CN112236399A - 核壳颗粒和使用核壳颗粒的分离对象物质的分离纯化方法 - Google Patents

核壳颗粒和使用核壳颗粒的分离对象物质的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明所要解决的课题在于提供一种核壳颗粒，其能够用于分离对象物质的分离方法，能够获得纯度高的纯化物。本发明的核壳颗粒(C)是具有核层(P)和壳层(Q)的核壳形状的核壳颗粒，上述核层(P)是含有磁性金属氧化物颗粒(A)的磁性氧化硅颗粒，上述壳层(Q)是形成于上述核层(P)的表面上的平均厚度为3～3000nm的氧化硅层，以核层(P)的重量为基准，上述核层(P)所含有的上述磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例为60～95重量％，上述核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为50％以下。

Description

核壳颗粒和使用核壳颗粒的分离对象物质的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及核壳颗粒和使用核壳颗粒的分离对象物质的分离纯化方法。
背景技术
以往，作为从试样中分离蛋白质等生物来源物质的方法，实行利用柱色谱的纯化法。但是，利用柱色谱法的纯化法为了大量且高纯度地对蛋白质等进行纯化，需要巨大的柱和大量的缓冲液，而且纯化需要较长时间，因此存在成本升高的问题。
因此，作为能够利用磁力容易地进行分离、回收的技术，公开了使用磁性氧化硅颗粒的蛋白质纯化技术(专利文献1)。但是，由该方法得到的纯化物中，目标蛋白质以外的蛋白质的含量多，纯化物的纯度不够。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-90570号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明所要解决的课题在于提供一种核壳颗粒，其能够用于分离对象物质的分离方法，能够获得纯度高的纯化物。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果完成了本发明。
即，本发明涉及：一种核壳颗粒(C)，其为具有核层(P)和壳层(Q)的核壳形状的核壳颗粒，
上述核层(P)是含有磁性金属氧化物颗粒(A)的磁性氧化硅颗粒，
上述壳层(Q)是形成于上述核层(P)的表面上的平均厚度为3～3000nm的氧化硅层，
以核层(P)的重量为基准，上述核层(P)所含有的上述磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例为60～95重量％，
上述核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为50％以下；
一种分离纯化方法，其使用上述核壳颗粒(C)对试样(E)中的分离对象物质(D)进行分离。
发明的效果
通过使用本发明的核壳颗粒对含有分离对象物质的试样进行分离，能够从试样中获得纯度高的纯化物。
具体实施方式
本发明的核壳颗粒(C)为具有核层(P)和壳层(Q)的核壳形状的核壳颗粒，
上述核层(P)是含有磁性金属氧化物颗粒(A)的磁性氧化硅颗粒，
上述壳层(Q)是形成于上述核层(P)的表面上的平均厚度为3～3000nm的氧化硅层。
另外，以核层(P)的重量为基准，上述核层(P)所含有的上述磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例为60～95重量％，
另外，上述核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为50％以下。
本发明的核壳颗粒(C)特别适合用于下文中详细说明的本发明的分离方法[对试样(E)中的分离对象物质(D)进行分离的物质的分离方法]。
本发明中的分离对象物质(D)是指试样(E)中包含的多种物质(生物来源的物质等)的混合物中的目标物质(D1)或非目标物质(D2)。
需要说明的是，目标物质(D1)是指希望最终以纯化物的形式从试样(E)中获得的物质。
非目标物质(D2)是指希望最终从试样(E)中除去的物质。
此处，作为本发明中的试样(E)，可以举出以生物来源试样[生物体体液(血清、血液、淋巴液、腹水和尿等)、各种细胞类和培养液等]为代表的、含有下文中详细说明的目标物质(D1)和/或非目标物质(D2)的混合物等。
如上所述，本发明中的核壳颗粒(C)具有核层(P)和壳层(Q)，上述核层(P)是含有磁性金属氧化物颗粒(A)的磁性氧化硅颗粒，上述壳层(Q)是形成于上述核层(P)的表面上的平均厚度为3～3000nm的氧化硅层。
上述核层(P)优选为磁性金属氧化物颗粒(A)分散于氧化硅的基体中而成的球体。
壳层(Q)也可以含有氧化硅以外的其他成分。
本发明中的磁性金属氧化物颗粒(A)可以为亚铁磁性、铁磁性或超顺磁性。上述之中，优选在磁分离后不残留剩磁从而能够迅速地再分散的超顺磁性。此处，超顺磁性是指，在外部磁场的存在下，物质的各个原子磁矩排列一致从而显示出被诱发的临时磁场，当去除外部磁场时，一部分排列一致性受损从而不再显示出磁场。
作为上述磁性金属氧化物颗粒(A)，可以举出铁、钴、镍和它们的合金等的氧化物，出于对磁场的感应性优异的原因，特别优选氧化铁。磁性金属氧化物颗粒(A)可以单独使用一种，也可以合用两种以上。
作为磁性金属氧化物颗粒(A)中使用的氧化铁，可以使用公知的各种氧化铁。氧化铁之中，出于化学稳定性特别优异的原因，优选磁铁矿、γ-赤铁矿、磁铁矿-α-赤铁矿中间氧化铁和γ-赤铁矿-α-赤铁矿中间氧化铁，出于具有大的饱和磁化强度且对外部磁场的感应性优异的原因，进一步优选磁铁矿。
上述核层(P)所含有的磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径优选为1～50nm、进一步优选为1～30nm、特别优选为1～20nm。
上述磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径为1nm以上的情况下，合成容易，体积平均粒径为50nm以下的情况下，容易均匀分散在氧化硅的基体中。
本发明中的磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径是利用扫描型电子显微镜(例如日本电子株式会社制造的“JSM-7000F”)对任意200个磁性金属氧化物颗粒(A)进行观察而测定得到的粒径的体积平均值。
磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径可以通过调节后述磁性金属氧化物颗粒(A)制作时的金属离子浓度来进行控制。另外，也可以通过分级等方法使磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径为所期望的值。
基于本发明中的核层(P)的重量，磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例的下限为60重量％、优选为65重量％，上限为95重量％、优选为80重量％。
磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例小于60重量％的情况下，所得到的核壳颗粒(C)的磁性不足，因此在实际用途中的分离操作耗费时间。另外，磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例超过95重量％的情况下，其合成困难。
磁性金属氧化物颗粒(A)的制造方法没有特别限定，可以通过以Massart的报道为基础并使用水溶性铁盐和氨的共沉淀法(R.Massart,IEEE Trans.Magn.1981,17,1247)、以及利用水溶性铁盐的水溶液中的氧化反应的方法等来合成。
如上所述，本发明的核壳颗粒(C)为核-壳形状的颗粒，在核层(P)的表面上形成有壳层(Q)。
本发明中的壳层(Q)的平均厚度可以通过将核壳颗粒(C)包埋在树脂(环氧树脂等)中并用切片机切断，利用透射型电子显微镜对所得的截面进行观察而得到的图像的图像分析来测定。壳层(Q)的平均厚度是指，利用透射型电子显微镜(例如株式会社日立制作所制造的“H-7100”)进行观察而测定得到的任意100个核壳颗粒(C)的壳层(Q)的厚度的平均值。壳层(Q)的厚度是指1个核壳颗粒(C)中的膜厚最薄的部分与最厚的部分的平均值。
壳层(Q)的平均厚度为3～3000nm、优选为10～800nm、进一步优选为50～800nm、特别优选为50～500nm、最优选为50～200nm。平均厚度小于3nm的情况下，无法获得形成壳层(Q)的效果，分离对象物质(D)的分离量降低，平均厚度超过3000nm时，合成困难。
核壳颗粒(C)的体积平均粒径优选为0.5～20μm、进一步优选为1～10μm、特别优选为1.1～5μm。
核壳颗粒(C)的体积平均粒径为0.5μm以上的情况下，具有能够缩短分离回收时的时间的倾向。另外，核壳颗粒(C)的平均粒径为20μm以下的情况下，能够使比表面积较大，因此能够增加分离对象物质(D)的分离量，具有结合效率增加的倾向。
此外，在核壳颗粒(C)的体积平均粒径为1.1μm以上、且下文中详细说明的核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为21～35％的情况下，分离对象物质(D)的分离性提高。
关于本说明书中的“分离性”，分成分离对象物质(D)为目标物质(D1)的情况和分离对象物质(D)为非目标物质(D2)的情况来进行说明。
在分离对象物质(D)为目标物质(D1)的情况下，“分离性提高”是指，利用核壳颗粒(C)从试样(E)中提取的成分中的目标物质(D1)的纯度(比例)升高。
另外，在分离对象物质(D)为非目标物质(D2)的情况下，“分离性提高”是指，利用核壳颗粒(C)从试样(E)中将非目标物质(D2)除去后的成分中的非目标物质(D2)的比例降低。
本发明中的核壳颗粒(C)的体积平均粒径是例如使用激光衍射/散射式粒径分布测定装置(Microtrac BEL株式会社制造的“Microtrac MT3300”)测定得到的体积平均粒径。
核壳颗粒(C)的体积平均粒径可以通过控制核层(P)的体积平均粒径和壳层(Q)的平均厚度来进行控制。核层(P)的体积平均粒径可以通过调节制作后述水包油型乳液时的混合条件(剪切力等)、调整水包油型乳液的粒径来进行控制，壳层(Q)的平均厚度可以通过调节后述壳层(Q)形成时的(烷基)烷氧基硅烷的量、催化剂量和反应时间等来进行控制。
另外，核层(P)和核壳颗粒(C)的体积平均粒径也可以通过制造时的水洗工序的条件变更和分级等方法而设为所期望的值。
本发明中，如上所述，核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为50％以下。若变异系数超过50％，则分离对象物质(D)的分离性变差。
另外，从进一步提高分离对象物质(D)的分离性的方面出发，核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数的下限优选为10％以上、进一步优选为13％以上、特别优选为20％以上、最优选为21％以上。
另外，从进一步提高分离对象物质(D)的分离性的方面出发，核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数的上限优选为35％以下。
核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数可以通过下述测定方法进行测定。
<变异系数的测定方法>
本发明中的变异系数是将例如利用激光衍射/散射式粒径分布测定装置(Microtrac BEL株式会社制造的“Microtrac MT3300”)测定得到的体积平均粒径(d)和标准偏差(SD)代入数学式(1)而得到的值。
变异系数(％)＝SD/d×100 (1)
关于核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数，可以将核壳颗粒进行分级来调整其变异系数。
例如，对于粒径比较大的核壳颗粒，可以通过离心分离使其沉降而将其除去。另外，对于粒径比较小的核壳颗粒，可以通过在离心分离后去除存在有未沉降的微粒的上清液而将其除去。
本发明的核壳颗粒(C)中的壳层(Q)的平均厚度与核层(P)的粒径的比例[壳层(Q)的平均厚度/核层(P)的粒径]优选为0.001～10、进一步优选为0.02～1.5、特别优选为0.04～1.5。
在上述比例为0.001以上的情况下，分离对象物质(D)的分离性提高。
另外，在上述比例为10以下的情况下，分离对象物质(D)的分离性提高。
此处，在上述比例的计算中，壳层(Q)的平均厚度使用通过上述说明的方法求出的值。另外，在上述比例的计算中，核层(P)的粒径可以使用上述说明的“核壳颗粒(C)的体积平均粒径”和“壳层(Q)的平均厚度”的值，通过下述计算式求出。
核层(P)的粒径＝核壳颗粒(C)的体积平均粒径-2×壳层(Q)的平均厚度
另外，在核壳颗粒(C)中的壳层(Q)的平均厚度与核层(P)的粒径的比例[壳层(Q)的平均厚度/核层(P)的粒径]为0.02～1.5、且核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为21～35％的情况下，分离对象物质(D)的分离性大幅提高。
接着，对本发明中的核壳颗粒(C)的制造方法进行说明。
本发明中的核壳颗粒(C)的制造方法可以通过至少经过下述2个工序的制造方法来制造。
(工序1)制作含有磁性金属氧化物颗粒(A)的(烷基)烷氧基硅烷的水包油型乳液，进行(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应，制造在氧化硅中包含有磁性金属氧化物颗粒(A)的核层(P)的工序。
(工序2)在核层(P)的表面使(烷基)烷氧基硅烷发生水解缩聚反应，形成壳层(Q)的工序。
以下，对上述工序进行说明。
首先，对工序1进行说明。
作为本发明中的核层(P)的制造方法，可以举出下述方法等：将含有磁性金属氧化物颗粒(A)和基于上述磁性金属氧化物颗粒(A)的重量为30～1000重量％的(烷基)烷氧基硅烷的分散液(B1)(以下也简记为“分散液(B1)”)与含有水、非离子型表面活性剂和(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化剂的溶液(B2)(以下也简记为“溶液(B2)”)混合，制作水包油型乳液，进行(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应，制造在氧化硅中包含有磁性金属氧化物颗粒(A)的颗粒。
在(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应后，利用离心分离和磁铁等进行固液分离，由此得到核层(P)。
在上文和下文中，(烷基)烷氧基硅烷是指烷基烷氧基硅烷和/或烷氧基硅烷。
作为所使用的(烷基)烷氧基硅烷，可以举出下述通式(1)所表示的化合物。
R1 (4-n)Si(OR2)n (1)
通式(1)中，R1和R2表示碳原子数为1～10的1价烃基。另外，该烃基的一部分氢可以被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基所取代。
作为碳原子数为1～10的1价烃基，可以举出碳原子数为1～10的脂肪族烃基(甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基或异丁基、正戊基或异戊基以及乙烯基等)、碳原子数为6～10的芳香族烃基(苯基等)和碳原子数为7～10的芳香脂肪族基团(苄基等)等。
通式(1)中的n表示1～4的整数。其中，在使用n为1的烷基烷氧基硅烷的情况下，需要与n为2～4的(烷基)烷氧基硅烷合用。从反应后的颗粒的强度和颗粒表面的硅烷醇基的量的方面出发，n优选为4。
作为通式(1)所表示的化合物的具体例，可以举出：烷氧基硅烷(四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、四异丙氧基硅烷和四丁氧基硅烷等)；
烷基烷氧基硅烷(甲基三甲氧基硅烷和甲基三乙氧基硅烷等)；
具有被氨基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷[3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基乙氧基硅烷、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷和N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷等]；
具有被羧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷(7-羧基庚基三乙氧基硅烷和5-羧基戊基三乙氧基硅烷等)；
具有被羟基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷(3-羟基丙基三甲氧基硅烷和3-羟基丙基乙氧基硅烷等)；
具有被巯基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷(3-巯基丙基三甲氧基硅烷和3-巯基丙基三乙氧基硅烷等)；
具有被环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷(3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷和3-环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷等)等。
(烷基)烷氧基硅烷可以单独使用一种，也可以合用两种以上。
相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量，(烷基)烷氧基硅烷的用量优选为30～1000重量％、进一步优选为40～500重量％。(烷基)烷氧基硅烷的用量相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量为30重量％以上的情况下，磁性金属氧化物颗粒(A)的表面容易被均匀地被覆。另外，(烷基)烷氧基硅烷的用量相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量为1000重量％以下的情况下，能够缩短利用磁力的回收时间。
相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量，水的用量优选为500～50,000重量％、进一步优选为1,000～10,000重量％。
此外，在核层(P)的合成中，可以使溶液(B2)等中含有水溶性有机溶剂等。
作为上述水溶性有机溶剂，可以举出25℃下在水中的溶解度为100g/水100g以上的、碳原子数为1～4的一元醇(甲醇、乙醇和正丙醇或异丙醇等)、碳原子数为2～9的二醇(乙二醇和二乙二醇等)、酰胺(N-甲基吡咯烷酮等)、酮(丙酮等)、环状醚(四氢呋喃和四氢吡喃等)、内酯(γ-丁内酯等)、亚砜(二甲基亚砜等)和腈(乙腈等)等。
这些之中，从核壳颗粒(C)的粒径的均匀性的方面出发，优选碳原子数为1～4的一元醇。水溶性有机溶剂可以单独使用一种，也可以合用两种以上。
水溶性有机溶剂的用量优选相对于水的重量为100～500重量％。
作为上述非离子型表面活性剂，可以举出：
碳原子数为8～24的一元醇(癸醇、十二烷醇、椰油烷基醇、十八烷醇和油醇等)的环氧烷烃(以下将环氧烷烃简记为AO)加成物；
碳原子数为3～36的2～8元醇(甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和山梨糖醇酐等)的AO加成物；
具有碳原子数为6～24的烷基的烷基酚(辛基酚和壬基酚等)的AO加成物；
聚丙二醇的环氧乙烷加成物和聚乙二醇的环氧丙烷加成物；
碳原子数为8～24的脂肪酸(癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和椰油脂肪酸等)的AO加成物；
上述碳原子数为3～36的2～8元醇的脂肪酸酯及其AO加成物[TWEEN(注册商标)20和TWEEN(注册商标)80等]；
烷基糖苷(N-辛基-β-D-麦芽糖苷、正十二酰基蔗糖和正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷等)；以及
蔗糖的脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺和它们的AO加成物(聚氧乙烯脂肪酸烷醇酰胺等)等。
它们可以单独使用一种，也可以合用两种以上。
作为上述非离子型表面活性剂的说明中的AO，可以举出环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷等，其加成形式可以为嵌段加成，也可以为无规加成。
另外，作为AO的加成摩尔数，相对于每1摩尔醇、酚或脂肪酸，优选为1～50摩尔、进一步优选为1～20摩尔。
这些非离子型表面活性剂之中，从在水中的溶解度和粘度的方面出发，优选碳原子数为8～24的一元醇的环氧乙烷1～50摩尔(优选1～20摩尔)加成物(聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烯基醚等)。
另外，这些非离子型表面活性剂之中，从使用最终得到的核壳颗粒(C)进行分离纯化时提高分离对象物质(D)的分离性的方面考虑，优选具有碳原子数为8～24的烯基的一元醇(油醇等)的环氧乙烷1～50摩尔(优选1～20摩尔)加成物。
相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量，非离子型表面活性剂的用量优选为10～1000重量％、进一步优选为100～500重量％。非离子型表面活性剂的用量相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量为10重量％以上或1000重量％以下时，乳液稳定，所生成的颗粒的粒度分布具有变窄的倾向。
工序1中使用的溶液(B2)的用量相对于分散液(B1)所含有的磁性金属氧化物颗粒(A)的重量优选为1,000～10,000重量％、进一步优选为1,500～4,000重量％。
包含非离子型表面活性剂的水溶液的用量相对于磁性金属氧化物颗粒(A)的重量为1,000重量％以上或10,000重量％以下时，乳液稳定，所生成的颗粒的粒度分布具有变窄的倾向。
作为上述(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化剂，可以使用路易斯酸和盐酸等，具体而言，可以使用无机酸(盐酸等)、有机酸(乙酸等)、无机碱化合物(氨等)和胺化合物(乙醇胺等)等。
相对于(烷基)烷氧基硅烷的重量，水解用催化剂的用量优选为1～1000重量％、进一步优选为2～500重量％。
上述分散液(B1)与溶液(B2)的混合方法没有特别限定，也可以使用后述的设备进行一次性混合，从核壳颗粒(C)的粒径的均匀性的方面出发，优选一边对溶液(B2)进行搅拌一边滴加分散液(B1)的方法。
作为将分散液(B1)与溶液(B2)混合时的设备，只要是通常作为乳化机、分散机进行市售的设备就没有特别限定，可以举出例如均化器(IKA公司制造)、POLYTRON(Kinematica公司制造)和TK自动均相混合机(Primix株式会社制造)等间歇式乳化机、Ebara Milder(株式会社荏原制作所制造)、TK FILMIX、TK PIPELINE-HOMO MIXER(Primix株式会社制造)、胶体磨(株式会社KOBELCO ECO-SOLUTIONS制造)、CLEAR MIX(M-Technique公司制造)、浆纱机、三角湿式微粉碎机(NIPPON COKE&ENGINEERING.CO.,LTD.制造)、Cavitron(株式会社Eurotec制造)和Fine Flow Mill(太平洋机工株式会社制造)等连续式乳化机、微射流均质机(MIZUHO INDUSTRIAL株式会社制造)、Nanomizer(Nanomizer株式会社制造)和APV Gaulin(Gaulin公司制造)等高压乳化机、膜乳化机(冷化工业株式会社制造)等膜乳化机、振动混合器(Vibromixer)(冷化工业株式会社制造)等振动式乳化机、超声波均化器(Branson公司制造)等超声波乳化机等。
这些之中，从粒径的均匀化的方面出发，优选APV Gaulin、均化器、TK自动均相混合机、Ebara Milder、TK FILMIX、TK PIPELINE-HOMO MIXER和CLEAR MIX(M-Technique公司制造)。
(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应的温度优选为10～100℃、进一步优选为25～60℃。另外，反应时间优选为0.5～5小时、进一步优选为1～2小时。
接着，对工序2进行说明。
作为本发明中的壳层(Q)的形成方法，可以举出下述方法等：将工序1中得到的核层(P)、(烷基)烷氧基硅烷、(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化剂、水以及必要时进一步使用的水溶性有机溶剂混合，进行(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应，在核层(P)的表面形成含有氧化硅的壳层(Q)。
作为工序2中使用的(烷基)烷氧基硅烷，可以举出在工序1的说明中例示的(烷基)烷氧基硅烷，优选例也相同。
在上述形成壳层(Q)的反应中，以反应溶液的重量为基准，核层(P)的浓度优选小于50重量％、进一步优选小于20重量％。
核层(P)的浓度小于50重量％时，核层(P)均匀地分散在溶液中，容易均匀地形成壳层(Q)，还能够抑制核层(P)彼此藉由氧化硅而凝集。
在上述形成壳层(Q)的反应中，以反应溶液的重量为基准，(烷基)烷氧基硅烷的浓度优选小于50重量％、进一步优选小于20重量％。
(烷基)烷氧基硅烷的浓度在溶液中小于50重量％时，能够抑制核层(P)彼此藉由氧化硅而凝集，还能够抑制仅由氧化硅构成的颗粒、其凝集物以及由它们与核层(P)构成的凝集物的生成。
作为工序2中使用的(烷基)烷氧基硅烷的水解用催化剂，可以使用工序1的说明中例示的水解用催化剂。
相对于(烷基)烷氧基硅烷的重量，水解用催化剂的用量优选为1～2000重量％、进一步优选为2～1000重量％。
相对于反应溶液的重量[反应中使用的核层(P)、(烷基)烷氧基硅烷、水解用催化剂、水以及水溶性有机溶剂等的总重量]，水的用量优选为0.01～99.9重量％、进一步优选为0.1～99.9重量％。
水的用量相对于(烷基)烷氧基硅烷的重量为0.01重量％以上时，(烷基)烷氧基硅烷的水解的反应速度不会变得过慢，能够缩短用于形成所期望的平均厚度的壳层(Q)的反应时间。
水溶性有机溶剂可以使用也可以不使用，在使用的情况下，可以单独使用一种，也可以合用两种以上。
作为水溶性有机溶剂，可以举出在工序1的说明中例示的水溶性有机溶剂，优选例也相同。
除了上述以外，为了改善反应中的核层(P)的分散性，可以使用非离子型表面活性剂等。
作为非离子型表面活性剂，可以举出在工序1的说明中例示的非离子型表面活性剂，优选例也相同。
工序2中的(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应的温度优选为0～90℃、进一步优选为15～50℃。
另外，工序2中的(烷基)烷氧基硅烷的水解缩聚反应的反应时间优选为1～5小时、优选为1～3小时。
本发明中的核壳颗粒(C)由于具有作为氧化硅层的壳层(Q)，因此在颗粒的表面具有硅烷醇基。
因此，能够将规定种类的分离对象物质(D)结合于其表面。
如上所述，上述核壳颗粒(C)能够通过核壳颗粒(C)所具有的硅烷醇基而使分离对象物质(D)结合于其表面。
具体而言，可以举出藉由离液盐(硫氰酸胍盐、胍盐酸盐和高氯酸钠等)使核壳颗粒(C)所具有的硅烷醇基与作为分离对象物质(D)的DNA的核苷酸链结合而形成络合物的方法(日本特开2014-176393号公报中记载的藉由离液盐进行的络合物形成反应等)等。
另外，在分离对象物质(D)不与核壳颗粒(C)直接结合的情况下，可以将与分离对象物质(D)结合的物质(G)固定于核壳颗粒(C)的表面。通过将这种物质(G)固定于表面，能够藉由物质(G)使分离对象物质(D)结合至核壳颗粒(C)上。以下，将这样在表面固定有物质(G)的核壳颗粒也记为“核壳颗粒(C1)”。
另外，分离对象物质(D)可以为目标物质(D1)或非目标物质(D2)，物质(G)只要是与目标物质(D1)或非目标物质(D2)结合的物质就没有特别限定。
物质(G)与分离对象物质(D)的结合可以是特异性的，也可以是非特异性的，分离对象物质(D)与物质(G)的结合优选为特异性的。
在分离对象物质(D)与物质(G)的结合为特异性的情况下，使用本发明的核壳颗粒(C)的分离纯化方法中，分离对象物质(D)的分离性提高。
作为与本发明中的分离对象物质(D)特异性结合的物质(G)，可以举出通过例如“抗原”-“抗体”间反应、“糖链”-“蛋白质”间反应、“糖链”-“凝集素”间反应、“酶”-“抑制剂”间反应、“蛋白质”-“肽链”间反应、“染色体或核苷酸链”-“核苷酸链”间反应、“核苷酸链”-“蛋白质”间反应等相互反应而与分离对象物质(D)结合的物质等。
在上述各组合中的任意一方为分离对象物质(D)的情况下，另一方为与分离对象物质(D)特异性结合的物质(G)。
例如，在分离对象物质(D)为“抗原”时，物质(G)为“抗体”。另外，在分离对象物质(D)为“抗体”时，物质(G)为“抗原”。
在其他上述各组合中也同样。
需要说明的是，本发明中使用的抗体也包括通过蛋白分解酶(木瓜蛋白酶和胃蛋白酶等)和化学分解所产生的分解产物[Fab、F(ab’)2片段等]。
作为将与分离对象物质(D)特异性结合的物质(G)固定于本发明中的核壳颗粒(C)上的方法，还可以举出使物质(G)物理吸附于核壳颗粒(C)的方法。另外，从更高效地固定物质(G)的方面出发，也可以使选自由戊二醛、碳二亚胺化合物、链霉亲和素、生物素和具有官能团的烷基烷氧基硅烷(H)组成的组中的至少一种有机化合物(K)结合于核壳颗粒(C)的表面，藉由它们将物质(G)固定到核壳颗粒(C)上。
这些有机化合物(K)之中，从特定物质(G)的固定的方面考虑，进一步优选具有官能团的烷基烷氧基硅烷(H)。
作为上述烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团，可以举出氨基、羧基、羟基、巯基和环氧丙氧基等，在1分子烷基烷氧基硅烷中可以具有不同种类的官能团。
作为使具有官能团的烷基烷氧基硅烷(H)结合到核壳颗粒(C)的表面的方法，可以举出：在利用上述方法制作核壳颗粒(C)时，作为工序2中使用的(烷基)烷氧基硅烷，使用具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的方法；和使用不具有这些取代基的(烷基)烷氧基硅烷制作核壳颗粒(C)后，利用具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷对核壳颗粒(C)进行处理的方法；等。
作为后者的方法的具体例，可以举出下述方法等：将核壳颗粒(C)按照其浓度相对于溶剂的重量为0.1～50重量％的方式分散于溶剂中，在该分散液中添加具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的溶液，在室温下进行水解缩合反应。
该方法中的溶剂根据所使用的烷基烷氧基硅烷的溶解性而适当选择，在使用可溶于水的具有被氨基、羧基、羟基或巯基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的情况下，优选使用水或水与醇的混合溶剂等，在使用难溶于水的具有被环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的情况下，优选使用乙酸丁酯等。
以物质(G)固定前的核壳颗粒(C)的重量为基准，具有被氨基、羧基、羟基、巯基或环氧丙氧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的用量优选为0.0001～100重量％。
该用量为0.0001重量％以上时，能够在核壳颗粒(C)的表面导入足够量的官能团。另外，该用量为100重量％以下时，能够抑制核壳颗粒(C)彼此发生反应而结合。
使戊二醛、碳二亚胺化合物、链霉亲和素或生物素结合到核壳颗粒(C)的表面的方法没有特别限定，例如可以如下进行结合。
具有醛基的戊二醛和具有羧基的生物素可以通过与表面结合有具有被氨基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的核壳颗粒(C)发生反应而结合到核壳颗粒(C)的表面。
另外，具有氨基的链霉亲和素以及具有碳二亚胺基的碳二亚胺化合物可以通过与表面结合有具有被羧基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷的核壳颗粒(C)发生反应而结合到核壳颗粒(C)的表面。
藉由有机化合物(K)将物质(G)固定到核壳颗粒(C)上的方法根据物质(G)的种类而适当选择有机化合物(K)即可。
例如，在固定具有链霉亲和素骨架的物质(G)的情况下，可以选择生物素作为有机化合物(K)，利用公知的方法进行固定。
另外，在固定具有生物素骨架的物质(G)的情况下，可以选择链霉亲和素作为有机化合物(K)，利用公知的方法进行固定。
另外，在固定具有氨基的物质(G)的情况下，可以选择戊二醛作为有机化合物(K)，利用公知的方法进行固定。
另外，在固定具有羧基的物质(G)的情况下，可以选择碳二亚胺化合物作为有机化合物(K)，利用公知的方法进行固定。
另外，在使用具有官能团的烷基烷氧基硅烷(H)作为有机化合物(K)的情况下，可以根据烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团来结合如下的物质(G)。
例如，在烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团为氨基的情况下，可以利用公知的方法固定具有羧基、羰基和/或醛基的物质(G)。
另外，在烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团为羧基的情况下，可以利用公知的方法固定具有氨基的物质(G)。
另外，在烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团为羟基的情况下，可以利用公知的方法固定具有羧基的物质(G)。
另外，在烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团为巯基的情况下，可以利用公知的方法固定具有巯基的物质(G)。
另外，在烷基烷氧基硅烷(H)所具有的官能团为环氧丙氧基的情况下，可以利用公知的方法固定具有氨基和/或羟基的物质(G)。
另外，也可以使有机化合物(K)与其他化合物反应，藉此将物质(G)固定到核壳颗粒(C)上。
例如，在使用具有氨基的烷基烷氧基硅烷作为有机化合物(K)的情况下，可以与琥珀酸酐反应，生成羧基。这种情况下，可以利用公知的方法固定具有氨基的物质(G)。
作为这样的方法，可以举出使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的方法等。
另外，作为与本发明中的分离对象物质(D)非特异性结合的物质(G)，可以举出具有通过共价键、氢键、疏水性相互作用和离子键等与分离对象物质(D)结合的官能团(J)的物质。
从能够在水溶液中迅速且牢固地结合的方面出发，作为官能团(J)，优选氨基和铵基等。
作为氨基，可以举出伯氨基～叔氨基等。另外，作为铵基，可以举出上述伯氨基～叔氨基与酸(盐酸、溴酸、碘酸、乙酸、硫酸、硝酸和磷酸等)的盐和季铵基等。
此处，作为具有伯氨基的基团，可以举出氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基等氨基烷基、3-氨基-1-乙氧基丙基、1-氨基-乙氧基甲基等氨基烷氧基烷基等。
作为仲氨基，可以举出被1个烃基取代的氨基。作为具有仲氨基的基团，包括N-烷基氨基烷基，可以举出N-甲基氨基乙基、N-乙基氨基乙基等N-烷基氨基烷基、咪唑基等。
作为叔氨基，可以举出被2个烃基取代的氨基。作为具有叔氨基的官能团，可以举出N-二甲基氨基乙基、N-二甲基氨基丙基、N-二乙基氨基乙基、N-二丁基氨基乙基等。
作为季铵基，可以举出被3个烃基取代的铵基。作为具有季铵基的官能团，可以举出三甲基铵基、三乙基铵基等三烷基铵基等。
作为成为季铵基的抗衡离子的成分，可以举出氢氧化物离子和酸来源的阴离子等。作为酸，可以举出盐酸、溴酸、碘酸、乙酸、硫酸、硝酸和磷酸等。
作为将含有氨基或铵基的物质(G)固定到核壳颗粒上的方法，除了在利用上述方法制作核壳颗粒(C)时使用具有被氨基取代的烷基的烷基烷氧基硅烷作为工序2中使用的(烷基)烷氧基硅烷的方法以外，还可以举出下面详细记载的使核壳颗粒(C)与具有氨基或铵基的化合物反应的方法等。
作为使核壳颗粒(C)与具有伯氨基～叔氨基或季铵基的化合物反应的方法，具体可以举出以下的方法。
作为使具有伯氨基的化合物反应的方法，可以举出例如使烷撑二胺与核壳颗粒(C)的羟基和/或羧基反应的方法。
需要说明的是，核壳颗粒(C)的羟基是指来自壳层(Q)所具有的硅烷醇基的基团、或者来自具有羟基的烷基烷氧基硅烷的基团。
另外，核壳颗粒(C)的羧基是指来自具有羧基的烷基烷氧基硅烷的基团。
具体而言，使羧基预先与碳二亚胺化合物反应，得到酰基异脲{R’-N＝C(OCOR)-NH-R’(-OCOR为来自具有羧基的核壳颗粒(C)的部分)}，然后将烷撑二胺加入到该酰基异脲中，由此能够使具有伯氨基的化合物在核壳颗粒(C)上进行酰胺键合。
从分离对象物质(D)的分离性的方面出发，以物质(G)固定前的核壳颗粒(C)的重量为基准，具有伯氨基的化合物的结合量优选为0.01～10mmol/g。
作为使具有仲氨基的化合物反应的方法，可以举出例如使N-烷基氨基烷基胺与核壳颗粒(C)的羟基和/或羧基反应的方法。
具体而言，使羧基预先与碳二亚胺化合物反应，得到酰基异脲{R’-N＝C(OCOR)-NH-R’(-OCOR为来自具有羧基的核壳颗粒(C)的部分)}，然后将N-烷基氨基烷基胺加入到该酰基异脲中，由此能够使具有仲氨基的化合物在核壳颗粒(C)上进行酰胺键合。从分离对象物质(D)的分离能力的方面出发，以物质(G)固定前的核壳颗粒(C)的重量为基准，具有仲氨基的化合物的结合量优选为0.01～10mmol/g。
作为使具有叔氨基的化合物反应的方法，可以举出例如使N-二烷基氨基烷基氯与核壳颗粒(C)的羟基和/或羧基反应的方法。
具体而言，在NaOH(氢氧化钠)存在下在水溶液中进行反应，由此能够与核壳颗粒(C)的羧基形成酯键或与核壳颗粒(C)的羟基形成醚键。
作为使具有季铵基的化合物反应的方法，可以举出例如使N-缩水甘油基三烷基氯化铵与核壳颗粒(C)的羧基和/或羟基反应的方法。
具体而言，在季铵盐催化剂存在下在水溶液中进行反应，由此能够与核壳颗粒(C)的羧基形成酯键或与核壳颗粒(C)的羟基形成醚键。
接着，下面举出两个示例，对使用本发明的核壳颗粒(C)分离试样(E)中的分离对象物质(D)的分离纯化方法进行说明。
需要说明的是，这些分离纯化方法也是本发明的分离纯化方法。
(第1分离纯化方法)
第1分离纯化方法为下述方法：分离对象物质(D)为目标物质(D1)，从包含目标物质(D1)的试样(E1)中提取、纯化目标物质(D1)。
第1分离纯化方法包括(1)复合体形成工序、(2)复合体分离工序、以及(3)目标物质解离工序。
以下，对各工序进行说明。
(1)复合体形成工序
本工序中，使包含目标物质(D1)的试样(E1)与核壳颗粒(C)接触，形成核壳颗粒(C)与目标物质(D1)的复合体(F1)。
复合体(F1)可以通过目标物质(D1)直接结合到核壳颗粒(C)上而形成。
另外，也可以使核壳颗粒(C)具有与目标物质(D1)结合的物质(G)，目标物质(D1)藉由物质(G)结合到核壳颗粒(C)上，由此形成复合体(F1)。
(2)复合体分离工序
接着，利用磁力将复合体(F1)从试样(E1)中分离。
复合体(F1)包含核壳颗粒(C)，核壳颗粒(C)具有磁性金属氧化物颗粒(A)，因此复合体(F1)可以利用磁力进行收集。
之后，除去残留的试样(E1)，由此能够将复合体(F1)从试样(E1)中分离。
作为这种方法，可以举出例如下述方法：利用磁铁等的磁力从反应槽的外侧收集复合体(F1)，将上清液(从试样(E1)中除去目标物质(D1)后的试样(E11))排出，分离出复合体(F1)。
另外，为了除去附着于复合体(F1)上的夹杂物，可以利用清洗液对分离后的复合体(F1)进行清洗。清洗操作可以重复1～10次。
作为清洗液，可以使用生理盐水和磷酸缓冲液等。
另外，在清洗液中也可以包含表面活性剂。作为表面活性剂，优选非离子型表面活性剂。
作为非离子型表面活性剂，可以举出：碳原子数为8～24的一元醇(癸醇、十二烷醇、椰油烷基醇、十八烷醇和油醇等)的环氧烷烃(以下将环氧烷烃简记为AO)加成物；
碳原子数为3～36的2～8元醇(甘油、三羟甲基丙烷、季戊四醇、山梨糖醇和山梨糖醇酐等)的AO加成物；
具有碳原子数为6～24的烷基的烷基酚(辛基酚和壬基酚等)的AO加成物；
聚丙二醇的环氧乙烷加成物和聚乙二醇的环氧丙烷加成物；
碳原子数为8～24的脂肪酸(癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸和椰油脂肪酸等)的AO加成物；
上述碳原子数为3～36的2～8元醇的脂肪酸酯及其AO加成物[TWEEN(注册商标)20和TWEEN(注册商标)80等]；
烷基糖苷(N-辛基-β-D-麦芽糖苷、正十二酰基蔗糖和正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷等)；以及
蔗糖的脂肪酸酯、脂肪酸烷醇酰胺和它们的AO加成物(聚氧乙烯脂肪酸烷醇酰胺等)等。
它们可以单独使用一种，也可以合用两种以上。
作为上述非离子型表面活性剂的说明中的AO，可以举出环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷等，其加成形式可以为嵌段加成，也可以为无规加成。
另外，作为AO的加成摩尔数，相对于每1摩尔醇、酚或脂肪酸，优选为1～50摩尔、进一步优选为1～20摩尔。
这些非离子型表面活性剂之中，从在水中的溶解度和粘度的方面出发，优选碳原子数为8～24的一元醇的环氧乙烷1～50摩尔(优选1～20摩尔)加成物(聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烯基醚等)。
从试样(E1)中分离复合体(F1)的操作优选重复1～10次。通过重复该操作，能够从试样(E1)中分离较多的复合体(F1)。
(3)目标物质解离工序
接着，使目标物质(D1)从复合体(F1)解离，得到目标物质(D1)。
作为使目标物质(D1)从复合体(F1)解离的方法，没有特别限定，可以举出通过加入抑制核壳颗粒(C)与目标物质(D1)的结合的物质而使目标物质(D1)解离的方法等。
作为抑制核壳颗粒(C)与目标物质(D1)的结合的物质，根据目标物质(D1)和物质(G)的种类而不同，可以举出通过pH差、盐浓度差、温度差和表面活性剂的作用而抑制结合的物质等。作为能够抑制结合的表面活性剂，可以举出月桂基硫酸盐和十二烷基苯磺酸盐等。
另外，在复合体(F1)为藉由上述离液盐形成的核壳颗粒(C)与目标物质(D1)的络合物的情况下，作为抑制核壳颗粒(C)与目标物质(D1)的结合的物质，可以使用高浓度的Tris-EDTA缓冲液等。
需要说明的是，Tris-EDTA缓冲液中优选三(羟基甲基)氨基甲烷为50mM以上、乙二胺四乙酸四钠为10mM以上。
经过上述工序，能够对目标物质(D1)进行分离纯化。
在通过该方法获得目标物质(D1)的情况下，由于在复合体形成工序中能够使目标物质(D1)选择性地与核壳颗粒(C)结合(分离对象物质(D)的分离性优异)，因此能够提高所得到的分离纯化物中的目标物质(D1)的纯度。
第1分离纯化方法中，在(3)目标物质解离工序之后，可以进行回收核壳颗粒(C)的核壳颗粒回收工序。
在上述(3)目标物质解离工序中，核壳颗粒(C)与目标物质(D1)解离。
通过回收这样的核壳颗粒(C)，能够进行再利用。
因此，在回收工序后，可以使用所回收的核壳颗粒(C)，反复进行上述(1)复合体形成工序、(2)复合体分离工序和(3)目标物质解离工序。
在上述核壳颗粒(C)的再利用中，再次接触的试样(E1)可以是作为残留有目标物质(D1)的试样的上述试样(E11)。
通过对核壳颗粒(C)进行再利用，能够抑制目标物质(D1)的分离纯化的成本。
(第2分离纯化方法)
第2分离纯化方法为下述方法：分离对象物质(D)为非目标物质(D2)，从包含目标物质(D1)和非目标物质(D2)的试样(E2)中除去非目标物质(D2)，由此对目标物质(D1)进行纯化。
第2分离纯化方法包括(1)复合体形成工序和(2)非目标物质除去工序。
下面，对各工序进行说明。
(1)复合体形成工序
本工序中，使包含目标物质(D1)和非目标物质(D2)的试样(E2)与核壳颗粒(C)接触，形成核壳颗粒(C)与非目标物质(D2)的复合体(F2)。
复合体(F2)可以通过非目标物质(D2)直接结合到核壳颗粒(C)上而形成。
另外，也可以使核壳颗粒(C)具有与非目标物质(D2)结合的物质(G)，非目标物质(D2)藉由物质(G)与核壳颗粒(C)结合，由此形成复合体(F2)。
(2)非目标物质除去工序
接着，利用磁力将复合体(F2)从试样(E2)中分离，由此从试样(E2)中除去非目标物质(D2)，得到包含目标物质(D1)的试样(E21)。
复合体(F2)包含核壳颗粒(C)，核壳颗粒(C)具有磁性金属氧化物颗粒(A)，因此复合体(F2)可以利用磁力进行收集。
之后，回收残留的试样(E21)，由此能够将复合体(F2)从试样(E21)中分离。
作为这样的方法，可以举出例如下述方法：利用磁铁等的磁力从反应槽的外侧收集复合体(F2)，回收上清液，分离出试样(E21)。
另外，在无法从试样(E21)中充分除去非目标物质(D2)的情况下，也可以使用试样(E21)反复进行(1)复合体形成工序和(2)非目标物质除去工序。由此，进一步除去试样(E21)中的非目标物质(D2)。
在第2分离纯化方法中，非目标物质(D2)的种类为多种，试样(E2)中可以包含多种非目标物质(D2)。
这种情况下，通过使用能够与各非目标物质(D2)结合的一种或多种核壳颗粒(C)，能够从试样(E2)中除去多种非目标物质(D2)。
经过上述工序，能够对包含目标物质(D1)的试样(E21)进行分离纯化。
作为从试样(E21)中进一步获得目标物质(D1)的方法，可以使用过滤、蒸馏等公知的方法。
在通过该方法获得目标物质(D1)的情况下，由于在复合体形成工序中能够使非目标物质(D2)选择性地与核壳颗粒(C)结合，因此除去非目标物质(D2)后的成分中的非目标物质(D2)的比例降低。其结果，能够提高试样(E21)中的目标物质(D1)的比例。
第2分离纯化方法中，在非目标物质除去工序之后，可以包括从复合体(F2)中回收核壳颗粒(C)的核壳颗粒回收工序。
作为从复合体(F2)中回收核壳颗粒(C)的方法，没有特别限定，可以举出通过加入抑制核壳壳颗粒(C)与非目标物质(D2)的结合的物质而使核壳颗粒(C)解离的方法。
作为抑制核壳颗粒(C)与非目标物质(D2)的结合的物质，根据非目标物质(D2)和物质(G)的种类而不同，可以举出通过pH差、盐浓度差、温度差和表面活性剂的作用而抑制结合的物质等。作为能够抑制结合的表面活性剂，可以举出月桂基硫酸盐和十二烷基苯磺酸盐等。
另外，在复合体(F2)为藉由上述离液盐形成的核壳颗粒(C)与非目标物质(D2)的络合物的情况下，作为抑制核壳颗粒(C)与非目标物质(D2)的结合的物质，可以使用高浓度的Tris-EDTA缓冲液等。
需要说明的是，作为Tris-EDTA缓冲液，优选三(羟基甲基)氨基甲烷为50mM以上、乙二胺四乙酸四钠为10mM以上。
通过回收这样的核壳颗粒(C)，能够进行再利用。
因此，在核壳颗粒回收工序后，可以使用所回收的核壳颗粒(C)，反复进行上述(1)复合体形成工序和(2)非目标物质除去工序。
在上述核壳颗粒(C)的再利用中，再次接触的试样(E2)可以是作为残留有非目标物质(D2)的试样的上述试样(E21)。
通过对核壳颗粒(C)进行再利用，能够抑制目标物质(D1)的分离纯化的成本。
作为本发明的分离纯化方法中的目标物质(D1)，可以举出：蛋白质[白蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、转铁蛋白、蛋白A、C反应蛋白(CRP)、脂蛋白、酶、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、凝血相关因子、抗体、抗原和激素等]、
核酸[脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)等]、
药物[抗癫痫药、抗生素、茶碱等]、
病毒[丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、嗜肝DNA病毒、腺病毒、弹状病毒、黄病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、正粘病毒等]、
细菌[O-157、幽门螺杆菌、沙门氏菌等]、
细胞[脂肪细胞、ES细胞、肝细胞、干细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、神经细胞、肿瘤细胞、IPS细胞等]等。
作为上述酶，可以举出碱性磷酸酶、淀粉酶、酸性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)、脂肪酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)、肾素、蛋白激酶(PK)、酪氨酸激酶等。
作为上述脂蛋白，可以举出高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、超低密度脂蛋白等。
作为上述免疫球蛋白，可以举出IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等。
作为上述免疫球蛋白片段，可以举出Fc段、Fab段、F(ab)2段等。
作为上述凝血相关因子，可以举出纤维蛋白原、纤维蛋白降解产物(FDP)、凝血酶原、凝血酶等。
作为上述抗体，可以举出抗链霉素O抗体、抗人乙型肝炎病毒表面抗原抗体(HBs抗原)、抗人丙型肝炎病毒抗体、抗类风湿因子抗体等。
作为上述抗原，可以举出癌胚抗原(CEA)等。
作为上述激素，可以举出促甲状腺激素(TSH)、甲状腺激素(FT3、FT4、T3、T4)、甲状旁腺激素(PTH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、雌二醇(E2)等。
另外，作为上述抗原和抗体，还可以举出作为癌标志物[甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA19-9、前列腺特异性抗原(PSA)等]和心脏病标志物[肌钙蛋白T(TnT)、人N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)等]而已知的物质等。
上述物质之中，优选核酸、抗原、抗体和激素等。
本发明中的非目标物质(D2)是指在试样(E)所包含的物质中除去目标物质(D1)后的物质中的至少一种。即，非目标物质(D2)的种类可以为多种。
例如，在试样(E)为血清、将血清中包含的癌胚抗原(CEA)作为目标物质(D1)的情况下，血清中包含的其他成分[蛋白质(白蛋白、抗体和CEA以外的抗原等)、脂质和无机物等]中的至少一种为非目标物质(D2)。
本发明中，分离对象物质(D)优选为选自由DNA、RNA、细胞、病毒、细菌和蛋白质组成的组中的至少一种。
实施例
以下，通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。以下，只要没有特别规定，则％表示重量％，份表示重量份。
制造例1：核壳颗粒(C1-1)的制成
<磁性金属氧化物颗粒(A)的制作>
向反应容器中投入氯化铁(III)六水合物186份、氯化铁(II)四水合物68份和水1288份，使其溶解并升温至50℃，在搅拌下一边将温度保持为50～55℃一边用1小时滴加25重量％氨水280份，在水中得到磁铁矿颗粒。向所得到的磁铁矿颗粒中加入作为分散剂的油酸64份，继续搅拌2小时。冷却到室温后，将通过倾滗进行固液分离而得到的吸附有油酸的磁铁矿颗粒用水1000份进行清洗，进行3次上述操作，进一步进行2次用丙酮1000份进行清洗的操作，在40℃干燥2天，由此得到体积平均粒径为15nm的磁性金属氧化物颗粒(A-1)。
<核层(P)的制作>
将磁性金属氧化物颗粒(A)80份加入到四乙氧基硅烷240份中并使其分散，制备出分散液(B1)。接着，在反应容器中加入水5050份、25重量％氨水溶液3500份、EMULMIN 200(三洋化成工业株式会社制造)400份，利用CLEAR MIX(M-Technique株式会社制造)进行混合，得到溶液(B2)。升温至50℃后，一边以6,000rpm的转速搅拌CLEAR MIX一边用1小时将上述分散液(B1)滴加到溶液(B2)中，之后在50℃反应1小时。反应后，以2,000rpm离心分离20分钟，除去存在微粒的上清液，得到含有83重量％的磁性金属氧化物颗粒(A-1)的核层(P-1)。
<核壳颗粒(PC)的制作>
向反应容器中加入核层(P-1)80份、去离子水2500份、25重量％氨水溶液260份、乙醇2500份、四乙氧基硅烷1200份，利用CLEARMIX(M-Technique公司制造)进行混合，一边以6,000rpm的转速搅拌CLEAR MIX一边反应2小时。反应后，以2,000rpm离心分离20分钟，除去存在微粒的上清液。在离心分离后沉淀的颗粒中加入去离子水4000份，使颗粒再分散，通过从容器的外侧使磁铁与分散的颗粒接触而进行磁力收集，除去上清液，进行10次上述操作，得到核壳颗粒(PC-1)。
<核壳颗粒(PC)的分级工序>
在含有所得到的核壳颗粒(PC-1)的固相中加入水5000份使颗粒分散，以2800rpm离心分离1分钟后，除去存在微粒的上清液，进行4次上述操作(离心分离工序1)。
接着，在所得到的固相中加入水5000份使颗粒分散，以600rpm离心分离1分钟，回收上清液，由此除去沉降的粒径大的颗粒，进行1次上述操作(离心分离工序2)。
进而，利用磁铁对颗粒进行磁力收集，除去上清液。之后，加入水5000份使核壳颗粒分散后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集，除去上清液，进行10次上述操作(清洗工序1)，得到核壳颗粒(C-1)。
<负载抗AFP抗体的核壳颗粒(C1)的制作>
在装有含1重量％γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的水溶液400mL的带盖聚乙烯瓶中加入分级后的核壳颗粒(C-1)50mg，在25℃反应1小时，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。接着，加入去离子水400mL使核壳颗粒分散，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体，对核壳颗粒进行清洗。进行4次该清洗操作。
接着，将该清洗后的核壳颗粒加入到装有含0.5重量％琥珀酸酐的乙醇溶液100mL的带盖聚乙烯瓶中，在25℃反应2小时。然后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。接着，加入去离子水400mL使核壳颗粒分散，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体，对核壳颗粒进行清洗。进行3次该清洗操作。
接着，将该清洗后的核壳颗粒加入到装有含0.5重量％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.5重量％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液400mL的带盖聚乙烯瓶中，在25℃反应1小时。然后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。
接着，加入25mM吗啉代乙磺酸缓冲液(pH5.0)200mL，使颗粒再分散后，再次利用磁铁对颗粒进行磁力收集，利用抽吸器抽吸除去液体，实施核壳颗粒的清洗操作。进行3次该清洗操作。
进而，将该清洗后的核壳颗粒加入到带盖聚乙烯瓶中，该带盖聚乙烯瓶中装有以20μg/mL的浓度含有抗AFP多克隆抗体(由Dako Cytomation株式会社购入)的100mM吗啉代乙磺酸缓冲液(pH5.0)400mL，在25℃反应3小时。反应后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。
接着，加入25mM吗啉代乙磺酸缓冲液(pH5.0)200mL，使颗粒再分散后，再次利用磁铁对颗粒进行磁力收集，利用抽吸器抽吸除去液体，实施核壳颗粒的清洗操作。进行3次该清洗操作，得到核壳颗粒(C1-1)。将其浸渍到含有0.1重量％的Blockmaster CE510(JSR株式会社制造)的0.02M磷酸缓冲液(pH7.2)50mL中，在4℃保存。
制造例2～4、制造例9～11和制造例15～16：核壳颗粒(C1-2)～(C1-4)、(C1-9)～(C1-11)和(C1-15)～(C1-16)的制成
在制造例1的“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到核壳颗粒(C1-2)～(C1-4)、(C1-9)～(C1-11)和(C1-15)～(C1-16)。
制造例5：核壳颗粒(C1-5)的制成
在制造例1的“核壳颗粒(PC)的制作”中，代替四乙氧基硅烷1200份而使用四乙氧基硅烷15份，并且在“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到核壳颗粒(C1-5)。
制造例6：核壳颗粒(C1-6)的制成
在制造例1的“核壳颗粒(PC)的制作”中，代替四乙氧基硅烷1200份而使用四乙氧基硅烷150份，并且在“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到核壳颗粒(C1-6)。
制造例7：核壳颗粒(C1-7)的制成
在制造例1的“核壳颗粒(PC)的制作”中，代替四乙氧基硅烷1200份而使用四乙氧基硅烷3000份，并且在“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到核壳颗粒(C1-7)。
制造例8：核壳颗粒(C1-8)的制成
在制造例1的“核壳颗粒(PC)的制作”中，代替四乙氧基硅烷1200份而使用四乙氧基硅烷10000份，并且在“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到核壳颗粒(C1-8)。
制造例12：核壳颗粒(C1-12)的制成
在制造例2的“核层(P)的制作”的制成中，代替磁性金属氧化物颗粒(A)80份而使用磁性金属氧化物颗粒(A)60份，除此以外进行与制造例2同样的操作，得到核壳颗粒(C1-12)。
制造例13：核壳颗粒(C1-13)的制成
在制造例2的“核层(P)的制作”的制成中，代替磁性金属氧化物颗粒(A)80份而使用磁性金属氧化物颗粒(A)100份，除此以外进行与制造例2同样的操作，得到核壳颗粒(C1-13)。
制造例14：核壳颗粒(C1-14)的制成
在制造例2的“核壳颗粒(PC)的制作”的制成中，代替四乙氧基硅烷1200份而使用四乙氧基硅烷600份，除此以外进行与制造例2同样的操作，得到核壳颗粒(C1-14)。
比较制造例1：比较用的颗粒(C1’-1)的制成
在制造例1的“核层(P)的制作”中，代替EMULMIN 200而使用NSA-17(三洋化成工业株式会社制造)，并且在制造例1的“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到比较用的颗粒(C1’-1)。
比较制造例2：比较用的颗粒(C1’-2)的制成
在制造例1的“核层(P)的制作”中，代替EMULMIN 200而使用NSA-17(三洋化成工业株式会社制造)，并且在制造例1的“核壳颗粒(PC)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外进行与制造例1同样的操作，得到比较用的颗粒(C1’-2)。
比较制造例3：比较用的颗粒(C1’-3)的制成
将制造例1中得到的核层(P-1)作为比较用的颗粒(PC’-1)，实施以下操作。
<颗粒(PC’)的分级工序>
在通过制造例1的“核层(P)的制作”的操作得到的全部磁性氧化硅颗粒[颗粒(PC’-1)]中加入水5000份，使颗粒分散，以1600rpm离心分离1分钟后，除去存在微粒的上清液，进行20次上述操作(离心分离工序1)(离心分离工序1)。
接着，在所得到的固相中加入水5000份，使颗粒分散，以800rpm离心分离1分钟，由此使粒径大的颗粒沉降而除去，进行1次上述操作(离心分离工序2)。
进而，利用磁铁对颗粒进行磁力收集，除去上清液。之后，加入水5000份使颗粒分散后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集，除去上清液，进行10次上述操作(清洗工序1)，得到颗粒(C’-3)。
<负载抗AFP抗体的颗粒(C1’)的制作>
在装有含1重量％γ-氨基丙基三乙氧基硅烷的水溶液400mL的带盖聚乙烯瓶中加入分级后的颗粒(C’-3)50mg，在25℃反应1小时，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。接着，加入去离子水400mL使颗粒分散，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体，对颗粒进行清洗。进行4次该清洗操作。
接着，将该清洗后的颗粒加入到装有含0.5重量％琥珀酸酐的乙醇溶液100mL的带盖聚乙烯瓶中，在25℃反应2小时。然后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。接着，加入去离子水400mL使颗粒分散，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体，对颗粒进行清洗。进行3次该清洗操作。
接着，将该清洗后的颗粒加入到装有含0.5重量％1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.5重量％N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液400mL的带盖聚乙烯瓶中，在25℃反应1小时。然后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。
接着，加入25mM吗啉代乙磺酸缓冲液(pH5.0)200mL，使颗粒再分散后，再次利用磁铁对颗粒进行磁力收集，利用抽吸器抽吸除去液体，实施颗粒的清洗操作。进行3次该清洗操作。
进而，将该清洗后的颗粒加入到带盖聚乙烯瓶中，该带盖聚乙烯瓶中装有以20μg/mL的浓度含有抗AFP多克隆抗体(由Dako Cytomation株式会社购入)的100mM吗啉代乙磺酸缓冲液(pH5.0)400mL，在25℃反应3小时。反应后，利用磁铁对颗粒进行磁力收集后，利用抽吸器抽吸除去液体。
接着，加入25mM吗啉代乙磺酸缓冲液(pH5.0)200mL，使颗粒再分散后，再次利用磁铁对颗粒进行磁力收集，利用抽吸器抽吸除去液体，实施颗粒的清洗操作。进行3次该清洗操作，得到比较用的颗粒(C1’-3)。将其浸渍到含有0.1重量％的Blockmaster CE510(JSR株式会社制造)的0.02M磷酸缓冲液(pH7.2)50mL中，在4℃保存。
比较制造例4：比较用的颗粒(C1’-4)的制成
在比较制造例4的“颗粒(PC’)的分级工序”中，设定为表1中记载的条件，除此以外与比较制造例1同样地得到颗粒(C1’-4)。
对于制造例1～16和比较制造例1～4中得到的磁性金属氧化物颗粒(A-1)、核壳颗粒(C1-1)～(C1-16)和比较用的颗粒(C1’-1)～(C1’-4)，如下进行评价。
<磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径的测定方法>
使用扫描型电子显微镜(型号：JSM-7000F、制造商名：日本电子株式会社)观察任意200个磁性金属氧化物颗粒(A)并测定粒径，求出体积平均粒径。结果记载于表1。
<磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例的测定方法>
对于通过制造例1的“核层(P)的制作”的操作得到的核层(P)中的任意20个，利用扫描型电子显微镜(型号：JSM-7000F、制造商名：日本电子株式会社)进行观察，通过能量色散型X射线光谱装置(型号：INCA Wave/Energy、制造商名：Oxford公司)测定磁性金属氧化物颗粒(A)的含量，将其平均值作为含量S。另外，通过该测定对氧化硅的含量进行测定，将其平均值作为含量T。利用下述计算式求出磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例。结果记载于表1。
磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例(重量％)＝[(S)/(S+T)]×100
<核壳颗粒(C1)的体积平均粒径和变异系数的测定方法>
关于核壳颗粒(C1-1)～(C1-16)和比较用的颗粒(C1’-1)～(C1’-4)的体积平均粒径和变异系数，将含有各制造例中得到的核壳颗粒的磷酸缓冲液作为试样，利用激光衍射/散射式粒径分布测定装置(Microtrac BEL株式会社制造的“Microtrac MT3300”)进行测定。结果记载于表1。
<壳层(Q)的平均厚度的测定方法>
将在核壳颗粒(PC)的分级工序中得到的核壳颗粒(C)或在颗粒(PC’)的分级工序中得到的比较用的颗粒(C’)包埋在环氧树脂中并用切片机切断，利用透射型电子显微镜(型号“H-7100”、株式会社日立制作所制造)对所得到的截面进行观察，由核壳颗粒(C)(或比较用的颗粒(C’))的膜厚最厚的部分与最薄的部分的平均值求出膜厚。进而对于任意100个核壳颗粒(C)(或比较用的颗粒(C’))与上述同样地求出膜厚，将其平均值作为壳层(Q)的平均厚度。结果记载于表1。
<实施例1～16和比较例1～4：使用核壳颗粒(C)的蛋白质的分离>
使用制造例1～16中得到的核壳颗粒(C1-1)～(C1-16)和比较制造例1～4中得到的比较用的颗粒(C1’-1)～(C1’-4)，通过下述方法实施试样(E)中的分离对象物质(D)[蛋白质]的分离。
另外，对于分离操作后得到的溶液，利用下述方法评价“总蛋白质浓度”、“AFP浓度”和“AFP纯度”。
<分离操作：从人血清中提取AFP>
[核壳颗粒(C1)的回收]
对于包含制造例中得到的核壳颗粒(C1)的0.02M磷酸缓冲液5mL，通过从容器的外侧使磁铁接触而对核壳颗粒(C1)进行磁力收集，在该状态下除去上清液，由此回收核壳颗粒(C1)。
[复合体形成工序]
接着，将包含作为目标物质的甲胎蛋白(AFP)1660ng/mL的人血清液10mL加入到除去了上清液的核壳颗粒(C1)中，进行1小时翻转搅拌，形成核壳颗粒(C1)与AFP的复合体(C1-AFP)。
[复合体分离工序]
反应后，通过从容器的外侧使磁铁接触而对复合体(C1-AFP)进行磁力收集，在该状态下除去上清液，由此回收复合体(C1-AFP)。
[目标物质解离工序]
在所得到的复合体(C1-AFP)中加入包含0.1重量％Sanonic SS-120(三洋化成工业株式会社制造)的生理盐水1mL，使颗粒分散后，用磁铁进行磁力收集，除去上清液，进行2次上述清洗操作。
接着，加入0.5重量％月桂基硫酸钠水溶液0.25mL并转倒搅拌1小时，使AFP从复合体(C1-AFP)中解离。利用磁铁对核壳颗粒(C1)进行磁力收集，用移液器取出上清液(XA-1)。在磁力收集得到的核壳颗粒(C1)中再次加入0.5重量％月桂基硫酸钠水溶液0.25mL并转倒搅拌1小时后，进行磁力收集，用移液器取出上清液(XB-1)。将上清液(XA-1)与上清液(XB-1)混合，得到包含AFP的溶液(X-1)。
<总蛋白质浓度>
使用紫外可见分光光度计UV-1800(株式会社岛津制作所制造)，测定包含AFP的溶液(X-1)的吸光度(光程长10mm)，通过下式计算出总蛋白质浓度(280nm处的吸光度为1.0的情况下，设总蛋白质浓度为1mg/mL)。将结果记载于表2。
总蛋白质浓度(mg/mL)＝280nm处的吸光度(光程长10mm)
<AFP浓度>
将包含AFP的溶液(X-1)用SphereLight样本稀释液[富士胶片和光纯药株式会社制造]稀释1000倍，利用自动化学发光酶免疫分析装置“SphereLight Wako”[富士胶片和光纯药株式会社制造]测定AFP浓度。将所得到的测定值乘以1000倍，计算出溶液(X-1)的AFP浓度。将结果记载于表2。
<AFP纯度>
通过下式计算出AFP纯度。结果记载于表2。
AFP纯度(％)＝AFP浓度/总蛋白质浓度×100
【表1】
Figure BDA0002827513580000301
Figure BDA0002827513580000311
如表2所示，可知：与通过使用比较用的颗粒的方法得到的包含分离对象物质(D)的溶液相比，通过本发明的方法得到的包含分离对象物质(D)[AFP]的溶液中分离对象物质(D)以外的物质的含量少，是纯度高的溶液。
<实施例17～23和比较例5：使用核壳颗粒(C)的DNA的分离>
使用上述制造例的核壳颗粒(PC)的分级工序或核壳颗粒(PC’)的分级工序中得到的核壳颗粒(C-1)～(C-4)、核壳颗粒(C-11)和比较用的颗粒(C’-2)，通过下述方法测定核壳颗粒(C)的体积平均粒径和变异系数，并且实施试样(E)中的分离对象物质(D)[DNA]的分离。
<核壳颗粒(C)的体积平均粒径和变异系数的测定方法>
关于核壳颗粒(C-1)～(C-4)、核壳颗粒(C-11)和比较用的颗粒(C’-2)的体积平均粒径和变异系数，将含有各制造例中得到的核壳颗粒的磷酸缓冲液作为试样，利用激光衍射/散射式粒径分布测定装置(Microtrac BEL株式会社制造的“Microtrac MT3300”)进行测定。结果记载于表3。
[核壳颗粒(C)的回收]
1)将核壳颗粒296mg装入玻璃制容器中，在样品瓶中加入10mL的纯水后，用涡旋搅拌机进行搅拌，由此得到核壳颗粒(C)的分散液。
2)采集600μL的核壳颗粒(C)的分散液至1.5mL微管中，除去上清液。
[复合体形成工序]
3)将DNA水溶液[将DNA[脱氧核糖核酸、来自三文鱼精液、富士胶片和光纯药株式会社制造]以2.40mg/ml的浓度溶解于Tris-EDTA缓冲液[三(羟基甲基)氨基甲烷：10mM、乙二胺四乙酸四钠：2mM、pH7.86]中而得到的水溶液]150μl和BSA水溶液[将BSA以2.40mg/ml的浓度溶解于Tris-EDTA缓冲液[三(羟基甲基)氨基甲烷：10mM、乙二胺四乙酸四钠：2mM、pH7.86]中而得到的水溶液]150μl的混合液作为试样(E)[含有作为目标物质(D1)的DNA和作为杂质的BSA的试样]，加入到2)中得到的微管中。
4)将离液盐水溶液[将表3中记载的种类的离液盐以6M溶解于Tris-EDTA缓冲液[(三(羟基甲基)氨基甲烷：10mM、乙二胺四乙酸四钠：2mM、pH7.86]中而成的水溶液]900μl加入到3)中得到的微管中。
5)使用振荡培养器，对4)中得到的微管进行振荡(37℃、350rpm、2.0hr)，得到复合体(C-DNA)。
[复合体分离工序]
6)将5)中得到的微管的上清液除去。接着，加入70体积％乙醇水溶液900μL使颗粒分散后，通过从容器的外侧使磁铁接触而对复合体(C-DNA)进行磁力收集，在该状态下除去上清液，重复10次上述清洗操作。由此回收复合体(C-DNA)。
[目标物质解离工序]
7)之后，将400μL的Tris-EDTA缓冲液[三(羟基甲基)氨基甲烷：50mM、乙二胺四乙酸四钠：10mM、pH7.86]加入到6)中得到的微管中，每隔5分钟用涡旋搅拌机搅拌15秒，将上述操作重复3次，由此使DNA等从复合体(C-DNA)中解离。之后，利用磁铁对核壳颗粒(C)进行磁力收集，用移液器取出上清液，回收含有DNA等的溶液。
<DNA浓度和BSA浓度的测定>
[测定前处理]
将通过7)的操作回收的溶液100μL全部滴加到去盐/缓冲液更换用重力柱(PD-10、GE Healthcare公司制造)中，然后使用纯水作为洗脱液，得到DNA浓度测定用和BSA浓度测定用的试样。
具体而言，首先，将通过7)的操作回收的溶液100μL添加到上述柱中。之后，将作为洗脱液的纯水1100μL添加到柱中，利用微管回收重力下落所得到的洗脱液，将上述操作重复6次。需要说明的是，回收中所用的微管每次进行更换。
从DNA被洗脱的第3～6次操作时得到的微管中的溶液中各抽取200μL，进行等体积混合，利用下述方法测定所得到的DNA溶液的浓度。
同样地，从BSA被洗脱的第3～6次操作时得到的微管中的溶液中各抽取200μL，进行等体积混合，利用下述方法测定所得到的BSA溶液的浓度。
[DNA浓度的测定]
使用分光光度计，测定260nm处的吸光度。
制作显示出与使用浓度已知的DNA[脱氧核糖核酸、来自三文鱼精液、富士胶片和光纯药株式会社制造]标准液时的吸光度的关系的校正曲线，使用校正曲线求出上述DNA的浓度。基于该值对通过7)的操作回收的溶液中的DNA浓度进行换算，将求出的值记载于表3中。
[BSA浓度的测定]
将Micro BCATM蛋白检测试剂盒(THERMO Fisher Scientific公司制造)的试剂A溶液、试剂B溶液和试剂C溶液按照25:24:1的比例进行混合，得到混合液(M)。
在BSA溶液100μL中加入混合液(M)100μL，在37℃静置2小时。
2小时后，在96孔板(日本Becton Dickinson株式会社制造)的每一孔中分注100μL静置后的混合物，接着利用酶标仪(CORONA ELECTRIC Co.,Ltd.制造的MTA-32)以562nm的吸光度测定吸光度。
制作显示出与使用浓度已知的BSA标准液时的吸光度的关系的校正曲线，使用校正曲线求出上述BSA的浓度。基于该值对通过7)的操作回收的溶液中的BSA浓度进行换算，将求出的值记载于表3中。
Figure BDA0002827513580000351
如表3所示，可知：与通过使用比较用的颗粒的方法得到的包含分离对象物质(D)的溶液相比，通过本发明的方法得到的包含分离对象物质(D)[DNA]的溶液中分离对象物质(D)以外的物质(BSA)的含量少，是纯度高的溶液。
工业实用性
使用本发明的核壳颗粒的分离对象物质的分离方法能够广泛地应用于蛋白质(抗体和抗原等)的纯化、RNA和DNA的纯化、以及细菌和病毒的除去等，在能够应用于药品等的原料的纯化、诊断等中的检查对象物质的提取的方面是有用的。
特别是在上述分离对象物质(D)为目标物质(D1)的情况下，最终得到的纯化物的纯度高，因此非常适合用于药品等的原料的纯化用途。

Claims (17)

1.一种核壳颗粒(C)，其为具有核层(P)和壳层(Q)的核壳形状的核壳颗粒，
所述核层(P)是含有磁性金属氧化物颗粒(A)的磁性氧化硅颗粒，
所述壳层(Q)是形成于所述核层(P)的表面上的平均厚度为3nm～3000nm的氧化硅层，
以核层(P)的重量为基准，所述核层(P)所含有的所述磁性金属氧化物颗粒(A)的重量比例为60～95重量％，
所述核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为50％以下。
2.如权利要求1所述的核壳颗粒，其中，所述核壳颗粒(C)的粒度分布的变异系数为10％～50％。
3.如权利要求1或2所述的核壳颗粒，其中，所述磁性金属氧化物颗粒(A)的体积平均粒径为1nm～50nm。
4.如权利要求1～3中任一项所述的核壳颗粒，其中，所述核壳颗粒(C)的体积平均粒径为0.5μm～20μm。
5.如权利要求1～4中任一项所述的核壳颗粒，其中，所述磁性金属氧化物颗粒(A)含有氧化铁。
6.一种分离纯化方法，其使用权利要求1～5中任一项所述的核壳颗粒(C)对试样(E)中的分离对象物质(D)进行分离。
7.如权利要求6所述的分离纯化方法，其中，包括下述工序：
复合体形成工序，其中，所述分离对象物质(D)为目标物质(D1)，使包含所述目标物质(D1)的试样(E1)与所述核壳颗粒(C)接触，形成所述核壳颗粒(C)与所述目标物质(D1)的复合体(F1)；
复合体分离工序，利用磁力将所述复合体(F1)从所述试样(E1)中分离；和
目标物质解离工序，使所述目标物质(D1)从所述复合体(F1)中解离而得到目标物质(D1)。
8.如权利要求7所述的分离纯化方法，其中，在所述目标物质解离工序后，包括回收所述核壳颗粒(C)的核壳颗粒回收工序。
9.如权利要求8所述的分离纯化方法，其中，在所述回收工序后，使用所回收的所述核壳颗粒(C)进行所述复合体形成工序、所述复合体分离工序和所述目标物质解离工序。
10.如权利要求6所述的分离纯化方法，其中，包括下述工序：
复合体形成工序，其中，所述分离对象物质(D)为非目标物质(D2)，使包含目标物质(D1)和所述非目标物质(D2)的试样(E2)与所述核壳颗粒(C)接触，形成核壳颗粒(C)与非目标物质(D2)的复合体(F2)；和
非目标物质除去工序，利用磁力将所述复合体(F2)从所述试样(E2)中分离，由此从所述试样(E2)中除去所述非目标物质(D2)，得到包含所述目标物质(D1)的所述试样(E21)。
11.如权利要求10所述的分离纯化方法，其中，在所述非目标物质除去工序后，包括从所述复合体(F2)中回收所述核壳颗粒(C)的核壳颗粒回收工序。
12.如权利要求11所述的分离纯化方法，其中，在所述回收工序后，使用所回收的所述核壳颗粒(C)进行所述复合体形成工序和非目标物质除去工序。
13.如权利要求10～12中任一项所述的分离纯化方法，其中，所述非目标物质(D2)的种类为复数种。
14.如权利要求6～13中任一项所述的分离纯化方法，其中，所述分离对象物质(D)为选自由DNA、RNA、细胞、病毒、细菌和蛋白质组成的组中的至少一种。
15.如权利要求6～14中任一项所述的分离纯化方法，其中，所述核壳颗粒(C)是在表面固定有与所述分离对象物质(D)结合的物质(G)的核壳颗粒(C1)。
16.如权利要求15所述的分离纯化方法，其中，所述物质(G)具有与所述分离对象物质(D)结合的官能团(J)。
17.如权利要求16所述的分离纯化方法，其中，所述官能团(J)为选自由氨基和铵基组成的组中的至少一种基团。
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