国也已成为全球腹透患者增长最迅速的国家之一。腹透因具有血流动力学更稳定、操作简便、不依赖机器可以在家进行、对患者的生活方式影响较小、残肾功能丢失更缓慢、肾移植后的结果更好、更加经济等优点而被越来越多的患者所接受。虽然腹透有着诸多优越性，但由于受到有限的腹膜表面积和腹腔空间的限制，多项病例对照研究发现，腹膜透析对蛋白结合类尿毒症毒素的清除效率远不及血液透析。一项对 46例维持性腹透患者前瞻性随访5年的研究发现，血清PCS浓度可作为预测腹透患者心血管并发症发生发展及全因死亡率的独立危险因素，血清PCS和IS水平与腹透患者技术失败率发生也密切相关。而与持续非卧床腹膜透析(Continuous ambulatoryperitoneal dialysis)相比，自动化腹膜透析(Automated peritoneal dialysis)在清除蛋白结合类尿毒症毒素方面并无优势。与传统葡萄糖腹透液相比，新型的艾考糊精腹透液也并不能增加此类毒素的清除。因此，研发一种可增加蛋白结合类尿毒症毒素清除效率的新型腹透液可能有益于降低腹透技术失败率，提高腹透患者的生存率和生活质量。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种腹膜透析用脂质体分散液及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种脂质体分散液，包括脂质体，所述脂质体包括磷脂、流动性缓冲剂和弹性增强剂，所述脂质体分散液的渗透压为300～500 mOsmol/L。

在本发明一些实施方式中，所述磷脂选自天然磷脂，所述天然磷脂选自卵磷脂。

在本发明一些实施方式中，所述流动性缓冲剂选自胆固醇、维生素E中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，流动性缓冲剂与磷脂的重量比为0.2～0.35。

在本发明一些实施方式中，所述弹性增强剂选自非离子表面活性剂中的一种或多种的组合，所述非离子表面活性剂优选选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，所述弹性增强剂与磷脂的重量比为0.35～0.6。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体的粒径为50～3000nm。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液中，脂质体的含量为5～200g/L，优选为 20-60g/L。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液为含水的脂质体分散液。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液的渗透压为344～483mOsmol/L。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液中还包括渗透压调节剂，所述渗透压调节剂优选选自葡萄糖，所述脂质体分散液中葡萄糖的浓度≥2.5wt％，优选为2.5～4.25wt％。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液还包括Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、乳酸根离子中的一种或多种的组合。

在本发明一些实施方式中，所述脂质体分散液的pH值为5.2～6.5。

本发明另一方面提供所述的脂质体分散液的制备方法，包括：通过薄膜水化法制备所述脂质体。

在本发明一些实施方式中，所述制备方法具体包括：

A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物；

B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂，以提供磷脂膜；

C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化，以提供所述脂质体分散液。

本发明另一方面提供所述的脂质体分散液在制备腹膜透析液中的用途。

附图说明

图1显示为本发明实施例2体外模拟腹膜透析装置模式示意图，其中，内室模拟腹腔，外腔模拟血液侧，两者之间用8KD的醋酸纤维素透析膜(红色)隔开，血液侧为含毒素的“人工血浆”(绿色星号代表毒素，粉色短棒代表白蛋白)，腹腔侧为2.5％标准腹膜透析液，或40g/L白蛋白腹透液，或40g/L脂质体腹透液。

图2显示为本发明实施例3大鼠腹膜透析模式示意图。

图3显示为本发明实施例1脂质体粒径分布及安全性评价示意图，其中，A：小粒径(<500nm)和大粒径(>500nm)脂质体粒径分布图；B：腹膜透析7小时后荧光标记脂质体进入大鼠血液循环中的含量；C：腹膜透析7小时后荧光标记脂质体残留在腹膜上(或腹腔内)的含量，“1”表示腹膜透析7小时后第一次腹腔灌洗，“2”表示腹膜透析7小时后第二次腹腔灌洗。数据以均数±标准差表示(N＝3)。ns表示差异无统计学意义。

图4显示为本发明实施例2体外腹透模型中蛋白结合类尿毒症毒素PBUT的清除示意图，其中，(A、B、C)：37℃平衡透析4小时后血浆侧PCS、IS、3-IAA的浓度；(D、E、 F)：37℃平衡透析4小时后腹腔侧(腹透液侧)PCS、IS、3-IAA的浓度；PCS:硫酸对甲酚,IS:硫酸吲哚酚,3-IAA:吲哚乙酸,PDS:标准腹透液,ALB:白蛋白腹透液,Liposome:脂质体腹透液。数据以均数±标准差表示(N＝4)。*p<0.05,**p<0.01和***p<0.001。

图5显示为本发明实施例3尿毒症大鼠6小时腹膜透析过程中各蛋白结合类尿毒症毒素的清除示意图，其中，(A、B、C)：6小时腹透过程中血清总PCS、IS和3-IAA变化规律；(D、E、F)：6小时腹透过程中腹透液中总PCS、IS和3-IAA变化规律；PCS:硫酸对甲酚，IS:硫酸吲哚酚，3-IAA:吲哚乙酸，2.5％Glu:标准2.5％葡萄糖腹透液，4.25％Glu: 传统4.25％葡萄糖腹透液，ALB:白蛋白腹透液，Liposome:脂质体腹透液。数据以均数± 标准差表示(N＝6/每组)。

图6显示为本发明实施例3尿毒症大鼠6小时腹膜透析过程中血清及腹透液中尿素氮和肌酐的变化规律示意图，其中，(A、B)：6小时腹透过程中血清尿素氮和肌酐变化规律；(C、D)：6小时腹透过程中腹透液中尿素氮和肌酐变化规律；(E、F)：各个时间点尿素氮和肌酐的透析液/血浆比值(D/P)。数据以均数±标准差表示(N＝6/每组)。*p<0.05vs.T＝0min。

具体实施方式

本发明发明人经过大量研究，提供了一种可以被用于腹膜透析的脂质体分散液，所述脂质体分散液可以利用卵磷脂的天然两性分子特性和动态运动特性使血液循环中更多的脂溶性蛋白结合类毒素被“趋化”至腹腔并被包封于脂质体微粒的磷脂双分子层内，进而提高对蛋白结合类尿毒症毒素的清除，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种脂质体，包括：磷脂、流动性缓冲剂和弹性增强剂。所述脂质体通常包含至少一个脂质双层，所述脂质双层可以是天然的，也可以是人工合成的，所述脂质双层通常可以围绕内部水相形成复层脂质囊泡。

本发明所提供的脂质体中，可以包括磷脂。所述磷脂通常可以作为制备脂质体的骨架材料，适合于制备脂质体的磷脂对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述磷脂可以是天然磷脂和/或合成磷脂等，所述天然磷脂可以是卵磷脂等，具体可以是磷脂酰胆碱 (PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、和磷脂酰肌醇(PI)等中的一种或多种的组合，天然磷脂还可以包括氢化大豆PC(HSPC)、鞘磷脂、和磷脂酰甘油(PG)等中的一种或多种的组合；所述合成磷脂可以是胆碱磷酸衍生物(例如DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、 DOPC、POPC、DEPC等)、磷酸甘油衍生物(例如DMPG、DPPG、DSPG、POPG等)、磷脂酸衍生物(例如DMPA、DPPA、DSPA等)、磷酸乙醇胺衍生物(例如DMPE、DPPE、 DSPE、DOPE等)、磷酸丝氨酸衍生物(例如DOPS等)、磷脂PEG衍生物(例如mPEG- 磷脂、聚甘油-磷脂、官能化磷脂、末端活化磷脂等)等中的一种或多种的组合。在本发明一优选实施例中，所述磷脂选自天然磷脂，在保证生物相容性同时，也可以快速吸附疏水性溶质。

本发明所提供的脂质体中，还可以包括流动性缓冲剂。所述流动性缓冲剂通常可以用于调节膜流动性。适合于制备脂质体的流动性缓冲剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述流动性缓冲剂可以是胆固醇、维生素E等中的一种或多种的组合，再例如，流动性缓冲剂比例过高通常会导致脂质体粒径过大，从而会影响脂质体稳定性，比例过小则通常会导致脂质体粒径过小，则会导致更多的脂质体在透析治疗过程中进入血液侧，流动性缓冲剂与磷脂的重量比具体可以为0.2～0.35、0.2～0.25、0.25～0.3、或0.3～0.35。

本发明所提供的脂质体中，还可以包括弹性增强剂。所述弹性增强剂通常用于增强脂质体的膜流动性，提高脂质体的稳定性。适合于制备脂质体的弹性增强剂的种类和用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述弹性增强剂可以是非离子表面活性剂等，更具体可以是聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80等中的一种或多种的组合，再例如，弹性增强剂比例过高或过低都会影响脂质体的膜结构，从而影响脂质体的稳定性，弹性增强剂与磷脂的重量比具体可以为0.35～0.4、0.4～0.45、0.45～0.5、0.5～0.55、或0.55～0.6。

本发明所提供的脂质体中，所述脂质体的粒径是可以通过改变流动性缓冲剂与磷脂比例被调整的。例如，增加流动性缓冲剂的比例则通常可以使脂质体的粒径增大，反之则可以使脂质体的粒径减小，所述脂质体的粒径具体可以为50～3000nm、50～100nm、100～200nm、 200～300nm、300～400nm、400～500nm、500～600nm、600～800nm、800～1000nm、1000～1500nm、1500～2000nm、2000～2500nm、或2500～3000nm。优选的平均粒径可以为500～600nm、600～700nm、700～800nm、800～900nm、或900～1000nm。

本发明第二方面提供一种脂质体分散液，包括本发明第一方面所提供的脂质体，所述脂质体分散液的渗透压可以为300～500mOsmol/L、344～483mOsmol/L、300～350mOsmol/L、 350～400mOsmol/L、400～450mOsmol/L、或450～500mOsmol/L。由于本发明所提供的脂质体分散液需要适用于腹膜透析，所以区别于其他常用的渗透液，其通常需要具有较高的渗透压，从而可以为腹透患者提供正超滤。所述脂质体分散液通常为含水的脂质体分散液，从而可以形成稳定的脂质双层，并进一步形成脂质体的分散液。

本发明所提供的脂质体分散液中，脂质体在脂质体分散液中的含量通常是可以被调整的，例如，以所述脂质体分散液的总质量计，脂质体的含量可以为5～200g/L、5～10g/L、 10～20g/L、20～30g/L、30～40g/L、40～60g/L、60～100g/L、100～150g/L、或150～200g/L (即脂质体中各组分的总质量相对于脂质体分散液的体积浓度)。再例如，所述脂质体分散液中，磷脂含量通常决定了脂质体在分散液中的含量，磷脂含量过高通常会导致脂质体浓度过高，影响脂质体分散液的稳定性，磷脂含量过低通常会导致能够实现的毒素清除效果不佳，磷脂的含量具体可以为2～60g/L、2～5g/L、5～10g/L、10～20g/L、20～30g/L、 30～40g/L、40～50g/L、或50～60g/L。再例如，所述脂质体分散液中，流动性缓冲剂比例过高会导致脂质体粒径过大及影响脂质体分散液的稳定性，并且多出未参与构成脂质体部分会分散于脂质体分散液中，并在透析过程中部分进入血液，而比例过低则通常会导致脂质体粒径降低，具有潜在提高脂质体在透析治疗过程中进入血液的量升高的风险，流动性缓冲剂的含量具体可以为0.5～35g/L、0.5～1g/L、1～3g/L、3～5g/L、5～10g/L、10～15g/L、 15～20g/L、20～25g/L、25～30g/L、或30～35g/L。再例如，所述脂质体分散液中，弹性增强剂比例过高会影响脂质体的膜结构，从而影响脂质体分散液的稳定性，并且多出未参与构成脂质体部分会分散于脂质体分散液中，并在透析过程中部分进入血液，而比例过低则通常会降低脂质体的稳定性，从而影响脂质体分散液的稳定性，弹性增强剂的含量具体可以为 1～50g/L、1～3g/L、3～5g/L、5～10g/L、10～15g/L、15～20g/L、20～25g/L、25～30g/L、30～35g/L、35～40g/L、40～45g/L、或45～50g/L。所述脂质体中各组分在脂质体分散液中的含量通常还需要符合如上所述的各组分之间的比例关系。

本发明所提供的脂质体分散液中，可以包括渗透压调节剂，所述渗透压调节剂主要用于调节脂质体分散液整体上的渗透压，从而可以在腹膜透析中获得正超滤。合适的适用于腹膜透析的渗透压调节剂对于本领域技术人员来说应该是可以选择的，例如，所述渗透压调节剂可以是葡萄糖、艾考糊精(Icodextrin)、各种氨基酸等。所述渗透压调节剂的含量主要取决于脂质体分散液整体上的渗透压，例如，当渗透压调节剂为葡萄糖时，所述脂质体分散液中葡萄糖的浓度通常可以≥2.5wt％、2.5～4wt％、2.5～3wt％、3～3.5wt％、3.5～4wt％、或4～4.25wt％。

本发明所提供的脂质体分散液中，还可以包括腹腔透析液中可以含有的其他各种组分，且具有合适的pH值。例如，所述脂质体分散液还可以包括Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、乳酸根离子等中的一种或多种的组合；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括125～145mmol/L的Na⁺，在本发明一具体实施例中，Na⁺的浓度可以为132mmol/L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L、或1～1.5mmmol/L的Ca²⁺，在本发明一具体实施例中，Ca⁺的浓度可以为1.24mmol/LL；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L、或 0.2～0.3mmmol/L的Mg²⁺，在本发明一具体实施例中，Mg²⁺的浓度可以为0.25mmol//L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括90～120mmol/L、或90～100mmol/L的Cl^-，在本发明一具体实施例中，Cl^-的浓度可以为95mmol/L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括30～50mmol/L的乳酸根离子，在本发明一具体实施例中，乳酸根离子的浓度可以为40 mmol/L；再例如，所述脂质体分散液的pH值可以为5.2～6.5、5.2～5.5、5.5～6.0、或6.0～6.5。

本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的脂质体、或本发明第二方面所提供的脂质体分散液的制备方法。通过如上所提供的脂质体的组分配方，本领域技术人员可选择合适的方法制备所述脂质体和/或脂质体分散液，例如，可以通过薄膜水化法制备所述脂质体和/或脂质体分散液。

本发明所提供的制备方法中，可以包括：A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物。所述制备方法中所使用的溶剂通常可以是原料组分的良溶剂，通常可以为有机溶剂，具体可以是卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂等，在本发明一优选实施例中，所述溶剂可以是包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇或乙醇等中的一种或多种的组合，溶剂的使用量可以是 25～75mL/1g固体、25～35mL/1g固体、35～45mL/1g固体、45～55mL/1g固体、55～65mL/1g固体、或65～75mL/1g固体。

本发明所提供的制备方法中，还可以包括：B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂，以提供磷脂膜。脱除溶剂的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以在减压的条件下，通过蒸发脱除预混物中的溶剂。

本发明所提供的制备方法中，还可以包括：C)将步骤B)所提供的磷脂膜水合、均化，以提供所述脂质体。对磷脂膜进行水合、均化的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以采用水合介质对磷脂膜进行水合，具体可以是合适的水溶液、缓冲液、透析液等。在本发明一优选实施方式中，采用缓冲液和/或透析液对磷脂膜进行水合处理，水合处理中所使用的缓冲液中可以包括但不限于PBS缓冲液、醋酸钙溶液等中的一种或多种的组合，用量可以为15～50mL/1g固体、15～25mL/1g固体、25～35mL/1g固体、或35～50mL/1g 固体，水合处理中所使用的透析液中可以包括腹膜透析液中可以含有的其他各种组分，且具有合适的pH值，例如，，所述脂质体分散液还可以包括Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、乳酸根离子等中的一种或多种的组合；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括125～145mmol/L 的Na⁺，在本发明一具体实施例中，Na⁺的浓度可以为132mmol/L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L、或1～1.5mmmol/L的Ca²⁺，在本发明一具体实施例中， Ca⁺的浓度可以为1.24mmol/L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括≤2mmol/L、或 0.2～0.3mmmol/L的Mg²⁺，在本发明一具体实施例中，Mg²⁺的浓度可以为0.25mmol//L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括90～120mmol/L、或90～100mmol/L的Cl^-，在本发明一具体实施例中，Cl^-的浓度可以为95mmol/L；再例如，所述脂质体分散液中，还可以包括30～50mmol/L的乳酸根离子，在本发明一具体实施例中，乳酸根离子的浓度可以为40 mmol/L；再例如，所述脂质体分散液的pH值可以为5.2～6.5、5.2～5.5、5.5～6.0、或6.0～6.5。再例如，可以采用高压均质的方法进行均化，在本发明一优选实施方式中，所述高压均质的参数具体为：均质压力为≤300bar，均质时间为5-60min。

本发明第四方面提供本发明第一方面所提供的脂质体、或本发明第二方面所提供的脂质体分散液在制备腹膜透析液中的用途。本申请所提供的脂质体分散液在腹膜透析中对于蛋白结合类尿毒症毒素有很强的清除作用，可以用于针对蛋白结合类尿毒症毒素清除的腹膜透析中，所述蛋白结合类尿毒症毒素可以是包括但不限于PCS、IS、3-IAA等中的一种或多种的组合。

本发明第五方面提供一种腹膜透析方法，包括：通过本发明第二方面所提供的脂质体分散液对个体进行腹膜透析。对个体进行腹膜透析的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述腹膜透析通常指将腹膜透析液引入患者的腹膜腔中(例如，可以通过重力作用进行灌输)，利用腹膜作为半渗透膜的特性，在腹膜两侧存在溶质的浓度梯度差的情况下，高浓度一侧的溶质会向低浓度一侧移动(弥散作用)，水分则从低渗一侧向高渗一侧移动(渗透作用)的处理方法。通过腹腔透析液不断地更换，可以使得透析液与体液进行物质交换，体液中所溶解的特定物质可以通过腹膜扩散到透析液中。

本发明所提供的腹膜透析方法中，受试对象可以是各种能够被施用腹膜透析的动物，具体可以包括但不限于人类、非人类的灵长类、哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等。

本发明提供了一种新的脂质体分散液及其制备方法和用途。本发明所提供的脂质体分散液作为腹腔透析液时，对某些蛋白结合类尿毒症毒素的清除效率与白蛋白腹透液相似，对PCS的清除效果甚至可以优于白蛋白腹透液。另外，本发明所提供的脂质体分散液具有合成原料经济易得、合成工艺简单、生物相容性好等优点，具有良好的产业化前景。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例中的所有数据均采用IBM SPSS Statistics 21统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，各组数据间两两比较采用Student’t检验进行分析，p<0.05认为有统计学差异。

实施例1

脂质体的制备：

采用薄膜水化法制备大豆卵磷脂脂质体。

制备平均粒径小于500nm脂质体：大豆卵磷脂脂质体中，大豆卵磷脂、胆固醇、吐温-80 之间的比例为12:5:3，将各原料组分溶于二氯甲烷中，真空蒸发过夜。然后用PBS缓冲液 (加入量为25mL/1g固体)对所得干膜进行水合处理，用高压均质机进行均质处理，均质压力60bar，均质时间10min。并在4℃下保存直至使用。

制备平均粒径大于500nm脂质体：大豆卵磷脂脂质体中，大豆卵磷脂、胆固醇、吐温-80 之间的比例为4:4:1，将各原料组分溶于二氯甲烷中，真空蒸发过夜。然后用PBS缓冲液(加入量为25mL/1g固体)对所得干膜进行水合处理，用高压均质机进行均质处理，均质压力 60bar，均质时间10min。并在4℃下保存直至使用。

制备尼罗红标记脂质体：将一定量尼罗红与上述粒径方法中比例的大豆卵磷脂、胆固醇和吐温-80共同溶解于二氯甲烷中，真空蒸发过夜。然后用PBS缓冲液(加入量为25mL/1g固体)对所得干膜进行水合处理，用高压均质机进行均质处理，均质压力60bar，均质时间10 min。并在4℃下保存直至使用。

脂质体粒径分布及安全性评价实验：

如上所述，以500nm为界分别选择制备了平均粒径<500nm和>500nm的尼罗红荧光标记脂质体腹透液，进行安全性评价。大鼠予9％水合氯醛(0.3ml/100g，肌肉注射)麻醉后，仰卧位固定于宠物垫上，开至中档以维持大鼠术中体温。每只大鼠按60ml/Kg缓慢灌注预热的尼罗红标记脂质体腹透液，进行腹膜透析7小时。每间隔1小时采取一次血样本，计算各时间点荧光标记脂质体进入大鼠血液循环中的百分比。腹膜透析7小时后，沿大鼠腹部正中线剪一1mm切口，用无菌吸管尽可能的收集腹水，然后用生理盐水灌洗腹腔两次，分别计算腹膜透析7小时后腹腔残留荧光标记脂质体的百分比。

脂质体粒径分布及安全性评价实验的具体结果如图3所示，图3显示了上述制备获得的小粒径(<500nm)脂质体和大粒径(>500nm)脂质体的粒径分布范围。图3B和C分别显示了腹腔灌注7小时后进入大鼠血液循环中荧光标记脂质体的百分比，以及腹膜透析7小时后腹腔残留荧光标记脂质体的百分比。结果表明，小粒径脂质体进入血液循环的速度明显大于大粒径脂质体。腹腔灌注7h后进入大鼠血液循环中的小粒径脂质体约为灌注总量的0.17％，而大粒径脂质体仅有0.12％。同时，腹腔灌注7h后大粒径脂质体残留量为灌注总量的1.83％，亦远远低于小粒径脂质体腹腔残留量(1.83％vs.2.37％，p<0.001)。因此，在接下来的体外及体内腹透实验中，我们均选择合成和制备了粒径>500nm的脂质体腹透液。

实施例2

体外模拟腹膜透析：

(1)以1×磷酸盐缓冲液(PBS，PH＝7.4)为溶剂，配制浓度为40g/L的牛血清白蛋白溶液，于体外实验中作为“人工血浆”；

(2)分别于40g/L的牛血清白蛋白溶液中加入尿毒症水平的上述各蛋白结合类尿毒症毒素，其中PCS浓度为37.60mg/L，IS浓度为37.65mg/L，3-IAA浓度为2.625mg/L；

(3)以Dianeal PD4 2.5％腹透液为标准腹膜透析液(standard peritonealdialysate(PDS)， Baxter Healthcare Corporation，美国)，分别配制40g/L的白蛋白腹透液和40g/L的脂质体腹透液，白蛋白透析液使用牛血清白蛋白(V900933，Sigma，美国)，脂质体腹膜透析液的制备方法参照实施例1，平均粒径选择＞500nm的脂质体；其中空白的PDS定义为阴性对照组，40g/L白蛋白腹透液定义为阳性对照组；

(4)以分子截留量为8KD的醋酸纤维素膜(索莱宝，北京)模拟腹膜，体外模拟腹膜透析(模式图如图1所示)，其中血液侧为“人工血浆”，腹腔侧分别为标准腹膜透析液(PDS)、40g/L白蛋白腹透液、40g/L脂质体腹透液。血液侧与腹腔侧体积比均为0.7。37℃ 孵育4小时后。

(5)平衡透析4小时后，分别于两侧小室取样，进行RP-HPLC测定。

(6)样品RP-HPLC前预处理：取样品150μl，加入450μl的甲醇，剧烈震荡3分钟，4℃过夜，10000转/分钟，4℃离心20min，取上清液进样分析检测。

体外腹透模型中蛋白结合类尿毒症毒素的清除实验结果具体如图4所示，标准腹透液组 (阴性对照组)体外于37℃平衡透析4小时后，“血浆侧”PCS、IS和3-IAA浓度分别下降了14.6％，20.2％，22.1％。白蛋白腹透液组“血浆侧”PCS、IS和3-IAA浓度分别下降了39.5％，51.2％，41.0％。脂质体腹透液组“血浆侧”PCS、IS和3-IAA浓度分别下降了43.3％，43.0％和42.6％。白蛋白腹透液组和脂质体腹透液组“血浆侧”三种PBUTs的下降率均显著高于标准腹透液组。与“血浆侧”相应，白蛋白腹透液组和脂质体腹透液组“腹腔侧”三种PBUTs浓度增加均显著高于标准腹透液组(all p<0.001)。同时，白蛋白腹透液和脂质体腹透液对PCS和3-IAA的清除差异无统计学意义(p>0.05)；白蛋白腹透液组对IS 的清除稍高于脂质体透析液(p<0.05)。

实施例3

尿毒症大鼠模拟腹膜透析：

1、实验动物的选择和饲养：

30只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自中科院上海实验动物中心)，6周，体重120～160克，饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院动物房(SPF级)，环境温度维持在70华氏度，空气湿度50％，独立通风笼盒(IVC)饲养，每日更换垫料，不限制其进食和饮水。适应环境一周后开始实验。所有动物实验均按照上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会的规章制度进行。

2、尿毒症大鼠模型构建：

尿毒症大鼠模型采用5/6肾切除手术建立：首先给大鼠称重并记录，将水合氯醛溶于去离子水配成10％水合氯醛保存在4℃冰箱备用。待大鼠用棉签刺激眼球无反应后，俯卧位固定于宠物垫上，开至中档维持大鼠术中体温。在左背部肋下0.5-1.0cm脊柱旁可触及肾脏下极，备皮后用安尔碘消毒三遍，用组织剪作一长约1cm的切口，暴露肾脏，小心剥除肾包膜，梯形切除左肾的上下极(按双肾占体重的0.74％，切除肾脏重量约占左肾质量的2/3)，记录切除的肾组织重量。切除过程中注意保护肾蒂，明胶海绵覆盖切面用以止血，连续缝合肌层，间断缝合皮肤。最后用生理盐水清洗并用安尔碘消毒切口，术后连续三天肌肉注射庆大霉素 (8mg/L)和青霉素(2万U)预防感染。恢复一周后，麻醉大鼠后俯卧位固定大鼠，和左侧切口对称处作右侧切口，暴露肾脏，缝合结扎肾蒂后切除右肾，术后连续肌肉注射抗生素三天预防感染。5/6肾切除手术后饲养16周，不限制其进食和饮水。

3、大鼠腹膜透析：

大鼠腹膜透析的模式图参见图2。

(1)分组：5/6肾切后16周，尿毒症大鼠随机分为4组：1)2.5％标准腹膜透析液组(2.5％ Glu)；2)4.25％高糖腹膜透析液组(4.25％Glu)；3)40g/L白蛋白腹透液组(AlbuminPD)； 4)40g/L脂质体腹透液组(LSPD)；其中，2.5％标准腹膜透析液为Dianeal低钙2.5％腹透液，40g/L的白蛋白腹透液和40g/L的脂质体腹透液的配置方法参见实施例2，4.25％高糖腹膜透析液为Dianeal低钙4.25％腹透液。

(2)样本采集

大鼠予9％水合氯醛(0.3ml/100g，肌肉注射)麻醉后，将大鼠仰卧位固定于宠物垫上，开至中档以维持大鼠术中体温。右侧腹股沟剃毛后，予以安尔碘消毒皮肤，沿腹股沟剪开皮肤，钝性分离皮下组织和肌层，定位右侧腹股沟血管神经鞘，钝性分离右侧股动脉。结扎股动脉远心端，将镊子柄垫在血管下方，动脉夹临时夹闭血管近心端。使用眼科剪在结扎处与夹闭处之间倾斜45度角，将动脉剪一细小破口，使用PE50导管作为血管插管，连接三通阀，导管向着近心端，缓慢插入股动脉中，缝线打结固定。注意操作过程中应用力适度，手法轻柔，以免损伤血管。首先在腹腔灌注腹膜透析液之前抽取0.5ml股动脉血，置于冰上静置30min，然后每只大鼠按60ml/Kg缓慢灌注预热的腹透液，进行腹膜透析6小时。然后每间隔2小时采取一次血样本和腹透液样本。腹透液样本采集方法：在大鼠腹部正中线剪一 1mm切口，每次采集样本完成后，用止血钳关闭腹部切口。进行腹透6小时后，再原腹部切口的基础上沿腹白线做切口，长约1.5cm，逐层剪开腹腔，小心勿使腹水流出，同时尽可能减少血液混入腹水。用无菌吸管尽可能的收集腹水，残余腹水用无菌纱布吸出，称量计算出腹腔内腹水量。并送检验科进行微生物培养及腹水常规检查，剔除腹水感染的个体。血标本于冰上静置30min后经4000转/分钟，离心10min，血清和腹透液标本贮存于-80℃备用。

(3)样本检测

渗透压(Osmolality，mOsm/kg)采用蒸气压渗透压计Wescor AC-061(Wescor,美国) 进行测定。

大鼠血清样本和腹透液样本进行RP-HPLC检测，前预处理方法参见实施例2；

尿素氮、肌酐、血清白蛋白检测由上海市第九人民医院进行检验科。

大鼠CRP(C-reactive protein)浓度采用鼠Rat ELISA kit(XLPCC,中国)测定。

(4)计算公式

净超滤量(net ultrafiltration，nUF，ml)＝6h收集腹透液容积-0h灌注腹透液容积；

清除总溶质量(Total mass removal，mg)＝6h腹透液浓度×6h收集腹透液容积；

尿素氮转运(dialysate-to-plasma(D/P)ratio)＝腹透液尿素氮浓度/血清尿素氮浓度(2h, 4h,6h)；

肌酐转运(dialysate-to-plasma(D/P)ratio)＝腹透液肌酐浓度/血清肌酐浓度(2h,4h,6h)；

腹膜透析前各组大鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、白蛋白(Alb)、硫酸对甲酚(PCS)、硫酸吲哚酚(IS)、吲哚乙酸(3-IAA)以及PBUTs的蛋白结合率(PB％)水平如表1所示，其中包括各尿毒症毒素以及血清白蛋白浓度，四组间上述各变量差异无统计学意义。

表1

数据以均数±方差表示。简写：2.5％Glu:2.5％标准腹膜透析液；4.25％Glu:4.25％高糖腹膜透析液；Albumin PD:albumin-based(40g/L)peritoneal dialysis，40g/L白蛋白腹透液； LSPD:liposome-supported(40g/L)peritoneal dialysis，40g/L脂质体腹透液(制备方法参照实施例2)。

尿毒症大鼠腹膜透析蛋白结合类尿毒症毒素PBUT清除结果具体如图5所示，尿毒症大鼠6小时腹膜透析过程中血清及腹透液中尿素氮和肌酐的变化规律如图6所示，各组大鼠腹透液渗透压、腹透6小时后净超滤量及CRP水平和小分子溶质转运及各溶质清除总量结果如表2所示。

表2

数据以均数±方差表示。简写：2.5％Glu:2.5％标准腹膜透析液；4.25％Glu:4.25％高糖腹膜透析液；Albumin PD:albumin-based(40g/L)peritoneal dialysis，40g/L白蛋白腹透液； LSPD:liposome-supported(40g/L)peritoneal dialysis，40g/L脂质体腹透液(制备方法参照实施例2)。*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001vs.2.5％Glu.^#p<0.05and^###p<0.001vs. 4.25％Glu。

如图5A所示，与基线期(t＝0min)相比，各组大鼠腹透后血清总PCS水平均逐渐下降。在2.5％和4.25％葡萄糖腹透组，血清总PCS浓度下降率(与各自基线期水平的差值)在腹透后360min时才具有统计学意义(p<0.05)；白蛋白腹透组在t＝120min时血清总PCS浓度下降率即具有具有统计学意义。故与标准腹透组(2.5％葡萄糖)相比，白蛋白腹透组血清总PCS 浓度在t＝120min,t＝240min和t＝360min采样点均显著下降(p<0.05，p<0.01， P<0.01)。在脂质体透析液组，血清总PCS浓度在6小时的腹膜透析过程中的清除趋势与白蛋白腹透液组相似，且在t＝360min时，脂质体腹透组血清总PCS浓度显著低于白蛋白腹透组(2.51±0.10v s.2.99±0.16,p<0.05)。相比之下，2.5％和4.25％葡萄糖腹透组在任何时间点的血清PCS总浓度水平均没有显著差异(p>0.3在t＝120min,240min和360min)。

如图5B所示，与基线期(t＝0min)相比，2.5％和4.25％葡萄糖腹透组血清总IS浓度在腹透的6小时过程中均无明显下降(p>0.05)。而在白蛋白腹透组和脂质体腹透组，血清总 IS浓度在腹透的6小时过程中均逐渐下降。在t＝240min时，白蛋白腹透组和脂质体腹透组血清总IS浓度显著低于标准葡萄糖组(p<0.05和p<0.01)。相比之下，2.5％和4.25％葡萄糖腹透组在任何时间点的血清IS总浓度水平均没有显著差异(p>0.1在t＝120min,240min 和360min)。同时，白蛋白腹透组和脂质体腹透组在任何时间点的血清IS总浓度水平也无显著差异(p>0.4在t＝120min,240min和360min)。如图5C所示，血清总3-IAA浓度变化趋势与IS相似，在t＝240min时，白蛋白腹透组和脂质体腹透组血清总3-IAA浓度显著低于标准葡萄糖组(p均<0.05)。

如图5D和5F所示，白蛋白PD组和脂质体PD组在各时间点，腹透液中PCS、IS和 3-IAA浓度均显著高于标准PD组。如表2所示，腹透6小时后，与标准PD相比，白蛋白 PD组和脂质体PD组PCS、IS和3-IAA清除总量也显著增加。

值得注意的是，脂质体PD组对PCS、IS和3-IAA的清除效率可媲美于白蛋白腹透组。然而，在各个时间点，2.5％和4.25％葡萄糖腹透组腹透液中PCS、IS、3-IAA的浓度以及腹透结束时各PBUTs的清除总量均无统计学差异(all p>0.05)。

此外，白蛋白PD和脂质体PD对大鼠超滤以及水溶性小分子溶质清除的影响可以参见表 2。如表2所示，4.25％腹透液的渗透压为476.7±3.71mOsm/kg，40g/L白蛋白腹透液的渗透压为395.8±1.11mOsm/kg，40g/L脂质体腹透液的渗透压为393.7±3.26mOsm/kg，均显著高于2.5％葡萄糖腹透液(p<0.001，p<0.001，p<0.01)。然而，经6小时腹透后各组大鼠的净超滤量无显著差异(p>0.05)。

如图6和表2所示，在各个时间点，四组大鼠血清尿素氮和肌酐浓度均无明显差异(p> 0.05)，腹透液中各时间点尿素氮和肌酐的浓度，以及腹透6小时后腹透液中尿素氮和肌酐清除总量，各组间也无显著差异(p>0.05)，表明白蛋白腹透和脂质体腹透对尿素氮和肌酐的清除均无显著影响。同时，我们发现在腹膜透析的各个时间点，各组大鼠尿素氮和肌酐的D/P值(2h,4h,6h)均无显著差异(p>0.05)，提示脂质体腹透液具有良好的生物相容性，因为小分子水溶性溶质转运率增加是急性腹膜炎症中血管通透性增加的重要指标。

另外，如表2所示，腹透6小时后，2.5％葡萄糖腹透组、白蛋白腹透组和脂质体腹透组血清CRP水平无显著差异(p>0.05)，而后两组血清CRP水平均显著低于4.25％葡萄糖腹透组。值得注意的是，白蛋白腹透组和脂质体腹透组透后腹腔内CRP浓度则均显著低于2.5％葡萄糖腹透组和4.25％葡萄糖腹透组，且脂质体腹透组透后腹腔内CRP浓度为各组间最低水平(p<0.01vs.白蛋白腹透组)，说明脂质体腹透液具有良好的生物相容性，因为血清和腹腔CRP水平增加是急性腹膜炎症中血管通透性增加的重要指标。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种脂质体分散液，包括脂质体，所述脂质体包括磷脂、流动性缓冲剂和弹性增强剂，所述脂质体分散液的渗透压为300～500mOsmol/L。

2.如权利要求1所述的脂质体分散液，其特征在于，所述磷脂选自天然磷脂，所述天然磷脂选自卵磷脂；

和/或，所述流动性缓冲剂选自胆固醇、维生素E中的一种或多种的组合；

和/或，所述流动性缓冲剂与磷脂的重量比为0.2～0.35。

3.如权利要求1所述的脂质体分散液，其特征在于，所述弹性增强剂选自非离子表面活性剂中的一种或多种的组合，所述非离子表面活性剂优选选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80中的一种或多种的组合；

和/或，所述弹性增强剂与磷脂的重量比为0.35～0.6。

4.如权利要求1所述的脂质体分散液，其特征在于，所述脂质体的粒径为50～3000nm。

5.如权利要求1所述的脂质体分散液，其特征在于，所述脂质体分散液中，脂质体的含量为5～200g/L，优选为20-60g/L。

6.如权利要求1所述的脂质体分散液，其特征在于，所述脂质体分散液为含水的脂质体分散液。

7.如权利要求1所述的脂质体分散液，其特征在于，所述脂质体分散液的渗透压为344～483mOsmol/L；

和/或，所述脂质体分散液中还包括渗透压调节剂，所述渗透压调节剂优选选自葡萄糖，所述脂质体分散液中葡萄糖的浓度≥2.5wt％，优选为2.5～4.25wt％；

和/或，所述脂质体分散液还包括Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、乳酸根离子中的一种或多种的组合；

和/或，所述脂质体分散液的pH值为5.2～6.5。

8.如权利要求1～7任一权利要求所述的脂质体分散液的制备方法，包括：通过薄膜水化法制备所述脂质体。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：

A)将各原料组分分散于溶剂中以提供预混物；

B)脱除步骤A)所提供的预混物中的溶剂，以提供磷脂膜；

10.如权利要求1～7任一权利要求所述的脂质体分散液在制备腹膜透析液中的用途。