CN112236159A - Oca-b肽缀合物和治疗方法 - Google Patents

Oca-b肽缀合物和治疗方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA‑B或其OCA‑B片段;接头;和细胞穿透肽。本文还描述了向受试者施用化合物以治疗1型糖尿病并阻断OCA‑B与Jmjd1a之间相互作用的方法。

Description

OCA-B肽缀合物和治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年5月3日提交的美国临时申请62/666,325的提交日的权益。该在先提交的申请的内容据此全文以引用方式并入。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在由国家卫生研究院(National Institutes of Health)颁发的授权号R01NS041249和R01AI100873拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明有一定的权利。
序列表的并入
本申请包含在本申请提交的同时经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表,包含在2019年4月16日创建的名称为“21101_0364P1_SL.txt”、大小为12,555字节的文件,并且该文件以引用方式整体并入本文。
背景技术
1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫性疾病,其中宿主免疫系统针对与内分泌胰腺的β细胞相关的抗原。在病理上,T1D的特征是胰岛炎、β细胞破坏和无法产生胰岛素。用于T1D的主要治疗是终生胰岛素疗法。许多研究旨在为这种疾病开发新的治疗,但不幸的是,T1D发病机理尚未被完全了解,从而限制了开发新疗法的能力。治疗TID需要替代途径。
发明内容
本文公开了化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段;接头;和细胞穿透肽。
本文公开了阻断OCA-B与Jmjd1a相互作用的化合物,其中所述化合物包含由OCA-B或其片段组成的肽SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3;接头;和细胞穿透肽。
本文公开了治疗患有疾病的受试者的方法,其中所述疾病通过OCA-B阻抑减轻,所述方法包括向所述受试者施用包含这样的化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段;接头;和细胞穿透肽。治疗方法中的任何治疗方法都可被配置为“使用”方法。
本文公开了治疗患有疾病的受试者的方法,其中所述疾病需要OCA-B阻抑,所述方法包括向所述受试者施用包含这样的化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段;接头;和细胞穿透肽。治疗方法中的任何治疗方法都可被配置为“使用”方法。
本文公开了化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段或变体;和细胞穿透肽。
在以下描述、附图和权利要求书中说明了本发明的组合物和方法的其他特征和优点。
附图说明
图1示出当其他转录因子(例如,NF-AT、AP-1)充当基因表达的开/关触发物时,Oct1(绿色)和OCA-B(蓝色)将沉默但先前被活化的靶基因保持为在CD4 T细胞中处于易再诱导的(或“停滞(poised)”)构型。OCA-B通过募集Jmjd1a(也称为Kdm3a)以去除抑制性组蛋白H3K9me2标记(抗阻抑)而以抗阻抑模式“锁定”Oct1。募集通过在较宽容的染色质环境中维持靶基因座来允许回忆性而非幼稚的再次应答。闪电表示本文所公开的OCA-B/Jmjd1a相互作用的新抑制剂。
图2A至图2C示出了OCA-B与Jmjd1a的相互作用。图2A示出了Oct1/OCA-B/DNA结构(Cepek等人,Genes Dev.1996年8月15日;10(16):2079-88),其中突出显示了特定的OCA-B残基;Oct1接头以红色虚线示出。图2B示出了OCA-B序列(SEQ ID NO:2;hOCA-B)与Oct1(SEQID NO:33;hOct1)和AR(SEQ ID NO:34;hAR)的顶部比对。图2C示出了Jmjd1a与双点突变OCA-B的免疫共沉淀。与对照(野生型OCA-B)不同,该突变体无法相互作用,从而将这一保守区域精准定位为与Jmjd1a相互作用的位点。使用了缺乏内源性OCA-B的HCT116细胞。
图3A至图3D示出了OCA-B抑制剂和在原代CD4 T细胞和NOD小鼠模型中使用这些肽的结果。图3A示出了为实现膜渗透性而被合成为Tat融合体的肽(肽编号1(SEQ ID NO:1)、肽编号2和肽编号3)。肽编号2(SEQ ID NO:2)和编号3(SEQ ID NO:3)显示出了功效。箭头指示突变体在图2C中的位置。下方:通过RT-qPCR测量的用25μM肽编号2处理的原代CD4 T细胞中的Il2表达。图3B示出了三种剂量(20mg/kg)的肽编号2在新近表现出糖尿病的雌性NOD小鼠中的效应。在这些动物中,大多数胰岛β功能丧失,并且糖尿病由胰腺中的自身免疫性炎症(胰岛炎)引起,从而使其余的β细胞无功能。图3C示出了终点处胰腺中T细胞的百分比。图3D示出了使用胰腺淋巴结(PLN)收集的相似数据。
图4A至图4D示出了未公开的Ocab条件等位基因。图4A示出了靶向事件。与ROSA26-FLP杂交会产生条件(fl)等位基因。图4B示出了靶等位基因的基因分型和随后的重组事件。首建动物(founder animal)显示在泳道2中。图4C示出了来自对照fl/fl和Δ/Δ动物的脾脏的免疫印迹。B-JAB B细胞核提取物被示出为OCA-B表达的阳性对照(泳道1)。图4D示出了在T细胞特异性CD4基因(CD4-Cre)的控制下,将等位基因与表达Cre重组酶的小鼠杂交的效应。示出了经刺激的总T细胞的免疫印迹。
图5示出了与OCA-B条件等位基因杂交的,促进自发自身免疫的一整组免疫原性NOD决定簇。示出了区分NOD和B/6等位基因的PCR琼脂糖凝胶。红色“N”表示成功与来自NOD背景的决定簇回交。
图6A至图6C示出了T细胞条件性Oct1丢失保护小鼠免受EAE。图6A示出了用MOG肽、CFA和百日咳毒素接种8周大的雌性C57BL/6Oct1fl/fl、CD4-Cre小鼠,并且对无力的尾巴、后肢瘫痪或四肢麻痹进行评分。图6B示出了在终点处从具有临床干预(8只野生型和3只基因敲除(KO))的动物收集的颈淋巴结。在存在布雷菲德菌素A的情况下,用PMA/离子霉素刺激细胞。对CD4 T细胞IL-17a和IFNg进行分析。示出了代表性动物。图6C示出了IL-17a/IFNg双重产生者的定量。
图7示出了CD4 T细胞中的异位OCA-B表达促进体内记忆。左小图:共转移的Thy1.1和1.2SMARTA细胞(SMARTA是LCMV反应性TCR转基因小鼠品系)在峰值LCMV响应和在用Lm-GP61进行后续异源攻击时的代表性图;首先用对照MIG或编码OCA-B的载体转导细胞。右小图:来自多只动物的定量。误差条指示标准偏差。
图8示出,通过NOD回交追踪具有loxP侧位(floxed)的Ocab等位基因的基因组PCR(顶部小图);用于NOD背景筛选的标志物(底部小图)。
图9A至图9D示出了“JumOCA”肽功效。图9A示出了将血糖被新升高到高于225mg/dL的雌性NOD动物以3次IV/RO肽注射(10mg/kg)间隔12小时进行处理。在第二次注射之前和最后一次注射之后12小时进行采血。图9B示出了在培养中被刺激和静息的T细胞。通过TaqManRT-qPCR测量Il2基因表达。图9C示出了从胰腺分离的CD4和CD8 T细胞的流式细胞术图。图9D和图9E示出了使用胰腺淋巴结(PLN)进行的类似分析。
图10示出了T细胞中Oct1(与转录因子OCA-B缔合)的缺失导致对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)/百日咳毒素(PT)实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)多发性硬化症(MS)小鼠模型的保护。
图11A至图11D示出Ocab-/-小鼠被保护免受白血病。图A示出了涉及癌蛋白MLL-AF9融合的常见小鼠AML白血病生成模型。图11B示出了野生型或用MLL-AF9转导的Ocab-/-BM的动物的存活率。图11C示出了使用来自(B)的代表性动物的外周血涂片。图11D示出了接受者小鼠中MLL-AF9的基因组PCR,证实了其供体血实际上已被病毒癌蛋白转导。
图12A至图12I是使用MS的EAE模型时,T细胞中Oct1丢失保护小鼠。图12A示出向CD4-Cre;Oct1fl/fl(n=9)或Oct1fl/fl(n=10)小鼠注射MOG35-55肽和PT以生成EAE。在治疗后的时程中确定临床评分。图12B示出了在疾病高峰时(第21天)从动物取得的胸脊髓切片的代表性的luxol快蓝(LFB)染色。脱髓鞘区域用红色勾勒出轮廓。图12C示出了实验小鼠中脱髓鞘的定量。来自2只小鼠的6个切片的平均脱髓鞘%。图12D示出了从EAE诱导的CD4-Cre;Oct1fl/fl(n=6)或Oct1fl/fl(n=6)小鼠分离并通过流式细胞术进行分析的宫颈淋巴结淋巴细胞。示出了来自代表性动物的CD4和CD8 T细胞的频率。图12E示出了平均CD4+和CD8+ T细胞百分比(左小图)和总细胞数(右小图)。从6只独立小鼠的宫颈淋巴结(CLN)中独立地纯化细胞。图12F示出了代表性数据,显示了CLN中产生细胞因子的CD4+细胞的频率。图12G示出了产生细胞因子的CD4+ T细胞的百分比(左小图和中间小图)或总细胞数(右小图)。每组N=6。示出了结果的平均值。图12H示出了脊髓中的平均CD4+和CD8+ T细胞百分比。每组N=3-4。图12I示出了产生细胞因子的CD4+ T细胞的百分比(左小图)和总细胞数(右小图)。从6只单独的小鼠的脊髓中独立地纯化细胞。
图13A至图13H示出了对缺乏Oct1的T细胞的体外刺激导致与激活相关的标志物的表达减少并且与无反应性相关的标志物的表达增加。图13A示出了Oct1缺陷型和对照CD4+T细胞在体外用所示抗体刺激并通过流式细胞术分析。示出了表达ICOS的CD4+CD44+细胞的代表性频率。图13B示出了从3只小鼠的脾脏中独立地纯化的细胞的定量,其中每只小鼠具有三个技术培养物重复。图13C示出了代表性的流式细胞术图,其描绘了在Oct1缺陷型和对照CD4+ T细胞中表达CD25的CD4+CD44+细胞的频率。图13D示出了来自3只动物的定量。图13E示出了CTLA4在CD4+CD44+ T细胞中的代表性表达被绘制为Oct1缺陷型和对照CD4+ T细胞的直方图。图13F示出了来自三只动物的CTLA4+百分比,其中绘示了每只动物三个培养重复。图13G示出了在Oct1缺陷型和对照CD4+CD44+细胞中FR4和CD73的表达。图13H示出了绘制的FR4hiCD73hiCD4+CD44+细胞的平均百分比。
图14A至图14D示出了在T细胞中不存在Oct1不会影响用小鼠肝炎病毒(JHMV)的神经质JHM株感染的小鼠的疾病。图14A示出了CD4-Cre;Oct1fl/fl(n=15)或Oct1fl/fl小鼠(n=14)用200个JHMV噬菌斑形成单位(PFU)颅内(i.c.)感染,并评定疾病严重度。记录直至在感染后(p.i.)第21天的临床疾病。图14B示出了在感染后第7天和第21天测定脑病毒滴度(nd表示未检测到)。图14C示出了在感染后第12天时来自实验小鼠的代表性LFB染色的胸脊髓切片。图14D示出了在感染后第12天和感染后第21天对来自CD4-Cre;Oct1fl/fl(n=4时,感染后第12天;n=3时,感染后第21天)和Oct1fl/fl小鼠(n=3时,感染后第12天;n=5时,感染后第12天)的平均脱髓鞘的定量。
图15A至图15J示出了在JHMV感染期间在Oct1 T细胞缺陷型小鼠中的正常免疫应答。图15A示出了将CD4-Cre;Oct1fl/fl或Oct1fl/fl小鼠用200PFU的JHMV颅内感染并在感染后第7天(n=8)、第12天(n=4-5)和第21天(n=6)处死以评定进入大脑的T细胞浸润。代表性的流分析,其描绘了在感染后第7天CD4+ T细胞浸润到小鼠的大脑中。图15B示出了如通过计算分离细胞的频率和数量所示的CD4+ T细胞的定量。图15C示出了代表性的流分析,其描绘了在感染后第7天CD8+ T细胞浸润到小鼠的大脑中。图15D示出了如通过计算分离的细胞的频率和数量所示的CD8+ T细胞的定量。图15E示出了使用来自感染JHMV的实验小鼠的脑的CD4+ T细胞的M133-147四聚体的代表性JHMV特异性TCR染色。图15F示出了来自实验组细胞的CD4+ T细胞的M133-147四聚体的频率和数量的定量。图15G示出了来自JHMV感染的实验小鼠的脑的CD8+ T细胞的代表性S510-518四聚体染色。图15H示出了来自实验组细胞的CD4+ T细胞的M133-147四聚体的频率和数量的定量。显示的数据来自2个独立的实验;感染后第7天,CD4-Cre;Oct1fl/fln=8,Oct1fl/fl小鼠n=8;感染后第12天,CD4-Cre;Oct1fl/fln=5,Oct1fl/fl小鼠n=4。(I)示出了代表性动物的产生IFNγ的CD4+(左小图)和CD8+(右小图)的CNS浸润性T细胞的百分比。图15J示出了如(B)中所分析的CD4+和CD8+细胞的平均频率(左小图)和总细胞数(右小图)。每组N=6。
图16示出了在表达降低水平的CD25的Oct1缺陷型T细胞中IL-10表达未改变。与图13相同地制备细胞。
具体实施方式
通过参考本发明的以下详细描述、附图和本文所包括的示例,可以更容易地理解本公开。
在公开和描述本发明的组合物和方法之前,应理解它们不限于特定的合成方法(除非另外指明)或特定的试剂(除非另外指明),因此此类组合物和方法当然可以变化。另外应当了解,本文使用的术语只是为了描述特定方面的目的,并非旨在进行限制。尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或检验,但现在描述示例性方法和材料。
此外,应当理解的是,除非另有明确说明,否则决不意味着在此阐述的任何方法都被解释为要求其步骤以特定次序执行。因此,在方法权利要求实际上没有叙述其步骤要遵循的次序或者在权利要求书或说明书中没有另外具体说明所述步骤被限制为特定的次序的情况下,在任何方面都不意味着推断出次序。这适用于任何可能的非表达解释基础,包括关于步骤排列或操作流程的逻辑事项、从语法组织或标点中得到的明显含义,以及在说明书中所描述的各方面的数量或类型。
本文提到的所有出版物以引用的方式并入本文以公开和描述连同出版物一起引用的方法和/或材料。提供本文中讨论的公布仅仅是针对它们在本申请的提交日期之前的公开。不得将本文的任何内容解释为承认由于先前发明,本发明无权先于此类出版物。此外,本文所提供的公开日可能不同于实际的公开日,这可能需要单独确认。
OCA-B(也称为OBF-1和Bob.1,基因符号Pou2af1)是转录共调节物,其对于B细胞抗体转换非常重要,并且分别对于记忆T细胞的产生和功能也很重要。OCA-B对制造促炎性细胞因子的T细胞也特别重要。多项人类GWAS研究表明OCA-B参与T1D发病机制(Farth等人,(2015)Nature,518(7539):337-43;以及Maurano等人,(2012)Science,337(6099):1190-5。
多发性硬化症(MS)是一种具有多方面病因的疾病,其中宿主免疫系统针对嵌入中枢神经系统(CNS)髓鞘内的蛋白质。在病理上,MS的特征在于炎症、脱髓鞘和相关的轴索病。CD4 T细胞显然与MS病理生理有关。这些细胞通常在疾病边界处发现,并且可以被认为是主要的调节物,而单核细胞和粒细胞则更深地迁移到组织中并放大白质损伤。目前尚无理想的MS治疗。例如,IFNβ和类固醇具有许多不期望的副作用。尽管没有针对原发性/进行性MS(该疾病的最具侵略性的形式)的治疗,但是利妥昔单抗有时被适应证外(off-label)开处方用于MS。在保持正常的免疫功能在很大程度上保持完整的同时,开发阻断MS发展的新治疗构成了该领域的主要长期目标,但不幸的是,对MS发病机理的理解还不完全,从而限制了开发新疗法的能力。涉及转录共激活因子OCA-B的靶向途径可提供治疗MS的治疗途径。
像MS一样,TID也是一种自身免疫性疾病。用于T1D的主要治疗是终生胰岛素疗法。在保持正常免疫功能在很大程度上完整的同时,开发阻断T1D发展的新治疗构成了该领域的主要长期目标。β细胞再生是一种有前途的疗法,但除非能开发出特异性阻断T1D自身免疫的方法,否则它不可能起作用。一种更加好的假想治疗方法是尽早捕获患者并在保持正常的免疫功能的同时阻断自身免疫。本文公开的发现表明靶向OCA-B可提供此类治疗途径。在一个方面中,本文描述了在原代细胞培养物中和在1型糖尿病小鼠模型中起作用的可渗透膜的肽OCA-B抑制剂。
本文公开了模仿OCA-B与Jmjd1a(基因符号Kdm3a)(与之相互作用的染色质修饰酶)之间的界面的肽的设计和生成。将该肽与Tat肽融合以获得膜通透性,从而产生具有以下序列的试剂:VKELLRRKRGH-GSG(接头)-GRKKRRQRRRGY(Tat)(SEQ ID NO:10)。如本文所述,这些肽在减轻小鼠的1型糖尿病(T1D)症状(血糖升高)方面显示出强大的功效,并显示出其根本原因是胰腺中浸润性T细胞,尤其是产生促炎性细胞因子的细胞的减少。这些研究还表明了在胰腺淋巴结中T细胞的数量和产生细胞因子的能力不受影响的控制结果,表明没有全局免疫解除。这些结果支持了该肽减少1型糖尿病中的致病性T细胞的功能,同时保留大多数正常的免疫功能完好无损。
在一个方面中,本文描述了能够在小鼠非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中阻断糖尿病前期进展的原型药物(图1,闪电)。该药物的靶标是转录共调节蛋白OCA-B(Bob1/OBF-1,基因符号Pou2af1),即新T细胞途径的重要部件。OCA-B的丢失使T细胞发育和病原体反应完好无损,但会损害新记忆的建立。T细胞记忆表型可继而成为自身免疫(包括T1D)的基础,即使在持续暴露于自身抗原的情况下。已经表明,OCA-B直接调节T细胞中重要靶基因的表达-所述重要靶基因中有Il2、Il21、Ifng、Icos和Csf2(Gmcsf)-但是处于选定情况下。例如,这些基因在受刺激的OCA-B缺陷型T细胞中没有变化,但是在二次刺激-抗原再遇到模型后下降高达500倍。多次抗原暴露是自身免疫性疾病的主要属性。人类GWAS研究确定了OCA-B和与其对接的转录因子Oct1作为T1D风险的介体。如本文所公开的,因此首要假设是OCA-B协调地调节T细胞中编码细胞因子和其他免疫调节蛋白的关键基因,以促进T1D发病机制。可以使用新的条件性Ocab(Pou2af1)等位基因测试此方面(参见例如实施例1)。也可以测试基于该蛋白质的分子生物学开发的可渗透膜的OCA-B肽抑制剂的特性(参见例如实施例2)。
定义
如在说明书和所附权利要求书中所用,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物,除非上下文另外明确指出不是这样。
如本文所用的字词“或”表示特定列表的任何一个成员,并且还包括该列表的成员的任何组合。
范围在本文中可表示为“约(about)”或“大约(approximately)”一个特定值和/或至“约”或“大约”另一特定值。当表达此类范围时,另一个方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地,在通过使用先行词“约”或“大约”将值表示为近似值时,应了解具体值形成另一个方面。将进一步理解,每个范围的端值对于另一端值而言都是重要的,并且独立于另一端值。还应当理解,本文公开了许多值,并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如,如果公开了值“10”,则还公开了“约10”。还应理解的是,还公开了在两个特定单元之间的每个单元。例如,如果公开了10和15,那么也公开了11、12、13和14。
如本文所使用,术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生,并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。
如本文所用,术语“受试者”是指所施用的靶标,例如人。如本文所用,术语“受试者”可以为脊椎动物,诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。术语“受试者”还包括家养动物(例如,猫、犬等)、家畜(例如,牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如,小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。在一个方面中,受试者为哺乳动物。在另一个方面中,受试者为人。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此,旨在涵盖成年、儿童、青春期和新生的受试者,以及胎儿,无论是雄性还是雌性。
如本文所用,术语“患者”是指患有疾病或疾患的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在所公开的方法的一些方面中,例如在施用步骤之前,“患者”已经被诊断出需要治疗癌症。
如本文所用,术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、减轻、延迟特定疾病、疾患和/或病症的发作,抑制或减缓其进展,降低其严重性和/或降低其的一种会多种症状或特征的发生率。可向未表现出疾病、疾患和/或病症迹象的受试者和/或仅表现出疾病、疾患和/或病症的早期迹象的受试者施用治疗,以降低发展出与所述疾病、疾患和/或病症相关的病理的风险。例如,疾病、疾患和/或病症可以是多发性硬化症、1型糖尿病、类风湿性关节炎、乳糜泻、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎或白血病。
术语“预防”、“阻断”、“拮抗”或“逆转”是指全部或部分预防、或改善或控制。
贯穿本说明书的描述和权利要求书,字词“包括”和所述字词的变型诸如“包含”和“含有”意指“包括但不限于”并且不旨在排除例如其他添加物、部件、整数或步骤。具体地,在被叙述为包括一个或多个步骤或操作的方法中,特别设想每个步骤包括所列出的事物(除非该步骤包括限制性术语,诸如“由......组成”),这意味着每个步骤并非旨在排除例如该步骤中未列出的其他添加剂、组分、整数或步骤。
“免疫系统的细胞”或“免疫细胞”或“免疫系统细胞”是指包括可被靶向或测定的任何免疫系统细胞,包括但不限于B淋巴细胞(也称为B细胞)、T淋巴细胞(也称为T细胞)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯细胞、干细胞、树突细胞、外周血单核细胞、肿瘤浸润(TIL)细胞、包括杂交瘤的基因修饰的免疫细胞、药物修饰的免疫细胞、抗原呈递细胞和上述细胞类型的衍生物、前体或祖细胞。
“T细胞”或“T淋巴细胞”是指参与细胞介导的免疫的一种淋巴细胞,一种白细胞。通过在细胞表面存在T细胞受体,可以将T细胞与其他淋巴细胞区分开。T细胞类型的示例包括但不限于T辅助细胞(例如,CD4+)、细胞毒性杀伤性T细胞(例如,CD8+),记忆(例如,CD4+或CD8+)和效应T细胞、调节性T细胞、天然杀伤性T细胞、γδ T细胞。
术语“片段”可以指的是肽的与参考肽基本上相同并保留所述参考肽的生物学活性的部分(例如,至少5个、10个、25个、50个、100个、125个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或500个等氨基酸或核酸)。在一些方面中,肽的片段或部分保留本文所述参考肽的生物学活性的至少50%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。参考肽的片段可以是参考多肽的连续或邻近部分(例如,十个氨基酸长的参考肽的片段可以是该参考肽内的任何2-9个邻近残基)。
术语“变体”可以指当与野生型肽或基因产物相比时在序列和/或功能特性(即,改变的特征)方面显示出修饰的肽或基因产物。一般地,应理解的是,定义本文公开的基因和蛋白质的任何已知变体和衍生物或可能出现的那些变体和衍生物的一种方式是通过就与特定已知序列的同源性而言定义变体和衍生物。本文所公开的特定序列的这种同一性也在本文其他地方讨论。一般而言,本文公开的基因和蛋白质的变体通常与所述序列或天然序列具有至少约70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质或核酸(例如基因)的同源性。例如,可以在比对两个序列之后计算同源性,使得同源性处于其最高水平。在一个方面中,术语“变体”可以表示与参考序列在某些方面的差异,而不仅仅是简单地缺失一个或多个N末端和/或C末端氨基酸残基。在一个方面中,变体可以包括氨基酸残基的取代,所述取代可以被认为是保守的或非保守的。保守取代是以下组内的那些:Ser、Thr和Cys;Leu、lie和Val;Glu和Asp;Lys和Arg;Phe、Tyr和Trp;以及Gin、Asn、Glu、Asp和His。变体可包含至少一种取代和/或至少一种添加,还可以存在至少一种缺失。变体还可包含一个或多个非天然存在的残基。例如,它们可以在任何位置处(包括半胱氨酸的位置处)包括硒代半胱氨酸(例如,硒代-L-半胱氨酸)。许多其他“非天然”氨基酸取代基是本领域已知的,并且可以从商业来源获得。非天然存在的氨基酸的示例包括D-氨基酸、具有附接至半胱氨酸的硫原子的乙酰氨基甲基的氨基酸残基、聚乙二醇化的氨基酸和式NH2(CH2)nCOOH的ω氨基酸(其中n为2-6)、中性氨基酸、非极性氨基酸,例如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸和正亮氨酸。苯甘氨酸可以替代Trp、Tyr或Phe;瓜氨酸和蛋氨酸亚砜是中性、非极性的,半胱氨酸是酸性的,并且鸟氨酸是碱性的。脯氨酸可以被羟基脯氨酸取代,并保留赋予脯氨酸的特性的构象。
如本文所用,术语“经取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在一个广义方面中,可允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环以及芳族和非芳族的取代基。示例性取代基包括例如下文所述的那些取代基。对于适当的有机化合物,可允许的取代基可为一个或多个以及相同或不同的。为了本公开的目的,杂原子(诸如氮)可具有氢取代基和/或本文所述有机化合物的任何满足杂原子化合价的可允许取代基。本公开不旨在以任何方式受有机化合物的可允许取代基的限制。此外,术语“取代”或“被......取代”包括以下隐含的条件:此类取代符合被取代原子和取代基的允许化合价,并且该取代产生稳定的化合物,例如不会自发进行转化(诸如通过重排、环化、消除等)的化合物。还设想,在某些方面中,除非明确地指出有相反情况,否则单个取代基可以进一步任选被取代(即,进一步取代或未取代)。
本文所用术语“烷基”为1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基,诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。应当理解的是,烷基是非环状的。所述烷基可为支链的或非支链的。所述烷基也可为取代的或未取代的。例如,烷基可以被一个或多个基团取代,所述基团包括但不限于如本文所述的烷基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤化物、羟基、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或巯基。“低级烷基”为含有一至六个(例如,一至四个)碳原子的烷基。术语烷基还可为C1烷基、C1-C2烷基、C1-C3烷基、C1-C4烷基、C1-C5烷基、C1-C6烷基、C1-C7烷基、C1-C8烷基、C1-C9烷基、C1-C10烷基,以及类似的高达且包括C1-C24烷基。
术语“烷基”通常用于指未取代的烷基和取代的烷基;然而,取代的烷基在本文中还具体地指识别烷基上的一个或多个特定取代基。例如,术语“经卤代的烷基”或“卤代烷基”具体地指被一种或多种卤化物(例如,氟、氯、溴或碘)取代的烷基。或者,术语“单卤代烷基”具体地指被单个卤化物(例如,氟、氯、溴或碘)取代的烷基。术语“多卤代烷基”具体地指被两个或更多个卤化物独立取代的烷基,即每个卤化物取代基不必为与另一卤化物取代基相同的卤化物,并且卤化物取代基的多个实例也不必位于相同的碳上。术语“烷氧基烷基”具体地指如下所述被一个或多个烷氧基取代的烷基。术语“氨基烷基”具体地指被一个或多个氨基取代的烷基。术语“羟基烷基”具体地指被一个或多个羟基取代的烷基。当将“烷基”用于一种情况下并且将特定术语诸如“羟基烷基”用于另一种情况下时,也并不意在暗示术语“烷基”也不是指诸如“羟基烷基”等的特定术语。
如本文所用的术语“链烯基”为具有含有至少一个碳-碳双键的结构式的2至24个碳原子的烃基。非对称的结构诸如(A1A2)C=C(A3A4)旨在包括E型异构体和Z型异构体两者。这可以在本文中存在不对称烯烃的结构式中推定,或者可以用键符号C=C明确表示。环烯基可以被一个或多个基团取代,所述基团包括但不限于本文所述的烷基、环烷基、烷氧基、链烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、叠氮基、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或巯基。
组合物
本文公开了化合物,所述化合物包含OCA-B肽或其片段;接头;和细胞穿透肽。本文还公开了化合物,所述化合物包含OCA-B肽或其OCA-B肽片段或变体;接头;和细胞穿透肽。本文还公开了化合物,所述化合物包含OCA-B肽或其OCA-B肽片段或变体;和细胞穿透肽。本文还公开了化合物,所述化合物公开了OCA-B肽片段的OCA-B肽变体。在一些方面中,本文公开的化合物还可包含接头。在一个方面中,接头可为烃接头。在一个方面中,本文公开了化合物,所述化合物包含OCA-B肽的片段;接头;和细胞穿透肽。在一个方面中,本文所述的化合物可充当OCA-B抑制剂,并且能够阻断OCA-B与Jmjd1a的相互作用。在一个方面中,本文所述的化合物可充当OCA-B抑制剂,并且能够阻断OCA-B与Oct1的相互作用。在一个方面中,本文所述的化合物能够阻断OCA-B与Jmjd1a的相互作用。在一个方面中,本文所述的化合物能够阻断OCA-B与Oct1的相互作用。同样,本文所公开的化合物可阻断OCA-B与Jmjd1a或Oct1的相互作用。在一个方面中,本文公开的化合物包含:包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的肽;接头;和细胞穿透肽。在一个方面中,本文公开的化合物包含:由SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3组成的肽;接头;和细胞穿透肽。在一个方面中,本文公开的化合物包含:由OCA-B或其片段组成的肽SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3;接头;和细胞穿透肽。在一些方面中,本文公开的化合物中的任何化合物可包含OC
OCA-B肽、其OCA-B片段或其OCA-B变体。在一个方面中,该肽可为OCA-B肽或其OCA-B片段。在一些方面中,该肽可以是OCA-B肽或OCA-B片段的变体。如本文所用,“片段”是指小于OCA-B蛋白的全长序列(例如,小于SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所示的全长序列)的肽。在一个方面中,该肽可为OCA-B肽或其片段的生物学活性变体。OCA-B肽片段的示例包括但不限于包含或由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3组成的肽。OCA-B肽的示例包括但不限于包含或由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7组成的肽。在一个方面中,OCA-B片段可为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3。在一个方面中,OCA-B肽片段或OCA-B肽的具有生物活性的变体可为SEQ ID NO:2。在一个方面中,OCA-B肽可为如SEQ ID NO:3所示的OCA-B肽的片段或具有生物活性的变体。OCA-B肽片段的变体的示例包括但不限于包含或由SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32组成的肽。
在一些方面中,OCA-B肽或其片段可为本文所述的OCA-B肽中的任何OCA-B肽的片段。在一些方面中,OCA-B片段可包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。在一个方面中,OCA-B肽片段至少包含SEQ ID NO:2。在一个方面中,OCA-B肽或片段不是SEQ ID NO:1。
在一些方面中,OCA-B变体可为本文所述的OCA-B肽中的任何OCA-B肽的变体。在一些方面中,OCA-B变体可包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQID NO:32。在一个方面中,OCA-B变体可为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的变体。
另外,本文所述或本领域普通技术人员已知的OCA-B肽中的任何OCA-B肽的片段或变体是保留阻断内源OCA-B与Jmjd1a或Oct1的相互作用的生物学功能的肽或变体。OCA-B片段的生物学活性变体能够阻断内源性OCA-B与Jmjd1a或Oct1的相互作用。在施用于受试者后,OCA-B的生物学活性变体或片段(包括OCA-B片段的变体)可以以足够有用的亲和力阻断内源性OCA-B与Jmjd1a或Oct1的相互作用。如本文所述,OCA-B或OCA-B片段的片段或其生物学活性变体可以源自任何物种。在一个方面中,源自一个物种的序列或其生物活性变体可以与源自另一物种的序列或其生物活性变体相同。在一个方面中,OCA-B或OCA-B片段的片段或生物学活性变体可以源自小鼠(SEQ ID NO:5)。在一个方面中,OCA-B或OCA-B片段的片段或生物学活性变体可以源自人(SEQ ID NO:7)。
如本文所述,OCA-B的片段可具有约或小于约256个、250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸残基。在一些方面中,OCA-B肽或其片段可以介于3个氨基酸残基与30个氨基酸残基之间。
在使用OCA-B的生物活性片段的情况下,所述片段可以与OCA-B的对应野生型片段至少或约80%相同(例如,至少或大约85%、90%、95%、98%、99%或100%相同)。在一些方面中,OCA-B肽可包含具有对应于SEQ ID NO:2的氨基酸的OCA-B片段或其生物活性变体。在一些方面中,OCA-B肽可包含具有对应于SEQ ID NO:3的氨基酸的OCA-B片段或其生物活性变体。在使用OCA-B的生物活性片段的情况下,该片段可与本文所公开的OCA-B的对应片段至少或约80%同一(例如,至少或约85%、90%、95%、98%或99%同一)。在一些方面中,OCA-B的生物活性片段可与OCA-B的对应野生型氨基酸序列至少或5%同一(例如,至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%同一)。
在一个方面中,OCA-B片段的氨基酸序列当与OCA-B肽的野生型片段相比时可具有至少90%(例如,至少90%、95%、98%、99%或100%同一)的序列同一性。在一个方面中,OCA-B肽的野生型片段可源自人或小鼠。
本文公开的肽还可包括变体。通常,本文公开的OCA-B肽或片段中的一种或多种OCA-B肽或片段的单独变体之间的氨基酸同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。因此,“变异OCA-B肽”是这样的肽,所述肽与本发明的亲本或参考OCA-B肽或其片段具有特定同一性,并且共享生物学功能,包括但不限于亲本或参考OCA-B肽或其片段的特异性和/或活性的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。例如,“变异OCA-B肽”可以是这样的序列,所述序列与本发明的亲本或参考OCA-B肽或其片段相比含有1个、2个、3个或4个氨基酸变化,并且共享或改善亲本OCA-B肽或参考OCA-B肽或其片段的生物学功能、特异性和/或活性。
在一个方面中,OCA-B变体的氨基酸序列当与参考或亲本序列相比时可具有至少90%(例如,至少90%、95%、98%、99%或100%同一)的序列同一性。在一个方面中,参考序列或亲本序列可为OCA-B肽的野生型片段。在一个方面中,OCA-B肽的野生型片段可源自人或小鼠。
在一些方面中,与亲本或参考OCA-B肽或其片段相比,本文公开的OCA-B肽变体序列中的任何OCA-B肽变体序列可包含单个氨基酸变化。在一些方面,与亲本或参考OCA-B肽或其片段相比,本文公开的OCA-B肽变体序列中的任何OCA-B肽变体序列可包含至少两个氨基酸变化。在一个方面中,氨基酸变化可以是从任何氨基酸残基到半胱氨酸残基的变化。在一个方面中,氨基酸变化可以是从任何氨基酸残基到丙氨酸残基的变化。各个OCA-B变体之间的氨基酸同一性可为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。因此,“OCA-B肽变体”可为这样的肽,所述肽与本发明的亲本或参考OCA-B肽或其片段具有特定同一性,并且共享生物学功能,包括但不限于亲本或参考OCA-B肽或其片段的特异性和/或活性的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。例如,亲本OCA-B序列可为SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7中的一者或多者。例如,参考OCA-B序列可为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的一者或多者。变体OCA-B序列可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:7中的任何一者至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一。变异OCA-B序列也可共享亲本或参考OCA-B肽或其片段的特异性和/或活性的至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
如本文所讨论的,OCA-B蛋白或肽的许多变体是已知的并且在本文中考虑的。蛋白质和肽片段、变体和衍生物是本领域技术人员很好地理解的,并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如,氨基酸序列修饰通常属于以下三种类别中的一种或多种:取代、插入或缺失变异。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常将为比氨基或羧基末端融合的插入小的插入,例如约1至4个残基。缺失的特征在于从肽序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常,在肽内的任一位点缺失不超过约2至6个残基。氨基酸取代通常是单个残基,但是可以一次在多个不同位置发生。插入通常将是约1至10个氨基酸残基;并且缺失将在约1至30个残基的范围内。优选在相邻对中进行缺失或插入,即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或它们的任何组合可进行组合以获得最终的构建体。取代变体是其中至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些变体。此类取代通常根据下表1和表2进行,并且被称为保守取代。
表1:氨基酸缩写
氨基酸 缩写
丙氨酸 AlaA
别异亮氨酸 AIle
精氨酸 ArgR
天冬酰胺 AsnN
天冬氨酸 AspD
半胱氨酸 CysC
谷氨酸 GluE
谷氨酰胺 GlnK
甘氨酸 GlyG
组氨酸 HisH
异亮氨酸 IleI
亮氨酸 LeuL
赖氨酸 LysK
苯丙氨酸 PheF
脯氨酸 ProP
焦谷氨酸 Glu
丝氨酸 SerS
苏氨酸 ThrT
酪氨酸 TyrY
色氨酸 TrpW
缬氨酸 ValV
表2:氨基酸取代
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通过选择比表2中的那些取代更不保守的取代来进行功能或免疫同一性的重大改变,即选择在对维持以下方面的影响上差异更显著的残基:(a)取代区域中的多肽主链结构,例如,作为薄片或螺旋构象,(b)分子在靶标位点的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积。通常预期进行以产生蛋白质特性的最大变化的取代将是对以下残基的那些取代:(a)亲水残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或被其取代);(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基(或被其取代);(c)具有正电侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代负电残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或被其取代);或(d)具有大体积侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代不具有侧链的残基(例如甘氨酸)(或被其取代),在这种情况下,(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位点的数量进行取代。
例如,在生物学和/或化学上相似的一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基替代是本领域技术人员已知的保守取代。例如,保守取代是将一个疏水残基替换为另一个疏水残基或将一个极性残基替换为另一个极性残基。取代包括组合,例如Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;以及Phe、Tyr。每个明确公开的序列的此类保守取代的变体包括在本文提供的镶嵌多肽内。
可以采用取代或缺失诱变来插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可为期望的。潜在的蛋白水解位点(例如,Arg)的缺失或取代是例如通过缺失碱性残基中的一个碱性残基或用谷氨酰基或组氨酰基残基取代一个位点而完成的。
氨基酸类似物和肽类似物通常具有增强的或所需的特性,例如更经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理特性(半衰期、吸收率、效力、功效等)、改变的特异性(例如,广谱的生物活性)、降低的抗原性等。
D-氨基酸可用于产生更稳定的肽,因为D-氨基酸不能被肽酶等识别。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸系统取代(例如,D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于将两个或更多个肽环化或附接在一起。这对于将肽约束为特定构象可为有益的。(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992),该参考文献以引用方式并入本文)。
同一性程度可以变化,并且可以通过本领域充分建立的方法来确定。“同源性”和“同一性”各自指两个多肽序列之间的序列相似性,其中同一性是更严格的比较。同源性和同一性可通过比较各序列中可为比较目的而比对的位置确定。当所比较的序列中的一个位置被相同的氨基酸残基占据时,则该多肽可被称为在该位置处同一;当相同位点被相同氨基酸(例如,同一)或相似氨基酸(例如,在空间和/或电子性质上相似)占据时,则分子可以被称为在该位置处同源。序列之间的同源性或同一性百分比根据序列所共享的匹配或同源位置的数量。本文所述的肽或多肽的生物学活性变体或片段可与对应的天然存在的肽或多肽具有至少或约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的同一性或同源性。
如本文所用,OCA-B片段的长度可变化,并且可以是或可包含天然存在于OCA-B中或与天然存在的OCA-B序列有一定程度变化(但保留生物学活性)的邻近氨基酸残基。
在OCA-B肽或OCA-B片段在其N末端或C末端(或两者)处包含在OCA-B中不天然存在的氨基酸残基的情况下,则一个或多个附加序列可为约1个至200个氨基酸残基长,并且这些残基可在N末端与C末端之间均匀或不均匀地分开。例如,N末端和C末端均可包含约1个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个氨基酸残基。或者,一个末端可包含约1个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个残基,并且一个末端可不包含任何残基。
更具体地,N末端或C末端可包括1个至约100个(例如,1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个带正电荷的氨基酸残基(例如,碱性氨基酸残基,诸如精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸残基);1个至约100个带负电荷的氨基酸残基(例如,酸性氨基酸残基,例如天冬氨酸或谷氨酸残基);1至约100个甘氨酸残基;1至约100个疏水性氨基酸残基(例如,疏水性脂肪族残基,例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸,或疏水性芳族残基,例如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸);或1至约100个(例如1-4个)半胱氨酸残基。当使用OCA-B片段的生物学活性变体时,该变体可以通过取代这些组中的一个或多个氨基酸残基而变化。变体可包含保守氨基酸取代。
OCA-B和OCA-B片段,包括上述经修饰的片段以及本文所公开的OCA-B变体,可以是蛋白酶抗性的,并且可包括一种或多种类型的保护基,例如酰基、酰胺基、苄基或苯甲酰基或聚乙二醇(PEG)。
如所指出的,可用于本发明组合物中的OCA-B、OCA-B片段及其变体可包括与天然存在的OCA-B内的序列相同的氨基酸序列,或者它们可包括其片段或生物活性变体。这些序列可以在例如氨基末端、羧基末端或两者处被修饰。
OCA-B和OCA-B片段及其生物学活性变体可以多种方式修饰。例如,可以将包括附加氨基酸残基、其他取代基和保护基的试剂添加到氨基末端、羧基末端或两者上。可以出于改变片段形式或改变片段与其他肽或多肽结合或相互作用的目的而进行修饰。例如,可以修饰片段以包括半胱氨酸残基或其他可参与二硫键形成的含硫残基或试剂。例如,可以添加至少一个半胱氨酸残基,所述至少一个半胱氨酸残基中的一个半胱氨酸残基任选地在所述片段的C末端或N末端处。
接头。本文所述的化合物还可包含一种或多种接头。接头可具有任何长度、灵活的序列并且不具有任何电荷。在一个方面中,接头可为肽接头。在一个方面中,一个或多个接头可以是基于肽的。在一个方面中,一个或多个接头可为GSG。在一个方面中,一个或多个接头可为不庞大的(non-bulky)氨基酸。在一些方面中,一个或多个接头可为AA、AAA、AGA、GGA、AGG或GAG。在一些方面中,一个或多个接头可与丝氨酸组合使用。
在一些方面中,接头可为烃接头。在一些方面中,烃接头可为α-螺旋稳定化部分。在一些方面中,烃接头可为烃钉(hydrocarbon staple)。在一些方面中,烃钉可为i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型。在一些方面中,烃钉可具有以下结构:
Figure BDA0002808303940000251
在一个方面中,m可为2、3或6;n可为介于1与10之间(包括1和10)的整数;Rb独立地为H或甲基;并且[Xaa]m可代表本文公开的肽中的任何肽的2个、3个或6个邻近氨基酸。在一些方面中,烃钉可具有以下结构:
Figure BDA0002808303940000252
在一个方面中,m可为2、3或6;并且[Xaa]m可代表本文公开的肽中的任何肽的2个、3个或6个邻近氨基酸。
在一些方面中,接头可为共价键。为了形成共价键,可以使用化学反应性基团,例如具有多种活性羧基(例如,酯)的化合物,其中羟基部分在修饰OCA-B肽序列、OCA-B肽片段序列或细胞穿透肽序列所需的水平上是生理上可接受的。
可以修饰本文所述并且掺入到化合物中的肽序列中的任何肽序列,以与如本文所述的接头化学相互作用或包含如本文所述的接头。这些经修饰的肽序列和肽接头构建体在本公开的范围内,并且可以包装为试剂盒的部件,所述试剂盒具有完成与例如OCA-B肽或其OCA-B肽片段或OCA-B变体和/或细胞穿透肽的缀合的过程的使用说明书。缀合是指偶联、链接(例如通过共价键)、连接、缔合两个或更多个分子。肽序列可经修饰为在N末端、C末端或两者上包含半胱氨酸残基或其他带有硫的部分(例如,C-SH)。
在一个方面中,本文所述的化合物可包含在肽与细胞穿透肽之间的接头。
细胞穿透肽。在一个方面中,细胞穿透肽可为促进肽或化合物进入细胞的肽。在一个方面中,细胞穿透肽可为来自HIV pTAT蛋白的蛋白转导结构域。在一些方面中,本文公开的化合物的细胞穿透肽可为TAT序列。在一个方面中,TAT序列可为SEQ ID NO:4。在一个方面中,TAT序列可为SEQ ID NO:8。在一些方面中,细胞穿透肽可为野生型TAT序列的片段或衍生物。在一个方面中,TAT序列可与野生型TAT序列90-100%同一。
如本文所述,细胞穿透肽可具有不同的大小、氨基酸序列和电荷。通常,细胞穿透肽是促进细胞对“货物”的摄取/摄入的短肽。“货物”可以通过化学键经由共价键或通过非共价相互作用而与细胞穿透肽缔合。细胞穿透肽的功能是将货物递送到细胞中,该过程通常通过胞吞作用发生。本公开的有用的细胞穿透肽将具有使质膜易位并促进将本文公开的化合物递送至其所需靶标的能力。细胞穿透肽可具有这样的氨基酸组成,所述氨基酸组成含有相对较高丰度的带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸),或具有含有极性/带电荷的氨基酸(聚阳离子)和非极性、疏水性氨基酸(两亲)的交替模式的序列。第三类细胞穿透肽是疏水性肽,其含有极性残基,具有低净电荷或具有对于细胞摄入重要的疏水性氨基酸基团。细胞穿透肽的示例可以在Bechara和Saga,FEBS Letters,587(2013),第1693-1702页中找到,该参考文献以引用方式并入本文。
在一个方面中,细胞穿透肽可为聚精氨酸序列;含有约6个至12个精氨酸氨基酸残基的肽序列。在一个方面中,细胞穿透肽可为SEQ ID NO:6。
在一个方面中,可将细胞穿透肽通过非共价方法缀合至接头。在一个方面中,细胞穿透肽可为Pep-1。
构型:本文公开了包含可直接缀合至接头的肽的化合物。本文公开了包含可直接缀合至细胞穿透肽的接头的化合物。本文公开了化合物,所述化合物包含包括或由SEQ IDNO:2组成的肽、可为GSG的接头和可为SEQ ID NO:4的细胞穿透肽。本文公开了化合物,所述化合物包含直接缀合至GSG的SEQ ID NO:2,其中GSG还直接缀合至SEQ ID NO:4。本文公开了化合物,所述化合物包含包括或由以下中的任一者组成的肽:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32。
另外,在以下序列中的一个序列中存在、代表肽中约一个或两个完整的螺旋圈的烃钉:i、i+3;i、i+4;或i、i+7,进一步限制了鉴定适合用α-甲基、α-烯基氨基酸替换的残基的鉴定。建议的序列包括以i、i+7模式隔开的残基。基本原理是使钉覆盖肽的较大部分,并且通过将七个残基间隔开,可将螺旋凸轮的两个完整圈包含在内,从而提供比i、i+3或i、i+4选项更大的稳定性。
在一些方面中,细胞穿透肽可在烃接头内。在一些方面中,细胞穿透肽可用于稳定化本文所公开的肽的α螺旋。例如,所述组合物可包含OCA-B变体(例如,CLLRRKRGC;SEQ IDNO:36),所述变体在5′端和3′端处均包含半胱氨酸残基,所述半胱氨酸残基形成与彼此的共价键,由细胞穿透肽桥接。
环化化合物。本文公开的化合物可包含至少两个半胱氨酸残基,所述至少两个半胱氨酸残基中的一个或两个半胱氨酸残基任选地在所述化合物的C末端或N末端处。例如,本文所公开的化合物可包括在C末端或N末端处或附近具有半胱氨酸残基的OCA-B来源的序列,以及在C末端或N末端处或附近具有半胱氨酸残基的细胞穿透肽序列。该化合物可通过在这两个半胱氨酸残基之间(或更普遍地,在末端区域处存在的至少两个半胱氨酸残基中的两者之间)形成二硫键而环化。尽管本发明的化合物可为线性或环状的,但是环状肽通常比线性肽具有优势,因为它们的环状结构更刚性,并且因此它们的生物学活性可高于对应的线性肽;并且是稳定的,使得可能需要较低的剂量或很少的施用(例如,注射)。任何使肽环化的方法都可以应用于本文所述的化合物。
装订的化合物。可将本文公开的肽装订,使得该肽可具有合成支架。为了使装订的肽起到有效的治疗作用,所述肽必须全身性地到达并穿透其靶细胞,同时保持α螺旋形状。肽装订可用于增强肽的药理活性。在一些方面中,将细胞穿透肽结合在装订的化合物内可降低本文公开的化合物的毒性。在一些方面中,烃接头可容纳细胞穿透肽。不希望受到理论的束缚,据推测,螺旋性的这种战略性增强可改善分子的许多生物物理和生化特性,包括蛋白水解抗性、细胞透性和靶标亲和力。实际上,因为一个或多个烃钉允许保持螺旋形状,所以预期将阻止肽获得蛋白水解降解所必需的延伸构象。在一些方面中,烃钉可用于诱导或维持本文公开的肽中的任何肽的α-螺旋形状。在一个方面中,烃钉可被配置为i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型;其中i可分别在SEQ ID NO:2的i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型烃钉中的选自1-9、1-8或1-4的任何氨基酸位置处或其活性片段中的对应氨基酸处,其中i可分别在SEQ IDNO:3的i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型烃钉中的选自1-18、1-19或1-16的任何氨基酸位置处或在其活性片段中的对应氨基酸处;其中i分别在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型烃钉的选自1-9、1-8或1-4的任何氨基酸位置处或在其活性变体中的对应氨基酸处。
用烃钉制造肽的方法。在一个方面中,公开了制备包含至少一个烃钉对的肽的方法,所述方法包括使如本文所公开的包含至少一个烃钉前体对的肽在用于闭环烯烃复分解的催化剂存在下反应,从而提供如本文所公开的包含至少一个烃钉的肽的步骤。
在另一个方面中,该方法的烃钉前体对可包含i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型的至少一个烃钉前体对;其中i可分别在SEQ ID NO:2的i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型烃钉的选自1-9、1-8或1-4的任何氨基酸位置处或其活性片段中的对应氨基酸处,其中i可分别在SEQ IDNO:3的i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型烃钉的选自1-18、1-19或1-16的任何氨基酸位置处或其活性片段中的对应氨基酸处;其中i分别在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的i、i+3;i、i+4;或i、i+7构型烃钉的选自1-9、1-8或1-4的任何氨基酸位置处或在其活性变体中的对应氨基酸处;其中一对α,α-二取代氨基酸替代了肽序列的i、i+3;i、i+4;或i、i+7处的氨基酸;并且其中每个α,α-二取代氨基酸为α-甲基、α-烯基甘氨酸或α-氢,α-烯基甘氨酸残基。
在各个方面中,用于闭环烯烃复分解的催化剂可为Schrock催化剂或Grubbs催化剂。在另一个方面中,用于闭环烯烃复分解的催化剂可为Grubbs催化剂。
不希望被理论所束缚,修饰该肽,包括减小大小和通过向主链上添加烃钉,可用于克服当前的递送问题。
主链烃钉的添加是用于稳定化α螺旋肽的相对较新技术(Schafmeister,C.E.等人,(2000)J.Am.Chem.Soc.122,5891-5892;Henchey,L.K.等人,(2008)Curr.Opin.Chem.Biol.12,692-697)。在合成肽之前,根据特定氨基酸残基在肽二级结构中的位置选择要进行修饰的特定氨基酸。更具体地,这些残基必须不参与与靶标的相互作用,并且必须存在于以下序列中的一者中,代表肽中的约1或2个完整螺旋圈:i、i+3;i,i+4;或i、I+7(Schafmeister,C.E.等人,(2000)J.Am.Chem.Soc.122,5891-5892;Kim,Y.W.等人,(2010)Org.Lett.12,3046-3049)。在合成期间,优选的氨基酸残基被α,α-二取代的氨基酸替代,这些氨基酸包括任意长度的立体特异性烷基链而不是在α位上的氢原子(Bird,G.H.等人,(2008)Methods Enzymol.446,369-386)。一旦序列已经合成,就使用钌催化的闭环烯烃复分解来连接烷基链,由此产生烃钉(方案1)(Kim,Y.W.等人,(2011)Nat.Protoc.6,761-771)。
不希望被理论所束缚,添加该钉书钉将肽锁定在其α-螺旋状态下,从而限制了溶液中可获得的构象的数量。这可以导致肽的螺旋性百分比增大,并且有助于极大地提高治疗效力。将肽锁定在α螺旋状态下是导致装订肽时观察到的蛋白水解抗性增加的主要原因,因为已知蛋白酶以扩展的非螺旋构象结合其底物(Verdine,G.L.And和G.J.Hilinski,(2012)Methods Enzymol.503,3-33)。因此,通过防止延伸构象的形成,装订肽显示出比未修饰的肽更强的对蛋白水解降解的抗性。此外,使用处于该α螺旋状态下的肽时,极性酰胺主链由于螺旋形成的分子内氢键键合特性而被内部地埋藏(Verdine,G.L.And和G.J.Hilinski,(2012)Methods Enzymol.503,3-33)。不希望受理论束缚,亲水性的这种隐蔽可增加疏水性残基的暴露,从而增加细胞膜渗透性。例如,一旦内化,由于由预先组织化的锁定肽状态导致的靶标结合熵成本大幅降低,靶亲和力可提高5-5000倍(Verdine,G.L.和G.J.Hilinski,(2012)Methods Enzymol.503,3-33;Schafmeister,C.E.等人,(2000)J.Am.Chem.Soc.122,5891-5892;Bird,G.H.等人,(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,14093-14098)。总的来说,蛋白水解抗性、细胞内化的增大和靶标亲和力的增强可导致肽治疗剂的体外和体内功效的显著改善。不希望受到理论束缚,在各个方面中,可以通过在较大的肽的主链上添加第二烃钉来进一步倍增这些增强作用(Bird,G.H.等人,(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,14093-14098)。
聚乙二醇化。在一些方面,本文公开的化合物可被聚乙二醇化。聚乙二醇化是将聚合物PEG(聚乙二醇)的链附接至分子(包括肽)的过程。所述聚乙二醇化可提高肽的安全性和效率。更具体地,聚乙二醇化是聚乙二醇聚合物链共价和非共价附接或汞齐化到分子和宏观结构(诸如药物、治疗性蛋白质或囊泡)的过程。聚乙二醇化通常是通过将PEG的反应性衍生物与分子一起孵育来实现。PEG与药物或治疗性蛋白质的共价附接可以从宿主的免疫系统“掩盖”该药剂,从而降低免疫原性和抗原性并增加该药剂的流体动力学大小(溶液中的大小),从而通过降低肾清除率而延长其循环时间。聚乙二醇化还可为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。
序列。序列在表3中示出。
表3.序列。
Figure BDA0002808303940000311
Figure BDA0002808303940000321
药物组合物
如本文所公开的是药物组合物,所述药物组合物包含上述化合物和药学上可接受的载体。优选地,配制用于静脉内施用的药物组合物。本公开的组合物还含有治疗有效量的如本文所述的化合物。该化合物可包含肽,其中该肽是OCA-B或其OCA-B片段;接头;和细胞穿透肽。可以将组合物配制成用于通过多种施用途径中的任一种施用途径来施用,并且可包括一种或多种生理学上可接受的赋形剂,所述赋形剂可根据施用途径而变化。如本文所用,术语“赋形剂”是指任何化合物或物质,包括也可以称为“载体”或“稀释剂”的那些化合物或物质。制备制药上和生理学上可接受的组合物在本领域中被认为是常规的,并且因此,如果需要的话,本领域的普通技术人员可以向众多权威咨询以获得指导。
如本文所公开的药物组合物可经制备以用于口服或肠胃外施用。被制备用于肠胃外施用的药物组合物包括被制备用于静脉内(或动脉内)、肌内、皮下、腹膜内、经粘膜(例如,鼻内、阴道内或直肠)或经皮(例如,局部)施用的那些药物组合物。气雾剂吸入也可用于递送双官能变构蛋白-药物分子。因此,可以制备用于肠胃外施用的组合物,所述组合物包含溶解或悬浮在可接受的载体中的双官能变构蛋白-药物分子,所述可接受的载体包括但不限于水性载体,诸如水、缓冲水、盐水、缓冲盐水(例如,PBS)等。所包含的赋形剂中的一种或多种赋形剂可有助于接近生理条件,诸如为pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、湿润剂、去污剂等。在组合物包含固体组分(当它们可用于口服施用时)的情况下,赋形剂中的一种或多种赋形剂可充当粘合剂或填充剂(例如,用于片剂、胶囊等的制剂)。在配制用于施加至皮肤或粘膜表面的组合物的情况下,赋形剂中的一种或多种赋形剂可为用于配制乳膏、软膏等的溶剂或乳化剂。
药物组合物可为无菌的,并且可以通过常规的灭菌技术进行灭菌或进行无菌过滤。水溶液可按原样被包装使用或被冻干,本公开所涵盖的冻干制备物可在施用之前与无菌溶液混合。药物组合物的pH通常将介于3与11之间(例如,介于约5与9之间)或介于6与8之间(例如,介于约7与8之间)。可以将固体形式的所得组合物以多个单剂量单位进行包装,每个单剂量单位包含固定量的一种或多种上述药剂,诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以包装在容器中以实现灵活的量,例如在设计用于可局部施用的乳膏或软膏的可挤压管中。
治疗方法
本文公开了用本文所述的化合物中的一种或多种化合物治疗患有疾病的受试者的方法。在一个方面中,疾病的治疗可需要阻抑OCA-B或阻断OCA-B与Jmjd1a和/或Oct1之间的相互作用。在一个方面中,该方法可包括识别需要治疗的患者。在一个方面中,该方法可包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的药物组合物(或化合物)。在一个方面中,该方法可包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物(或化合物),所述药物组合物包含:化合物肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段或OCA-B变体;接头;以及细胞穿透肽,以及药学上可接受的载体或赋形剂。在一个方面中,该方法可包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物(或化合物),所述药物组合物包含:化合物肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段或OCA-B变体;以及细胞穿透肽,以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本文公开了抑制哺乳动物细胞中的OCA-B的方法。在一个方面中,所述方法可包括用本文所述的化合物中的任何化合物处理细胞。在一个方面中,所述方法可包括用治疗有效量的药物组合物处理细胞,所述药物组合物包含:化合物肽,其中所述肽为OCA-B或其OCA-B片段或OCA-B变体;接头;以及细胞穿透肽和药学上可接受的载体。在一个方面中,所述方法可包括用治疗有效量的药物组合物处理细胞,所述药物组合物包含化合物肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段或OCA-B变体;以及细胞穿透肽,以及药学上可接受的载体。在一个方面中,细胞可为免疫系统细胞。在一个方面中,免疫系统细胞可为T细胞。
可以将上述药物组合物配制成包含治疗有效量的本文所公开的化合物。治疗性施用涵盖预防性施加。基于基因测试和其他预后方法,与其患者会诊的医师可选择预防性施用,其中患者对某种类型的自身免疫性疾病(包括多发性硬化症、1型糖尿病、类风湿性关节炎、乳糜泻、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎或白血病)具有临床确定的易患病体质或增加的易感性(在一些情况下,大大增加的易感性)。
本文所述的药物组合物可以以足以延迟、减少或优选防止临床疾病发作的量施用于受试者(例如,人类患者)。因此,在一些方面中,患者可为人类受试者或患者。在治疗应用中,可以将组合物以足以至少部分地改善体征或症状或抑制病症的症状、其并发症和后果的进展(并且优选地阻止其进展)的量施用于已经患有或被诊断为患有疾病(例如,1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、乳糜泻、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎或白血病)的受试者(例如,人类患者)。将足够实现此的量定义为“治疗有效剂量”。药物组合物的治疗有效量可为达到治愈的量,但该结局只是可达到的多个结局中的一种。如上所述,治疗有效量包括提供治疗的量,其中疾病的发作或进展被延迟、阻碍或预防,或疾病或疾病的症状得到改善。症状中的一种或多种症状可能不太严重。可以加快被治疗的个体中的恢复。
在一些方面中,疾病可为1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、乳糜泻、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎或白血病。在一些方面中,该疾病与阻抑、阻断或抑制OCA-B(例如内源性OCA-B)相关联。
本文公开了治疗患有1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、乳糜泻、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎或白血病的患者的方法。在一些方面中,得到方法可包括确定需要治疗或需要阻抑OCA-B的受试者的步骤。
本文公开了可进行以确定一种或多种肽阻断OCA-B和Jmjd1a或Oct1的相互作用的功效的方法。在一些方面中,该方法可用于低通量研究,用测试肽(10-50μM)处理先前已在培养中刺激和静息的原发性人或小鼠CD4 T细胞,然后在抑制剂存在下用CD3/CD28抗体再刺激细胞。可以通过抑制例如接受第二刺激的T细胞中的Il2基因表达,对OCA-B种系缺陷小鼠进行表型模拟来确定功效(如图3A所示)。在一些方面中,可以例如使用对萤光素酶报道基因的抑制来进行高通量测定,例如,使用合成的或免疫球蛋白启动子驱动来自瞬时转染或稳定整合的质粒的报道基因在几乎任何细胞系中的表达。另一个无细胞示例可为抑制免疫共沉淀。
对于这种用途有效的量可取决于疾病严重程度,以及受试者的体重和总体状况和健康。用于初始施用和加强施用的合适方案的典型特征是初始施用之后通过后续施用以每小时、每天、每周或每月的间隔中的一者或多者重复剂量。对于治疗用途,该化合物可包含药学上可接受的赋形剂。此类组合物可在没有过度实验的情况下配制以施用于包括人类在内的哺乳动物,如对于特定应用合适的。另外,可以在不进行过度实验的情况下,使用标准剂量-反应方案确定组合物的适当剂量。例如,受试者可以每周一次或多次(例如,每周2次、3次、4次、5次、6次或7次或更多次)接受本文公开的化合物或组合物中的任何化合物或组合物。
本文公开的药物组合物中的任何化合物的总有效量可以作为单剂量,作为大丸剂或通过在相对较短的时间段内进行输注来施用于哺乳动物,或者可以使用分次治疗方案来施用,其中在长时间段内施用多次剂量(例如,每4-6小时、8-12小时、14-16小时或l8-24小时,或每2-4天、1-2周或一个月一次的剂量)。或者,足以维持血液中治疗有效浓度的连续静脉内输注也在本公开的范围内。
可由本领域普通技术人员考虑个体在年龄、体重和其他一般情况(如上所述)方面的差异来确定本文所述并且用于在如本文所公开的方法中施加至哺乳动物(例如,人)的药物组合物中存在的本文公开的任何化合物的治疗有效量。
实施例
实施例1:T细胞中的OCA-B促进遗传小鼠模型中的T1D。
为了确定T细胞中的OCA-B丢失是否赋予T1D保护,可以使用Ocab(Pou2af1)条件小鼠等位基因。完成将OCA-B等位基因与NOD菌株背景(其易于发生自发T1D)回交。接下来,可以将这种动物与NOD/CD4-Cre杂交。这些小鼠可接受整套测试以测量T1D易感性和严重性。
OCA-B之所以如此命名,是因为其在B细胞谱系中的强表达,其中其为在B细胞活化后产生高亲和力抗体所必需的。有趣的是,分泌抗体的细胞本身不表达OCA-B,表明OCA-B控制着长寿命的分泌抗体的细胞的形成但不维持其。因此,OCA-B抑制将不影响由长寿命抗体分泌细胞介导的中和免疫。鉴定了OCA-B在CD4辅助性T细胞中的功能性作用:缺乏OCA-B的T细胞正常发育并引起正常的病原体反应,但未能形成可观数量的中央记忆CD4细胞。形成的细胞对再遇到的抗原的应答有缺陷。T细胞中的OCA-B水平比B细胞中低至少50倍,表明精心调谐剂量的竞争性抑制剂将导致T细胞选择性效应。OCA-B在再次遇到抗原时促进靶基因表达的潜在分子机制如下:转录因子Oct1与T细胞中一大批免疫调节基因中的调节区结合。在没有OCA-B的情况下,Oct1响应于信号而增强或抑制基因表达。当OCA-B在活化的CD4 T细胞中表达时,其通过充当Oct1与Jmjd1a/Kdm3a之间的桥梁来“锁定”Oct1的增强基因表达的能力,Jmjd1a/Kdm3a是一种去除抑制性组蛋白H3K9me2染色质修饰的组蛋白赖氨酸脱甲基酶。在没有OCA-B的情况下观察到的正常T细胞发育和原发性免疫反应表型有助于形成T1D患者的潜在“治疗指数”的基础,其中靶向OCA-B仅使基线免疫功能受到最小的影响。表观遗传模型预测,就像B细胞中的抗体分泌一样,OCA-B一旦形成就将在CD4记忆T细胞中为非必要的(dispensable)。
OCA-B在T1D中发挥作用的证据:OCA-B水平在不同的T细胞群体中有所不同。OCA-B在幼稚CD4 T细胞中无法检测到,但在持续的抗原刺激后表达。正如预期的那样,相对于其他T细胞群体(未示出),CD4中央记忆细胞中的OCA-B水平升高,但有趣的是所分析的细胞中的最高表达是在胰腺浸润的自反应性CD4 T细胞中发现的(ImmGen(http://immgen.org));显示了Ocab(Pou2af1)在αβ CD4 T细胞亚群中的表达)。人类多态性已被鉴定为影响Oct1结合位点,Oct1为与OCA-B对接的转录因子,所述结合位点在Tnfα和Ctla4基因座中。这些多态性分别与IBD和SLE相关,表明了OCA-B在自身免疫病因学中的一般作用。此外,Oct1结合位点多态性直接与人类T1D发病机制有关。在这项研究中鉴定出的转录因子中(Maurano等人,Science.2012年9月7日;337(6099):1190-5)中,Oct1(Pou2f1)最有效,并且与Oct1相关的最强疾病是T1D。这项研究中的其他关联与乳糜泻和类风湿性关节炎有关。第二项研究(Farh等人,Nature.2015年2月19日;518(7539):337-43)将其他Oct1结合位点多态性与多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、乳糜泻、牛皮癣和溃疡性结肠炎相关联。
三次注射阻断OCA-B与染色质调节剂Jmjd1a(与OCA-B相互作用以促进转录)相互作用的肽,减少了NOD小鼠模型中的血糖和T细胞浸润。用对照肽处理的动物进行对比进展。可以确定使用该药剂的长期治疗,并且还可以确定使用该药剂的所述治疗是否能够提供持续的保护并导致任何免疫学或毒性副作用。效应的持久性可以通过去除抑制剂并监测T1D进展来确定。最后,还可以确定对具有完全确定的疾病的动物的影响,其中期望在没有β细胞替代的情况下不会观察到改善。
药理性OCA-B抑制阻止T1D进程。在存在活动MEK/ERK信号的情况下,Oct1可以在没有OCA-B的情况下与Jmjd1a相互作用。Oct1含有两个共有的ERK磷酸受体丝氨酸。Oct1 DNA结合结构域、OCA-B N末端和共有结合DNA的共晶体结构(Chasman等人,Genes Dev.(1999)13(2):2650-7)揭示了这些Oct1丝氨酸位于柔性的、暴露于溶剂的环(接头结构域)中,该环连接两个DNA结合亚结构域(图2A,红色虚线)。图2示出了与已知的Jmjd1a募集者雄激素受体的比对,并鉴定了OCA-B相互作用表面。已知OCA-B的结晶区域包括对Oct1结合和转录活性重要的区域。与Oct1不同,OCA-B组成性地与Jmjd1a相互作用。为了鉴定潜在的与Jmjd1a相互作用的氨基酸,将全长Oct1和OCA-B氨基酸序列与雄激素受体(AR)(已知与Jmjd1a相互作用的另一种转录因子)进行比对。已将引起雄激素不敏感的人AR突变定位到跨越残基698-721的辅因子相互作用表面。图2B示出了具有AR辅因子相互作用区域的Oct1/OCA-B比对;星号表示引起雄激素不敏感的AR突变;并且加框的丝氨酸显示预测的ERK位点。该序列与Oct1接头结构域比对(图2B),暗示该接头为潜在的与Jmjd1a相互作用的表面。比对显示使用Oct1的4个AR突变位点中的3个为保守的。不保守的AR突变位点是谷氨酸残基,一种潜在的磷酸化模拟物,并且在Oct1中是共有ERK靶标(Ser370)。这些发现表明,Oct1接头结构域构成了表面,所述表面当被ERK磷酸化时与Jmjd1a相互作用。Oct1突变分析证实了这一假设。
与Oct1一样,与OCA-B比对鉴定出了潜在的Jmjd1a相互作用表面(图2B)。与Oct1不同,OCA-B谷氨酸残基(Glu30)与AR比对,这与在没有ERK信号传导的情况下OCA-B与Jmjd1a相互作用的发现一致。有趣的是,与AR比对的残基位于暴露于溶剂的螺旋的一侧上(图2A)。因此,Glu30(红色)、Leu31(黄色)、Arg34(蓝色)和His38(蓝色)可构成Jmjd1a对接表面。这些残基在人类中是保守的。生成了OCA-B瞬时表达质粒中的不同点突变。使用Jmjd1a抗体和野生型OCA-B的对照co-IP可鉴定相互作用(图2C,左)。一种突变蛋白,例如L31A/R34A,仍与Oct1相互作用(未示出),但未能与Jmjd1a相互作用(图2C,左)。该突变体在HCT116细胞中与野生型等效地表达(图2C,右)。两种蛋白质均等地表达(图2C,最右边)。
OCA-B的Jmjd1a相互作用表面(图4)揭示了药理学地靶向OCA-B的机会。将肽设计成与负责Jmjd1a结合的OCA-B表面重叠,并合成为Tat融合体以实现膜渗透性(图3A)。在所测试的肽中,有25μM的肽编号2或编号3表型模拟了OCA-B无效表型,揭示了CD4T细胞再刺激后选择性的Il2和Ifng表达缺陷(图3A和未示出;还参见图9)。经处理的细胞显示为在活力、形态或扩增方面均无变化(未示出)。将肽编号2用于后续实验。
将肽合成并纯化以用于体内实验。NOD小鼠的T1D发作是自发的和急性的,从而允许在出现症状时施用该肽。用三次静脉内注射20mg/kg肽或仅Tat肽对照处理血糖水平新升高到高于225mg/dL但仍低于275mg/dL的雌性14-18周龄NOD小鼠。血清中的肽半衰期预计为约5小时,因此进样间隔12小时。在最后一次注射后十二小时,收集血糖,并对胰腺和胰腺淋巴结(PLN)执行流式细胞术。令人惊讶的是,该抑制剂逆转了升高的血糖(图3B;还参见图9)、胰腺T细胞浸润(总数和百分比两者,图3C和未示出;还参见图9)和促炎性IFNγ和IL-17A细胞因子产量(未示出)。相同浓度的对照肽没有效应。与胰腺不同,PLN显示为T细胞数量或百分比没有变化(图3D和未示出;还参见图9)并且促炎性细胞因子产量的变化较小,表明了基线免疫应答没有受到损害。B细胞中的OCA-B水平为T细胞(Immgen)中的至少50倍高,从而使得观察到的效应可能是由于对T细胞的竞争性抑制。这些数据提供了该肽在体内无毒和有效的证据,从而为治疗新兴的T1D提供了有效的策略。该肽用作原型药物以评定功能和可能的副作用。
NOD/Ocab条件敲除小鼠。使用转基因核心设施,生成条件性Ocab小鼠等位基因(图4A至图4B)。纯合的具有loxP侧位的小鼠产生正常量的蛋白质,而在Δ/Δ脾脏中不存在蛋白质,表明fl等位基因是OCA-B充足的,而Cre缺失的等位基因为无效的(图4C)。与CD4-Cre驱动者杂交会导致脾脏T细胞的有效缺失(图4D)。这些小鼠是在C57BL/6背景上产生的。为了测试T1D出现需要T细胞中的OCA-B表达的预测,进行与NOD菌株背景的快速同基因回交。该方法允许通过筛选和选择与NOD自身免疫易感性相关的13种微卫星和SNP标志物来快速生产小鼠。根据这些标志物,产生回交动物(图5),所述回交动物重演了自发的自身免疫性(未示出)。将这些动物与NOD/CD4-Cre杂交以缺失T细胞中的OCA-B,以评定对T1D的影响(实施例1)。
原理:多个证据线索将OCA-B与T1D相关联。这些数据表明,OCA-B还可为靶向该疾病提供有效的治疗途径。在此描述的实验通过利用新的条件Ocab小鼠等位基因测试遗传Ocab缺失在T1D小鼠模型中为保护性的假设,为这一系列研究提供了机械支持。
确定T细胞中的OCA-B丢失降低NOD小鼠中的T1D发病率或严重性。NOD模型是自发的并且由遗传确定的,但为部分渗透的,就像人类疾病一样。雌性NOD小鼠中的约60-80%在标准环境中发展出T1D。为了测试T1D出现需要T细胞中的OCA-B表达的预测,将跟踪年龄匹配的雌性NOD Ocabfl/fl;CD4-Cre小鼠,以及缺乏Cre或具有loxP侧位的等位基因的对照的T1D出现。将每周两次对动物进行高血糖和体重减轻监测。将生成Kaplan-Meier图以追踪无病生存期。一旦检测到糖尿病,就将处死动物以评定疾病后遗症,诸如胰腺中浸润的淋巴细胞(组织学上)和胰腺淋巴结中的反应性细胞(流式细胞术)。将测量T细胞和巨噬细胞的数量以及细胞因子产量(IL-2、TNFα、IL-17A和IFNγ)。使用BDC2.5MHC四聚体对自身反应性CD4 T细胞进行评分。作为平行实验,将在18周的固定时间点(疾病高峰)处死另一个同期群。将具有T1D参与的动物的比例绘制成曲线图。
NOD小鼠的疾病源于发育中的T细胞的缺陷型负选择,导致了T细胞自身反应性。在缺乏OCA-B的动物中T细胞发育不受影响。因此,该肽在动物模型中的有效性表明,可靶向OCA-B以保护动物免受预先存在的自身反应性。还可以执行血糖水平和体重减轻的曲线平均值和标准偏差。
如果两个模型中的OCA-B丢失均不能提供保护,则使用NODTCR转基因小鼠(例如BDC2.5(CD4选择的转基因)和NY8.3(CD8选择的转基因))敲除OCA-B可能产生更稳健的效应。
实施例2:可渗透膜的OCA-B肽抑制剂在NOD小鼠中的长期效应和持久性。
本文所述的发现表明,OCA-B抑制剂肽在短时间间隔内阻断NOD动物体内的T1D出现。仍然存在许多重要的问题,包括该肽是否通过涉及OCA-B与Jmjd1a相互作用的表面的机制起作用(可使用乱序和点突变肽测试);该肽是否稳定地阻止疾病出现并变得慢性或急性毒性(可用较长的注射持续时间测试);该肽是否抑制已经建立的T细胞记忆(可在LCMV感染和清除后用肽治疗进行测试);以及该肽是否对已经建立的T1D有效(可通过让动物在治疗前变得完全糖尿病来测试)。本实施例中的实验测试了这些预测。
确定特异于OCA-B与Jmjd1a相互作用的表面的化学合成肽是否在NOD动物无毒且稳定地抑制T1D。来自图4的结果表明,短暂施用OCA-B肽会抑制T1D的出现。本文所述的肽可以以毫克级以及附加的乱序和双点突变的肽对照进行合成。
为了测试肽治疗对T1D出现的影响,将在血糖达到225mg/dL之后开始向八只雌性和雄性NOD小鼠的同期群给予注射。此后将每12个小时施用一次肽,持续4或8天。如本文所述,将静脉内施用20mg/kg的肽。将使用逐渐减少的剂量方案,并且将计算用于短期功效(血糖、血清胰岛素)的最小剂量。如果为20mg/kg的较低剂量产生完全保护,则以下实验也将使用该剂量。单独的Tat肽、乱序肽和含有图3所示的点突变的肽将用作对照。在每次注射后,将监测小鼠的呼吸困难和摇摆,以评定即时毒性。将监测动物的体重减轻和气恼出现的迹象,以评定慢性影响。将在处死前测得血糖。将同期群的一半处死以用于胰腺组织学。固定和包埋切片将用H&E染色,并由病理学家以盲法进行分析。相邻的切片可用于使用针对CD4、CD8、CD19和CD11b的抗体进行IHC,以鉴定特异性的浸润性T细胞和B细胞以及巨噬细胞。其余四只小鼠将用于胰腺和胰腺淋巴结的流式细胞术。将测量T细胞和巨噬细胞的数量以及细胞因子产量(例如,由OCA-B靶基因编码的细胞因子,诸如IL-2、IFNγ和IL-17A)。使用BDC2.5MHC四聚体对自身反应性CD4 T细胞进行评分。
为了测试长期耐久性和毒性,将每天两次向单组小鼠注射肽编号2,持续4周。将在注射后立即监测小鼠的呼吸困难和摇摆,并且纵向监测体重减轻或昏睡/气恼出现。如果存在持久的保护作用,则将在4周后收回肽,以确定保护是否可以在不进行连续治疗的情况下保持。在一个单独的实验中,将对患有成熟疾病的年长雌性NOD动物进行处理。
肽抑制剂与任何其他药物的类似警告相关联,所述类似警告包括毒性和副作用的可能性。OCA-B被认为在淋巴细胞和肺上皮细胞中表达。这种狭窄的表达应使由于对OCA-B的直接作用而引起的副作用最小化。此外,OCA-B生殖系无效小鼠是活的和可育的,没有肺病理学的迹象。因此,预期任何毒性都将是由脱靶效应而不是OCA-B抑制引起的。如果观察到急性或免疫毒性,则改变或偏移肽序列的注册(register),并且降低剂量或浓度以限制效应。尽管不是在BCL6抑制剂肽的背景下,Tat膜穿透肽已与毒性相关。如果需要的话,将使用其他穿膜肽,例如聚精氨酸。类似于图3A的测定将确保新肽是有效的。
确定OCA-B抑制是否影响预先建立的T细胞记忆。OCA-B已被证明对现有的血浆B细胞功能是非必要的。此外,与T细胞(ImmGen)相比,B细胞中的OCA-B水平要高得多,从而形成了潜在的治疗窗口,其中特定水平的抑制剂肽竞争性地抑制T细胞中而不是B细胞中与Jmjd1a的相互作用。这种生物学应限制抑制剂对现有和正在发展的B细胞功能的影响。对于不太严重的自身免疫疾病和有预先存在的疗法可用的疾病,在临床中将OCA-B抑制作为自身免疫的疗法的潜在用途将部分依赖于是否需要OCA-B来维持预先存在的记忆T细胞库。为了测试对记忆形成和回忆反应的影响,将在感染模型病原体LCMV后进行肽注射实验,以评定对已建立或已存在的LCMV特异性记忆T细胞的影响。从效应器到记忆池的转换需要4-6周。在感染后42天,将具有四只C57BL/6小鼠的同期群处死,以使用四聚体研究CD4记忆,以鉴定LCMV反应性T细胞。其他同期群将在第42天用Lm-gp61感染,以测试第42+7天的记忆回忆反应。与OCA-B基因缺失一样,预计肽治疗将导致较少的CD4中央记忆T细胞,并且这种减少的群体无法引起回忆反应。使用滑动的8天肽处理窗口,所述肽处理窗口可以在需要OCA-B时被精确定位。为了测试对预先建立的记忆的影响,将在感染后第42天的小鼠用肽处理,并用表达LCMV GP61-80CD4表位(Lm-gp61)的重组李斯特产单核细胞(L.monocytogenes)单核细胞再攻击。该处理将选择性地重新激活特异于该表位的记忆CD4细胞。
在预先建立的CD4记忆T细胞中需要OCA-B的发现违反所述模型,因为所述模型表明了在靶基因染色质调节中的另外未曾预料到的作用。尽管可能仍会出现靶向OCA-B的可行药物,但也会缩小治疗指数和潜在患者生活型(patient profile)。更重要的是,这种发现将表明,该途径的在OCA-B下游操作以建立记忆表观遗传状态而不是维持记忆表观遗传状态的部件,将构成更好的治疗靶标。
确定重组纯化的肽是否可替代化学合成的肽。天然肽在动物中不稳定,从而需要大量合成。作为起作用的药物干预途径的临时解决方案,将从大肠杆菌(E.coli)中克隆、表达和纯化所述肽。与Tat融合的肽编号2、乱序肽对照和双点突变对照肽将被表示为His10融合蛋白,所述融合蛋白之间具有TEV蛋白酶接头。编码肽的DNA将被合成为双链基因块(IDT),并克隆到pNR111细菌表达载体的BamHI和EcoRI位点。该肽将用IPTG诱导,并在变性(尿素)条件下使用镍-NTA琼脂糖色谱法纯化。该策略还去除了内毒素。这种克隆策略将两个N末端氨基酸引入了肽中,因此必须对所述肽进行重新验证。化学合成的肽已出于定量目的而在C末端处含有酪氨酸,这也将用于细菌纯化。在移至小鼠模型之前,可首先在如图3A中的细胞中测试功效。
如果重组肽不能概括化学合成肽的效应,则另一种途径是利用装订的、聚乙二醇化的或环化的肽。这些修饰延长了血清半衰期,因此降低了所需的肽量。从长远来看,肽抑制可为实现真正药物干预的中间步骤,该步骤允许评估定功能、副作用等。模仿肽效应的小分子的发展也在本公开的范围内。尽管序列特异性DNA结合转录因子通常(并且错误地)被认为是“无成药性的”,但是转录辅因子(OCA-B)与染色质修饰酶(Jmjd1a)之间的界面,即基因调节之前曾成功靶向过的区域,被禁止。
实施例3:在MOG/EAE模型中在T细胞中缺乏Oct1的小鼠得到保护。
将Oct1fl/fl;CD4-Cre动物在完全弗氏佐剂(CFA)存在下用小鼠MOG35-55接种,然后注射百日咳毒素导致了由MOG35-55-反应性CD4+ T细胞驱动的自身免疫性神经炎性脱髓鞘疾病的产生。该标准方案导致了经典的自限性单相疾病模式,所述模式包括体重减轻、上行性麻痹和消退。使用标准临床评分系统评估小鼠。图6A中的数据(按应答百分比)和临床评分(未示出)显示,T细胞特异性Oct1丢失导致疾病频率和严重度降低。在疾病消退后,观察到了较少的致病性宫颈淋巴结IFNγ/IL-17A双重产生者T细胞(图6B、图6C)。脊髓的组织病理学分析证实了这些发现。这些结果表明,Oct1的丢失保护了MOG/EAE模型中的动物。
实施例4:确定可渗透膜的OCA-B肽抑制剂在MS小鼠模型中的长期效应和持久性。
为了测试长期毒性,向每组5只C57BL/6小鼠注射5-20mg/kg,每天两次,持续4周。注射后,将监测小鼠的呼吸困难和摇摆,以评定即时毒性(immediate toxicity)。长期来看,将监测动物的重量减轻和气恼出现。为了研究由OCA-B抑制引起的可能的副作用,将研究这些小鼠中新记忆细胞的形成。将通过添加用广泛表征的称为LCMV的小鼠模型病毒感染,来进行与本文所述的那些类似的实验。使用称为四聚体的LCMV特异性T细胞的特异性探针,将评定对建立LCMV特异性记忆T细胞的影响。为了测试MS模型中的功效,将使用MOG35-55诱导的EAE(Waldor等人,Science,1985,227:415-7。简而言之,将8周大的雌性动物处理4周(如果观察到意外的毒性,则更短)。在该时程中,将如图6所示向小鼠施用MOG肽/PT,并监测临床过程。在疾病高峰时,将每组中的小鼠子集处死,并用于宫颈淋巴结和CNS的流式细胞术。另一个子集将进行脊髓包埋、切片并分析浸润性白细胞和脱髓鞘。图10示出了T细胞中Oct1(转录因子OCA-B位于其上)的缺失:保护MOG/PT EAE。
使用组织病理学分析,将测试肽治疗将减少神经炎症和浸润性白细胞的假说。使用Luminex,将探测T细胞和血清细胞因子生产,其中期望由直接靶基因(例如,GM-CSF、IL-17和IFNγ)编码的细胞因子的表达将大大降低。为了测试应答的持久性,将对小鼠进行处理,然后在不进行进一步注射的情况下使其保持并施用MOG/PT。最后,将对NOD动物进行处理,所述动物以渐进临床模式响应于MOG/PT,而不是C57BL/6小鼠中所看到的疾病缓解。这些实验将确定肽施用是否在侵袭性原发性进展性疾病中显示出功效。
OCA-B生殖系无效小鼠是活的和可育的。OCA-B主要在淋巴细胞和肺上皮细胞中表达。这种狭窄的表达谱使由于肽对OCA-B的直接作用而引起的副作用最小化。
为了提供药理实验的遗传基础,将在MOG/EAE模型中部署新的条件性Ocab小鼠等位基因(图4A),其中CD4-Cre在T细胞中缺失。预计在两种模型中,T细胞特异性Ocab缺失都会显著抑制疾病影响。
实施例5:T细胞中异位OCA-B表达促进体内记忆。
材料和方法:用LCMV免疫显性肽接种Thy1.1+和Thy1.1+/1.2+供体小鼠以促进刺激(在没有致病和共刺激信号的情况下,不会发生完全刺激)来允许进行转导。在二十四小时后,分离T细胞并用空载体(Thy1.1)或编码鼠OCA-B的MSCV-IRES-GFP(MIG)载体(Thy1.1/1.2)离体转导。将细胞1∶1合并,并转移到C57BL/6(Thy1.2)接受者中。二十四小时后,动物被LCMV感染。在反应高峰时并且在病毒清除、记忆建立和用表达SMARTA表位(Lm-GP61)的李斯特产单核细胞进行异源性再攻击之后,对小鼠子集实施安乐死并进行尸检。根据CD4和GFP的表达对细胞进行门控,并且使用Thy1.2阳性来计算空载体与OCA-B过表达细胞的比率。结果在图7中示出。
实施例6:Ocab-/-小鼠被保护免患白血病。
在小鼠中使用用于模型化MLL-AF9驱动的白血病的转导/移植系统(参见,图11)。在该模型中,用MSCV-MLL-AF9-IRES-GFP转导BM祖细胞。由该构建体编码的融合蛋白与AML的侵袭性形式相关。移植了转导细胞的小鼠有效发展出了寡克隆AML,并且在约10周内死亡。可以使用Hemavet监测白血病的迹象,例如细胞过多和外周血中成纤维细胞浓度升高。还使用载体中编码的GFP来监测白血病细胞。
实施例7:Oct1的T细胞选择性缺失保护动物免受自身免疫性神经炎症,同时保持神经性病原体应答。
摘要
背景:自身免疫性疾病的治疗旨在减轻自身反应性,同时保持正常的免疫功能。在CD4+ T细胞中,转录因子Oct1/Pou2f1对于T细胞发育和对初次感染的应答来说是非必要的,但是促进了靶基因,包括Il2和Ifng在再遇到抗原的条件下的表达。因此,它们在二次刺激时更强烈地表达。这种重复的抗原遇到在记忆回忆反应中发生,在可以多次识别自身抗原的自身免疫中发生,并且在外来抗原持续存在的慢性感染中发生。基于这些先前的发现,测试了Oct1丢失是否将保护动物免受自身免疫,但保持对CNS中病原体的正常应答。
目的:使用自身免疫驱动的EAE自身免疫模型和JHMV病毒感染模型,使用条件性小鼠Oct1(Pou2f1)等位基因和CD4-Cre驱动物来确定T细胞特异性Oct1丢失对自身免疫和病毒诱导的神经炎症的影响。
结果:在EAE模型中,Oct1条件性缺失减低了临床评分,并且减少了浸润性T细胞和细胞因子产生。一致地,体外刺激的Oct1缺陷型CD4+ T细胞显示出与T细胞无反应性相关的标志物的表达增加,尤其是在没有共刺激信号的情况下。相比之下,在没有Oct1的情况下,抗病毒T细胞效应物功能是完好无损的,其中神经炎症、浸润性T细胞或细胞因子生产没有变化。
结论:这些发现揭示了Oct1丢失对自身免疫的影响与抗病原体反应之间的显著差异,这可能可以用于治疗性益处。
简介
多发性硬化症(MS)是一种慢性衰弱性神经系统疾病,其特征在于由于宿主免疫系统对中枢神经系统(CNS)的细胞的不适当应答引起的炎症、脱髓鞘和神经元损伤(SteinmanL.Annu Rev Immunol.2014;32:257-81)。尽管尚不完全了解MS的病理生理,但活性MS病变的特征是由CD4+ T细胞(布置在活性MS病变的周围)和CD8+ T细胞(通常为血管周围)两者进行CNS浸润,并且随后活化小胶质细胞、巨噬细胞和B细胞(Rumble JM等人,J ExpMed.2015;212:23-35)。CD4+ T细胞可以被认为是MS期间免疫应答的主要调节器,而血管周CD8+ T细胞、小胶质细胞、巨噬细胞以及甚至嗜中性粒细胞在很大程度上介导白质损伤(Rumble JM等人,J Exp Med.2015;212:23-35)。全基因组关联研究(GWAS)指出人类白细胞抗原(HLA)区域中的主要组织相容性复合物(MHC)基因对疾病具有最强影响,从而进一步强调了T细胞在MS病理生理学中的重要性(Patsopoulos NA.Cold Spring Harb PerspectMed.2018;8:a028951)。
Oct1/Pou2f1是一种POU结构域转录因子,其在小鼠中对于T细胞发育和对原发感染的应答来说是非必要的,但是对CD4+中央记忆细胞的形成很重要(Shakya A等人,J ExpMed.2015;212:2115-31)。因此,缺少Oct1的CD4+ T细胞在记忆回忆反应方面完全有缺陷。记忆T细胞极易产生促炎性细胞因子,并且记忆或类似记忆的细胞可作为自身免疫的基础(包括T1D),即使在持续暴露于自体抗原的情况下也是如此(Kawakami N等人,JImmunol.2005;175:69-81;Chee J等人,J Immunol.2014;192:572-80;以及Yeo L等人,JClin Invest.2018;128:3460-74)。在体外,Oct1及其辅助因子OCA-B协调地控制CD4+淋巴细胞中重要直接靶基因的大同期群,所述重要直接靶基因包括Il2、Il21、Stat5a、Ifng、Tbx21(Tbet)、Csf2(Gmcsf)、Tnfrsf4(Ox40)、Icos和Ctla4(Shakya A等人,J ExpMed.2015;212:2115-31)。有趣的是,Oct1和OCA-B对于这些基因的基线活性是非必要的。例如,由于种系或条件性缺失而缺乏Oct1的CD4+ T细胞正常地发育并在初次刺激下表达正常水平的关键T细胞效应细胞因子基因IL-2(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31;和ShakyaA等人,J Biol Chem.2011;286:450-9)。替代地,Oct1和OCA-B在抗原再遇到的条件下强烈调节这些基因,使得对静息但先前被活化的细胞的二次刺激导致了20倍的表达缺陷(Shakya A等人,J Biol Chem.2011;286:450-9)。在CD4+ T细胞极化期间,Oct1与另一种转录因子CTCF一起工作,以介导Il4、Ifng和Il17a靶基因座之间的物理通信(Kim LK等人,2014;54:56-66)。Oct1辅助因子OCA-B/Bob.1也与CD4+中央记忆细胞的形成和功能有关,并且与Th17细胞的形成有关(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31;和Yosef N等人,Nature.2013;496:461-8)。累积地,该发现表明Oct1和OCA-B在CD4+ T细胞应答的控制中具有有效作用,但在特定情况下涉及重复的抗原暴露。这种正常的发育和刺激应答形成了潜在的“治疗窗口”的一部分,在该窗口中,靶向Oct1及其相关途径可用于治疗自身免疫应答,同时保留正常的免疫功能。
除了免疫记忆外,在诸如慢性感染、移植物抗宿主病、肿瘤免疫和自身免疫的情况下,也会发生重复的抗原接触。在后者的情况下,人类GWAS研究显示了Oct1结合位点的多态性与自身免疫性疾病的易患病体质之间的强相关性,所述自身免疫性疾病包括风湿性关节炎、乳糜泻、1型糖尿病、溃疡性结肠炎、自身免疫性甲状腺炎和MS(Ma urano MT等人,Science.2012;337:1190-51;Farh KK-H等人,Natur e.2015;518:337-43;van Heel DA等人,Hum Mol Genet.2002;11:1281-9;以及Graham DSC等人,Hum Mol Genet.2006;15:3195-205)。与控制神经炎性疾病,尤其是MS强相关,导致要考虑Oct1在神经炎性T细胞对自身抗原和病毒感染的应答中的作用。
在此,数据显示,T细胞中Oct1的丢失大大减弱了鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中的临床反应、T细胞浸润和细胞因子产生,同时保持了对JHMV感染的免疫应答。EAE是自动抗原驱动的,并且是MS的原型小鼠模型。体外刺激时,特别是在没有共刺激信号的情况下,降低的临床反应性与CD4+ T细胞上与无反应性相关的表面蛋白的表达变化有关。使用通过用小鼠肝炎病毒(JHMV)的嗜神经性JHM株进行颅内感染而诱导的神经炎症模型时,观察到在临床评分、浸润性T细胞和巨噬细胞以及细胞因子表达方面几乎没有差异。在具有Oct1缺陷型T细胞的动物中,病毒清除被减慢但是为完全的。累积地,这些结果表明,在CD4+ T细胞中涉及Oct1的靶向途径可为MS和其他神经炎性疾病的治疗提供新颖的治疗途径,同时大大保留有益的免疫功能。
材料和方法
实验室小鼠。在这项研究中使用的小鼠为C57BL/6J株背景。与CD4-Cre杂交的Oct1(Pou2f1)条件性小鼠先前已描述(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31)。
EAE的诱导和评分。将EAE使用肌球蛋白少突胶质细胞蛋白(MOG)/百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)毒素(PT)方法启动(Grist JJ等人,Eur J Immunol.2018;48:1199-210)。简而言之,向小鼠皮下注射在完全弗氏佐剂(CFA,Sigma,2mg/mL)中的0.2μmol的MOG35-55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:35),在犹他大学HSC中心(University of Utah HSC Core)合成)。将200ng的PT(Sigma)两次静脉内注射到小鼠体内。基于以下标准确定临床评分:0,无临床疾病;1,失去尾巴张性;2,轻度后肢瘫痪;3,中肢后肢瘫痪;4,下身麻痹;5,四肢瘫痪、昏迷或死亡。
白细胞分离和细胞内细胞因子染色。使用Percoll梯度法从脊髓和宫颈淋巴结中分离白细胞(Stiles LN等人,J Immunol.2006;177:8372-80;Stiles LN等人,Eur JImmunol.2006;36:613-22;以及Stiles LN等人,Autoimmunity.2009;42:484-91)。简要地,将组织通过研磨解离,并穿过尼龙滤网。将细胞以1300×g在室温下与80%与和40%Percoll一起离心。获取在介于40%Percoll与80%Percoll之间的界面处的细胞。为了进行细胞内染色,将分离的细胞用PMA(Sigma,50ng/mL)和离子霉素(Sigma,1μg/mL)以及布雷菲德菌素A(Golgi Plug,Becton-Dickenson)刺激4小时,并根据制造商的方案用细胞固定/透化溶液(BD Cytofix/Cytopermtm)固定。用于流式细胞术的抗体如下:FITC缀合的抗小鼠CD4(Biolegend)、PerCP缀合的抗小鼠CD8a、APC缀合的抗小鼠IFNγ和PE缀合的抗小鼠IL-17(eBioscience)。
体外培养。通过将脾脏研磨穿过70μm滤网来制备来自CD4-Cre;Oct1fl/fl或对照Oct1fl/fl小鼠的单细胞悬浮液。将CD4+ T细胞通过小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)分离。如先前所述(Shakya A等人,J Biol Chem.2011;286:450-9)培养分离的CD4+T细胞,并用5μg/ml平板结合的抗CD3ε(BD Bioscience)和2μg/ml抗CD28抗体(eBioscience)刺激24小时。
JHMV。对于颅内(i.c.)注射,用200μL的氯胺酮(Hospira,Lake Forest,IL,USA)和甲苯噻嗪(Phoenix Pharmaceutical,Saint Joseph,MO,USA)在Hank平衡盐溶液(HBSS)中的混合物进行腹膜内(i.p.)注射以麻醉具有不同基因型的年龄匹配(5-7周)的C57BL/6小鼠。向小鼠颅内注射悬浮在30μL HBSS中的200个噬菌斑形成单位(PFU)的JHMV(菌株V34)。使用先前描述的四点评分量表(Dickey LL等人,J Neuroinflammation.2016;13:240)评定临床严重度。为了分析病毒滴度,在指定的时间点处死小鼠。将每个脑的一半匀浆化,并用于使用DBT小鼠星形细胞瘤细胞系执行的噬斑测定中(Dickey LL等人,JNeuroinflammation.2016;13:240)。
细胞分离和流式细胞术。通过使分离的组织匀浆化并生成单细胞悬浮液以供通过流式细胞术进行分析,可以完成在感染后(p.i.)的限定时间处对被JHMV感染的小鼠的大脑和脊髓内存在的免疫细胞的免疫分型(Dickey LL等人,J Neuroinflammation.2016;13:240;Marro BS等人,J Immunol.2016;196:1855-64;以及Blanc CA等人,J Neuroinflammation.2014;11:138)。简而言之,用以下抗体对分离的细胞进行染色:APC缀合的大鼠抗小鼠CD4和特异于JHMV基质(M)糖蛋白内跨氨基酸133-147存在的CD4免疫优势表位的PE缀合的四聚体(M133-147四聚体),用于分别测定总的和病毒特异性的CD4+细胞(Dickey LL等人,J Neuroinflammation.2016;13:240;Marro BS等人,J Immunol.2016;196:1855-64;以及Blanc CA等人,J Neuroinf lammation.2014;11:138);APC缀合的大鼠抗小鼠CD8a和特异于尖峰(S)糖蛋白中跨氨基酸510-518存在的CD8免疫优势表位的PE缀合的四聚体(S510-518),用于鉴定总的和病毒特异性的CD8+细胞(Dicke y LL等人,JNeuroinflammation.2016;13:240;Marro BS等人,J I mmunol.2016;196:1855-64;以及Blanc CA等人,J Neuroinflammat ion.2014;11:138)。通过NIH四聚体核心设施合成四聚体。用APC缀合的大鼠抗小鼠CD4和PE缀合的抗CD25确定总T调节细胞;并且用BV510缀合的大鼠抗小鼠CD45和FITC缀合的抗F4/80鉴定巨噬细胞。使用BD LSR Fortessa X-20流式细胞仪和FlowJo软件分析样品。
组织学。将脊髓在确定的时间点分离,并在4℃下用4%多聚甲醛固定过夜。随后将切片在30%蔗糖中冷冻保护5-7天,分成12个冠状切片,并包埋在以下物质中:最佳切割温度(optimum cutting temperature,OCT)制剂(VWR,Radnor,PA,USA)(Grist JJ等人,Eur JImmunol.2018;48:1199-210;Dickey LL等人,J Neuroinflammation.2016;13:240;MarroBS等人,J Immunol.2016;196:1855-64;以及Blanc CA等人,J Neuroinflammation.2014;11:138);APC缀合的大鼠抗小鼠CD8a和特异于尖峰(S)糖蛋白中跨氨基酸510-518存在的CD8免疫优势表位的PE缀合的四聚体(S510-518),用于鉴定总的和病毒特异性的CD8+细胞(Dickey LL等人,J Neuroinflammation.2016;13:240;Marro BS等人,J Immunol.2016;196:1855-64;以及Blanc CA等人,J Neuroinflammation.2014;11:138)。切下冠状切片(8μm厚),并用luxol快蓝(LFB)与苏木精和曙红(H&E)的组合对切片染色。用Image J软件确定总白质和脱髓鞘白质的面积。通过使用既定方法将脱髓鞘的白质的面积除以总白质面积来计算脱髓鞘百分比(Dickey LL等人,J Neuroinflammation.2016;13:240)。
统计学分析。误差条指示±SEM。使用学生T检验来归属统计显著性。对于所有数字,*=p值≤0.05;**=p值≤0.01。
结果
为了确定T细胞中Oct1对神经自身免疫疾病发病机理的影响,使用Oct1 T细胞条件小鼠(CD4-Cre;Oct1fl/fl(Shakya A等人,J Exp Med。2015;212:2115-31)将小鼠和对照小鼠(Oct1fl/fl)与MS的MOG-EAE模型一起使用。在用对应于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的肽(MOG35-55,参见方法)和用弗氏完全佐剂接种后,向小鼠注射百日咳毒素以增加血脑屏障通透性。通过评估临床评分来确定疾病严重程度。C57BL/6小鼠在MOG注射后9-14天发展出临床症状(Bittner S等人,J Vis Exp.2014;15;(86))。如图12A所示,CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠受到显著保护,具有的临床评分小于1,而对照Oct1fl/fl小鼠在疾病高峰点处表现出更高的临床干预(第20天,图12A)。另外,在EAE诱导后21天收集脊髓用于组织病理学评分。对照小鼠的脱髓鞘程度是CD4-Cre;Oct1fl/fl组的两倍(图12B、图12C)。这些结果表明,在MS的MOG-EAE模型中,T细胞中的Oct1缺失强烈保护小鼠免受临床症状影响。
T细胞对于EAE和MS发病机制为必不可少的(Goverman J.Nat Rev Immunol.2009;9:393-407)。在EAE中IFNγ和IL-7在CNS浸润性Th1和Th17 CD4+ T细胞中的表达与临床严重度相关(Goverman J.Nat Rev Immunol.2009;9:393-407;Segal BM等人,J ExpMed.1996;184:771-5;以及Langrish CL等人,J Exp Med.2005;201:233-40)。CD4+和CD8+ T细胞均有助于临床和组织学疾病。CD8+ T细胞被募集到病变处并介导少突胶质细胞和轴突的破坏(Goverman J等人,CurrDrug Targets Inflamm Allergy.2005;4:239-45;和FrieseMA等人,Brain.2005;128:1747-63)。因此,在疾病进展的高峰处筛选Oct1条件性和对照小鼠的引流宫颈淋巴结(CLN)和脊髓中的T细胞群,以确定缺乏Oct1的T细胞是否在CNS和CLN中具有降低的自身免疫活性。尽管各组之间CLN CD4+和CD8+的百分比相似(图12D、图12E,左小图),但是与对照Oct1fl/fl小鼠相比,在CD4-Cre;Oct1fl/fl组中检测到了更少(p<0.01)的总CD4+和CD8+ T细胞更(图12E,右小图)。该结果表明在EAE模型中淋巴结细胞性减少。由于CD4+ T细胞是EAE模型中的主要诱导物(Goverman J.Nat Rev Immunol.2009;9:393-407),因此在这些细胞中也对细胞因子产量进行分析。与Oct1fl/fl对照相比,在CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠的CLN中产生IL-17和IFNγ的CD4+ T细胞的频率和总数均降低(图12F、图12G)。与CLN一样,CD4+和CD8+T细胞的频率在CD4-Cre;Oct1fl/fl和Oct1fl/fl小鼠中为相似的(图12H)。CD4+和CD8+ T细胞的总数也是在CD4-Cre;Oct1fl/fl和Oct1fl/fl小鼠之间相似的。然而,如在CLN中一样,与对照相比,CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠的脊髓中的浸润性T细胞中促炎性细胞因子的产生大大降低(图12I)。这些数据表明,T细胞中Oct1的丢失强力地保护动物免受EAE的临床症状影响,并且这种保护与降低的CNS T细胞浸润和促炎性细胞因子表达有关。
T细胞无反应性是在没有共刺激信号的情况下由TCR刺激诱导的外周耐受机制,其中T细胞变得反应性差,从而保护动物免受潜在的自身反应性(Kearney ER等人,Immunity.1994;1:327-39;Vanasek TL等人,J Immunol.2001;167:5636-44;Kalekar LA等人,Nat Immunol.2016;17:304-14;以及Chai JG等人,Int Immunol.1997;9:935-44)。Oct1丢失导致靶基因诸如Ifng的表达在重复T细胞刺激的情况下选择性地降低(Shakya A等人,J Biol Chem.2011;286:450-9)。使用Oct1辅助因子OCA-B缺陷型CD4+ T细胞进行的基因表达谱分析显示这些基因被下调,并且鉴定出与无反应性相关的基因例如Ctla4的表达增加(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31)。可以通过在没有共刺激的情况下向T细胞提供初次TCR模拟(经由固定的抗CD3ε单克隆抗体)来在体外模仿无反应性应答(Chai JG等人,Int Immunol.1997;9:935-44)。为了确定Oct1丢失对无反应性应答的影响,将CD4+CD44+T细胞(主要由预活化的静息细胞组成)从CD4-Cre;Oct1fl/fl和对照CD4-Cre动物收获,在具有或不具有CD28共刺激的情况下使用抗CD3抗体离体刺激它们24小时,并分析与活化和无反应性相关的蛋白质的表达。
ICOS(可诱导的T细胞刺激物)在体外诱导T细胞无反应性和体内自身免疫发展中具有重要但复杂的作用(Tuettenberg A等人,J Immunol.2009;182:3349-56;Dong C等人,Nature.2001;409:97-101;以及Dong C等人,J Autoimmun.2003;21:255-60)。通过流式细胞术分析ICOS表达,发现在幼稚Oct1缺陷型细胞中基线ICOS水平为约2倍高,但是在接受抗CD3/28的完全刺激的细胞中没有明显差异(图13A、图13B)。有趣的是,与对照组相比,仅用抗CD3刺激Oct1缺陷型细胞导致Oct1缺陷型细胞中的ICOS表达明显降低(图13A、图13B)。静息细胞中基线ICOS表达增加和无反应性刺激后ICOS表达降低均与在EAE模型中观察到的保护相一致,因为抗原引发期间(第1天至10天)的ICOS阻断会增加脑部炎症并促进EAE,而后来在EAE发病机制中进行阻断(第9天至20天)减少了CNS白细胞浸润并且是保护性的(DongC等人,Nature.2001;409:97-101;以及Rottman JB等人,2001;2:605-11)。此外,CD25(CD4+T细胞活化时诱导的高亲和力IL-2受体)的表达(Caruso A等人,Cytometry.1997;27:71-6)在Oct1缺陷型细胞中降低,特别是在缺乏共刺激的无反应性条件下。T调节细胞(Treg)表达CD25并且还产生IL-10,然而这些细胞中的IL-10产生与对照CD4+ T细胞相似(图16),表明这些体外差异与效应T细胞相关。与CD25不同,各组之间的CD44表达水平相似(图13C、图13D)。这些结果表明,Oct1缺陷型细胞中的ICOS和CD25水平以与EAE模型中观察到的保护一致的方式改变。
还分析了与无反应性应答有关的抑制性分子的表达。在无反应和完全激活两种条件下,Oct1丢失均增加CTLA4(一种检查点抑制剂和一种无反应性标志物)的表达(Greenwald RJ等人,Immunity.2001;14:145-55)(图13E、图13F)。类似地,在所有条件下,与对照细胞相比,Oct1缺陷型细胞中FR4/CD73双阳性细胞的频率增加(图13G、图13H)。CD4+CD44+FR4hiCD73hi细胞与无反应性相关(Kalekar LA等人,Nat Immunol.2016;17:304-14;以及Martinez RJ等人,J Immunol.2012;188:170-81)。还测量了Th1或Th17分化培养条件下产生IFNγ或IL-17的细胞的频率,以研究Oct1丢失是否影响细胞因子表达水平。用MOG35-55肽刺激5天后未观察到差异。因此,缺乏Oct1的T细胞的体外刺激导致与活化相关的表面蛋白表达降低,而与无反应性相关的蛋白表达升高。
以上发现表明靶向Oct1可为用于MS的可行治疗策略。使用模型病原体LCMV进行急性感染的先前发现表明,T细胞中的Oct1对于病原体应答和清除是非必要的,但对于稳健的记忆回忆反应却是必需的(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31)。然而,尚未测试Oct1在由嗜神经病毒引起的神经炎症中的作用。在JHMV情况下显著增加的病理学表明,直接靶向Oct1作为用于自身免疫的治疗将导致不希望的副作用。为了确定Oct1是否介导病毒诱导的脑脊髓炎的疾病严重度,研究对JHMV的应答。JHMV是一种嗜胶质(glial-tropic)冠状病毒,并且是病毒诱导的脑脊髓炎和免疫介导的脱髓鞘的公认模型(Lane TE等人,CritRev Immunol.2010;30:119-30;Bergmann CC等人,Nat Rev Microbiol.2006;4:121-32;以及Liu MT等人,Immunol Res.2001;24:111-9)。用JHMV颅内接种C57BL/6小鼠通常会导致急性脑脊髓炎、免疫介导的脱髓鞘和后肢瘫痪。T细胞应答对于控制CNS内的JHMV复制很重要(Williamson JS等人,J Virol.1990;64:4589-92)。将年龄匹配的Oct1fl/fl和CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠颅内(i.c.)接种JHMV(200PFU),并监测临床疾病的严重程度和存活率。被JHMV感染的CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠被证明在21天内再临床疾病严重程度方面没有差异(图14A)。在感染后的确定时间处研究与对照小鼠相比,被JHMV感染的CD4-Cre;Oct1fl/fl的脑中的病毒滴度尽管在感染后第7天,CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠的CNS中的病毒滴度与对照组动物相比升高,但是到感染后第21天时,病毒滴度低于两个组中的检测水平(约100PFU/g组织)(图14B)。该结果表明在Oct1 T细胞缺陷型小鼠中病毒清除是完整的。支持这些发现,观察到了在疾病高峰(感染后第12天)和终点(感染后第21天,图14C、图14D)处相似的脱髓鞘程度。与对照小鼠相比,浸润性CD4+(图15A、图15B)或CD8+ T细胞(图15C、图15D)CD4-Cre;Oct1fl/fl小鼠中的数量是相似的。此外,使用四聚体染色(Dickey LL等人,Neuroinflammation.2016;13:240;Marro BS等人,J Immunol.2016;196:1855-64;和BlancCA等人,J Neuroinflammation.2014;11:138)时,在病毒特异性CD4+ T细胞(图15E、图15F)或CD8+ T细胞(图15G、图154H)中没有观察到显著差异。在任何时间点,被JHMV感染的小鼠的中枢神经系统(CNS)中CD25+细胞或巨噬细胞积累的百分比也没有差异。从感染后第21天安乐死的动物研究CNS T细胞中的促炎细胞因子表达未观察到显著水平的IL-17表达,这与以下的先前发现一致:Th17细胞在该模型中没有发挥重要作用(Held KS等人,ViralImmunol.2008;21:173-88;以及
Kapil P等人,J Virol.2009;83:5978-86)。存在表达IFNγ的细胞,然而在IFNγ产生的百分比或数量或程度上均未观察到显著差异(图15I、图15J)。这些数据一起表明,T细胞中的Oct1丢失不影响神经系统疾病或免疫介导的脱髓鞘或响应于对CNS的JHMV感染的T细胞功能性。
讨论
本文所述的结果表明,使用MOG-EAE模型时,T细胞中转录因子Oct1的表达促进CNS自身免疫,但很少参与CNS抗病毒免疫。这些结果表明,靶向Oct1及其相关的活性和途径,可用于治疗自身免疫,同时保留病毒病原体定向的免疫功能。
已经在CD4+ T细胞中研究了Oct1转录调节机制(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31;以及Shakya A等人,J Biol Chem.2011;286:450-9)。直接靶基因包括Il2、Ifng、Csf2(Gmcsf)、Icos和Ctla4。然而,与NF-AT或AP-1不同,Oct1对于这些基因的基线活性是非必要的。原发性CD4+Oct1缺陷型幼稚T细胞的刺激导致了关键T细胞效应细胞因子IL-2的正常水平和诱导动力学(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31;和Shakya A等人,J Biol Chem.2011;286:450-9)。正常的T细胞发育和对初始刺激的应答形成了潜在“治疗窗口”的一部分,其中靶向Oct1及其相关途径可用于以最小的副作用治疗自身免疫反应。相反,Oct1靶基因在第二次遇到抗原和共刺激信号时显示出严重的缺陷型表达(100倍或更多)(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31;以及Shakya A等人,J BiolChem.2011;286:450-9)。在体内,缺乏Oct1的CD4+ T细胞对急性病毒病原体LCMV产生正常应答,但无法形成可观数量的记忆细胞。那些形成的记忆细胞在病原体回忆反应方面是有缺陷的(Shakya A等人,J Exp Med.2015;212:2115-31)。记忆细胞最易产生促炎性细胞因子,并且记忆或类似记忆的细胞可作为自身免疫的基础,即使在持续暴露于自体抗原的情况下也是如此(Kawakami N等人,J Immunol.2005;175:69-81;Chee J等人,JImmunol.2014;192:572-80;以及Yeo L等人,J Clin Invest.2018;128:3460-74)。这些发现以及Oct1结合位点中的人多态性与包括MS在内的自身免疫疾病的易患病体质之间的强关联(Maurano MT等人,Science.2012;337:1190-5;Farh KK-H等人,Nature.2015;518:337-43;van Heel DA等人,Hum Mol Genet.2002;11:1281-9;Graham DSC等人,Hum MolGenet.2006;15:3195-205),表明了Oct1在促进MS中的可能作用。
MOG-EAE是确立的MS模型,通过在存在促炎性信号的情况下用自身抗原接种来驱动。使用该模型时,本文所述的结果表明,T细胞中Oct1丢失保护动物免受EAE的临床症状的影响。这种保护与减少的CLN淋巴结病和炎性细胞因子表达,以及减少的CNS T细胞浸润和细胞因子表达相关联。
由于诱导的Treg的活性或对无反应性的诱导,可通过胸腺选择中央地,或外周地诱导T细胞耐受(Kearney ER等人,Immunity.1994;1:327-39)。已经发现,用单独的CD3刺激缺乏Oct1的CD4+ T细胞以模拟在没有共刺激信号的情况下的TCR刺激,与对照Oct1充足的细胞相比明显增加了无反应性的迹象。在没有共刺激的情况下,在Oct1缺陷型细胞中观察到了降低的ICOS和CD25水平,而在具有共刺激的情况下没有观察到差异。ICOS是由活化T细胞表达的共刺激分子,在体外诱导T细胞无反应性和体内自身免疫发展中具有重要但复杂的作用(Tuettenberg A等人,J Immunol.2009;182:3349-56;Dong C等人,Nature.2001;409:97-101;以及Dong C等人,J Autoimmun.2003;21:255-60)。在抗原引发期间阻断ICOS促进了EAE,而在疾病过程中的后期阻断ICOS为保护性的(Dong C等人,Nature.2001;409:97-101;以及Rottman JB等人,Nat Immunol.2001;2:605-11)。有趣的是,除了在无反应性刺激下观察到的降低的ICOS水平外,还发现缺乏Oct1的未刺激CD4+ T细胞以较高水平表达基线ICOS。因此,两个观察结果都与EAE模型中观察到的保护作用一致。缺乏Oct1的细胞还显示出较高水平的抑制受体CTLA-4和无反应性标志物CD73和FR4。
这些发现还表明,Oct1对于JHMV诱发的神经系统疾病的临床反应是非必要,因为该模型中的临床评分和脱髓鞘是可叠加的。Oct1的表达加速,但不是进行有效病毒控制所必需的。然而,总的和抗病毒的T细胞数量、细胞因子表达和巨噬细胞募集基本上不受影响。示例包括T细胞百分比以及表达细胞因子的细胞和调节性T细胞的数量。
结论
总的来说,这些结果表明,尽管Oct1丢失对病毒引起的炎症有适度的影响,但是它显著改善了对自身抗原驱动疾病的反应。这些结果表明,靶向Oct1及其相关的上游和下游途径(例如辅因子OCA-B)可为在自身免疫方面有治疗益处的,同时保留了病毒病原体定向的免疫功能。
对于本领域的技术人员将显而易见的是,在不脱离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明作出各种修改和变型。对于本领域的技术人员而言,考虑到说明书和本文所公开的本发明的实践,本发明的其他方面将显而易见。说明书和示例仅应视为是示例性的,本发明的真正的范围和精神由以下权利要求书指示。
序列表
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 1
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<210> 5
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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Arg Arg Lys Arg Gly His Thr Ser Val Gly Ala Ala Gly Pro Pro Thr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Cys Lys Glu Leu Leu Arg Arg Lys Arg Gly His
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<211> 11
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Val Cys Glu Leu Leu Arg Arg Lys Arg Gly His
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<211> 11
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<220>
<223> 合成构建体
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Val Lys Cys Leu Leu Arg Arg Lys Arg Gly His
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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Val Lys Glu Cys Leu Arg Arg Lys Arg Gly His
1 5 10
<210> 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Lys Glu Leu Cys Arg Arg Lys Arg Gly His
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Val Lys Glu Leu Leu Arg Arg Lys Arg Cys His
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<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Val Lys Glu Leu Leu Arg Arg Lys Arg Gly Cys
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<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Leu Ser Ser Pro Ser Ala Leu Asn Ser Pro Gly Ile Glu Gly Leu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Arg Lys
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val
1 5 10 15
His Trp Lys Trp
20
<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
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1 5 10 15
Tyr Arg Asn Gly Lys
20
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Cys Leu Leu Arg Arg Lys Arg Gly Cys
1 5

Claims (34)

1.一种化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段;接头;和细胞穿透肽。
2.一种化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段或变体;和细胞穿透肽。
3.如权利要求2所述的化合物,所述化合物还包含烃接头。
4.如权利要求1或2所述的化合物,其中所述OCA-B片段是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
5.如权利要求4所述的化合物,其中所述OCA-B或其片段是SEQ ID NO:3。
6.如权利要求4所述的化合物,其中所述OCA-B或其片段是SEQ ID NO:2。
7.如权利要求1所述的化合物,其中所述OCA-B片段的氨基酸序列与OCA-B肽的野生型片段具有至少90%的序列同一性。
8.如权利要求2所述的化合物,其中所述OCA-B变体的氨基酸序列与参考序列具有至少90%的序列同一性。
9.如权利要求7所述的化合物,其中所述OCA-B肽的所述野生型片段来源于人或小鼠。
10.如权利要求1所述的化合物,其中所述接头为肽接头。
11.如权利要求1所述的化合物,其中所述接头为GSG。
12.如权利要求1所述的化合物,其中所述细胞穿透肽是TAT序列。
13.如权利要求12所述的化合物,其中所述TAT序列是SEQ ID NO:4。
14.如权利要求1或权利要求2所述的化合物,其中所述肽直接缀合至接头,并且所述接头直接缀合至所述细胞穿透肽。
15.如权利要求1所述的化合物,其中所述肽是SEQ ID NO:2,所述接头是GSG,并且所述细胞穿透肽是SEQ ID NO:4。
16.如权利要求15所述的化合物,其中SEQ ID NO:2直接缀合至GSG,并且GSG直接缀合至SEQ ID NO:4。
17.如权利要求1或2所述的化合物,其中所述化合物能够阻断OCA-B与Jmjd1a的相互作用。
18.如权利要求1所述的化合物,其中所述化合物是环化的或聚乙二醇化的。
19.一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1或2的化合物和药学上可接受的载体。
20.如权利要求19所述的药物组合物,其中所述药物组合物被配制用于静脉内施用。
21.一种治疗患有疾病的受试者的方法,其中所述疾病的治疗需要OCA-B阻抑,所述方法包括向所述受试者施用这样的化合物,所述化合物包含肽,其中所述肽是OCA-B或其OCA-B片段;接头;和细胞穿透肽。
22.如权利要求21所述的方法,其中所述化合物在药学上可接受的赋形剂中。
23.如权利要求22所述的方法,其中施用治疗有效量的所述化合物。
24.如权利要求25所述的方法,其中所述受试者是人类患者。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述疾病是1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、乳糜泻、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎或白血病。
26.一种抑制哺乳动物细胞中的OCA-B的方法,所述方法包括用权利要求1或2的化合物处理所述细胞。
27.如权利要求26所述的方法,其中所述细胞是免疫系统细胞。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述免疫系统细胞是T细胞。
29.一种阻断OCA-B与Jmjd1a相互作用的化合物,其中所述化合物包含由OCA-B或其片段组成的肽SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3;接头;和细胞穿透肽。
30.如权利要求29所述的化合物,其中所述接头为肽接头。
31.如权利要求30所述的化合物,其中所述接头为GSG。
32.如权利要求29所述的化合物,其中所述细胞穿透肽是TAT序列。
33.如权利要求29所述的化合物,其中所述接头是GSG并且所述细胞穿透肽是SEQ IDNO:4。
34.如权利要求29所述的化合物,所述化合物在药学上可接受的赋形剂中。
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