CN112255166A - 扫描流式细胞成像分析仪 - Google Patents

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CN112255166A CN202011247948.9A CN202011247948A CN112255166A CN 112255166 A CN112255166 A CN 112255166A CN 202011247948 A CN202011247948 A CN 202011247948A CN 112255166 A CN112255166 A CN 112255166A
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马玉婷
裴智果
王策
陈忠祥
吴云良
宋飞飞
钟金凤
严心涛
王耀
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Abstract

本发明公开了一种扫描流式细胞成像分析仪，包括：液流聚焦模块、光信号激发检测模块、扫描振镜、采集与控制板卡以及上位机。本发明将激光聚焦为小于细胞大小的光点，利用光点扫描实现细胞成像，可提高成像光源的功率密度，有效激发荧光；本发明中采用扫描激发方式时，激光全光斑用于成像，有整体激发效果，不存在不均匀分布的情况；同时可克服由于液流不稳定而造成的光斑功率不均匀激发，导致的成像质量下降的问题。本发明中，通过在物镜的焦平面上设置探测针孔，能将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差和色差；采用光电倍增管收集光信号，可以将很微弱的信号放大，相比于传统的CCD成像灵敏度得以大大提升。

Description

扫描流式细胞成像分析仪
技术领域
本发明涉及生物颗粒检测技术领域，特别涉及一种扫描流式细胞成像分析仪。
背景技术
流式细胞术是一种可以对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个快速定量分析和分选的技术。当需要获得细胞形态及内部结构信息时，相对于传统的流式细胞仪，成像流式细胞仪有着更大的优势。它将流式系统的高通量与成像系统亚细胞的分辨率相结合，既弥补了传统流式细胞仪不能分辨亚细胞结构特征和形态信息的不足，又改善了光学显微成像系统成像速率低造成的不适宜大规模细胞观察的劣势。其提供的细胞的诸如大小、形状等精细形态信息，探针类型、位置等光谱信息以及高通量探测的特性使得其在分析细胞种类，细胞周期，胞内信号转导等生物学研究中有重要地位。
目前，美国Merck Millipore旗下的Amnis公司已经做出了性能不错的成像流式细胞仪，型号有Image StreamMark II和Flow Sight等，能实时捕获每个流动细胞最多可以达到12幅高分辨率图像，检测速率可达5000细胞/秒。然而，场光源目标上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或者散射光的干扰，造成成像质量的下降，加上激光光斑的高斯分布不均及液流系统的扰动会进一步造成成像精度的下降。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种扫描流式细胞成像分析仪。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种扫描流式细胞成像分析仪，包括：
液流聚焦模块，其提供一个样品流道，且通过聚焦作用使颗粒或细胞在样品流道内呈单列流动状态；
光信号激发检测模块，其用于产生激光光斑并聚焦至所述样品流道的检测区以激发流经所述检测区的颗粒或细胞产生荧光和散射光，以及收集颗粒或细胞产生的荧光和散射光信号，并将该光信号转换为电信号；
扫描振镜，其用于使所述光信号激发检测模块产生的激光光斑沿所述检测区内的颗粒或细胞流线的正交方向进行往复扫描；
采集与控制板卡，其接收所述光信号激发检测模块传输的电信号；
以及上位机，其接收所述采集与控制板卡传输的信号，并进行成像。
优选的是，所述光信号激发检测模块产生的激光光斑小于待检测的颗粒或细胞的尺寸，以能满足对颗粒或细胞不同区域的逐点成像。
优选的是，所述扫描振镜使激光光斑垂直于颗粒或细胞的流动方向进行往复扫描，所述扫描振镜的扫描周期不大于光斑在颗粒/细胞流线上的长度与颗粒/细胞的流速的比值。
优选的是，所述光信号激发检测模块包括主光路单元、至少一组激光发射光路以及与所述激光发射光路对应的至少一组光信号检测光路；
所述激光发射光路产生激光并传导至所述主光路单元，所述主光路单元形成激光光斑并聚焦至所述检测区的颗粒或细胞上，所述主光路单元还收集所述检测区的颗粒或细胞产生的荧光和散射光并传导至所述光信号检测光路，所述光信号检测光路采集荧光和散射光信号并转换为电信号后传输至所述采集与控制板卡。
优选的是，所述主光路单元包括沿激光的入射方向依次设置的第一柱镜、第二柱镜、激发针孔、第一二向色镜和物镜，以及沿所述物镜出射的荧光和散射光的光路方向依次设置的探测针孔和收集镜；
所述激光发射光路包括激光器；
所述光信号检测光路包括干涉滤光片、透镜和光电倍增管，进入所述光信号检测光路的光依次经过所述干涉滤光片、透镜后到达所述光电倍增管，所述光电倍增管将光信号转换为电信号后传输至所述采集与控制板卡。
优选的是，所述激光发射光路发出的激光依次经所述第一柱镜、第二柱镜、激发针孔后形成激光光斑，再经所述第一二向色镜反射至所述扫描振镜，再经物镜聚焦至所述检测区的颗粒或细胞上；
所述检测区的颗粒或细胞产生的荧光和散射光经所述物镜收集，透过所述第一二向色镜后依次经过所述探测针孔和收集镜，再进入所述光信号检测光路。
优选的是，所述激光发射光路的数量为N个，且N大于1，所述激光发射光路还包括反射镜或二向色镜，以通过所述反射镜或二向色镜使N个激光器发出的激光均导入所述第一柱镜；
所述光信号检测光路的数量为M个，所述光信号检测光路还包括二向色镜，以通过所述二向色镜将所述收集镜出射的M种不同波长范围的光导入到M个不同的光电倍增管中。
优选的是，所述扫描振镜包括中部具有开口的支架、通过两条对称分布的弹性臂悬置在所述支架的开口中的反射片以及设置在所述支架的侧臂上的压电片，所述压电片用于在电场作用下产生逆压电效应，从而驱动所述反射片扭转。
优选的是，所述液流聚焦模块包括样品流道以及设置在所述样品流道外围的鞘液流道，通过所述鞘液流道中的鞘液使所述样品流道中的颗粒或细胞呈现单列流动状态。
优选的是，所述液流聚焦模块包括样品流道、设置在所述样品流道上的用于实现颗粒或细胞在所述样品流道的平面内的聚焦的第一压电元件以及设置在所述样品流道上的用于实现颗粒或细胞在所述样品流道的深度方向上的聚焦的第二压电元件。
本发明的有益效果是：
1、本发明将激光聚焦为小于细胞大小的光点，利用光点扫描实现细胞成像，可提高成像光源的功率密度，有效激发荧光；
2、传统成像使用场光源，目标上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或者散射光的干扰，本发明中采用点扫描技术将目标分解成二维空间上的无数点，用十分细小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过计算机组合成一个整体平面的像，图像的清晰度和精密度得以提升(传统成像中采用的场光源是照亮一个场，细胞上所有的点都被照亮同时成像，本发明采用点照射，扫描的过程中每次只照亮局部的一点，其他部分都不被照亮，也就没有其他部分的干扰，从而能克服传统成像中容易受到邻近点的衍射或者散射光的干扰的缺陷)。
3、整形后激光光斑光强度一般呈高斯分布，若细胞通过区域存在光斑强度分布不均的情况，将导致成像质量的下降，本发明中采用扫描激发方式时，激光全光斑用于成像，有整体激发效果，不存在不均匀分布的情况；同时可克服由于液流不稳定而造成的光斑功率不均匀激发，导致的成像质量下降的问题。
4、本发明中，通过在物镜的焦平面上设置探测针孔，能将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差和色差。
5、本发明采用光电倍增管收集光信号，可以将很微弱的信号放大，相比于传统的CCD成像灵敏度得以大大提升。
6、本发明的一些实施例中，采用声波对细胞进行聚焦，流速得以减慢，有利于后续检测灵敏度和成像质量的提升。
附图说明
图1为本发明的实施例中的扫描流式细胞成像分析仪的结构示意图；
图2为本发明的实施例中的激光光斑对颗粒或细胞进行扫描的原理示意图；
图3为本发明的实施例1中的扫描流式细胞成像分析仪的结构示意图；
图4为本发明的实施例2中的激光发射光路的结构示意图；
图5为本发明的实施例2中的光信号检测光路的结构示意图；
图6为本发明的实施例2中的扫描流式细胞成像分析仪的结构示意图；
图7为本发明的实施例3中的扫描振镜的结构示意图；
图8为本发明的实施例4中的液流聚焦模块的结构原理示意图；
图9为本发明的实施例5中的液流聚焦模块的示意图；
图10为本发明的实施例5中的液流聚焦模块的聚焦原理示意图。
附图标记说明：
1—液流聚焦模块；2—主光路单元；3—激光发射光路；4—光信号检测光路；5—扫描振镜；6—采集与控制板卡；7—上位机；8—测速传感器；9—颗粒或细胞；10—样品流道；11—鞘液流道；12—第一压电元件；13—第二压电元件；20—第一柱镜；21—第二柱镜；22—激发针孔；23—第一二向色镜；24—物镜；25—探测针孔；26—收集镜；30—激光器；31—第一激光器；32—反射镜；33—第二激光器；34—第二二向色镜；35—第三激光器；36—第三二向色镜；40—干涉滤光片；41—透镜；42、46、47、48—光电倍增管；43—第四二向色镜；44—第五二向色镜；50—支架；51—弹性臂；52—反射片；53—侧臂；54—压电片；55—安装片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
参照图1，本发明提供的一种扫描流式细胞成像分析仪，包括：
液流聚焦模块1，其提供一个样品流道10，且通过聚焦作用使颗粒或细胞9在样品流道10内呈单列流动状态；
光信号激发检测模块，其用于产生激光光斑并聚焦至样品流道10的检测区以激发流经检测区的颗粒或细胞9产生荧光和散射光，以及收集颗粒或细胞9产生的荧光和散射光信号，并将该光信号转换为电信号；
扫描振镜5，其用于使光信号激发检测模块产生的激光光斑沿检测区内的颗粒或细胞9流线的正交方向进行往复扫描；
采集与控制板卡6，其接收光信号激发检测模块传输的电信号；
以及上位机7，其接收采集与控制板卡6传输的信号，并进行成像。
其中，在优选的实施例中，采集与控制板卡6还可对扫描振镜5进行控制。采集与控制板卡6采用常规即可，例如：NI PXI系列板卡。
其中，光信号激发检测模块产生的激光光斑小于待检测的颗粒或细胞9的尺寸，以能满足对颗粒或细胞9不同区域的逐点成像。细胞流经检测区时，由激光光斑产生垂直于细胞流动方向上的扫描，如图2所示，为激光光斑对颗粒或细胞9进行扫描的原理示意图。在优选的实施例中样品流道10上还设置有测速传感器8(选择常规产品即可)，以对样品流道10中的颗粒或细胞9进行测速，由于颗粒或细胞9在一定方向上直线流动，加上激光光点的垂直扫描，可形成逐点成像的平面式扫描效果，通过测量细胞流速，结合扫描频率再通过数据采集与处理芯片进行图像数据的叠加与合成，最终形成细胞图像。其中，需要理解的是，上位机7采用计算机或平板电脑等设备，其通过常规方案即可根据采集与控制板卡6传输的信号进行成像，本发明中，对具体成像方案不做具体限制。
其中，扫描振镜5使激光光斑垂直于颗粒或细胞9的流动方向进行往复扫描，扫描振镜5的扫描周期不大于光斑在颗粒/细胞流线上的长度与颗粒/细胞的流速的比值。
以上为本发明的总体构思，以下在其基础上再结合更为详细的实施例以对本发明作进一步说明。
实施例1
参照图1和图3，本实施例中，光信号激发检测模块包括主光路单元2、一组激光发射光路3以及与激光发射光路3对应的一组光信号检测光路4；
激光发射光路3产生激光并传导至主光路单元2，主光路单元2形成激光光斑并聚焦至检测区的颗粒或细胞9上，主光路单元2还收集检测区的颗粒或细胞9产生的荧光和散射光并传导至光信号检测光路4，光信号检测光路4采集荧光和散射光信号并转换为电信号后传输至采集与控制板卡6。
其中，主光路单元2包括沿激光的入射方向依次设置的激发针孔22、第一二向色镜23和物镜24，以及设置在物镜24的荧光和散射光的出射侧的探测针孔25，在优选的实施例中，激发针孔22的进光侧还设置有第一柱镜20、第二柱镜21，探测针孔25的出射侧还包括收集镜26；
激光发射光路3包括激光器30；
光信号检测光路4包括干涉滤光片40、透镜41和光电倍增管42，
本实施例中，整体光路为：
激光发射光路3发出的激光依次经第一柱镜20、第二柱镜21、激发针孔22后形成激光光斑，再经第一二向色镜23反射至扫描振镜5，再经物镜24聚焦至检测区的颗粒或细胞9上；
检测区的颗粒或细胞9产生的荧光和散射光经物镜24收集，透过第一二向色镜23后依次经过探测针孔25和收集镜26，再进入光信号检测光路4；
进入光信号检测光路4的光依次经过干涉滤光片40、透镜41后到达光电倍增管42，光电倍增管42将光信号转换为电信号后传输至采集与控制板卡6。
本实施例中，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜24，物镜24的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。该分析仪调焦后扫描限制在样品的一个平面内，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔25，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。
本实施例中，采用激光束作光源，激光束经第一柱镜20、第二柱镜21、激发针孔22后形成激光光斑，再经第一二向色镜23反射至扫描振镜5，然后再经物镜24聚焦于样品上，对样品焦平面上每一点进行扫描。样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向透过第一二向色镜23后依次经过探测针孔25和收集镜26，被光电倍增管42(PMT)探测收集，并将信号输送到采集与控制板卡6，然后传输至上位机7，在上位机7上成像并显示。
实施例2
参照图4-6，作为实施例1的基础上的进一步改进，本实施例中，激光发射光路3和光信号检测光路4可拓展为多组，采用多路激光时可采用多激光共点或者多激光点相隔一定空间距离；此时对应的探测针孔25也呈现一定的空间排布，与多路激光一一对应；参照图4，需要理解的是，从图4的方向上看三束激光重合了，事实上不是重合的，有一定的间距的，这个间距体现在另一个方向上：即与纸面垂直的方向。
本实施例中，激光发射光路3的数量为N个，且N大于1，激光发射光路3还包括反射镜32或二向色镜，以通过反射镜32或二向色镜使N个激光器30发出的激光均导入第一柱镜20；光信号检测光路4的数量为M个，光信号检测光路4还包括二向色镜，以通过二向色镜将收集镜26出射的M种不同波长范围的光导入到M个不同的光电倍增管42中。一般而言，1个激光发射光路3对应多个光信号检测光路4，如N＝1，M＝3或4...；N＝2，M＝4或6...等。
参照图4，在一种更为具体的实施例中，N＝3，即包括3路激光发射光路3；
3路激光发射光路3中的第一路包括：第一激光器31和反射镜32，第二路包括第二激光器33和第二二向色镜34，第三路包括第三激光器35和第三二向色镜36；第一激光器31发出的激光被反射镜32反射然后依次透射第二二向色镜34和第三二向色镜36后到达第一柱镜20，第二激光器33发出的激光被第二二向色镜34反射后透射第三二向色镜36到达第一柱镜20，第三激光器35发出的激光被第三二向色镜36反射至第一柱镜20，从而使得三路激光均进入主光路。
参照图5和图6，在一种更为具体的实施例中，M＝3，即3路光信号检测光路4，3路光信号检测光路4还包括2个二向色镜：第四二向色镜43和第五二向色镜44，收集镜26出射的光中，一部分光直接被第四二向色镜43反射至一个光电倍增管46，一部分光透射第四二向色镜43后被第五二向色镜44反射至另一个光电倍增管47，剩余的光依次透射第四二向色镜43、第五二向色镜44后反射至剩余的一个光电倍增管48，由于光电倍增管48前面有干涉滤光片40，从而收集不同波长的光，从而能实现三路光的采集检测。
实施例3
参照图7，作为实施例1或实施例2的基础上的进一步改进，本实施例中，扫描振镜5包括中部具有开口的支架50、通过两条对称分布的弹性臂51悬置在支架50的开口中的反射片52以及设置在支架50的侧臂53上的压电片54，压电片54用于在电场作用下产生逆压电效应，从而驱动反射片52扭转旋转。本实施例中，支架50上还设置有安装片55。扫描振镜5的尺寸越小，可达到的扫描频率越高，对于MHz以上的扫描，可采用MEMS工艺制作微米尺度的振镜。
实施例4
参照图8，作为实施例1或实施例2或实施例3的基础上的进一步改进，本实施例中，液流聚焦模块1包括样品流道10以及设置在样品流道10外围的鞘液流道11，通过鞘液流道11中的鞘液产生包裹样品的效果，在鞘液的压缩下，使样品流道10中的颗粒或细胞9呈现单列流动状态。
实施例5
参照图9和10，作为实施例1或实施例2或实施例3的基础上的进一步改进，本实施例中，液流聚焦模块1包括样品流道10、设置在样品流道10上的用于实现颗粒或细胞9在样品流道10的平面内的聚焦的第一压电元件12以及设置在样品流道10上的用于实现颗粒或细胞9在样品流道10的深度方向上的聚焦的第二压电元件13，本实施例中，压电元件为压电换能器。
参照图10，为第一压电换能器12和第二压电换能器13的聚焦原理示意图，第一压电换能器12产生的超声驻波的波长约为流道宽度的2倍，在流道宽度范围内形成一条驻波节线，节线位置接近流道宽度的中线，颗粒或细胞9在声波的持续作用下沿宽度方向的中心线移动，第一压电换能器12实现XY平面内的聚焦；第二压电换能器13产生的超声驻波的波长约为流道深度的2倍，在流道深度范围内形成一条驻波节线，节线位置接近流道深度的中线，颗粒或细胞9在声波的持续作用下沿深度方向的中心线移动，第二压电换能器13实现YZ平面内的聚焦；在第一、第二压电换能器12、13的作用下，颗粒或细胞9沿流道长度方向单列移动，速度均等，不存在超车现象，为逐个通过下游激光检测区提供了有利条件，如图7所示。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，包括：
液流聚焦模块，其提供一个样品流道，且通过聚焦作用使颗粒或细胞在样品流道内呈单列流动状态；
光信号激发检测模块，其用于产生激光光斑并聚焦至所述样品流道的检测区以激发流经所述检测区的颗粒或细胞产生荧光和散射光，以及收集颗粒或细胞产生的荧光和散射光信号，并将该光信号转换为电信号；
扫描振镜，其用于使所述光信号激发检测模块产生的激光光斑沿所述检测区内的颗粒或细胞流线的正交方向进行往复扫描；
采集与控制板卡，其接收所述光信号激发检测模块传输的电信号；
以及上位机，其接收所述采集与控制板卡传输的信号，并进行成像。
2.根据权利要求1所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述光信号激发检测模块产生的激光光斑小于待检测的颗粒或细胞的尺寸，以能满足对颗粒或细胞不同区域的逐点成像。
3.根据权利要求2所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述扫描振镜使激光光斑垂直于颗粒或细胞的流动方向进行往复扫描，所述扫描振镜的扫描周期不大于光斑在颗粒/细胞流线上的长度与颗粒/细胞的流速的比值。
4.根据权利要求1所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述光信号激发检测模块包括主光路单元、至少一组激光发射光路以及与所述激光发射光路对应的至少一组光信号检测光路；
所述激光发射光路产生激光并传导至所述主光路单元，所述主光路单元形成激光光斑并聚焦至所述检测区的颗粒或细胞上，所述主光路单元还收集所述检测区的颗粒或细胞产生的荧光和散射光并传导至所述光信号检测光路，所述光信号检测光路采集荧光和散射光信号并转换为电信号后传输至所述采集与控制板卡。
5.根据权利要求4所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述主光路单元包括沿激光的入射方向依次设置的第一柱镜、第二柱镜、激发针孔、第一二向色镜和物镜，以及沿所述物镜出射的荧光和散射光的光路方向依次设置的探测针孔和收集镜；
所述激光发射光路包括激光器；
所述光信号检测光路包括干涉滤光片、透镜和光电倍增管，进入所述光信号检测光路的光依次经过所述干涉滤光片、透镜后到达所述光电倍增管，所述光电倍增管将光信号转换为电信号后传输至所述采集与控制板卡。
6.根据权利要求5所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述激光发射光路发出的激光依次经所述第一柱镜、第二柱镜、激发针孔后形成激光光斑，再经所述第一二向色镜反射至所述扫描振镜，再经物镜聚焦至所述检测区的颗粒或细胞上；
所述检测区的颗粒或细胞产生的荧光和散射光经所述物镜收集，透过所述第一二向色镜后依次经过所述探测针孔和收集镜，再进入所述光信号检测光路。
7.根据权利要求6所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述激光发射光路的数量为N个，且N大于1，所述激光发射光路还包括反射镜或二向色镜，以通过所述反射镜或二向色镜使N个激光器发出的激光均导入所述第一柱镜；
所述光信号检测光路的数量为M个，所述光信号检测光路还包括二向色镜，以通过所述二向色镜将所述收集镜出射的M种不同波长范围的光导入到M个不同的光电倍增管中。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述扫描振镜包括中部具有开口的支架、通过两条对称分布的弹性臂悬置在所述支架的开口中的反射片以及设置在所述支架的侧臂上的压电片，所述压电片用于在电场作用下产生逆压电效应，从而驱动所述反射片扭转。
9.根据权利要求1-7中任意一项所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述液流聚焦模块包括样品流道以及设置在所述样品流道外围的鞘液流道，通过所述鞘液流道中的鞘液使所述样品流道中的颗粒或细胞呈现单列流动状态。
10.根据权利要求1-7中任意一项所述的扫描流式细胞成像分析仪，其特征在于，所述液流聚焦模块包括样品流道、设置在所述样品流道上的用于实现颗粒或细胞在所述样品流道的平面内的聚焦的第一压电元件以及设置在所述样品流道上的用于实现颗粒或细胞在所述样品流道的深度方向上的聚焦的第二压电元件。
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