CN112229896A - 一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，本研究基于tet(X)基因表达的酶能降解替加环素的功能，开发了一种使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF MS)的方法，本发明的检测方法操作简便、快速，准确性和特异性高；相比较于传统的CIM方法，本发明所公开的方法的检测时间由原来的18～24小时大大缩短至4～5小时，同时，本发明的检测方法的准确性和特异性与CIM方法相当。

Description

一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法及其应用。
背景技术
四环素类抗生素在治疗由大多数革兰氏阳性及革兰氏阴性病菌造成的感染时具有显著的治疗效果，因此在临床上具有非常重要的作用。然而，随着细菌不断的进化，一些细菌能够产生四环素修饰酶，导致许多临床使用四环素类药物治疗失败的案例出现。
替加环素是治疗耐多药(MDR)革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌引起的复杂感染的最后手段之一。近年来，在临床分离的多药耐药菌中出现零星的替加环素耐药的病例，大部分是由于核糖体保护或高表达的抗生素外排机制所致。这种耐药性影响抗生素的吸收或抗生素与靶标之间的相互作用，但不影响替加环素的浓度或活性。此外，电阻只能垂直传输，而不能水平传输。
但是，在中国，报道了在肠杆菌科和不动杆菌属中发现了一种新的质粒介导的酶促替加环素抗性机制，即tet(X)基因。tet(X3/X4)基因具有高水平的替加环素抗性，并且存在于可转移质粒上，可以在不同菌株和物种之间水平转移抗性。tet(X3/X4)基因通过表达产生的酶可直接失活、钝化所有四环素类抗生素，包括替加环素和美国FDA新批准的依拉瓦环素、奥玛环素等，通过在碳11a位置的羟基化作用，威胁整个四环素类抗生素家族的临床疗效。更令人担心的是，在不同的生态位，包括家畜(猪、牛和鸡)、环境(农田、土壤和灰尘)和临床样本中，均发现了质粒携带的tet(X3/X4)基因。因此，急需一种快速的tet(X)基因检测方法来监测和控制质粒介导的替加环素耐药性的传播。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术对于tet(X)基因检测方法存在的检测时间长，检测灵敏度低的缺陷。
本发明的首要目的是提供一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法。
本发明的第二个目的是提供上述方法在筛选含tet(X)基因的菌株中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，包括以下步骤：
(1)配制含抗生素的标准溶液，将其与待测菌株样品的菌苔混匀、孵育3～5h，孵育后离心；
(2)取离心上清液点靶，晾干后加入基质覆盖；
(3)设置MALDI-TOF MS参数：质谱范围1m/z～1000m/z，离子源20kV，线性反射器2.62kV，镜头6kV，激光频率50Hz，脉冲离子萃取延迟114ns；
(4)结果判定：若样品出现602m/z产物峰，判定该待检测菌株携带tet(X)基因；若样品未出现602m/z产物峰，判定该待检测菌株不携带tet(X)基因。
优选的，所述抗生素为替加环素。
当选用替加环素时，步骤(1)标准溶液用0.5％NaCl溶液配制，浓度为50μg/ml。
优选的，步骤(1)孵育的条件为：37℃、转速250rpm。
优选的，步骤(1)混匀的操作为：取500ul标准溶液与一接种环的待测菌株的菌苔涡旋混匀。
优选的，步骤(1)离心的条件为：13000rpm，离心2min。
作为一种具体的实施方案，本发明上述快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，包括以下步骤：
(1)用0.5％NaCl溶液配置浓度为50μg/ml替加环素，并在2ml离心管中加入500μl该溶液。
(2)刮一接种环(使用10μl的接种环，并刮满一整环)的待检测菌菌苔加至步骤(1)的离心管中，对离心管进行涡旋(10～20秒钟)，使菌苔与溶液充分混匀。
(3)将离心管放入37度摇床中250转孵育3小时后取出，在高速离心机中13000rpm离心2分钟，取出离心管。
(4)吸取步骤(3)中离心管内1μl上清液进行点靶，室温晾干3分钟后吸取1μl基质覆盖并室温晾干。
(5)在MALDI-TOF MS内设置参数质谱范围1m/z～1000m/z，离子源20kV，线性反射器2.62kV，镜头6kV，激光频率50Hz，脉冲离子萃取延迟114ns，观察产物峰(602m/z)和药物峰(586m/z)。
(6)结果判定：若样品出现产物峰(602m/z)，判定该待检测菌株携带tet(X)基因；若样品未出现产物峰(602m/z)，判定该待检测菌株不携带tet(X)基因。
本发明还提供上述方法在筛选含tet(X)基因的菌株中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，本研究基于tet(X)基因表达的酶能降解替加环素的功能，开发了一种使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS，型号Axima iDplus Performance，分析软件Saramis)的方法，本发明的检测方法操作简便、快速，准确性和特异性高；相比较于传统的CIM方法，本发明所公开的方法的检测时间由原来的18～24小时大大缩短至4～5小时，同时，本发明的检测方法的准确性和特异性与CIM方法相当。
附图说明
图1为快速检测菌株携带tet(X)基因的方法的流程示意图；
图2为实验例中阳性对照检测结果图；
图3为实验例中阴性对照检测结果图；
图4为实验例阳性测试组检测结果图；
图5为实验例阴性测试组检测结果图；
图6为实验例空白对照组检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，包括以下步骤：
(1)用0.5％NaCl溶液配置浓度为50μg/ml替加环素，并在2ml离心管中加入500μl该溶液；在本实施例中，替加环素和NaCl溶液最好是现配现用。
(2)刮一接种环(使用10μl的接种环，并刮满一整环)的待检测菌菌苔加至步骤(1)的离心管中，对离心管进行涡旋(10～20秒钟)，使菌苔与溶液充分混匀。
(3)将离心管放入37度摇床中250转孵育3小时后取出，在高速离心机中13000rpm离心2分钟，取出离心管。
(4)吸取步骤(3)中离心管内1μl上清液进行点靶，室温晾干3分钟后吸取1μl基质(α-氰-4-羟基肉桂酸，配置好的基质应立即使用，剩余溶液避光存放)覆盖并室温晾干。
(5)在MALDI-TOF MS内设置参数质谱范围1m/z～1000m/z，离子源20kV，线性反射器2.62kV，镜头6kV，激光频率50Hz，脉冲离子萃取延迟114ns，观察产物峰(602m/z)和药物峰(586m/z)。
(6)结果判定：若样品出现产物峰(602m/z)，判定该待检测菌株携带tet(X)基因；若样品未出现产物峰(602m/z)，判定该待检测菌株不携带tet(X)基因。
设置一个阳性对照组，一个阴性对照组，一个阳性测试组，一个阴性测试组，一个空白对照组其中阴性对照组为一株经过PCR鉴定无含有使四环素类药物失活酶的菌株的大肠杆菌标准菌株ATCC25922(购自中国微生物菌种保藏中心)，按照实施例1的方法进行检测，结果如图2至图6，阴性对照组经过PCR得出实验结果：上述阴性对照为不产生四环素类药物失活、钝化酶的菌株。

Claims (7)

1.一种快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制含抗生素的标准溶液，将其与待测菌株样品的菌苔混匀、孵育3～5h，孵育后离心；
(2)取离心上清液点靶，晾干后加入基质覆盖；
(3)设置MALDI-TOF MS参数：质谱范围1m/z～1000m/z，离子源20kV，线性反射器2.62kV，镜头6kV，激光频率50Hz，脉冲离子萃取延迟114ns；
(4)结果判定：若样品出现602m/z产物峰，判定该待检测菌株携带tet(X)基因；若样品未出现602m/z产物峰，判定该待检测菌株不携带tet(X)基因。
2.根据权利要求1所述的快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，其特征在于，所述抗生素为替加环素。
3.根据权利要求2所述的快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，其特征在于，步骤(1)标准溶液用0.5％NaCl溶液配制，浓度为50μg/ml。
4.根据权利要求1所述的快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，其特征在于，步骤(1)孵育的条件为：37℃、转速250rpm。
5.根据权利要求1所述的快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，其特征在于，步骤(1)混匀的操作为：取500ul标准溶液与一接种环的待测菌株的菌苔涡旋混匀。
6.根据权利要求1所述的快速检测菌株携带tet(X)基因的方法，其特征在于，步骤(1)离心的条件为：13000rpm，离心2min。
7.权利要求1至6任一项所述方法在筛选含tet(X)基因的菌株中的应用。
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