CN112220959B - 一种铜基mof水凝胶功能化抗菌膜及其制备方法与应用 - Google Patents

一种铜基mof水凝胶功能化抗菌膜及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜及其制备方法与应用。本发明先合成天然高分子大单体，所述的天然高分子大单体为乙烯基壳聚糖衍生物、乙烯基壳聚糖衍生物和甲基丙烯酸酯化明胶中任意一种或多种，将铜离子以铜基金属有机骨架纳米粒子的形式负载于天然高分子‑g‑N‑异丙基丙烯酰胺的交联水凝胶中，借助水凝胶基体表面的活性基团与改性隔菌膜表面异氰酸酯基之间的亲核加成反应，制备出铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜。本发明结合了铜基MOF功能化水凝胶温敏性、抗菌性与隔菌膜阻隔细菌的能力，通过物理化学作用来达到隔菌膜与功能化水凝胶之间的有效粘结，实现抗菌膜在具备隔菌抑菌效果的同时，还具有较好的物理机械性能。

Description

一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及温敏水凝胶功能化抗菌膜，特别是涉及一种铜金属有机骨架(MOF)纳米粒子载入温敏水凝胶功能化抗菌膜的制备方法；其属于皮肤创面再生修复用的膜类医用敷料制造领域。
背景技术
医用敷料作为伤口处的覆盖物，在伤口愈合过程中，可以替代受损的皮肤起到暂时性屏障作用，避免或控制伤口感染，提供有利于创面愈合的环境。传统的医用敷料就是使用于伤口外的覆盖物，虽然对创面有保护作用，但在阻水透气和阻隔细菌进入等难以满足慢性和复杂伤口的治疗需求。为了提供良好的伤口愈合环境、减少疤痕、并且增进使用者的舒适度，新型医用敷料近年来逐渐取代仅能提供最简单隔离保护作用的传统敷料。另外，随着人口的老龄化和慢性溃疡性伤口的增多，目前也迫切需要开发出新型功能型医用敷料。
随着科学技术的进步，医用敷料研究方面取得了较快的发展，出现了很多结构不同、功能较全面的新型医用敷料。中国发明专利CN201610219873.0公开了一种含有纳米银的医用温敏水凝胶的制备方法及在伤口愈合领域的应用，其由纳米银和壳聚糖组成，但是由于纳米银具有较强的细胞毒性，在杀菌的过程中会损伤正常细胞，且该温敏水凝胶的药物缓释性能差，易造成纳米银的爆释，不利于伤口愈合。
发明人课题组申请的中国发明专利CN201811534121.9，利用明胶上的氨基与甲基丙烯酸酐发生酰化反应合成支链含有碳碳双键的甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)，再借助其支链上的碳碳双键与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)进行自由基共聚，制备了甲基丙烯酸酯化明胶-g-N-异丙基丙烯酰胺(Gel-MA-g-NIPAm)温敏水凝胶，并将铜离子以铜基金属-有机框架 (MOF)纳米粒子形式嵌入Gel-MA-g-NIPAM水凝胶中。小鼠模型全厚层切口愈合试验结果表明：该类铜基MOF纳米粒子实现了铜离子的可控缓慢释放，有效降低了其细胞毒性，促进体外真皮细胞迁移和诱导血管生成，这表明协同稳定释放铜离子的铜基MOF水凝胶是用于治疗慢性伤口有前途的创新敷料。
水凝胶类敷料具有的部分水合结构可连续吸收伤口的渗出物。吸收了渗出物的水凝胶不污染伤口,所以大约在一周内不必更换敷料，但大量吸收渗出物后可因胶体的膨胀而导致敷料与伤口分离,另外细菌可以通过渗透的方式穿过水凝胶基体从而导致创面感染,中国发明专利CN201811534121.9未能很好的解决这一问题，而目前使用的聚合物衬垫如无纺布等也难以满足相应的细菌阻隔要求。此外，中国发明专利CN201811534121.9给出的敷料中铜基MOF纳米粒子含量相对较高，而铜基MOF纳米粒子本身是具有一定细胞毒性的，对创面的治愈不利。
发明内容
本发明为了解决目前水凝胶类敷料对外界细菌阻隔性差的问题，同时最大程度的降低由抗菌剂带来的细胞毒性，优化制备工艺，提供一种可用于组织再生修复的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜及其制备方法。
本发明在中国发明专利CN201811534121.9的基础上，在温敏性水凝胶敷料表面引入了聚酯膜层，通过聚酯膜与水凝胶的偶联作用，一方面解决了通过温敏转变形成水凝胶强度差的问题，使敷料应用更为方便；另一方面，该聚酯膜为无孔透气膜，能够隔绝外界细菌的进入，同时可以允许水汽和空气的渗透，从而为创面提供一个无菌或少菌的愈合环境，并通过与铜基MOF粒子的协同作用，赋予了敷料具有更加优异的抗菌性能，降低了敷料对铜基MOF纳米粒子抗菌性能的依赖，最大程度提升敷料的生物相容性。另外，该聚酯膜在一定程度上也减少了创面水分的流失，提供有利于创面愈合的湿润环境，最终加速创面的愈合，该敷料有望作为新型敷料应用于各类创面的皮肤再生修复。
本发明中的壳聚糖单元的结构式为：
Figure BDA0002748737790000021
本发明壳聚糖粘度为100-200mpa.s，麦克林试剂公司生产。
本发明将铜离子以铜基金属有机骨架(铜基MOF)纳米粒子的形式负载于天然高分子 -g-N-异丙基丙烯酰胺的交联水凝胶中，借助水凝胶基体表面的活性基团(羟基或氨基)与改性隔菌膜表面异氰酸酯基之间的亲核加成反应，制备出铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：
1)铜基MOF纳米粒子的制备：将1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜一水合物分别溶解于乙醇和去离子水中，将两种溶液混合，室温下搅拌反应，形成凝胶状深绿松石悬浮液；离心悬浮液分离颗粒，乙醇溶液洗涤，除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜，将得到的铜基MOF 纳米粒子固体冷冻干燥后，充分研磨，得铜基MOF纳米粒子粉末，密封保存；
2)表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜的制备：将聚酯隔菌膜漂浮氢氧化钠溶液表面，在65～80℃下进行单面酯水解6～8h；所得水解膜用去离子水洗涤，干燥至恒重；所得单面水解隔菌膜的水解面漂浮二异氰酸酯的酯或酮类溶液表面，在70～80℃下进行单面膜羟基与二异氰酸酯之间的亲核加成反应，所得膜采用丙酮洗涤，凉干，得表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜；所述的聚酯隔菌膜为WPD-8C、TWPD-8GE、LSC-1或MB55型聚酯膜；
3)铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备：将天然高分子大单体和N-异丙基丙烯酰胺溶解于乙酸水溶液中，添加光引发剂Irgacure 2959，制备均相溶液；然后加入铜基MOF纳米粒子粉末，搅拌混合均匀得悬浮液；将悬浮液倒入底部铺设有表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜的模具中，通氮气驱氧，紫外线灯辐照；将所得水凝胶功能化抗菌膜粗产物洗涤，冷冻干燥，得铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜；所述的天然高分子大单体为乙烯基壳聚糖衍生物、乙烯基壳聚糖衍生物和甲基丙烯酸酯化明胶中任意一种或多种。
为了进一步实现本发明的目的，优选地，所述的乙烯基壳聚糖衍生物(CS-GMA)通过如下方法合成：将壳聚糖溶解乙酸水溶液中，调节pH值至3～5，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，45～70℃下反应4～10h，产物采用截留分子量为8000～14000的透析袋，使用去离子水透析，冷冻，干燥，得乙烯基壳聚糖衍生物(CS-GMA)；其中，乙酸水溶液的质量百分比浓度为1～2％；NaOH溶液的质量百分比浓度为2～4％；壳聚糖的结构单元与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1：1～6；去离子水透析的时间为3～5d。
优选地，所述的乙烯基壳聚糖衍生物(CS-MA)通过如下方法合成：将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，调节pH值至7～9，加入甲基丙烯酸酐，室温下反应10～24h，产物采用截留分子量为8000～14000的透析袋，使用去离子水透析，冷冻干燥，得乙烯基壳聚糖衍生物 (CS-MA)；其中，乙酸水溶液的质量百分比浓度为1～2％；NaOH溶液的质量百分比浓度为2～4％；壳聚糖的结构单元与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：0.2～2；去离子水透析的时间为 3～5d。
优选地，所述的甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)通过如下方法合成：在50～70℃下将明胶溶解在碳酸盐缓冲溶液中；在搅拌下，加入甲基丙烯酸酐，50～60℃下反应3～5h后，终止反应，将产物转移至可截留分子量为8000～14000的透析袋中，使用去离子水透析，以除去杂质和未反应的单体；冷冻干燥，得甲基丙烯酸酯化明胶；其中，碳酸盐缓冲溶液的 pH为8.5～9，制明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为1：0.05～0.5；磷酸盐缓冲溶液的pH为 7.2～7.4；磷酸盐缓冲溶液为反应液体积的5～8倍；去离子水透析的时间为3～5d。
优选地，步骤1)中，所述的1,3,5-苯三甲酸与乙酸铜一水合物的摩尔比为1：1.0～2.0；乙醇和去离子的体积比为1：1.0～1.5；室温下搅拌反应的时间为10～50min；所述的乙醇溶液洗涤的次数为3～4次，乙醇溶液的质量百分比浓度为30～50％。
优选地，步骤2)中，所述的氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为2～4％；所述的水解膜用去离子水洗涤的洗涤次数为3～4次；所述的干燥至恒重的温度为40～60℃；所述的二异氰酸酯的酯或酮类溶液的质量百分比浓度为2～5％，所述的二异氰酸酯为己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、苯二亚甲基二异氰酸酯和二环己基甲烷二异氰酸酯中的一种，所述的二异氰酸酯的酯或酮类溶液的溶剂为乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、醋酸异丙酯或环己酮或甲基异丁基酮；所述的亲核加成反应的时间为1～3h；所述的丙酮洗涤的次数为3～5次。
优选地，步骤3)中，所述的乙酸水溶液的质量百分比浓度为1～2％；所述的N-异丙基丙烯酰胺与天然高分子大单体质量比为1：1～3；所述的光引发剂Irgacure 2959占天然高分子大单体质量的0.5～5％。
优选地，步骤3)中，所述的铜基MOF纳米粒子粉末在悬浮液中质量百分比浓度为0.01～2％；所述的紫外线的辐照强度为4～10mW/cm2，辐照时间为3～15min；所述的水凝胶功能化抗菌膜粗产物洗涤的次数为3～5次。
一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜，由上述的制备方法制得，该铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜厚度为1mm-2.5mm时，阻菌率达到100％，抑菌率达到95-99％，温敏性为 32.4-38.5℃，拉伸强度达到9.2-10.8MPa，透湿率为694-786g/(m2·24h)，生物相容性为 84-99％。
所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜在伤口贴敷膜中的应用。本发明得到的铜基MOF 水凝胶功能化抗菌膜作为敷料用于创面的治愈，贴敷在受创皮肤表面，主要起到阻隔细菌、透气、抗菌的作用，从而减少创面感染，提升创面愈合速度。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1)水凝胶敷料具有良好的吸液性，可以吸收大量渗出液，防止创面积液和细菌滋生，同时保持创面湿润，可有效减少敷料与创面粘连，减少病人的痛苦，是目前使用中十分广泛的一种敷料。然而，水凝胶敷料一般物理机械性能较差，尤其是通过注射原位凝胶的敷料，极易在吸收大量渗出液过程破碎。本发明在中国发明专利CN201811534121.9的基础上，在温敏性水凝胶敷料表面引入了聚酯膜层，通过聚酯膜与水凝胶的偶联作用，解决了水凝胶敷料吸收大量渗出液过程易破碎的问题，使敷料使用更加方便。
2)水凝胶类敷料在大量吸收渗出物后会因胶体的膨胀而造成敷料与伤口分离，导致细菌的入侵，另外通过渗透的方式细菌也可以穿过水凝胶基体进而感染创面。本发明使用的聚酯膜为无孔透气膜，能够隔绝外界细菌的进入，为创面提供一个无菌或少菌的愈合环境，有效减少了与创面接触细菌的数量，进而降低了对铜基MOF纳米粒子抗菌性的依赖，敷料的生物相容性提升。
3)本发明结合了铜基MOF功能化水凝胶温敏性、抗菌性与隔菌膜阻隔细菌的能力，通过物理化学作用来达到隔菌膜与功能化水凝胶之间的有效粘结，从而实现抗菌膜在具备隔菌抑菌效果的同时，还具有较好的物理机械性能。
4)本发明使用的聚酯膜可以允许水汽和空气的渗透，但在一定程度上也减少了创面水分的流失，防止创面干燥，有利于创面的愈合。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下结合实施方式对本发明作进一步的描述，需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限定。本发明实施例所用的试剂均为从市场购得。
下面实施例中制得的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜厚度为1mm-2.5mm。
实施例中所涉及的测试方法说明如下：
1)阻菌率：依照YY/T0471.5-2017接触性创面敷料阻菌性测定法测定。
2)抑菌率：采用平板菌落计数法用来测定水凝胶及其功能化抗菌膜的抑菌活性。通过酶标仪测量其在600nm的光密度值计算细菌浓度。随后采用逐步稀释的方式将金黄色葡萄球菌(S.aureus)或大肠杆菌(E.coli)母液梯度稀释至2×104CFU/mL，稀释倍数最大不超过10倍。接着吸取200μL细菌悬液，采用涡旋混匀器与不同水凝胶及其功能化抗菌膜充分混匀，置于37℃、转速为220rpm恒温摇床中孵育2h。到达时间后，取10μL上述混合物滴于琼脂平板上进行涂板。将涂好的平板做好标记，倒置在37℃霉菌培养箱培养12h 后，对于琼脂平板上的细菌菌落数进行计数，通过计算得出抑菌率。
3)温敏性：采用德国NETZSCH/耐驰公司STA449 F3差示扫描量热仪(DSC)测定水凝胶及水凝胶功能化抗菌膜相转变温度。
4)拉伸性能：依照GB/T 1040.3-2006标准测试抗菌膜试样的拉伸强度。
5)透湿率：依照ASTM E96-2000(23℃,50％RH)标准测试抗菌膜试样的透湿率。
6)生物相容性测试：采用的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的浸提液来测试对细胞的毒性。将细胞以每孔3×103个细胞的密度接种到48孔板上24小时。之后，将各实施例及实施对比例制备的抗菌膜浸提液与细胞共培养24小时，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)测定法评估抗菌膜对L929细胞的毒性。将没有浸泡过水凝胶的完全培养基培养的细胞作为空白对照组。
本发明利用壳聚糖(CS)大分子链上的羟基与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)上环氧基发生开环反应合成乙烯基壳聚糖衍生物(CS-GMA)，再利用此乙烯基壳聚糖衍生物大分子单体与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)进行光引发自由基接枝共聚，制备壳聚糖-g-N-异丙基丙烯酰胺(CS-GMA-g-NIPAM)交联温敏水凝胶；与此同时，借助紫外线物理作用，促使交联温敏水凝胶基体表面的羟基与改性隔菌膜表面异氰酸酯基之间发生亲核加成反应，制备出铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜。
实施例1
一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将2.00g壳聚糖溶解于150mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，用质量百分比浓度为2％的NaOH溶液调至pH值至3.8，加入3.28mL甲基丙烯酸缩水甘油酯；体系在 60℃恒温水浴中反应6h，产物采用截留分子量为8000～14000的透析袋(上海源叶生物科技有限公司MD1477型普通透析袋)，使用去离子水透析4d，以除去杂质和未反应的单体；然后冷冻干燥，得乙烯基壳聚糖衍生物(CS-GMA)。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约20min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用体积浓度为50％的乙醇溶液洗涤4次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)取4x4cm2的聚酯隔菌膜(TWPD-8GE，佛山金万达公司)漂浮于质量百分比浓度为3％的氢氧化钠溶液表面，在70℃下进行单面酯水解6h；将水解膜用去离子水洗涤3次，在60℃下干燥至恒重。然后将单面水解隔菌膜的水解面漂浮在质量百分比浓度为4％异佛尔酮二异氰酸酯的乙酸正丁酯溶液表面，使其在70℃下进行单面膜羟基与二异氰酸酯之间的亲核加成反应2h，采用丙酮洗涤改性膜5次，凉干即得一种表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜。
(4)将步骤(1)合成得到的100mg CS-GMA和200mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，添加6mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子3mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入底部铺设有步骤(3)制备得到的改性隔菌膜的模具中，通氮气8min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为6mW/cm2，辐照时间为10min；最后，将抗菌膜粗产物用去离子水洗涤 4次，冷冻干燥后得一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜，封装备用。
实施例2
一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将3.0g壳聚糖溶解于200mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，用质量百分比浓度为4％的NaOH溶液调节pH值至8，加入1.38mL甲基丙烯酸酐；体系在室温下反应24h，产物采用截留分子量为8000～14000的透析袋，使用去离子水透析3d，以除去杂质和未反应的单体；然后冷冻干燥得一种乙烯基壳聚糖衍生物(CS-MA)。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约30min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤3 次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)取4x4cm2的聚酯隔菌膜(WPD-8C，佛山金万达公司)漂浮于质量百分比浓度为2％的氢氧化钠溶液表面，在70℃下进行单面酯水解8h；将水解膜用去离子水洗涤4次，在40℃下干燥至恒重。然后将单面水解隔菌膜的水解面漂浮在质量百分比浓度为5％异佛尔酮二异氰酸酯的乙酸正丁酯溶液表面，使其在80℃下进行单面膜羟基与二异氰酸酯之间的亲核加成反应1h，采用丙酮洗涤改性膜3次，凉干即得一种表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜。
(4)将步骤(1)合成得到的100mg CS-MA和200mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，添加6mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子5mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入底部铺设有步骤(3)制备得到的改性隔菌膜的模具中，通氮气10min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为4mW/cm2，辐照时间为12min；最后，将抗菌膜粗产物用去离子水洗涤3 次，冷冻干燥后得一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜，封装备用。
实施例3
一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)在50℃下将3g猪皮明胶溶解在30ml 0.25M碳酸盐缓冲溶液(pH＝9)中；在搅拌下，将0.36mL甲基丙烯酸酐以0.1ml/min的速度逐滴加入明胶碳酸盐缓冲溶液中；体系在60℃恒温水浴中反应3h，加入5倍体积磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2～7.4)以终止反应，并将产物转移至可截留分子量为8000～14000的透析袋中，使用去离子水透析5d，以除去杂质和未反应的单体；然后将甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)溶液冷冻干燥。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约25min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤3 次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜，得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)取4x4cm2的聚酯隔菌膜(MB55，佛山金万达公司)漂浮于质量百分比浓度为4％的氢氧化钠溶液表面，在65℃下进行单面酯水解7h；将水解膜用去离子水洗涤3次，在 60℃下干燥至恒重。然后将单面水解隔菌膜的水解面漂浮在质量百分比浓度为2％己二异氰酸酯的环己酮溶液表面，使其在70℃下进行单面膜羟基与二异氰酸酯之间的亲核加成反应3h，采用丙酮洗涤改性膜3次，凉干即得一种表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜。
(4)将步骤(1)合成得到的100mg Gel-MA和120mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL去离子水中，添加4.4mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子3mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入底部铺设有步骤(3) 制备得到的改性隔菌膜的模具中，通氮气5min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为10mW/cm2，辐照时间为3min；最后，将抗菌膜粗产物用去离子水洗涤5次，冷冻干燥后得一种铜基 MOF水凝胶功能化抗菌膜，封装备用。
实施例4
一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)在50℃下将3g猪皮明胶溶解在30ml 0.25M碳酸盐缓冲溶液(pH＝9)中；在搅拌下，将0.36mL甲基丙烯酸酐以0.1ml/min的速度逐滴加入明胶碳酸盐缓冲溶液中；体系在60℃恒温水浴中反应3h，加入5倍体积磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2～7.4)以终止反应，并将产物转移至可截留分子量为8000～14000的透析袋中，使用去离子水透析3d，以除去杂质和未反应的单体；然后将甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)溶液冷冻干燥。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约25min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤3 次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)取4x4cm2的聚酯隔菌膜(LSC-1，佛山金万达公司)漂浮于质量百分比浓度为4％的氢氧化钠溶液表面，在80℃下进行单面酯水解7h；将水解膜用去离子水洗涤4次，在50℃下干燥至恒重。然后将单面水解隔菌膜的水解面漂浮在质量百分比浓度为2％己二异氰酸酯的环己酮溶液表面，使其在75℃下进行单面膜羟基与二异氰酸酯之间的亲核加成反应 3h，采用丙酮洗涤改性膜3次，凉干即得一种表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜。
(4)将步骤(1)合成得到的100mg Gel-MA和200mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL去离子水中，添加6mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子5mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入底部铺设有步骤(3) 制备得到的改性隔菌膜的模具中，通氮气5min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为10mW/cm2，辐照时间为3min；最后，将抗菌膜粗产物用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后得一种铜基 MOF水凝胶功能化抗菌膜，封装备用。
为了对比添加改性隔菌膜对抗菌膜阻菌抑菌的效果，本发明提供了实施对比例1、实施对比例2和实施对比例3，其分别对应于本发明实施例1、实施例2和对实施例3。实施对比例与实施例的区别在于：其制备过程中不使用改性隔菌膜作为水凝胶隔菌层。
对比例1
(1)将2.00g壳聚糖溶解于150mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，用质量百分比浓度为2％的NaOH溶液调至pH值至3.8，加入3.28mL甲基丙烯酸缩水甘油酯；体系在 60℃恒温水浴中反应6h，产物采用截留分子量为8000～14000的透析袋，使用去离子水透析4d，以除去杂质和未反应的单体；然后冷冻干燥，得乙烯基壳聚糖衍生物(CS-GMA)。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约20min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤4 次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)将步骤(1)合成得到的100mg CS-GMA和200mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，添加6mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子3mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入模具中，通氮气8min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为6mW/cm2，辐照时间为10min；最后，将水凝胶粗产物用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后得一种CS-GMA-g-NIPAM温敏水凝胶，封装备用。
对比例2
(1)将3.0g壳聚糖溶解于200mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，用质量百分比浓度为4％的NaOH溶液调节pH值至8，加入1.38mL甲基丙烯酸酐；体系在室温下反应24h，产物采用截留分子量为8000～14000的透析袋，使用去离子水透析3d，以除去杂质和未反应的单体；然后冷冻干燥得一种乙烯基壳聚糖衍生物(CS-MA)。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约30min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤3 次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)将步骤(1)合成得到的100mg CS-MA和300mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，添加8mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子5mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入模具中，通氮气10min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为4mW/cm2，辐照时间为12min；最后，将水凝胶粗产物用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后得一种CS-MA-g-NIPAM温敏水凝胶，封装备用。
对比例3
(1)在50℃下将3g猪皮明胶溶解在30mL 0.25M碳酸盐缓冲溶液(pH＝9)中；在搅拌下，将0.36mL甲基丙烯酸酐以0.1ml/min的速度逐滴加入明胶碳酸盐缓冲溶液中；体系在60℃恒温水浴中反应3h，加入5倍体积磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.2～7.4)以终止反应，并将产物转移至可截留分子量为8000～14000的透析袋中，使用去离子水透析5d，以除去杂质和未反应的单体；然后将甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)溶液冷冻干燥。
(2)将0.42g(2mmol)1,3,5-苯三甲酸和0.60g(3mmol)乙酸铜一水合物分别溶解于10mL乙醇和去离子水中，然后将两种溶液混合，在室温下以300rpm转速搅拌约25min 以形成凝胶状深绿松石悬浮液；通过离心悬浮液分离颗粒，并使用50％的乙醇溶液洗涤3 次，以除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜。得到的固体冻干，将其充分研磨至粉末，密封保存。
(3)将步骤(1)合成得到的100mg Gel-MA和200mg N-异丙基丙烯酰胺溶解于5mL质量百分比浓度为1％的乙酸水溶液中，添加10mg Irgacure 2959光引发剂，制备均相溶液；然后加入步骤(2)制备得到的铜基MOF纳米粒子10mg，搅拌混合均匀呈悬浮液；将悬浮液倒入模具中，通氮气5min驱氧，UV灯辐照，辐照强度为10mW/cm2，辐照时间为3min；最后，将水凝胶粗产物用去离子水洗涤3次，冷冻干燥，得Gel-MA-g-NIPAM温敏水凝胶，封装备用。
表1各实施例样品性能测试结果
性能 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2 对比例3
阻菌率(％) 100 100 100 100 56 42 27
抑菌率(％) 95 98 98 99 96 98 99
温敏性(℃) 38.5 37.1 32.4 34.6 36.2 34.7 32.3
拉伸强度(MPa) 10.6 10.8 9.2 9.7 — — —
透湿率g/(m<sup>2</sup>·24h) 694 720 752 786 — — —
生物相容性(％) 99 84 96 87 87 83 79
从表1可以看出，本发明的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜阻菌率为100％，而铜基MOF水凝胶的阻菌率小于56％，显示了抗菌膜贴合的隔菌膜优异阻菌性，而且隔菌膜的存在也赋予了抗菌膜较好的物理机械性能。表1中实施例和对比例试样的抑制率均接近于100％，表明水凝胶内铜基MOF纳米粒子的优异抗菌性。而就生物相容性而言，当抗菌膜中铜基MOF的含量达到5mg及以上时，制备的抗菌膜就表现出明显的细胞毒性，对创面的愈合不利。与中国发明专利CN201811534121.9制备的抗菌水凝胶比较，本发明引入了阻隔膜使得MOF的用量降低40％左右也能达到相同的抗菌效果，生物形容性得到明显的提升。此外，相比于明胶而言，壳聚糖结构单元中含有更多的活性基团(氨基或羟基)，导致其所形成的温敏水凝胶交联密度更大，且水凝胶界面活性基团含量较多，这体现在表1中对应的含壳聚糖类水凝胶试样透湿率较低，以及其水凝胶与改性隔菌膜粘接后形成的抗菌膜拉伸强度较大、相转变温度提高。
应用实施例
小鼠创面愈合：35只雄性SPF级SD大鼠(4周龄)，重约80-100g，分为七组，每组 5只大鼠。用5％水合氯醛(400mg/Kg)经腹腔注射麻醉后，背部剃毛并用脱毛膏将其背部的毛发完全去除。用医用酒精棉签消毒后，使用医用打孔器在大鼠背部脊椎左侧造成一个直径为10mm的圆形伤口。第一组大鼠伤口用灭菌后的PBS缓冲液处理，后面六组分别贴敷由实施例1、2、3以及实施对比例1、2、3制备的水凝胶敷料。其中，滴加灭菌的PBS 溶液作为空白对照组。并用医用胶带和纱布固定水凝胶，以免动物互咬伤口或活动时撕扯伤口。然后放入笼中饲养每隔一天来观察伤口愈合情况，并采用数码相机拍摄伤口，用 Imagine J计算伤口像素区域，采用以下公式计算伤口愈合率：
愈合率＝[1-Sn/S0]×100％
式中：S0为初试伤口面积，cm2；Sn为n天后伤口面积，cm2。
表2各实施例处理小鼠创面的愈合率实验结果
Figure BDA0002748737790000121
中国发明专利CN201811534121.9的水凝胶类敷料吸收了大量伤口的渗出物后可因胶体的膨胀而导致敷料与伤口分离，细菌可以通过渗透的方式穿过水凝胶基体从而导致创面感染，且敷料中铜基MOF纳米粒子含量相对较高，而且铜基MOF纳米粒子本身是具有一定细胞毒性的，对创面的治愈不利。从表2可以看出，本发明的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜处理小鼠创面的愈合率在21d后均不小于95％，其中实施例4在处理伤口14d就可达到愈合率95％的指标；而未添加改性隔菌膜的对比实施例水凝胶敷料，其处理小鼠创面21d 的伤口愈合率均不大于85％。这表明隔菌膜贴合的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜更有利于小鼠创面的愈合，此结果应归因于抗菌膜的优异阻菌性和较好的物理机械性能(见表1)。此外，从表2还可看到，各实施例及对比例中，随铜基MOF纳米粒子在水凝胶中的含量增大，伤口的愈合速率加快。表1的测试结果证明本发明制得的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜在生物相容性方面与中国发明专利CN201811534121.9有明显优势；表2证明本发明得到的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜作为敷料用于创面的治愈，贴敷在受创皮肤表面，主要起到阻隔细菌、透气、抗菌的作用，可以明显减少创面感染，提升创面愈合速度，细菌阻隔性能较现有技术优势明显。
本发明的实施方式并不限于此，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1）铜基MOF纳米粒子的制备：将1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜一水合物分别溶解于乙醇和去离子水中，将两种溶液混合，室温下搅拌反应，形成凝胶状深绿松石悬浮液；离心悬浮液分离颗粒，乙醇溶液洗涤，除去残留的1,3,5-苯三甲酸和乙酸铜，将得到的铜基MOF纳米粒子固体冷冻干燥后，充分研磨，得铜基MOF纳米粒子粉末，密封保存；
2）表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜的制备：将聚酯隔菌膜漂浮氢氧化钠溶液表面，在65~80℃下进行单面酯水解6~8h；所得水解膜用去离子水洗涤，干燥至恒重；所得单面水解隔菌膜的水解面漂浮二异氰酸酯的酯或酮类溶液表面，在70~80℃下进行单面膜羟基与二异氰酸酯之间的亲核加成反应，所得膜采用丙酮洗涤，凉干，得表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜；所述的聚酯隔菌膜为WPD-8C、TWPD-8GE、LSC-1或MB55 型聚酯膜；
3）铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备：将天然高分子大单体和N-异丙基丙烯酰胺溶解于乙酸水溶液中，添加光引发剂Irgacure 2959，制备均相溶液；然后加入铜基MOF纳米粒子粉末，搅拌混合均匀得悬浮液；将悬浮液倒入底部铺设有表面含有异氰酸酯基团的改性隔菌膜的模具中，通氮气驱氧，紫外线灯辐照；将所得水凝胶功能化抗菌膜粗产物洗涤，冷冻干燥，得铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜；所述的天然高分子大单体为乙烯基壳聚糖衍生物CS-MA、乙烯基壳聚糖衍生物CS-GMA和甲基丙烯酸酯化明胶中任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，所述的乙烯基壳聚糖衍生物CS-GMA通过如下方法合成：将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，调节pH值至3~5，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，45~70℃下反应4~10h，产物采用截留分子量为8000~14000的透析袋，使用去离子水透析，冷冻，干燥，得乙烯基壳聚糖衍生物CS-GMA；其中，乙酸水溶液的质量百分比浓度为1~2%；调节pH值至3~5所用的NaOH溶液的质量百分比浓度为2~4%；壳聚糖的结构单元与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1：1~6；去离子水透析的时间为3~5d。
3.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，所述的乙烯基壳聚糖衍生物CS-MA通过如下方法合成：将壳聚糖溶解于乙酸水溶液中，调节pH值至7~9，加入甲基丙烯酸酐，室温下反应10~24h，产物采用截留分子量为8000~14000的透析袋，使用去离子水透析，冷冻干燥，得乙烯基壳聚糖衍生物CS-MA；其中，乙酸水溶液的质量百分比浓度为1~2%；调节pH值至7~9所用的NaOH溶液的质量百分比浓度为2~4%；壳聚糖的结构单元与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1：0.2~2；去离子水透析的时间为3~5d。
4.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酸酯化明胶通过如下方法合成：在50~70℃下将明胶溶解在碳酸盐缓冲溶液中；在搅拌下，加入甲基丙烯酸酐，50~60℃下反应3~5h后，终止反应，将产物转移至可截留分子量为8000~14000的透析袋中，使用去离子水透析，以除去杂质和未反应的单体；冷冻干燥，得甲基丙烯酸酯化明胶；其中，碳酸盐缓冲溶液的pH为 8.5~9，明胶与甲基丙烯酸酐的质量比为1：0.05~0.5；终止反应所用的磷酸盐缓冲溶液的pH为 7.2~7.4；磷酸盐缓冲溶液为反应液体积的5~8倍；去离子水透析的时间为3~5d。
5.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的1,3,5-苯三甲酸与乙酸铜一水合物的摩尔比为1：1.0~2.0；乙醇和去离子的体积比为1：1.0~1.5；室温下搅拌反应的时间为10~50min；所述的乙醇溶液洗涤的次数为3~4次，乙醇溶液的质量百分比浓度为30~50 %。
6.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为2~4%；所述的水解膜用去离子水洗涤的洗涤次数为3~4次；所述的干燥至恒重的温度为40~60℃；所述的二异氰酸酯的酯或酮类溶液的质量百分比浓度为2~5%，所述的二异氰酸酯为己二异氰酸酯、异佛尔酮二异氰酸酯、苯二亚甲基二异氰酸酯和二环己基甲烷二异氰酸酯中的一种，所述的二异氰酸酯的酯或酮类溶液的溶剂为乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、醋酸异丙酯或环己酮或甲基异丁基酮；所述的亲核加成反应的时间为1~3h；所述的丙酮洗涤的次数为3~5次。
7.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的乙酸水溶液的质量百分比浓度为1~2%；所述的N-异丙基丙烯酰胺与天然高分子大单体质量比为1：1~3；所述的光引发剂Irgacure 2959占天然高分子大单体质量的0.5~5%。
8.根据权利要求1所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的铜基MOF纳米粒子粉末在悬浮液中质量百分比浓度为0.01~2%；所述的紫外线的辐照强度为4~10mW/cm2，辐照时间为3~15min；所述的水凝胶功能化抗菌膜粗产物洗涤的次数为3~5次。
9.一种铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜，其特征在于其由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得，该铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜厚度为1mm-2.5mm时，阻菌率达到100%，抑菌率达到95-99%，温敏性为32.4-38.5℃，拉伸强度达到9.2-10.8 MPa，透湿率为694-786 g/(m2·24h)，生物相容性为84-99%。
10.权利要求9所述的铜基MOF水凝胶功能化抗菌膜在伤口贴敷膜制备中的应用。
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