CN112219787B - 一种急性热应激动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents
一种急性热应激动物模型及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种急性热应激动物模型及其构建方法和应用，通过将动物在36～42℃的温度下饲养12h～18h作为造模期，然后在18～20℃的温度下饲养5～7d这一构建方法得到该动物模型。本发明所提出的急性热应激动物模型具有稳定，成本低，操作简单等优点，填补了急性热应激动物模型缺失的空白，为抗热应激药物的研制和急性热应激的科研探究提供了良好的工具。
Description
技术领域
本发明属于动物模型领域，具体涉及一种急性热应激动物模型及其构建方法和应用。
背景技术
研究表明，适用于大多数家禽的环境温度范围为18至20℃，超过此范围，家禽便会产生热应激，而无论是急性的还是慢性的，热应激都会严重阻碍家禽的生长；热应激会降低家禽的生产性能和免疫功能，从而导致鸡的免疫器官失重，对外来抗原的抗性被削弱，特别是在长期热应激的情况下，免疫器官会引起不可逆转的损害和其他并发症，从而更容易加重疾病甚至致死。
目前，对于家禽的热应激的研究还不够深入，而且主要是慢性热应激的报道居多，这主要是因为缺乏动物模型方面的研究，也影响了抗热应激药物的研发工作；此外，动物模型中，由于动物自身免疫能力是会不断变化的，因此，在用药后判断究竟是动物自身免疫能力的作用还是药物的作用是动物模型的关键，因此，提出一种良好的急性热应激动物模型十分有意义。
发明内容
本发明的目的在于解决上述的技术问题，具体通过以下技术方案实现：
一种急性热应激动物模型的构建方法，包括以下步骤：将动物在36～42℃的温度下饲养12h～18h作为造模期，然后在18～20℃的温度下饲养5～7d。
发明人发现动物在高温度环境下产生热应激，动物脾脏中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量会产生较大的起伏变化，在其初始阶段，动物的免疫能力反而会增强到一个顶峰，因此，发明人根据不断的实验，发现12～18h作为热应激期，然后在正常温度下饲料7～9d后，动物的免疫功能会降低最低，在此期间的前2d(即5～7d)使用抗应激药物，可以避免动物自身免疫能力的干扰，从而对抗应激药物的药效有一个客观评价，也能最大区分开各种药物之间药效的作用程度的客观差距。
优选地，在造模期之前，将动物预先喂养12h，自由饮水和进食。
优选地，所述动物为鸡、鸭、鹅中的一种。
优选地，所述动物为鸡，其体重为2～3kg。
本发明根据上述的构建方法得到的一种急性热应激动物模型，在评价抗热应激药物效果领域中有着较大应用前景，具体应用过程包括以下步骤：将动物分成两组，分别喂食正常饲料和添加有抗热应激药物的饲料，饲养4～5d，然后将动物处死，收集脾脏和肝脏，测定脾脏和肝脏的器官指数，并测定脾脏中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量。
优选地，测定脾脏中的HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量的具体过程为：提取脾脏的蛋白质，变性后进行电泳，然后将蛋白条带印迹到转印膜上，将其浸入至封闭溶液中；以β-肌动蛋白作为内部对照，针对HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的一抗进行免疫印迹，然后用缓冲溶液洗涤后与HRP标记兔抗小鼠IgG抗体一起温育1h，然后使用发光试剂盒进行显色，最后采用ImageJ软件得出HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
优选地，所述转印膜为聚偏二氟乙烯膜。
优选地，所使用的电泳凝胶为10％或15％的SDS-PAGE。
本发明的有益效果为：本发明所提出的急性热应激动物模型具有稳定，成本低，操作简单等优点，填补了急性热应激动物模型缺失的空白，为抗热应激药物的研制和急性热应激的科研探究提供了良好的工具。
附图说明
图1为实施例1中HSP70在41℃的条件下不同时长的蛋白表达量；
图2为实施例1中IFN-α，IFN-β和IL-1β在41℃的条件下不同时长的蛋白表达量；
图3为实施例2中脾脏和肝脏在41℃的条件下12h后不同恢复时间下的器官指数变化图；
图4为实施例2中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β在41℃的条件下12h后不同恢复时长的蛋白表达量。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：
一种急性热应激动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：从种鸡场购买重量为2～3kg的麻鸡，将麻鸡放在温度可控(18～20℃)的圈舍内饲养12h，期间自由饮水和喂食；
步骤二：将麻鸡随机分为9组，每组5只，分在41℃的条件下饲养0h，6h，12h，18h，24h，30h，36h，42h，48h；然后处死，收集脾脏，并测定脾脏中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
其中，测定脾脏中的HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量的具体过程为：提取脾脏的蛋白质(总蛋白质浓度由Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定)，用5x上样缓冲溶液变性，然后进行10％或15％SDS-PAGE，然后将蛋白条带印迹到聚偏二氟乙烯膜上，将其浸入至封闭溶液(TBST中3％BSA)中；以β-肌动蛋白作为内部对照，在室温下针对HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的一抗进行免疫印迹，然后用缓冲溶液TBST洗涤膜后与HRP标记兔抗小鼠IgG抗体一起温育1h，然后使用ECL发光试剂盒进行显色，最后采用ImageJ软件得出HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
图1为HSP70在41℃的条件下不同时长的蛋白表达量，由图1可知，经过6h，12h，18h，24h，30h，36h，42h和48h的41℃热刺激下，HSP70的蛋白表达量相比0h均显著上升(研究表明，高水平的HSP70有助于抵抗压力和整体的恢复)；图2为实施例1中IFN-α，IFN-β和IL-1β在41℃的条件下不同时长的蛋白表达量，其中，A、B、C分别为IL-1β，IFN-α，IFN-β在41℃的条件下不同时长的蛋白表达量，有图2可知，相比于0h组，IL-1β在6h处降低，在12～18h升高，在36～48h降低；IFN-α在6～18h显著增加，在30～48h显著降低；IFN-β在6～42h显著增加，在48h后降低；IFN-α，IFN-β和IL-1β代表着动物的免疫能力，以上结果表明，在41℃的热刺激下，动物的免疫能力明显发生了变化，其整体是先升高，然后下降，基本上在12h处时处于免疫能力最强的时候。同时对于不同家禽类动物会有些许差异，但基本在12～18h之间。
实施例2：
一种急性热应激动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：从种鸡场购买重量为2～3kg的麻鸡，将麻鸡放在温度可控(18～20℃)的圈舍内饲养12h，期间自由饮水和喂食；
步骤二：将麻鸡随机分为7组，每组6只，分在41℃的条件下饲养12h，然后在20℃左右的条件下，每组分别正常饲养1d，3d，5d，7d，9d，11d，13d；然后处死，收集脾脏，并测定脾脏中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
其中，测定脾脏中的HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量的具体过程为：提取脾脏的蛋白质(总蛋白质浓度由Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定)，用5x上样缓冲溶液变性，然后进行10％或15％SDS-PAGE，然后将蛋白条带印迹到聚偏二氟乙烯膜上，将其浸入至封闭溶液(TBST中3％BSA)中；以β-肌动蛋白作为内部对照，在室温下针对HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的一抗进行免疫印迹，然后用缓冲溶液TBST洗涤膜后与HRP标记兔抗小鼠IgG抗体一起温育1h，然后使用ECL发光试剂盒进行显色，最后采用ImageJ软件得出HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
脾脏和肝脏器官指数的测定方法：用PBS冲洗脾脏和肝脏后，干燥，称重获得湿重；然后将脾脏和肝脏放入80℃的烤箱中干燥72h，再次称重获得干重；然后根据干重与湿重的比值计算得出器官指数。
图3为脾脏和肝脏在41℃的条件下12h后不同恢复时间下的器官指数变化图，其中，A为脾脏的器官指数的变化图，B为肝脏的器官指数的变化图；由图3可知，脾脏在41℃的条件下12h后的1d先升高，在5d和7d降低，然后恢复正常水平；肝脏在7d后显著下降，然后在11d和13d后升高；这说明41℃的条件下12h后，在5～7d恢复时间后，麻鸡的免疫能力是最低的。
图4为HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β在41℃的条件下12h后不同恢复时长的蛋白表达量，其中，A为HSP70在41℃的条件下12h后不同恢复时长的蛋白表达量，B为IL-1β在41℃的条件下12h后不同恢复时长的蛋白表达量，C为IFN-α在41℃的条件下12h后不同恢复时长的蛋白表达量，D为IFN-β在41℃的条件下12h后不同恢复时长的蛋白表达量；由图4可知，41℃的条件下12h后3d～7d仍具有较高的HSP70蛋白表达，但是IL-1β在1d～13d显著增加，IFN-α在1d～13d显著降低，IFN-β在1d～5d增加，然后7d～13d显著降低，其最低表达在7d。
因此，通过实施例1和实施例2的数据表明，本发明所提出的造模方法得到的动物模型，其属于免疫能力最低的易感动物模型，使用本发明的动物模型进行抗热应激药物的药效评价是合适的。
实施例3：
急性热应激动物模型用于评价抗热应激药物(延胡索酸和酵母铬均常用来作为抗热应激药物)的药效的方法，包括以下步骤：
急性热应激动物模型的构建：从种鸡场购买重量为2～3kg的麻鸡，将麻鸡放在温度可控(18～20℃)的圈舍内饲养12h，期间自由饮水和喂食；将麻鸡放置在41℃的条件下饲养12h，然后在20℃左右的条件下正常饲养5d；
抗热应激药物的药效评价：随机将麻鸡分为三组，每组5只，正常喂养2d，其中，第一组喂食常规饲料，第二组喂食常规饲料混合延胡索酸(0.1％)，第三组喂食常规饲料混合酵母铬(0.1％)；然后处死，收集脾脏和肝脏，测定脾脏和肝脏的器官指数，并测定脾脏中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
根据检测结果，发现在41℃的条件下饲养12h后的第7d，添加延胡索酸的第二组的麻鸡相比于第一组和第三组，其免疫能力显然更强，第三组次之，第一组最差。
Claims (5)
1.一种急性热应激动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将动物在41℃的温度下饲养12h作为造模期，然后在18~20℃的温度下饲养5~7d；
在造模期之前，将动物预先喂养12h，自由饮水和进食；
所述动物为鸡，其体重为2~3kg；
所述构建方法制得的急性热应激动物模型，属于免疫能力低的易感动物模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述急性热应激动物模型在评价抗热应激药物效果领域中的应用，包括以下步骤：将模型动物分成两组，分别喂食正常饲料和添加有抗热应激药物的饲料，饲养4~5d，然后将模型动物处死，收集脾脏和肝脏，测定脾脏和肝脏的器官指数，并测定脾脏中HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述测定脾脏中的HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白表达量的具体过程为：提取脾脏的蛋白质，变性后进行电泳，然后将蛋白条带印迹到转印膜上，将其浸入至封闭溶液中；以β-肌动蛋白作为内部对照，针对HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的一抗进行免疫印迹，然后用缓冲溶液洗涤后与HRP标记兔抗小鼠IgG抗体一起温育1h，然后使用发光试剂盒进行显色，最后采用ImageJ软件得出HSP70，IFN-α，IFN-β和IL-1β的蛋白质表达量。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述转印膜为聚偏二氟乙烯膜。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所使用的电泳凝胶为10%或15%的SDS-PAGE。
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