CN112285075B - 多散射体系自适应荧光检测系统及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多散射体系自适应荧光检测系统及检测方法，该系统包括：荧光收集透镜、主二向色镜、激发光光路、副二向色镜、第一汇聚透镜、第一光电转换探测器、带通滤光片、第二汇聚透镜以及第二光电转换探测器。本发明能同步检测样品散射的激发光信号和发射的荧光信号，将散射激发光作为参比，从而能根据参比光强对目标荧光能量测量数据自动进行同步修正，可排除不同样品中悬浊颗粒散射不均导致的荧光信号强度差异，进而可消除散射体系变化所导致的定量检测误差，能自适应多种不同散射体系、抗击样品散射不均的干扰，适用于悬浊颗粒大小、表面形态、均匀度存在差异的不同散射体系的悬浊液样品荧光信号检测。

Description

多散射体系自适应荧光检测系统及检测方法

技术领域

本发明涉及光学设备技术领域，特别涉及一种多散射体系自适应荧光检测系统及检测方法。

背景技术

荧光免疫分析是将免疫学反应的特异性和荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，多用于检测蛋白质、激素、药物、微生物等生物活性化合物，样品中超大分子团簇易凝聚形成悬浊状态，对入射的激发光以及发射出的荧光产生散射作用。

样品放置时间的长短以及批次的不同使得悬浊颗粒的大小、表面形态、均匀度出现差异(即散射体系的差异)，一方面影响着样品对入射激发光的散射和光能吸收，另一方面也影响着发射出的荧光散射状况及进入检测光路的荧光比例。

传统的荧光检测光路系统只检测进入检测光路的荧光信号，无法应对荧光免疫分析过程中散射体系的差异导致荧光信号强度上出现的误差，从而降低了检测结果定量的准确度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种多散射体系自适应荧光检测系统及检测方法。

本发明能同步检测样品散射的激发光信号和发射的荧光信号，通过以激发光散射信号作为激发参比，可排除不同样品中悬浊颗粒散射不均导致的荧光信号强度差异，能自适应多种不同散射体系、抗击样品散射不均的干扰，适用于悬浊颗粒大小、表面形态、均匀度存在差异的不同散射体系的悬浊液样品荧光信号检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种多散射体系自适应荧光检测系统，包括：荧光收集透镜、主二向色镜、激发光光路、副二向色镜、第一汇聚透镜、第一光电转换探测器、带通滤光片、第二汇聚透镜以及第二光电转换探测器；

所述激发光光路发出的呈平行状态的激发光入射至所述主二向色镜后被反射到所述荧光收集透镜上，经所述荧光收集透镜汇聚后照射到样品中；

样品被激发产生的荧光经所述荧光收集透镜准直后依次透射所述主二向色镜、副二向色镜，再经所述带通滤光片滤光后由所述第二汇聚透镜汇聚至所述第二光电转换探测器上；

部分被样品散射的激发光进入所述荧光收集透镜被准直后作为一次激发光照射到所述主二向色镜上，一次激发光中的一部分被所述主二向色镜反射，另一部分透射所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上；二次激发光中的一部分被所述副二向色镜反射，再经所述第一汇聚透镜汇聚至所述第一光电转换探测器上，另一部分透射所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上；三次激发光中的一部分被所述带通滤光片反射，另一部分透射所述带通滤光片作为四次激发光经所述第二汇聚透镜汇聚至所述第二光电转换探测器上。

优选的是，所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99%±0.5%。

优选的是，所述带通滤光片对激发光的透过率为1%±0.5%。

优选的是，所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99%。

优选的是，所述带通滤光片对激发光的透过率为1%。

优选的是，其中，一次激发光中的1%±0.5%透射所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上，二次激发光中的1%±0.5%透射所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上，三次激发光中的1%±0.5%透射所述带通滤光片作为四次激发光经所述第二汇聚透镜汇聚至所述第二光电转换探测器上。

优选的是，其中，一次激发光中的1%透射所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上，二次激发光中的1%透射所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上，三次激发光中的1%透射所述带通滤光片作为四次激发光经所述第二汇聚透镜汇聚至所述第二光电转换探测器上。

本发明还提供一种多散射体系自适应荧光检测方法，其通过如上所述的多散射体系自适应荧光检测系统对样品进行荧光检测，然后利用所述第二光电转换探测器获得的目标荧光能量强度与所述第一光电转换探测器获得的激发光能量强度的比值来计算待测样品的浓度。

优选的是，该方法具体包括以下步骤：

1）制取标准曲线：

采用所述多散射体系自适应荧光检测系统对已知的、具有一定浓度梯度的N组标样进行荧光检测，获得每组标样的检测结果，该检测结果包括：所述第一光电转换探测器获得的激发光能量强度An和所述第二光电转换探测器获得的目标荧光能量强度Bn，共得到N组数据；计算每组数据对应的自参比Kn=Bn/An，得到N组自参比值，将每组Kn与其对应的标样的浓度Cn对应，以Kn为横坐标、Cn为纵坐标，拟合得到浓度C与自参比系数K的对应关系的标准曲线：C=F（K）；

2）进行样品检测：

采用所述多散射体系自适应荧光检测系统对待测的样品进行检测，通过所述第二光电转换探测器获得该样品的目标荧光能量强度B₀，同时通过第一光电转换探测器获得激发光能量强度A₀，计算该样品的自参比K₀=B₀/A₀，然后将K₀代入步骤1）获得的标准曲线，计算得到待测的样品的浓度C₀=F（K₀）。

本发明的有益效果是：本发明能同步检测样品散射的激发光信号和发射的荧光信号，利用散射体系对激发光和荧光存在同等散射的原理，将散射激发光作为参比，将第二光电转换探测器获得样品的目标荧光能量强度与第一光电转换探测器获得的样品的激发光能量强度的比值与样品浓度进行对应，从而能根据参比光强对目标荧光能量测量数据自动进行同步修正，可排除不同样品中悬浊颗粒散射不均导致的荧光信号强度差异，进而可消除散射体系变化所导致的定量检测误差，能自适应多种不同散射体系、抗击样品散射不均的干扰，适用于悬浊颗粒大小、表面形态、均匀度存在差异的不同散射体系的悬浊液样品荧光信号检测；

此外本发明的荧光检测系统增加了一片二向色镜，对散射激发光和荧光的混合光进行了3次滤光处理，使得能够到达荧光检测光电转换探测器的散射激发光相比于传统的荧光检测光路系统降低了约2个数量级，即将目标荧光信号中的本底激发光能量降低了2个数量级，因此可以检测荧光信号更加微弱的低浓度样品。

附图说明

图1为本发明的多散射体系自适应荧光检测系统的结构示意图。

图2-6为本发明的实施例3中的对比检测结果。

附图标记说明：

101—荧光收集透镜；102—主二向色镜；103—激发光光路；104—副二向色镜；105—第一汇聚透镜；106—第一光电转换探测器；107—带通滤光片；108—第二汇聚透镜；109—第二光电转换探测器。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

如图1所示，本实施例的一种多散射体系自适应荧光检测系统，包括：荧光收集透镜101、主二向色镜102、激发光光路103、副二向色镜104、第一汇聚透镜105、第一光电转换探测器106、带通滤光片107、第二汇聚透镜108以及第二光电转换探测器109；

激发光光路103发出的呈平行状态的激发光入射至主二向色镜102后被反射到荧光收集透镜101上，经荧光收集透镜101汇聚后照射到样品中；

样品被激发产生的荧光经荧光收集透镜101准直后依次透射主二向色镜102、副二向色镜104，再经带通滤光片107滤光后由第二汇聚透镜108汇聚至第二光电转换探测器109上；

部分被样品散射的激发光进入荧光收集透镜101被准直后作为一次激发光照射到主二向色镜102上，一次激发光中的一部分被主二向色镜102反射，另一部分透射主二向色镜102作为二次激发光照射到副二向色镜104上；二次激发光中的一部分被副二向色镜104反射，再经第一汇聚透镜105汇聚至第一光电转换探测器106上，另一部分透射副二向色镜104作为三次激发光照射到带通滤光片107上；三次激发光中的一部分被带通滤光片107反射，另一部分透射带通滤光片107作为四次激发光经第二汇聚透镜108汇聚至第二光电转换探测器109上。

其中，主二向色镜102和副二向色镜104均为低反高通的干涉型滤光片，波长小于其截止波长的激发光照射到二向色镜上绝大部分被反射掉，波长大于其截止波长的荧光照射到二向色镜上绝大部分可以穿透二向色镜；高通型二向色镜的共性是无法对小于截止波长的短波光子做到100%的反射，两者对激发光的反射率均为99%左右，故而仍会有1%左右的短波光子穿透二向色镜进入到另一侧，为99%±0.5%。

带通滤光片107也是基于干涉原理，其对通带波长内的光子的透过率亦为99%左右，通带波长之外的光子也会有1%左右会穿透滤光片进入到另一侧，在一些实施例中，带通滤光片107对激发光的透过率为1%±0.5%。

其中，激发光光路103用于发出平行的激发光。

在一种实施例中，激发光光路103包括激发光光源、准直器、带通滤光片，激发光光源发出的激光经过准直器准直、带通滤光片滤光后变为平行的激发光。

在一些实施例中，一次激发光中的1%±0.5%透射主二向色镜102作为二次激发光照射到副二向色镜104上，二次激发光中的1%±0.5%透射副二向色镜104作为三次激发光照射到带通滤光片107上，三次激发光中的1%±0.5%透射带通滤光片107作为四次激发光经第二汇聚透镜108汇聚至第二光电转换探测器109上。

使得到达第二光电转换探测器109的激发光经3次滤除之后被衰减到了百万分之一左右，即能大大降低目标荧光信号中的本底激发光能量，因此可以检测荧光信号更加微弱的低浓度样品。

在一种实施例中，主二向色镜102和副二向色镜104均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99%。

带通滤光片107对激发光的透过率为1%。

本实施例中，系统光路为：

参照图1，激发光光路103发出的呈平行状态的激发光入射至主二向色镜102上，由于激发光的波长小于二向色镜的截止波长，绝大部分入射激发光经主二向色镜102反射后照射到荧光收集透镜101上，经荧光收集透镜101汇聚后照射到样品中，经样品体系散射后，一部分入射激发光被目标分子团簇吸收进而发射出波长较大的荧光，其余激发光被样品散射后散向各个方向；

对于荧光：样品被激发产生的荧光亦被散射朝向四面八方，部分荧光经荧光收集透镜101准直后变成近似平行光，然后依次透射主二向色镜102、副二向色镜104，再经带通滤光片107滤光后由第二汇聚透镜108汇聚至第二光电转换探测器109上；

对于激发光：被样品散射后的激发光散向各个方向，其中一部分进入荧光收集透镜101被准直后变成近似平行光作为一次激发光照射到主二向色镜102上，一次激发光中的99%被主二向色镜102反射，1%透射主二向色镜102作为二次激发光照射到副二向色镜104上；二次激发光中的99%被副二向色镜104反射，再经第一汇聚透镜105汇聚至第一光电转换探测器106上，1%透射副二向色镜104作为三次激发光照射到带通滤光片107上，三次激发光经二向色镜两次滤除后被衰减到万分之一；由于激发光的波长不在带通滤光片107的通带波长范围内，三次激发光中的99%被带通滤光片107反射，1%透射带通滤光片107作为四次激发光经第二汇聚透镜108汇聚至第二光电转换探测器109上，即最终与目标荧光一起到达第二光电转换探测器109上的激发光经3次滤除之后被衰减到了百万分之一。

由于绝大部分荧光都能透过二向色镜，所以到达带通滤光片107的荧光被衰减的比例较小，由于带通滤光片107仅能高效透过通带波长之内的光，故通带波长之外的荧光绝大部分被反射滤除掉，通带波长范围之内的目标荧光绝大部分透过带通滤光片107到达第二汇聚透镜108，最终经第二汇聚透镜108汇聚到第二光电转换探测器109上。

实施例2

本实施例提供了一种多散射体系自适应荧光检测方法，其通过实施例1的多散射体系自适应荧光检测系统对样品进行荧光检测，然后利用第二光电转换探测器109获得的目标荧光能量强度与第一光电转换探测器106获得的激发光能量强度的比值来计算待测样品的浓度。

由于样品中的大分子团簇对入射激发光和所发射出的荧光具有同样的散射作用，故而当样品散射体系发生变化时，从样品中反向照射到荧光收集透镜101上的散射激发光和荧光的比例变化相当；由于同一光路系统中各光学器件对不同波长的反射、透射、吸收的比例是固定的，因而当样品散射体系发生变化时经上述荧光检测光路系统后，最终照射到第一光电转换探测器106上的散射激发光能量和照射到第二光电转换探测器109上的目标荧光能量比例变化是一致的。

本荧光检测光路系统对照射到第一光电转换探测器106上的散射激发光能量和照射到第二光电转换探测器109上的目标荧光能量进行同步检测，最终以照射到第一光电转换探测器106上的散射激发光能量作为参考来对照射到第二光电转换探测上的目标荧光能量强度数据进行同比修正调整来对目标成分进行定量，最终排除掉了由于散射体系变化所导致的检测定量误差。

本实施例的方法具体包括以下步骤：

1）制取标准曲线：

采用多散射体系自适应荧光检测系统对已知的、具有一定浓度梯度的N组标样进行荧光检测，获得每组标样的检测结果，该检测结果包括：第一光电转换探测器106获得的激发光能量强度An和第二光电转换探测器109获得的目标荧光能量强度Bn，共得到N组数据；计算每组数据对应的自参比Kn=Bn/An，得到N组自参比值，将每组Kn与其对应的标样的浓度Cn对应，以Kn为横坐标、Cn为纵坐标，拟合得到浓度C与自参比系数K的对应关系的标准曲线：C=F（K）；

2）进行样品检测：

采用多散射体系自适应荧光检测系统对待测的样品进行检测，通过第二光电转换探测器109获得该样品的目标荧光能量强度B₀，同时通过第一光电转换探测器106获得激发光能量强度A₀，计算该样品的自参比K₀=B₀/A₀，然后将K₀代入步骤1）获得的标准曲线，计算得到待测的样品的浓度C₀=F（K₀）。

本实施例利用散射体系对激发光和荧光存在同等散射的原理，将散射激发光作为参比，从样品中自行寻找参比（自参比）、同步检测参比，将第二光电转换探测器109获得的样品的目标荧光能量强度B与第一光电转换探测器106获得的样品的激发光能量强度A的比值与样品浓度进行对应（传统方案中是以光电转换探测器获得样品的目标荧光能量强度B与样品浓度进行对应），从而能根据参比光强对目标荧光能量测量数据自动进行同步修正，进而可消除散射体系变化所导致的定量检测误差，可以自动适应多种不同的散射体系。

此外由于本实施例的系统增加了一片二向色镜，对散射激发光和荧光的混合光进行了3次滤光处理，使得能够到达荧光检测光电转换探测器的散射激发光相比于传统的荧光检测光路系统降低了约2个数量级，即将目标荧光信号中的本底激发光能量降低了2个数量级，因此可以检测荧光信号更加微弱的低浓度样品。

实施例3

本发明的检测系统与常规荧光检测系统的对比，其中，与本发明相比，常规荧光检测系统中少了副二向色镜104和第一光电转换探测器106，且第二光电转换探测器109只检测进入检测光路的荧光信号。

采用本发明实施例2的检测系统与常规荧光检测系统对相同的样品进行检测，具体测量方法及过程如下：首先将一份测试样本均分为7等分，分别编号为1—7，即编号分别为1—7的7个分样本，由于7个分样本均来自于同一份测试样本，故它们的物质组成相同；随后将7个分样本按照相同的方法步骤进行样品前处理，处理完毕后分别采用常规荧光检测光路以及本发明实施例2的检测系统依次对7个分样本进行检测，结果分别如图2-6所示，图中横坐标均为样品编号，纵坐标为荧光或激光的强度。

图2为常规光路所检测的7个分样品的荧光强度，从图中可以看出从同一测试样品中均分出来的7个分样品的荧光强度差别较为明显，说明经样品前处理后7个分样品的散射体系已出现一定差别。

图3和图4分别为本发明光路系统所检测到的7个分样品的未经处理的原始激发散射光强和原始荧光强度，从图中可以看出，它们的强度差别较为明显、变化趋势和常规光路所检测的荧光一致。

图5是本发明中以激发散射光作为参比、用荧光强度除以激发散射光所得的同步修正后的7个分样品的相对荧光强度（按照实施例2的方法），从图中可以看出经自参比同步修正后7个分样品的相对荧光差异大幅较小，检测结果得到显著改善。

图6是以7个分样品的平均荧光强度为分母、各分样品荧光强度对平均强度归一化(分样品荧光强度除以平均荧光强度)之后的检测结果对比图，方点线为常规光路检测结果，圆点线为本发明检测结果，从图中可以看出本发明相比于常规荧光检测光路检测结果波动差异大幅减小、检测精度大幅提高。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (4)

1.一种多散射体系自适应荧光检测系统，其特征在于，包括：荧光收集透镜、主二向色镜、激发光光路、副二向色镜、第一汇聚透镜、第一光电转换探测器、带通滤光片、第二汇聚透镜以及第二光电转换探测器；

所述激发光光路发出的呈平行状态的激发光入射至所述主二向色镜后被反射到所述荧光收集透镜上，经所述荧光收集透镜汇聚后照射到样品中；

样品被激发产生的荧光经所述荧光收集透镜准直后依次透射所述主二向色镜、副二向色镜，再经所述带通滤光片滤光后由所述第二汇聚透镜汇聚至所述第二光电转换探测器上；

部分被样品散射的激发光进入所述荧光收集透镜被准直后作为一次激发光照射到所述主二向色镜上，一次激发光中的一部分被所述主二向色镜反射，另一部分透射所述主二向色镜作为二次激发光照射到所述副二向色镜上；二次激发光中的一部分被所述副二向色镜反射，再经所述第一汇聚透镜汇聚至所述第一光电转换探测器上，另一部分透射所述副二向色镜作为三次激发光照射到所述带通滤光片上；三次激发光中的一部分被所述带通滤光片反射，另一部分透射所述带通滤光片作为四次激发光经所述第二汇聚透镜汇聚至所述第二光电转换探测器上；

所述主二向色镜和副二向色镜均为低反高通的干涉型滤光片，两者对激发光的反射率均为99%±0.5%；

所述带通滤光片对激发光的透过率为1%±0.5%。

2.根据权利要求1所述的多散射体系自适应荧光检测系统，其特征在于，所述主二向色镜和副二向色镜两者对激发光的反射率均为99%。

3.根据权利要求2所述的多散射体系自适应荧光检测系统，其特征在于，所述带通滤光片对激发光的透过率为1%。

4.一种多散射体系自适应荧光检测方法，其特征在于，其通过如权利要求1-3中任意一项所述的多散射体系自适应荧光检测系统对样品进行荧光检测，然后利用所述第二光电转换探测器获得的目标荧光能量强度与所述第一光电转换探测器获得的激发光能量强度的比值来计算待测样品的浓度；

该方法具体包括以下步骤：

1）制取标准曲线：

采用所述多散射体系自适应荧光检测系统对已知的、具有一定浓度梯度的N组标样进行荧光检测，获得每组标样的检测结果，该检测结果包括：所述第一光电转换探测器获得的激发光能量强度An和所述第二光电转换探测器获得的目标荧光能量强度Bn，共得到N组数据；计算每组数据对应的自参比Kn=Bn/An，得到N组自参比值，将每组Kn与其对应的标样的浓度Cn对应，以Kn为横坐标、Cn为纵坐标，拟合得到浓度C与自参比系数K的对应关系的标准曲线：C=F（k）；

2）进行样品检测：

采用所述多散射体系自适应荧光检测系统对待测的样品进行检测，通过所述第二光电转换探测器获得该样品的目标荧光能量强度B₀，同时通过第一光电转换探测器获得激发光能量强度A₀，计算该样品的自参比K₀=B₀/A₀，然后将K₀代入步骤1）获得的标准曲线，计算得到待测的样品的浓度C₀=F（k₀）。

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