CN112218627B - 前药及其在医学上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为靶向肿瘤的细胞毒性剂的含氮芥取代的哌嗪甲酰胺及其相应的药学上可接受的盐，及其单独使用或与其它癌症疗法联合使用的方法。

Description

前药及其在医学上的应用
技术领域
本发明涉及作为靶向肿瘤的细胞毒性剂的含氮芥取代的哌嗪甲酰胺及其相应的药学上可接受的盐，及其单独使用或与其他癌症疗法联用的方法。
背景技术
肿瘤选择性前药的使用(即，可通过细胞代谢和/或在肿瘤微环境中被选择性转化为治疗活性化合物的无治疗活性化合物)是一种在针对呈现癌症特异性(如缺氧)的靶向细胞的癌症治疗中已经应用的方法。特别是，仅在低氧肿瘤区室中成为细胞毒性剂的低氧激活的前药(HAPs)被认为是有希望的抗肿瘤药物，特别是在不良预后、药物组合和/或对标准护理治疗产生耐药性的情况下(Hunter F等,2016；Mistry IN等,2017；Phillips R,2016；Silva VL and Al-Jamal WT,2017)。
由于血管网发育不良，大多数肿瘤，特别是高度侵袭性和/或耐药性的实体肿瘤，呈现或多或少的广泛缺氧区域。具有烷基化基团的HAPs，如氮芥，被设计成通过在缺氧区域内诱导DNA的损伤来选择性地消除缺氧肿瘤中的癌细胞，将它们的细胞毒性活性扩展到由于激活(旁观者效应)时的再分布区域(而在正常组织中只有最小的毒性)之外。
在HAPs中，诸如氮芥及其化学衍生物已经在临床前模型中进行了测试(WO2009140553；WO2014031012；Baran N and Konopleva M,2017)。然而，尚未证实这些化合物在癌症患者或癌症动物模型中的临床功效，至少作为潜在的广谱细胞毒性剂和/或在特定类型的肿瘤中的治疗有用性尚未得到证实。由于对肿瘤缺氧和HAPs的药理学的不完全理解和评估，这些研究可能已经失败。事实上，HAPs的治疗特性实际上取决于它们自身的物理化学特性和肿瘤特异性特性，这些特性使癌细胞对细胞毒性剂本质上敏感(或不敏感)。此外，所述HAPs可能呈现不利的药物特征，如水溶性差、最大耐受剂量低、旁观者效应低、人体需氧还原酶的非机制激活和/或不可口服生物利用。
因此，在氮芥中，那些至少在特定癌症如乳腺癌、肺癌和胰腺癌中表现出合适的药物和治疗特性的氮芥是有价值和有用的，特别是当这些特性适用于特定的癌症亚型和/或改善护理标准治疗时。
发明内容
在一些方面，本发明提供了用于治疗癌症的组合物和方法，包括涉及抗癌药物和免疫疗法的联合疗法和方案，还包括使用含氮芥取代的哌嗪甲酰胺，特别是对称或不对称的含卤代烷磺酸盐的氮芥(haloalkanesulfonates mustards)(或简单的卤代烷磺酸盐氮芥，如下文所示)。具体而言，本发明涉及如下定义的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体，用于在有需要的患者中治疗乳腺癌、胰腺癌或肺癌的方法中。除非另有说明，否则本发明涉及治疗患有乳腺癌、胰腺癌或肺癌的患者的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效剂量的本发明化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体。
所述方法优选适用于体内存在一种或多种癌症(乳腺癌、胰腺癌、肺癌及其转移性的癌症，或其他类型的癌症，如胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤)的患者中，其特征在于具有可检测或以其他方式可检测的低氧区，所述低氧区对施用卤代烷磺酸盐氮芥和/或其代谢物敏感，卤代烷磺酸盐氮芥和/或其代谢物中一个或多个基团在体内缺氧或常氧条件下被修饰，或可通过化学合成获得。在治疗患者之前、期间和之后，可以通过使用非侵入性技术(例如磁共振或放射学)或通过需要分析从患者获得的生物样品的技术(例如肿瘤活检或血液分析)来确定相关的癌症特异性低氧状态，以便通过这些样品中的特定基因表达标准(例如基因标志物)来关联或预测癌症特异性低氧状态。
在一些方面，本发明中治疗癌症的组合物和方法中的对称或不对称卤代烷磺酸盐氮芥及其盐、溶剂化物或立体异构体具有由式(I)定义的结构：
及其盐、溶剂化物或立体异构体，其中：
W表示Cl，Br，I，OSO2R3；
X表示Cl，Br，I，OSO2R3；和
R1、R2和R3各自独立地表示氢或C1-6的烷基。
本发明的方法和组合物中使用优选式(I)的化合物，优选的化合物是其中R1、R2和R3中的至少一个(但优选为全部)表示C1-6烷基的化合物，更优选其中W是Br或I，X是OSO2Me或Br。此外，R2优选是甲基或乙基，R1是甲基、乙基、丙基或异丙基。例如，优选的式(I)化合物是2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲基磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11，或Cpd.11)。可以将优选的式(I)化合物定义和分组为在R1和R2的每一个中呈现特定组合的不对称或对称的带有卤代烷磺酸盐氮芥。
本发明的方法和组合物中使用药学上可接受的盐形式的式(I)化合物，优选的化合物是例如甲磺酸盐。例如，式(I)化合物优选的药学上可接受的盐是2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11Ms或Cpd.11Ms)的甲磺酸盐。
式(I)化合物可以是生物活性的和/或在替代式(II)下提供的：
其中W、X、R1、R2和R3具有与式(I)相同的一般和优选定义，并且Z可以是NHOH(羟胺)或NH2(胺)。优选的式(I)化合物是2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11)的代谢物或衍生物，其中Z是NHOH(在化合物11c中，或Cpd.11c中)或NH2(在化合物11d中，或Cpd.11d中)。这种优选化合物的新陈代谢可以产生这样的化合物，其中W或X是氯，(或W和X都是氯)，并且可以与特定的细胞成分(如核酸，特别是染色体DNA)反应，从而形成细胞毒性DNA加合物。
一般而言，式(I)(或式(II))化合物对人癌细胞(包括存在于癌症缺氧区的细胞)产生缺氧依赖性细胞毒性。这种细胞毒性可以在从乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌和软组织肉瘤中发现、分离或选择的癌细胞中进行评估。这种癌细胞可以来源于来自活检组织、肿瘤球体或已建立的癌细胞系的原发性癌细胞，所述已建立的癌细胞系可以在体外或离体进行测试(例如作为小鼠癌症模型中的异种移植物)。鉴于本发明中提供的式(I)(或式(II))化合物的实验特征，可以将所述化合物施用给具有低氧肿瘤细胞的受试者，所述低氧肿瘤细胞是使用合适的体内或体外技术建立的，例如使用特定的标记物、示踪剂和/或源自肺、胰腺或乳腺的癌细胞。
本发明的方法和组合物中的式(I)(或式(II))化合物可以根据与在低氧条件下测定的生物活性相关的标准，与在常氧条件下观察到的(或不依赖于氧的存在)标准相比或不同而进一步定义。例如，这样的标准可以是低氧细胞毒性比(HCR)，其可以在体外使用肿瘤活检或癌细胞系来测量(例如在选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、胃肠癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞和/或软组织肉瘤细胞的人类癌细胞中，特别是当呈现低氧区域时，如上所述)，并且包含在一个范围内(例如在2-250、5-250之间，或者任何中间范围，例如5-150或者4-190)。
优选地，本发明的组合物和方法中使用的式(I)化合物(或式(II)化合物)用于治疗、改善或预防乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤，特别是当存在缺氧区域时。这种癌症的特定亚型或变异体可以通过临床标准或生物学相关标准(例如特定的形态学、起源、阶段、耐药性、复发、先前的治疗、转移特性、上皮-间质转化、免疫逃逸、癌症复发和/或癌症特异性分子标记)来另外定义。本发明可被治疗的这些癌症的亚型是小细胞肺癌或非小细胞肺癌(对于肺癌)、三阴性乳腺肿瘤(对于乳腺癌)或胰腺癌(对于胰腺癌)，以及在具体实施方式和以下实施方式中列出的其他癌症。
受任何此类癌症影响的受试者在使用式(I)化合物(或式(II)化合物)及相关组合物和方法进行治疗之前，可能已接受(或未接受)标准护理方案(如放疗、化疗和/或免疫疗法)的治疗。此类治疗可旨在避免(或预防)耐药性(包括降低或缺乏上述标护理准治疗的功效)、癌症复发或复发、免疫逃逸(癌细胞对免疫排斥的抗性)或转移，并可针对癌细胞生长、肿瘤消退或允许定义适当的进一步治疗或临床方案的其他临床相关标准进行评估，仍包括(或不包括)式(I)化合物(或式(II)化合物)。
涉及使用式(I)化合物(或式(II)化合物)或相关药学上可接受的盐的药物组合物和方法可以通过配制这种化合物(采用/不采用药学上可接受的赋形剂、佐剂、载体、缓冲剂、稀释剂或稳定剂)来建立，特别是用于胃肠外给药(更优选用于皮下或静脉给药)、肿瘤内给药、经动脉栓塞给药或口服给药。这种组合物施用给待癌症(特别是肺癌、胰腺癌或乳腺癌)治疗的受试者，优选剂量为40-4000mg/m2或更高，最高达4000-10,000mg/m2(或者定义为1-100mg/kg或更高，最高达100mg/kg-250mg/kg)。所述化合物或药物组合物可以每月一天给药，或者每月以2、3、4或5个连续(或非连续)天或每个周期(超过2、3或4周)每天给药的频率进行给药。所述方案可持续一个月或多个月，例如长达12个月，包括或不包括其他抗肿瘤疗法的进一步给药，特别是标准护理方案(如放疗、化疗和/或免疫疗法)。
本发明的另一个客体是式(I)(或式(II))的化合物或相关的药学上可接受的盐、组合物或与另一种治疗剂或疗法(特别是用于治疗乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌和/或软组织肉瘤(以及这类癌症的任何特定亚型变体)的治疗剂或疗法)制成的制剂的用途。这些药剂和疗法选自放射疗法、化学疗法、免疫疗法和/或涉及药剂使用的任何其他方法，所述药剂的使用调节与癌症相关的一种或多种生物靶标，特别是乳腺癌、肺癌、胰腺癌或上面列出的其他类型或亚型的癌症，特别是当存在缺氧区域时。这些组合对于改善癌症治疗(如肿瘤消退、延长生存期、减少或没有转移等)和/或改善其他药剂或疗法的效果(例如减少剂量、限制副作用、更宽的治疗窗、降低药物特异性抗性等可能特别有用。这些组合可以以组合物和方案的形式提供，所述组合用于同时、交替或顺序施用式(I)(或式(II))和其他药剂或疗法结合的化合物。
本发明进一步的实施方式涉及式(I)或式(II)化合物在治疗癌症(一般或特定癌症亚型)的组合物和方法中的用途，优选的式(I)或式(II)化合物，所述化合物和相关制剂的制备，特定剂量和方案，以及与其他药剂或疗法的特定组合，将在具体实施方式和下述实施例中进行说明。
附图说明
图1：本发明可以使用式I的对称或非对称卤代烷磺酸盐氮芥。本发明提供了式(I)的特定的对称或非对称的含卤代烷磺酸盐氮芥的结构Cpd.8-Cpd.19(A)。参考式I的不对称卤代烷磺酸盐氮芥(命名为Cpd.11Ms(B))的合成方法包括WO2014031012中描述的初始步骤，从用亚磺酸钠处理的3,4-二氟苯甲醛(化合物1)开始，获得相应的烷基砜(化合物2)，随后氧化得到相应的苯甲酸(化合物3)。经典硝化得到化合物4，所述化合物4转化为相应的酰氯(化合物5)，并进一步与1-乙基哌嗪反应得到中间体酰胺(化合物6)。与溴化锂和氮丙啶乙醇反应得到化合物7，然后用甲磺酸酐官能化得到2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-l-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯，其被称为化合物11(Cpd.11)。用甲磺酸成盐得到化合物11Ms(Cpd.11Ms；4-(5-((2-溴乙基)(2-((甲磺酰基)氧基)乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基)-1-乙基哌嗪-1-甲磺酸盐)。式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥可在体内被人类酶代谢成一系列细胞毒性化合物，如化合物11，其在肿瘤环境中存在的缺氧条件下被修饰成中间体化合物11a(Cpd.11a)，然后被修饰成化合物11b(Cpd.11b)，然后通过氧独立机制(C)被修饰成细胞毒性化合物11c(Cpd.11c)和11d(Cpd.11d)。由于生理盐的存在，这些代谢物可在体内进一步被修饰，从而使溴和/或OMs基团被氯原子取代，生成一氯化或二氯化衍生物。
图2：特定的Cpd.11c和Cpd.11d代谢物的合成及其氘代变体。参考式I的不对称卤代烷磺酸盐氮芥(命名为Cpd.11Ms(图1B))的合成方法可适用于产生氘化形式Cpd.11Ms-d8，其中哌嗪环中的8个氢原子全部被氘化，通过在由化合物5产生化合物6的反应中用相应的氘化形式取代1-乙基哌嗪，所有后续反应保持相同(A)。原始的甲磺酸盐(Cpd.11Ms)和氘化的甲磺酸盐(Cpd.11Ms-d8)可以被还原以产生代谢物Cpd.11c和Cpd.11d，或者它们相应的氘化形式Cpd.11c-d8和Cpd.11d-d8(B-E)。
图3：在一组人类癌细胞系中，在常氧和缺氧条件下Cpd.11Ms和代谢物的细胞毒性。在常氧(NRX)或缺氧(ANX)条件下，五种表示各相关癌症类型的细胞系暴露于Cpd.11Ms(4h药物暴露)，并使用基于体外ATP的效价测定计算相关IC50和HCR值，以表征Cpd.11Ms(A)的缺氧特异性细胞毒性。使用同一组细胞系计算Cpd.11c和Cpd.11d代谢物(B)的形成率。一组从肺癌(A-427，A459，NCI-460，NCI-H1975)，胰腺癌(Hs 766T，BxPC-3，Capan-1)和乳腺癌(MDA-MB-453，SK-BR-3，EFM-19，Hs578t)中分离的人细胞系已暴露于Cpd.11c和Cpd.11d代谢物的合成型式中，它们在正常氧条件下(C)也表现出细胞毒性。在常氧条件下，无药物对照孔中的平均电镀效率为43％，在缺氧条件下为30％。
图4：Cpd.11Ms在三阴性乳腺癌异种移植模型中的疗效，所述模型是用MDA-MB-436乳腺癌细胞系建立的。在没有较大提供损失的情况下观察到Cpd.11Ms(腹膜内给药)对肿瘤大小(A)和动物存活率(B；以TVx4表示)的强烈影响。
图5：Cpd.11Ms在使用NCI-H69肺癌细胞系建立的肺癌异种移植模型中的功效。如图2所示，在没有较大体重损失(C)的情况下观察到Cpd.11Ms(腹膜内给药)对肿瘤大小(A)和动物存活率(B；以TVx4表示)的强烈影响。
图6：Cpd.11Ms在使用PANC-1胰腺癌细胞系建立的胰腺癌异种移植模型中的功效。在没有较大体重损失(C)的情况下观察了Cpd.11Ms(腹膜内给药)对肿瘤大小(A)和动物存活率(B；以TVx4表示)的影响。
图7：Cpd.11Ms的功效以及癌症缺氧状态与Cpd.11Ms的生物活性之间的关系，这些活性与癌细胞特异性细胞毒性相关。本发明使用了哌莫硝唑(PIMO+)染色评估了从人癌细胞系产生的一组肿瘤异种移植物中的低氧部分。两个胰腺肿瘤异种移植模型未显示缺氧区域(A)。Cpd.11Ms在人肺癌模型DMS114(B)中的抗肿瘤效果已经建立，并且通过pH2AX染色评估的DNA损伤主要在相应的肿瘤异种移植物(C)中通过哌莫硝唑染色评估的缺氧区域中检测到。尽管这些细胞系在使用体外细胞培养模型建立的缺氧条件下对Cpd.11Ms高度敏感，Cpd.11Ms的这种抗肿瘤作用并未在未检测到缺氧的胰腺癌模型MIApaA-2(D)和SW1990(E)异种移植物中观察到。D0在DMS114模型中为肿瘤接种后28天，在SW1990模型中为14天，在MiaPaCa-2模型中为16天。
具体实施方式
在本发明的方法和组合物中使用的式(I)或式(II)定义的化合物中，优选的化合物是在定义为W、X、R1、R2、R3和Z的位置上具有取代基的特定组合的化合物，及其相关的盐、溶剂化物或立体异构体。这些化合物被定义为在选定类型的癌症中具有治疗活性，如使用相关基于细胞的动物模型的实施方式中所示，当暴露于示例性式(I)化合物时，这些癌症尤其敏感并消退(regress)。这些证据支持本发明的化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体在治疗患有乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤以及在临床和/或分子水平上定义的特定亚型(特别是关于存在低氧区的)的患者中的用途。
本发明的这些治疗方法包括施用有效剂量的式(I)或式(II)化合物，并且还可以包括预先、同时、交替、顺序施用另一种治疗活性化合物，特别是用于治疗癌症，包括放射疗法、化学疗法、免疫疗法或涉及施用调节癌症相关靶标的化合物的任何疗法。联合疗法可包括可以提供进一步的补充治疗效果的疗法或药剂，特别是在不依赖于缺氧的乳腺癌、肺癌和/或胰腺癌中。
如本文所用，术语“处理(treat)”、“治疗(treating)”或“疗法(treatment)”包括缓解、减轻或改善疾病或病症的至少一种症状，预防额外的症状，防止病症的发展，抑制疾病或状况(condition)，例如，阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，导致疾病或病症的消退，缓解由疾病或病症引起的状况，或停止疾病或病症的症状。在一个实施方式中，所述治疗是预防性治疗。在一个实施方式中，所述治疗指的是治疗性治疗。在任一所述实施方式中，根据任何优选的、符合临床的剂量或方案，所述治疗可以单独或与护理标准治疗相结合来提供疾病或状况的改善。
在本发明使用的式(I)化合物中，R1和/或R2表示优选的化合物在R1和/或R2的取代位上具有C1-6烷基。在本发明使用的这些优选的式(I)化合物中，以不对称卤代烷磺酸盐氮芥形式提供的那些化合物在R3具有C1-6烷基。
如本文所用，定义R1、R2和R3基团的“C1-6烷基”是指包含1-6个碳原子的脂族烃基。提及的C1-6烷基包括“饱和C1-6烷基”和/或“不饱和C1-6烷基”。C1-6烷基的定义，无论是饱和的还是不饱和的，包括支链、直链或环状基团。仅作为例子，C1-6烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
在本发明的用于治疗癌症的组合物和方法中的式(I)所定义的那些化合物中，优选的化合物可以被定义和分组为在R1和R2的每一个中呈现相同的C1-6烷基，其中R2优选是甲基或乙基，R1是甲基、乙基、丙基或异丙基。这些优选的化合物可以以对称或不对称(含卤代烷磺酸盐)的卤代烷磺酸盐氮芥形式提供。在前一种情况下，W和X都表示Cl、Br或I(优选W和X都是Br)。在后一种情况下，W表示Cl、Br或I，(优选W是溴)，R3表示C1-6烷基(优选表示甲基)，R3表示C1-6烷基(优选表示甲基)。
根据所述优选实施方式，式(I)的优选化合物选自不对称或对称的带有卤代烷磺酸盐氮芥，在R1和R2的每一个中具有下列组合(见图1A)：
(a)当R1和R2都是甲基时，所述化合物是5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(化合物8)或2-((2-溴乙基)(5-(4-甲基哌嗪-l-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物9)；
(b)当R1是乙基而R2是甲基时，所述化合物是5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物10)或2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11)；
(c)当R1是异丙基，R2是甲基时，所述化合物是(5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-(2-硝基苯基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物12)，或2-((2-溴乙基)(5-(4-异丙基哌嗪-l-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物13)；
(d)当R1是甲基，R2是乙基时，所述化合物是5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(乙基磺酰基)(2-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(化合物14)，或2-((2-溴乙基)(2-(乙基磺酰基)-5-(4-甲基哌嗪-l-羰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物15)；
(e)当R1和R2都是乙基时，化合物是5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(乙基磺酰基)-(2-硝基苯基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物16)，或2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-l-羰基)-2-(乙基磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物17)；或者
(f)当R1是异丙基而R2是乙基时，所述化合物是5-(双(2-溴乙基)氨基)4(乙基磺酰基)-(2-硝基苯基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物18)，或2-((2-溴乙基)(2-(乙基磺酰基)-5-(4-异丙基哌嗪-1-羰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物19)。
可选的，在本发明的用于治疗癌症的组合物和方法中的式(I)所定义的那些化合物中，优选的化合物可以被定义和分组为具有交替的R1和R2取代基的对称或不对称的卤代烷磺酸盐氮芥。在前一种情况下，W和X都表示Cl、Br或I，(优选W和X都是Br)，优选至少R1和R2中的一个(但更优选R1和R2都)表示C1-6烷基。
在对称卤代烷磺酸盐氮芥的另一个优选实施方式中，R2优选是甲基或乙基，R1是甲基、乙基、丙基或异丙基。在后一种情况下，W表示Cl、Br或I，(优选W是Br)，R3表示C1-6烷基(优选表示甲基)，优选至少R1和R2中的一个(但更优选R1和R2都)表示C1-6烷基。在不对称卤代烷磺酸盐氮芥的优选实施方式中，R2优选是甲基或乙基，R1是甲基、乙基、丙基或异丙基。根据所述实施方式，根据式(I)的最优选化合物选自：
(a)5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(化合物8)、5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物10)、5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-(2-硝基苯基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物12)、5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(乙基磺酰基)(2-硝基苯基)(4-甲基哌嗪-1-基)甲酮(化合物14)、5-(双(2-溴乙基)氨基)-4-(乙基磺酰基)-(2-硝基苯基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物16)和5-(双(2-溴乙基)氨基)4(乙基磺酰基)-(2-硝基苯基)(4-异丙基哌嗪-1-基)甲酮(化合物18)；或者
(b)2-((2-溴乙基)(5-(4-甲基哌嗪-l-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物9)，2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11)，2-((2-溴乙基)(5-(4-异丙基哌嗪-l-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物13)，2-((2-溴乙基)(2-(乙基磺酰基)-5-(4-甲基哌嗪-l-羰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物15)，2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-l-羰基)-2-(乙基磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物17)，2-((2-溴乙基)(2-(乙基磺酰基)-5-(4-异丙基哌嗪-1-羰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物19)。
独立于以上定义的式(I)的优选化合物的任一定义(即不对称的卤代烷磺酸盐氮芥或由于R1和R2中取代基的组合而不对称的卤代烷磺酸盐氮芥，或为不对称的具有R1和R2组合的卤代烷磺酸盐氮芥，或由于X中的取代基而不对称的具有R1和R2组合的卤代烷磺酸盐氮芥)，用于治疗癌症(特别是乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤，特别是当存在缺氧区域时)的组合物或方法中使用的式(I)的一个优选化合物是2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11)和任何盐、溶剂化物或立体异构体。
此外，独立于上面定义的式(I)的优选化合物的任一定义，这些化合物可以在更多任选的替代方案中提供，相应的式(II)化合物是由式(I)中的-NO2取代基修饰成替代的氮基取代基(例如羟胺或胺)而产生的代谢物。
式(I)化合物或其盐、溶剂化物或立体异构体可作为前药提供，其在体内给药后代谢，特别是如式(II)化合物。优选的式(II)化合物是式(I)化合物，其中Z可以是NHOH或NH2，如图1C中化合物11所示，其在给药后可以产生对癌细胞具有细胞毒性的活性代谢物化合物11c和化合物11d形式的代谢物。式(II)化合物也可以根据任何制备式(I)衍生物化合物的替代方法来提供，例如从式(I)化合物合成中的中间化合物开始。
本文公开的化合物的“代谢物”是所述化合物代谢时形成的化合物的衍生物。术语“活性代谢物”是指化合物代谢时形成的化合物的生物活性衍生物。本文所用术语“代谢的”是指通过生物体改变特定物质的过程(包括但不限于水解反应和酶催化的反应，如氧化反应或硝基还原酶催化的还原反应)的总和。因此，酶可以使一种化合物产生特定的结构改变。例如，细胞色素P450催化多种氧化和还原反应，而尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶催化活化的葡萄糖醛酸分子向芳香醇、脂肪醇、羧酸、胺和游离巯基的转移。关于代谢的更多信息可从古德曼和吉尔曼的《治疗学的药理学基础》(2017年第13版；麦格劳-希尔)。本文公开的化合物的代谢物可以通过将化合物给药于宿主(随后分析来自宿主(人或动物模型)的组织样品)或通过在体外/离体条件下将化合物与人或动物细胞在细胞培养物中孵育(随后分析细胞提取物和/或细胞培养基)来鉴定。这两种方法在本领域都是公知的。本发明的特定药理活性代谢物是通过还原式(I)化合物的硝基部分形成的，从而产生活性的含羟胺和胺的代谢物，如式(II)所示。此外，在体内与生理盐反应后，氯原子可以存在于式(I)化合物的代谢物中，如可选的W基团、X基团(或两者)。
无论何时在下文中使用，短语“式(I)化合物”、“式(II)化合物”、“本发明化合物”或“本发明化合物”或类似术语，都意味着包括式(I)或式(II)化合物、其盐、溶剂化物和立体化学异构形式。式(I)或式(II)的化合物可以具有手性中心，特别是当R1、R2或R3基团分支时，并且可以以立体化学异构形式存在。
本发明还旨在包括存在于本发明化合物上的所有原子同位素。同位素包括原子数相同但质量数不同的原子。作为一般示例而非限制，氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括C-13和碳C-14。在实施例1中提供了式(I)或式(II)化合物的例子作为氘化变体，其中哌嗪环的氢原子被氘取代(以Cpd.11-d8、Cpd.11s-d8和Cpd.11d-d8的结构和合成方法为例)。
本文使用的术语“立体化学异构形式”定义了由相同的原子通过相同的键序列键合而成的所有可能的化合物，但是具有不同的三维结构，这些结构是不可互换的，式(I)的化合物可以具有这些结构。参考其中(R)或(S)用于指定取代基内手性原子的绝对构型的实例，所述指定是考虑整个化合物而不是单独的取代基来完成的。除非另有说明，化合物的化学名称包括所述化合物可能具有的所有可能的立体化学异构形式的混合物。所述混合物可以包含所述化合物基本分子结构的所有非对映异构体和对映异构体。本发明化合物的所有立体化学异构形式，无论是纯的形式还是相互混合的形式，都包含在本发明的范围内。
本文所述的式(I)或式(II)化合物和中间体的纯立体异构形式被定义为基本上不含所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映体或非对映体形式的异构体。具体而言，术语“纯立体异构”指的是化合物或中间体具有超过至少80％(即最少80％的一种异构体，最多20％的其他可能的异构体)至达100％(即一种异构体的100％，而没有其他异构体)的过量立体异构体，更具体而言，化合物或中间体具有90％-100％的立体异构体，甚至更具体而言，化合物或中间体具有94％-100％的立体异构体，最具体而言，化合物或中间体具有97％-100％的立体异构体。术语“对映体纯的”和“非对映体纯的”也应以类似的方式理解。
如本文所述的式(I)或式(II)化合物和中间体的纯立体异构形式可以通过应用本领域已知的方法获得。例如，对映异构体可以通过它们的非对映体盐与光学活性酸或碱的选择性结晶而彼此分离。其例子是酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲苯甲酰酒石酸和樟脑磺酸。
可选的，可以通过色谱技术使用手性固定相分离对映体。所述纯立体化学异构形式也可以衍生自相应的合适原料的纯立体化学异构形式，如果反应是立体化发生的。优选地，如果需要特定的立体异构体，所述化合物将通过立体化异构制备方法合成。这些方法将有利地使用对映体纯的原料。式(I)或式(II)化合物的非对映体外消旋物可以通过常规方法分别获得。可以有利地使用合适的物理分离方法，例如选择性结晶和色谱法，例如柱色谱法。
在本发明的用于治疗癌症的组合物和方法中，优选以药学上可接受的盐的形式提供以上定义的式(I)的任何优选化合物(即为不对称的或由于具有R1、R2、R3组合而不对称的卤代烷磺酸盐氮芥，或具有不对称的或由于R3而不对称R1和R2组合的卤代烷磺酸盐氮芥)。
上文提及的药学上可接受的酸和碱加成盐是指包含式(I)或式(II)化合物能够形成的有治疗活性的无毒酸和碱加成盐形式。药学上可接受的酸加成盐可以通过用阴离子形式的合适无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)或有机酸(如乙酸、甲磺酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸等)处理碱形式而方便地获得。合适的阴离子包括，例如，乙酸根、苯磺酸根、苯甲酸根、碳酸氢根、酒石酸氢根、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸根、碳酸盐、氯化物、柠檬酸根、二盐酸盐、乙二胺四乙酸根、酒石酸根、富马酸根、葡萄糖酸根、谷氨酸根、羟基苯胂酸根、羟基苯胂酸根、氢溴酸根、盐酸盐、羟基萘酸根、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸根、乳糖酸根、苹果酸根、马来酸根、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、苹果酸根、硝酸盐、泛酸根、磷酸盐/二磷酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、亚乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、三乙基碘、甲烷磺酸盐、甲苯磺酸盐等。相反，所述盐形式可以通过用合适的碱处理转化成游离碱形式。更优选地，盐是甲磺酸盐。例如，式(I)化合物的优选药学上可接受的盐是2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯(化合物11Ms)。
含有酸性质子的式(I)或式(II)化合物也可以通过用适当的阳离子形式的有机和无机碱处理转化成它们无毒的金属或胺加成盐形式。合适的碱性盐包括与有机阳离子如苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因等形成的盐；以及由金属阳离子如铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌等形成的那些。相反，所述盐形式可以通过用合适的酸处理转化为游离形式。一些式(I)或式(II)化合物也可以以它们的互变异构体形式存在。尽管上面没有明确指出，但是这些形式旨在包括在本发明的范围内。
在一些实施方式中，式(I)或式(II)化合物以未溶剂化形式或与药学上可接受的溶剂如水、乙醇、醇等的溶剂化形式存在。式(I)或式(II)化合物的溶剂化形式也被认为在此公开。对于治疗用途，式(I)或式(II)化合物的盐是这样的盐，即其中反离子是药学上可接受的，这些盐可称为药学上可接受的酸和碱加成盐。非药学上可接受的酸和碱的盐也可用于例如制备或纯化药学上可接受的化合物。所有盐，无论是否药学上可用，都包括在本发明的范围内。
本发明的式(I)化合物可以根据WO2014031012中描述的方法制备，其内容在此引入作为参考。如WO2014031012的图8所示，3,4-二氟苯甲醛(100)与烷磺酸钠的反应提供了烷基砜(Ⅲ)，其可以在含有过氧化氢的磷酸盐缓冲液中被亚氯酸钠氧化得到酸(Ⅳ)。这些的硝化反应提供了硝基酸(Ⅴ)，其可以直接与二乙醇胺反应得到二醇(Ⅵ)，或者首先被保护得到叔丁基酯(Ⅷ)，其随后与二乙醇胺反应得到二醇(Ⅳ)。亚硫酰氯介导的二醇的氯化(Ⅵ)和随后所得酰氯中间体与脂肪胺的反应提供了1-甲酰胺二氯氮芥(Ⅶ)，其可以在甲基乙基酮中回流进行卤化锂介导的卤素交换，得到式(I)化合物。通过与适当的烷基磺酰氯反应，可选的二醇(Ⅳ)可以转化为它们的双链烷磺酸酯(Ⅹ)。双链烷磺酸酯(Ⅹ)与三氟乙酸的叔丁酯脱保护得到酸(Ⅺ)。这些与草酰氯在氧化镁存在下的反应提供了酰氯中间体，所述酰氯中间体可以进一步与脂肪胺反应，得到双链烷磺酸盐1-甲酰胺衍生物(Ⅶ)。它们可以在室温下在丙酮中与过量的卤化锂反应，得到式(I)的对称氮芥，而在室温下在丙酮中与1当量的卤化锂反应，得到式(I)的不对称卤代烷磺酸氮芥。
关于式(I)的对称卤代烷磺酸盐氮芥，如WO2014031012的图11所示，二甲磺酸酯109与草酰氯在氧化镁存在下的反应提供了酰氯中间体，所述酰氯中间体进一步与1-甲基哌嗪反应得到双甲磺酸1-甲酰胺124。室温下在丙酮中将其与过量的溴化锂反应，得到化合物22。亚硫酰氯介导的二醇104的氯化以及随后所得酰氯中间体与1-乙基哌嗪和1-异丙基哌嗪的反应分别得到二氯氮芥131和132。溴化锂介导的甲基乙基酮中的卤素交换在回流下分别得到化合物23和24。二甲磺酸酯119与草酰氯在氧化镁存在下反应，得到酰氯中间体，所述中间体与1-甲基哌嗪、1-乙基哌嗪和1-异丙基哌嗪反应，分别得到双甲磺酸1-甲酰胺133、134和135。室温下在丙酮中与过量的溴化锂反应，分别得到化合物25、26和27。
上面定义的根据式(I)的任何优选化合物(即不对称的卤代烷磺酸盐氮芥或由于R1和R2中取代基的组合而不对称的卤代烷磺酸盐氮芥，或为不对称的具有R1和R2组合的卤代烷磺酸盐氮芥，或由于X中的取代基而不对称的具有R1和R2组合的卤代烷磺酸盐氮芥)也可以通过使用图1B中概述的替代方法来生产，包括使用氮丙啶乙醇(或其他氮丙啶醇)，如使用化学保护基团进行修饰。常见的保护基团是甲硅烷基醚，特别有用的是三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS/TBDMS)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)，因为它们可以在温和条件下选择性地安装和移除。根据以上定义的式(II)的任何优选化合物可通过改变以上概述的方法可选的获得，从化合物1、2、3或4(图1B)开始，如此或为了在最终产物中得到所需的Z取代基而修饰。
式(I)化合物旨在优选通过其代谢物(例如，进入式(II)化合物)在人癌症细胞中发挥缺氧依赖性细胞毒性(具有或不具有进一步的旁观者效应)，优选在癌症缺氧区域的细胞中，在体内发挥其治疗活性。这种细胞毒性可以在从乳腺癌、肺癌和胰腺癌中发现、分离或选择的癌细胞中进行评估，也可以在胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌和软组织肉瘤中进行评估。这种癌细胞可以来源于来自活检组织、肿瘤球体或已建立的癌细胞系的原发性癌细胞，其可以在体外或离体进行测试(例如作为小鼠癌症模型中的异种移植物)。特别地，在人类实体肿瘤中发现的病理性缺氧存在的情况下，可能发生羟胺和胺细胞毒性代谢物的还原。除了通过硝基还原酶或其他酶的代谢之外，式(I)化合物也可在肿瘤区域内可能发现的缺氧区域中代谢。
本文所指的“缺氧的”或“缺氧”是指组织中的氧浓度明显低于正常的生理氧浓度，即身体或身体的一个区域缺乏足够的氧水平(由所述区域或组织中的供应和消耗之间的不平衡引起)，特别是当氧张力低于约1％(百万分之10,000的氧浓度；7.6mm汞柱)。评价正常细胞或癌细胞(单层或多层中的粘附细胞，以及肿瘤球体中的粘附细胞)体内和特定组织或器官中体外缺氧的方法在文献中是公知的。式(I)(或式(II))化合物的作用可被评估为此类模型中氧浓度的函数，特别是评估氧对细胞毒性的抑制或缺氧依赖性诱导γH2AX磷酸化、与DNA损伤相关的修复和反应、药物-DNA加合物和DNA交联的存在和/或细胞周期停滞。在此范围内，呈现有缺陷的(或增强的)低氧依赖性活性和/或代谢活性(如一种或多种特异性还原酶)的细胞系可用于鉴定式(I)(或式(II))化合物的代谢活化如何触发相关的低氧依赖性细胞毒性和显著的旁观者效应。式(I)(或式(II))化合物可在体内或三维模型中通过技术和设备进行评估，所述技术和设备用于对细胞和组织样品中与氧和缺氧平行的代谢物形成过程进行成像和评估，包括示踪剂、放射性标记或荧光探针或组织学分析(Meng F等,2012；Dhingra VK等,2015；Papkovsky DB and DmitrievRI,2018；StornettaA等,2018；Mirabello V等,2018)。
“旁观者效应”或“旁观者效应”是指用细胞毒性前体药物代谢物处理靶细胞而引发的效应，是指对靶细胞局部微环境中的细胞或组织的二次消融效应。
不希望被理论所束缚，旁观者效应被认为是由细胞毒性前体药物代谢物(活化的前体药物)从产生位点的扩散引起的，以影响与靶细胞分离的未修饰细胞。旁观者效应(也定义为BEE，旁观者效应效率)可以根据文献和实施方式中描述的方法进行量化(WilsonW等,2002；HunterF等,2014)。测试前体药物的旁观者效应通过旁观者效应效率来测量，旁观者效应效率可以使用算法((LogC10T-LogC10Tc)/(LogC10T-LogC10Ac))来计算。小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约1％的BEE值被认为是“实质最小”，而大于约20％、50％、70％或更多的BEE值被认为是“实质最大”。
此外，在本发明的方法和组合物中使用的式(I)化合物(或式(II))可以与在低氧条件下测定的生物活性相关的标准，与在常氧条件下观察到的那些相比(或独立于氧的存在)，进一步定义。例如，这样的标准可以是低氧细胞毒性比(HCR)，其可以在体外使用癌细胞系(例如在选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、胃肠癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、头颈癌细胞和/或软组织肉瘤细胞的人类癌细胞中，如上所述)来测量，并且包含在一系列值中。“低氧细胞毒性比”或“HCR”是通过计算给定化合物在常氧条件和缺氧条件下杀死50％癌细胞的浓度(IC50)，并根据刃天青或硫罗丹明B(SRB)测定或另一种生存力测定(如基于ATP的生存力测定)对这些值进行划分而获得的，如文献中所述。在实施例1中提供了用于计算这种值的示例性分析。具体而言，式(I)(或式(II))化合物的缺氧细胞毒性值(IC50)为1nM-500μM，或任何中间范围(如10nM-100μM或100nM-50μM)，低氧细胞毒性比在5(或甚至2)-1000之间。或任何中间范围(例如2-250、5-250、4-190或5-150)。实施例提供了在具有不同来源或对应于不同癌症亚型的癌细胞系中测量的中间范围或其他IC50值的额外例子。
可以基于描述体外或离体测试时特定癌细胞系(人或动物，天然或端粒酶逆转录酶永生化)或原代细胞癌活检样本之间关系的文献进行模型(体外、离体或动物模型)选择。许多功能性分析可用于评估因使用式(I)(或式(II))化合物而对肿瘤产生的缺氧相关效应，包括细胞增殖、程序性细胞死亡、凋亡、坏死、基因激活或失活以及可通过免疫印迹、逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、免疫沉淀、RNA微阵列、RNA-seq、流式细胞术、荧光显微镜、多孔阅读器等进行分析的其他癌症标志(Menyhárt O等,2016)。
式(I)(或式(II))化合物用于本发明的组合物和方法中，用于治疗乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤。描述暴露于药物后癌细胞系的基因型、表型和临床相关性之间关系的文献的具体例子可用于胰腺癌(Deer EL等,2010)、肺癌(Cai Z等,2015)和乳腺癌(Dai X等,2017)。此外，ATCC(https://www.atcc.org)和DSMZ(https://www.dsmz.de)是采购这种生物材料的组织机构，并提供它们在功能测定中的用途和/或与人类癌症的相关性的具体描述，例如在ATCC的报告和关于ATCC癌细胞系(包括来自乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌和软组织肉瘤)的资源书籍中，所述癌细胞系由特定基因突变(如APC、EGFR、BRAF、PTEN、RAS、RB1或TP53)、亚型、来源和/或病理学(例如，参见ATCC cat.No.CB-0915-02、CB-1015-07、CB-0513-01，以及其他可从ATCC或德国制造厂获得的产品，如实施例2所示)。
这种癌症的特定亚型或变异体可以通过如上所述的临床或生物学相关标准(例如特定的形态学、起源、阶段、耐药性、复发、转移特性和/或分子标记)来定义，并且可以适用于一种或多种癌症(亚)类型和/或患者群体。受任何此类癌症影响的受试者在使用式(I)化合物(或式(II)化合物)和相关组合物和方法进行治疗之前，可能已经用(或未用)标准护理方案(如放射疗法、化学疗法和/或免疫疗法)进行了治疗，从而可以避免、预防或延迟所述受试者中癌症的耐药性、免疫逃逸、复发或转移。
鉴于本发明中提供的式(I)化合物的实验特征，可以将所述化合物施用给具有低氧肿瘤细胞的受试者，所述低氧肿瘤细胞是使用适当的体内或体外技术建立的，例如使用来自肺癌、胰腺癌或乳腺癌的特定标记物、示踪剂和/或癌细胞(包括通过在动物模型中利用患者癌细胞的活检和异种移植)。可选的，根据对护理标准的抗性、癌细胞或免疫细胞(T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞等)的数量和/或分子标记的变化，来进一步定义癌症(亚)类型。这些细胞可以作为肿瘤内、肿瘤微环境中或生物液体(如血液)中的特定细胞群(或亚细胞群)使用标准技术(如免疫细胞化学、流式细胞术或免疫组织化学)来检测，并且可以帮助评估施用式(I)(或式(II))的治疗效果，也考虑到癌症或其他生物标志物的特定免疫学特征。
可根据本发明的方案进行治疗的肺癌亚型是小细胞肺癌、非小细胞肺癌或间皮瘤。非小细胞肺癌的例子包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。在某些情况下，间皮瘤是肺和胸腔内层(胸膜)或腹部内层(腹膜)的癌性肿瘤。间皮瘤可能是由于暴露于石棉中产生的。
可根据本发明的方案进行治疗的胰腺癌亚型包括：1)外分泌型胰腺癌，例如腺泡细胞癌、腺癌、腺鳞癌、胰腺巨细胞癌、导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)、粘液性囊腺癌、胰母细胞瘤和浆液性囊腺癌，以及，2)内分泌型胰腺癌，例如胃泌素瘤(佐林格-埃里森综合征)、胰岛素瘤、无功能胰岛细胞瘤、生长抑素瘤、血管活性肠肽释放瘤(血管活性肠肽瘤或韦纳-莫里森综合征)，或者胰腺神经内分泌肿瘤(PNETs)。在优选的实施方式中，胰腺癌是腺癌(即胰腺导管癌)、浸润性胰腺导管癌、实性假乳头状瘤(SPT)、胰高血糖素瘤或1型多发性内分泌瘤(MEN1)(韦默综合征)。
可根据本发明的方案进行治疗的乳腺癌亚型为三阴性乳腺肿瘤和癌症。本文所用的“乳腺癌”是指任何乳腺细胞的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种乳腺癌，其特征在于细胞缺乏雌激素受体和孕酮受体，并且在其表面上没有过量的HER2蛋白。TNBC乳腺癌通常比其他乳腺癌更具侵袭性。由于肿瘤细胞缺乏雌激素和孕酮，激素疗法(如他莫昔芬)本身无效。此外，由于细胞缺乏HER2蛋白，靶向HER2的药物无效，因此需要更有效的特异性治疗。
乳腺癌四种主要亚型可通过结合分子标记和药物反应定义为鲁米那A(ER阳性，HER2阴性，增殖标记Ki67低表达，通常对激素治疗或化疗有反应)、鲁米那B(ER阳性，HER2阳性，增殖标记Ki67高表达，对激素治疗、化疗或抗HER2抗体治疗有不同反应)、基底样型(ER-/PR-/HER2-三阴性，增殖标记Ki67和EGFR高表达，对激素治疗无反应，但通常对化疗有反应)，HER2扩增(ER阴性、HER2阳性、增殖标记Ki67高表达、对激素治疗、化疗或抗HER2抗体治疗有不同的反应)。
可选的，乳腺癌的亚型可以根据组织形态学异常进一步定义，包括但不限于原位导管癌(DCIS，最常见的非侵袭性乳腺癌)、原位小叶癌(LCIS)、侵袭性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵袭性(或浸润性)导管癌(IDC)、微侵袭性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、腺样囊性(腺囊性)癌、低级腺鳞状细胞癌、髓样癌、粘液(或胶体)癌、乳突癌、管状癌、化生癌、乳房筛状癌、男性乳腺癌、正常样乳腺癌、乳头佩吉特病、乳腺叶状肿瘤、转移性乳腺癌或微乳头状癌。单个乳腺癌肿瘤可以是这些类型的组合，也可以是浸润性和原位癌症的混合。乳腺癌的这些亚型可以通过使用一种或多种被认为是给定乳腺癌亚型的标准治疗方法来治疗，包括手术、放射治疗、化疗(例如紫杉醇)、激素治疗(例如他莫昔芬)、免疫治疗或其他针对癌症抗原的基于抗体的治疗(例如曲妥珠单抗，靶向HER2受体)，或结合(或不结合)免疫治疗的化疗(例如他莫昔芬和曲妥珠单抗)。
可选的，乳腺组织的增生和其他良性病变的亚型或多或少预示着乳腺癌的倾向，可以从包括导管增生、小叶增生、非典型导管增生和非典型小叶增生在内的这种异常细胞增殖(没有进一步的组织形态学异常)的位置进一步定义。
额外类型和亚型的癌症可以存在缺氧区域，并可通过使用本文所述的式(I)化合物(或式(II)化合物)来治疗。胃肠癌的亚型包括但不限于食道癌、胃癌、神经内分泌肿瘤(NETs)、小肠癌、胆囊和胆道癌、胃肠间质瘤(GIST)、结肠直肠癌和肛门癌。前列腺癌的亚型包括但不限于腺泡腺癌、导管腺癌、移行细胞癌(或尿路上皮癌)、鳞状细胞癌和小细胞前列腺癌。卵巢癌的亚型包括但不限于上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢肿瘤、性索间质肿瘤或交界性卵巢肿瘤。脑癌的亚型包括但不限于听神经瘤、星形细胞瘤、脊索瘤、CNS淋巴瘤、颅咽管瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、混合胶质瘤、视神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、转移性脑肿瘤、少突胶质细胞瘤、垂体肿瘤、原始神经外胚层肿瘤、神经鞘瘤、幼年毛细胞星形细胞瘤(JPA)、松果体瘤或横纹肌样瘤。头颈癌的亚型包括但不限于喉癌、唇癌和口腔癌、具有隐匿原发性的转移性鳞状颈癌、鼻咽癌、口咽癌、副鼻窦和鼻腔癌或唾液腺癌。软组织肉瘤的亚型包括但不限于血管肉瘤、皮肤纤维肉瘤、上皮样肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。
涉及使用式(I)化合物(或式(II)化合物)或相关的药学上可接受的盐的药物组合物和方法可以通过配制这种化合物(含有或不含有药学上可接受的赋形剂、佐剂、载体、缓冲剂、稀释剂或稳定剂)来建立，所述化合物适于向受试者给药，特别是用于治疗肺癌、胰腺癌、乳腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤。优选地，这种组合物用于胃肠外给药(更优选用于皮下或静脉给药)、肿瘤内给药、经动脉栓塞给药或口服给药。给药途径的选择可以由各种因素决定，例如特定的癌症(亚)类型、其缺氧状态/位置或同时进行的治疗。
本发明的药物组合物可以使用一种或多种药学上可接受的非活性成分以常规方式进行配制，所述非活性成分有助于将活性化合物加工成药学上可使用的制剂。合适的配方取决于所选择的给药途径。本文描述的药物组合物和制剂的概述可在例如雷明顿所著《药学科学和实践》(2005年第21版；LippincottWilliams&Wilkins)，《药学科学与技术百科全书》(2013年第4版；CRC Press，Taylor&Francis Group)，以及《Ansel的药物剂型和药物输送系统》(2017年第11版；Wolters Kluwer)，在此引入作为参考。
如本文所用，“施药”或“给药”是指提供治疗，例如开处方治疗、应用治疗或分散治疗。在某些情况下，给药意味着医疗专业人员开出患者应用的治疗处方(例如，患者应用设备、消费药物或注射药物)。医学治疗的实施不需要医务人员即时或持续的管理。
本文所述的任何组合物任选地包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、酸碱度缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂、稀释剂和其他此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。所述组合物可进一步包含乳糖、葡萄糖、甘露醇、酸碱度缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、张力调节剂中的一种或多种或其组合。任选的使用药学上可接受的载体的例子包括但不限于水性载体、非水性载体、抗微生物剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂和其他药学上可接受的物质。
在一些实施方式中，本文所述的化合物在药物组合物中以单独给药或与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合的方式进行给药。本文所述的化合物和组合物的给药可以通过能够将化合物递送至作用部位的任何方法来实现。这些方法包括但不限于经肠途径(包括口服、胃或十二指肠饲管、直肠栓剂和直肠灌肠剂)、胃肠外途径(注射或输注，包括动脉内、心内、皮内、十二指肠内、髓内、肌内、骨内、腹膜内、鞘内、血管内、静脉内、玻璃体内、硬膜外和皮下)、吸入、透皮、经粘膜、舌下、口腔和局部(包括表皮、皮肤、灌肠剂、滴眼液、滴耳液、鼻内、阴道)给药，尽管最合适的途径可能取决于例如受试者的状况或失调情况。仅作为示例，本文所述的化合物可通过例如外科手术期间的局部输注、局部应用(如乳膏或软膏、注射、导管或植入物)而局部施用至需要治疗的区域。给药也可以通过在患病组织或器官的部位直接注射，或者通过在肿瘤细胞处直接注射(预先确定/未确定肿瘤中的缺氧区域)。全身给药可以通过口服、静脉内、腹膜内和肌肉内注射的给药方式来进行。
在一些实施方式中，适于口服给药的药物组合物以离散的单位存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每一种含有预定量的本发明化合物；作为粉末或颗粒；作为水溶液/非水溶液中的溶液或悬浮液；或者作为水包油液体乳液或油包水液体乳液。本发明的式(I)或式(II)化合物，特别是Cpd.11d(初步表征为具有相对高的口服生物利用度)可以以丸剂、冲剂或糊剂的形式存在。对于口腔或舌下给药，所述组合物可以采取片剂、含片(lozenges)、锭剂、凝胶、由明胶制成的压入式胶囊以及由明胶和增塑剂制成的软密封胶囊的形式，所述增塑剂是例如以常规方式配制的甘油或山梨醇。这种组合物可以包含调味基料中存在的化合物，例如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶。
片剂形式的药物组合物可以通过压缩或模塑制成，任选地具有一种或多种辅助成分。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的本发明化合物来制备，例如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、惰性稀释剂或润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。片剂(或糖衣丸)被包衣或配制以提供本发明化合物的缓慢或受控释放。可将合适的包衣(如糖溶液，其可任选含有阿拉伯树胶、滑石或聚乙烯吡咯烷酮)和染料或颜料加入片剂或糖衣丸包衣中。片剂可以含有本发明化合物与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物，例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂，如微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、玉米淀粉或海藻酸；其他试剂，例如淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、润滑剂如滑石或硬脂酸镁、阿拉伯胶、硬脂酸镁或滑石。片剂可以是未包衣的或通过已知技术包衣的，以掩盖味道或延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并提供更长时间的持续作用。掩味材料可以是羟丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素，或延时材料如乙基纤维素。口服制剂也可以是硬明胶胶囊，其中存在的化合物与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者是软明胶胶囊，其中存在的化合物与载体如聚乙二醇或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
本发明的药物组合物也可以配制成通过注射进行肠胃外给药的形式，例如通过丸药注射或连续输注。注射制剂可以以单位剂量形式存在，例如安瓿或多剂量容器，并添加防腐剂。所述组合物可以在油性或水性载体中以悬浮液、溶液或乳液的形式存在，并且可以含有制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的有机溶剂(如乙醇、二甲基亚砜或二甲基乙酰胺)或溶剂混合物可用于生产包含本发明化合物的长期储存、高浓度和/或批量药物组合物，所述组合物可在肠胃外给药前(通过预装注射器、小瓶或试剂盒中的其他组分)通过使用合适的水性缓冲液(包括葡萄糖、氯化钠、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水溶液或其他稀释在无菌注射水溶液中的赋形剂)稀释至活性成分的所需浓度或日剂量。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以以粉末形式或在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如盐水或无菌无热原水。临时注射溶液和悬浮液可以通过前面所述的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的药物制剂是在γ射线照射下灭菌的粉末填充小瓶。式(I)化合物(或式(II)化合物)可以以粉末形式提供，所述粉末足够稳定且可溶于水，以用于在给药前(例如通过注射)立即在注射用水中以适当的稀释度(10mg/ml、100mg/ml或进一步浓缩)制备稀释液，以进一步添加到葡萄糖输注袋中。可以添加乙酸钠，以确保酸碱度适于所选给药途径(如静脉给药或其他类型的注射)。
用于肠胃外给药的药物组合物包括活性化合物的含水和非水(油性)无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌化合物和溶质，使制剂与预期受体的血液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。含水注射剂混悬液可能含有增加混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
在一些实施方式中，本文所述的化合物在囊泡(如脂质体)中递送。在进一步或可选的实施方式中，本文所述的化合物和药物组合物在控释系统中递送，或者控释系统可以放置在治疗目标附近。
药物组合物也可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或肌肉注射给药。因此，例如，本发明的化合物可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或微溶盐来配制。
水性悬浮液包含活性成分与适于制造水性悬浮液的赋形剂的混合物。这些赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙基-氧杂环丁烷醇)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯(如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)的缩合产物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯(如聚乙二醇脱水山梨醇单油酸酯)的缩合产物。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙基酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物是无菌注射水溶液的形式。可接受的载体和溶剂包括但不限于水、林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液、乙醇和1,3-丁二醇。此外，无菌的固定油(如任何温和的固定油，包括合成甘油单酯或甘油二酯)可用作溶剂或悬浮介质。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体或其他微粒系统，可用于将药剂靶向血液成分或一个或多个器官。无菌可注射制剂可以是无菌可注射水包油微乳，其中存在的化合物溶解在油相中。本发明中的化合物可以首先溶解在大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液引入水/甘油混合物中，加工形成微乳液。在另外的实施方式中，可注射的溶液或微乳液通过局部团注被引入受试者的血流中。
在其他实施方式中，药物组合物是用于肌内和皮下给药的无菌可注射水性或油性混悬液的形式。在另外的或附加的实施方式中，这种悬浮液是使用上述那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制的。无菌注射制剂可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，在一些实施方式中，任选的使用任何温和的固定油，包括合成甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
合适的药物载体包括惰性稀释剂或填充剂、水和各种有机溶剂。在一些实施方式中，药物组合物包含额外的成分，例如调味剂、粘合剂、赋形剂等。因此，对于口服给药，含有各种赋形剂(如柠檬酸)的片剂与各种崩解剂(如淀粉)、藻酸和某些复合硅酸盐以及粘合剂(如蔗糖)、明胶和阿拉伯胶一起使用。此外，润滑剂如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石通常可用于压片。在其他实施方式中，相似类型的固体组合物用于软/硬填充的明胶胶囊中。因此，优选的材料包括乳糖或乳糖和高分子量聚乙二醇。在某些实施方式中，其中水性悬浮液或酏剂需要用于口服给药，其中的活性化合物与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料以及乳化剂或悬浮剂(如果需要的话)，以及稀释剂(如水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合)相结合。
在一些实施方式中，通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性悬浮液。在某些实施方式中，油性悬浮液包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。在进一步的实施方式中，加入甜味剂如上述那些，和调味剂以提供可口的口服制剂。在其他实施方式中，这些组合物通过加入抗氧化剂如丁基化羟基茴香醚或α-生育酚来保存。在一些实施方式中，药物组合物是水包油乳液的形式。在一些实施方式中，油相是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或其混合物。
药物组合物可以局部给药，即通过非全身给药。这包括在表皮或口腔外部施用本发明的化合物，并将这种化合物滴注到耳朵、眼睛和鼻子中，使得所述化合物不会显著进入血流中。适用于局部给药的药物组合物包括适用于透过皮肤的液体或半液体制剂，如凝胶、搽剂、洗液、乳膏、软膏或糊剂，以及适用于眼睛、耳朵或鼻子给药的滴剂。对于局部给药，药物组合物可包含0.001％-10％w/w的制剂，例如1％-2％。对于局部使用，可以使用含本发明化合物的面霜、软膏、果冻、溶液或悬浮液、漱口水和漱口液等。
用于吸入给药的药物组合物可方便地从吹入器、喷雾器加压包或其他方便的气溶胶喷雾输送装置中输送。加压包可以包括合适的推进剂，例如二氯代甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门来输送计量的量来确定。或者，对于通过吸入或吹入给药，药物制剂可以采取干粉组合物的形式，例如化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂量形式存在，例如胶囊、药筒、明胶或泡罩包装，其中的粉末可以在吸入器或吹入器的帮助下给药。
适于通过加水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。上述提及的合适的例子是合适的甜味剂、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、分散剂或湿润剂和悬浮剂。可以存在额外的赋形剂(例如甜味剂)、调味剂和着色剂。在进一步或另外的实施方式中，通过加入抗氧化剂(如抗坏血酸)来保存这些组合物。合适的乳化剂包括但不限于天然磷脂(例如大豆卵磷脂)，以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯)，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物还包含浓度(w/v)为约0.001％-约50％的环糊精。本文描述的一些实施方式提供了进一步包含环糊精的组合物，其中当环糊精衍生物是SBE7-β-CD时，环糊精具有约15％、20％、22％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％或38％的浓度(w/v)。在一个实施方式中，当环糊精衍生物是SBE7-β-CD时，环糊精具有约30％的浓度(w/v)。在另一个实施方式中，当环糊精衍生物是SBE7-β-CD时，溶解度增强剂具有约29.4％的浓度(w/v)。适用于本文所述静脉注射组合物的其他环糊精衍生物在本领域中是已知的，并在下述文件中记载：US5134127、US5376645，“修饰的环糊精:超分子化学的支架和模板”(Eds.C.J.Easton,S.F.Lincoln,Imperial College Press)，其中每一篇都在此引入作为参考。用于本文所述组合物、方法和试剂盒的某些实施方式的合适环糊精衍生物的例子包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及其衍生物、SAE-CD衍生物。
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物为适于精确剂量的单一给药的单位剂型。在单位剂量形式中，制剂被分成含有适当量的一种或多种活性成分的单位剂量。在一些实施方式中，单位剂量是包含离散量制剂的包装形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊，以及小瓶或安瓿中的粉末。在一些实施方式中，水性悬浮液组合物包装在单剂量不可再封闭的容器中。可选的，可以使用可再封闭的多剂量的容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。仅作举例来说，用于肠胃外注射的制剂以单位剂量形式存在，其包括但不限于安瓿或多剂量容器，并添加有防腐剂。
在一些实施方式中，单位剂量形式的所述药物组合物可以以试剂盒或其他包装的形式提供，所述包装包含离散量的液体或固体形式的药物组合物。所述试剂盒可以包括用于单次或多次使用的容器、用于即用或浓缩药物组合物(和/或相关缓冲剂或稀释剂)的容器、用于给药的装置(例如注射器、针、管或过滤器)和说明书。所述试剂盒可适用于长期储存，特别是在低温下。
本发明化合物用于癌症的预防和/或治疗，特别是乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤。在某些治疗应用中，将本发明化合物以足以治愈或至少部分阻止至少一种癌症症状的剂量给予已经患有这种癌症的受试者。有效施用剂量取决于癌症的严重程度和病程、既往治疗、受试者的健康状况、性别、体重、饮食和对药物的反应以及治疗医生的判断。有效治疗量可选地通过包括但不限于剂量递增和/或剂量范围临床试验的方法来确定。对应于所述量的给定药物的量根据诸如特定化合物(包括其生物利用度和代谢或排泄速率)、癌症阶段和缺氧特征或合适的制剂和给药途径等因素而变化。
本文使用的术语“有效剂量”或“有效治疗量”是指给予足够量的化合物，所述化合物将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是减少和/或减轻癌症的体征、症状或诱因，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效剂量”是包含本发明化合物的组合物的量，所述量是提供疾病症状的临床显著减少所需要的量。
术语“受试者”或“患者”包括哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人类、非人灵长类动物如黑猩猩以及其他类人猿和猴子物种；家畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，如兔子、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠等。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。
在预防性应用中，将含有本文所述本发明化合物的组合物施用于易患特定癌症或有患特定癌症风险的患者。所述量被定义为“预防性的有效剂量或剂量”。在这种使用中，精确的量还取决于患者的健康状况、体重等。在一个方面，预防性治疗包括给以前经历过所治疗疾病的至少一种症状并且目前正在缓解的哺乳动物施用包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，以防止癌症复发。
这种组合物可以以有效治疗量给药于患有待治疗癌症(特别是肺癌、胰腺癌或乳腺癌)的受试者。适用于活性剂的日剂量为约0.1mg-约3000mg，或约100mg-6000mg，方便地以分剂量给药，包括但不限于每天最多四次或以延长释放的形式给药。适合口服给药的单位剂型包括约1-6000mg活性成分、约100-3000mg、约500-3000mg、约1-2500mg、约0.1-500mg、约1-250mg、约1-100mg、约1-50mg、约1-30mg、约1-20mg的本发明化合物。所述剂量可根据多种变量任意改变，不限于所用化合物的活性、给药方式、受试者的要求、所治疗癌症的严重程度和医生的判断。在一个实施方式中，所需剂量方便地以单剂量或分剂量的形式同时或以适当的间隔给药，例如2、3、4或更多次给药每1h、2h、3h、4h、6h、9h等每天，并且还需考虑到特定的癌症(子)类型，以及考虑用于治疗、维持或预防性使用等目的。
在一个实施方式中，适用于本文所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量优选以40-10,000mg/m2、40-4000mg/m2或1200-2400mg/m2(或可选的定义为1-100mg/kg(体重)，或更高至100mg/kg)和中间范围或值(例如，约0.01-约50mg/kg，约5mg/kg-约30mg/kg，例如约25mg/kg、约20mg/kg、约15mg/kg、或约10mg/kg、或4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、或1mg/kg)进行给药。在一些实施方式中，基于关于个体治疗方案的许多变量，剂型中活性化合物的剂量或量低于或高于本文所示的范围。在多个实施方式中，采用的单位剂量基于许多变量，包括但不限于，所用化合物的活性、待治疗的疾病或病症、给药方式，个体受试者的要求、所治疗的癌症的严重程度以及医师的判断。
所述药物组合物可以以每1、2、3或4周或每月定义的多次给药(周期)的常规方案进行给药，例如每周一天(或每周2、3、4或5个连续天或非连续天每天进行给药的频率)或每月一天(或每月2、3、4或5个连续天或非连续天每天进行给药的频率)，优选连续3天每天进行2h以上的静脉输注给药。所述方案可持续一个或多个连续周或连续月，例如最多2、4、8、12、26或52周，或最多2、4、6、8、10或12个月，根据受试者和/或癌症阶段的需要，可采用相同的剂量或更高或更低的剂量。
在某些实施方式中，其中患者的状况确实得到改善，给药的药物剂量被暂时减少或暂时中止一段时间(即“药物假期”)。在具体的实施方式中，药物假期的长度在1天和1年之间，仅举例来说，包括1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、19天、20天、21天、28天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、300天、320天、350天或365天。仅举例来说，药物假期期间的剂量减少量可以是10％-100％，包括仅举例来说10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。
一旦患者的病情有所改善，必要时施用维持剂量。随后，在具体的实施方式中，作为症状的函数，剂量或给药频率(或两者都)降低至保持疾病、障碍或病症改善的水平。然而，在某些实施方式中，一旦症状复发，患者需要长期间歇性治疗。在某些患者的病情没有改善的实施方式中，根据医生的判断，化合物的给药将是长期给药，即很长一段时间，包括在患者的整个生命周期，以改善或以其他方式控制或限制癌症的症状。
在前述任一方面的进一步实施方式中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐的有效剂量为：(a)对受试者全身给药；和/或(b)对受试者口服给药；和/或(c)对受试者静脉给药；和/或(d)通过注射给药于受试者；和/或(e)对受试者局部给药；和/或(f)对受试者非全身性或局部给药。在用于治疗乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤的方法中，在包括多次施用有效剂量的本发明化合物的任何进一步的实施方式中，将所述化合物作为单一药剂或以组合疗法连续或间歇地施用给受试者，其中以相似或不同的频率施用本发明的化合物或其他治疗剂。在进一步的实施方式中，所述方法包括药物假期，其中本发明化合物的给药被暂时中止或被给予的剂量暂时减少；在药物假期结束时，例如在1天、1周、1个月或更多连续月之后，直至1年，恢复化合物的给药。
式(I)(或式(II))化合物和用于治疗乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤的药物组合物可以与另一种治疗剂或疗法同时或依次给药于受试者，特别是与用于治疗乳腺癌、肺癌和/或胰腺癌的治疗剂或疗法一起给药，如在临床实践或(预)临床开发中所确定的治疗剂或疗法。在一些实施方式中，其他治疗剂或疗法独立于缺氧条件发挥其活性。鉴于靶向肿瘤中低氧区域的式(I)(或式(II))化合物的细胞毒性活性可提高治疗活性、降低剂量和/或缩短另一种药物(通过不同机制起作用)的治疗周期，式(I)(或式(II))化合物优选在这种药物、治疗剂或疗法之前，特别是在开始标准护理方案(如放疗、化疗或免疫疗法)之前给药。
本文所述的任何医学用途和治疗方法可进一步包括对个体或患者进行额外的癌症治疗。在某些实施方式中，作为非限制性实例，癌症疗法至少包括一种抗癌剂(例如，化疗剂)、放射疗法或手术，特别是针对肺癌、胰腺癌、乳腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌和/或软组织肉瘤的标准护理治疗。在一些实施方式中，组合(1)施用有效剂量的本发明化合物和(2)1-3种疗法，所述疗法选自(i)施用有效剂量的额外抗癌剂，(ii)施用有效剂量的激素治疗剂，和(iii)更有效地预防和/或治疗癌症的非药物疗法，包括手术和/或放射疗法。
“联合给药”、“联合疗法”或“联合治疗”是指使用两种或多种药剂或疗法，即使用本文所述的低氧活化前药和一种或多种化合物的组合以任何方式治疗癌症，其中两者的药理作用在受试者中是可见或可测量的。联合给药不要求两种药物的给药使用单一的药物组合物、相同的剂型、相同的给药途径，或者两种药物以相同的顺序和/或相同的频率同时给药。在一些实施方式中，本发明化合物仅在施用药剂后或治疗后施用。在一些实施方式中，仅在施用药剂前或治疗前施用本发明的化合物。在一些实施方式中，本发明的化合物和另一种药物或疗法以周期、顺序或交替的方式给药，其中两种药物的给药频率相同，或者任一种药物比另一种药物给药更频繁。在一些实施方式中，本发明化合物仅作为二线治疗给药，或仅作为一线(首选)治疗给药。在一些实施方式中，在施用本发明化合物之前，需要评估其他药剂或疗法对肿瘤内低氧区域的效果。在一些实施方式中，在施用其他疗法或药剂之前，需要评估本发明化合物对肿瘤内缺氧区域的作用。
在多个实施方式中，治疗被称为一线、二线或三线治疗或疗法。在另一个实施方式中，治疗是第一、第二或第三线治疗。如本文所用，短语“一线治疗”或“二线治疗”是指受试者接受的治疗顺序。例如，初次治疗可以是手术、化疗、放疗或这些治疗的组合。通常，受试者需要接受后续治疗方案，因为受试者对一线治疗没有表现出阳性临床反应或仅表现出亚临床反应。在一些实施方式中，式(I)(或式(II))化合物和相关药物组合物用作一线治疗或二线治疗。
包括给药的联合治疗的一个优选药剂或疗法是化疗。在可以施用的化疗剂中，非限制性的例子是顺铂、卡铂、紫杉醇、吉西他滨、多西他赛或阿霉素。此外，化疗剂的非限制性例子包括烷化剂、抗代谢物、抗癌抗生素、植物来源的抗癌剂等。
烷化剂包括但不限于苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替派、卡波醌、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、美法仑、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、链脲佐菌素、溴丙哌嗪、乙环氧啶、卡铂、顺铂、米波铂、奈达铂、奥沙利铂、六甲蜜胺、嘌嘧替派、苯达莫司汀、替莫唑胺、treosulphan、氯乙环磷酰胺、净司他丁、阿多来新、半胱氨亚硝脲等。
抗代谢物包括但不限于巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核糖苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、依诺西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷烷磷酯、盐酸安西他滨、5-FU药物(例如氟尿嘧啶、替加氟、UFT、脱氧氟脲苷、卡莫氟、加洛西他滨、乙嘧替氟等)、氨基蝶呤、亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、thiazophrine等。
抗癌抗生素包括但不限于放线菌素-D、放线菌素-C、丝裂霉素-C、色霉素-A3、盐酸博莱霉素、硫酸博莱霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿克拉比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、新制癌菌素、光神霉素、肉霉素、亲肌霉素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌等。
植物来源或其他天然抗癌剂包括但不限于依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、长春瑞滨、曲贝替丁、鲁比奈丁等。
用于包括给药的联合治疗的优选试剂或疗法是免疫疗法，其包括多种靶向细胞、组织和/或蛋白质的试剂和疗法，所述试剂和疗法可调节免疫反应，优选针对癌症，更优选针对肺癌、胰腺癌、乳腺癌、胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌和/或软组织肉瘤，鉴于本发明化合物的特征。免疫治疗剂的性质和结构可以不同，其包括细胞、蛋白质、肽、小分子或核酸。
免疫治疗剂包括但不限于干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、淋巴毒素或抑制或以其他方式靶向细胞生长因子或细胞生长因子受体作用的其他蛋白质(包括抗体)。抑制细胞生长因子作用的免疫治疗靶向剂包括但不限于HER2抗体(如曲妥珠单抗)、甲磺酸伊马替尼、ZD1839或EGFR抗体(如西妥昔单抗)、VEGFR抗体(如贝伐单抗)、VEGFR受体抗体、VEGFR受体抑制剂和EGFR抑制剂(如埃罗替尼)。
特别地，本发明的医学用途和治疗方法也考虑到式(I)化合物可与其他抗癌剂如抗体治疗剂或抗癌抗体联合使用。在另一个实施方式中，附加药物是靶向抗癌抗体，即靶向特定肿瘤类型的抗体。术语“抗体”在最广泛的意义上使用，具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双体；线性抗体。生产单特异性或双特异性抗体的技术和产品在本领域是已知的，如文献中广泛涉及的，也涉及替代形式、抗体-药物缀合物、抗体设计方法、体外筛选方法、恒定区、翻译后的修饰和化学修饰、触发癌细胞死亡的改进特征如Fc工程、肿瘤相关抗原和相应的治疗上有用的抗肿瘤抗体试剂(Tiller Kand Tessier P,2015；Weiner G,2015.；Fan G等,2015；Sliwkowski&Mellman,2013)。
在一个方面，靶向抗癌抗体是吉妥珠单抗(Mylotarg)、阿仑单抗(CAMPATHTM)、利妥昔单抗(Rituxin、Mabthera)、曲妥珠单抗(HerceptinTM)、尼妥珠单抗、西妥昔单抗(Erbitux)、埃罗替尼(TARCEVATM、Genentech/OSI Pharma)、贝伐单抗(AvaSteeM)、培妥珠单抗(OMNITARGTM，rhuMab 2C4，Genentech)、本妥昔单抗(AdcetrisTM)，伊匹单抗(MDX-101，也称为Yervoy)、奥法木单抗(Arzerra)、帕尼单抗(Vectibix)和托西莫单抗(Bexxar)中的一种或几种。在另一方面，靶向抗体是阿伦单抗、apolizumab、阿塞珠单抗、atlizumab、bapineuzumab、贝伐单抗、bivatuzumab mertansine、cantuzumab mertansine、cedelizumab、赛妥珠单抗、cidfusituzumab、cidtuzumab、达克珠单抗、依库利单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、erlizumab、felvizumab、fontolizumab、吉妥珠单抗、inotuzumabozogamicin、伊匹单抗、labetuzumab、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、motavizumab、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗、nolovizumab、numavizumab、ocrelizumab、奥马珠单抗、帕利珠单抗、pascolizumab、pecfusituzumab、pectuzumab、帕妥珠单抗、培克珠单抗、ralivizumab、兰尼单抗、reslivizumab、瑞利珠单抗、toralizumab、曲妥珠单抗、西莫白介素单抗、tucusituzumab、umavizumab、urtoxazumab和visilizumab中的一种或多种。在另一个实施方式中，至少一种附加药物包括针对免疫共刺激分子的抗体(包括但不限于CTLA-4、4-1BB和PD-1)、针对细胞因子的抗体(包括但不限于白介素-10、TGF-β等)、以及趋化因子受体(包括但不限于CCR2、CCR4等)。
在一些实施方式中，免疫治疗剂是共刺激或共抑制分子。在一些实施方式中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂和/或免疫检查点激活剂。在一些实施方式中，免疫调节剂是靶向一种或多种T细胞的共刺激或共抑制分子、B7家族成员、肿瘤坏死因子受体或肿瘤坏死因子配体超家族成员、TIM家族成员和半乳糖凝集素家族成员的试剂。在多个实施方式中，免疫调节剂是靶向PD-1、PD-L1、PD-L2、CD137(4-1BB)、CD137配体(4-1BB配体)、CTLA-4、OX-40、OX-40配体、HVEM、GITR、GITR配体、CD27、CD28、CD30、CD30配体、CD40、CD40配体、LIGHT(CD258)、CD70、B7-1、B7-2、ICOS、ICOS配体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、BTLA、半乳凝素-1、半乳凝素-9、CEACAM-1、CEACAM-4、CEACAM-5、LAG-3、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、HHLA2、HMGB1、BTLA、CRTAM、CD200、CCR4和CXCR4的试剂。
在一些实施方式中，所述免疫治疗剂通过与这些细胞表面蛋白中任一种的胞外结构域结合来阻断、减少和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2的结合(以及与CTLA-4结合的那些)。作为非限制性实例，这些抗体包括纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO，BRISTOL MYERSKIBB)，派姆单抗(KEYTRUDA，Merck)，MK-3475(MERCK)，BMS-36559(BRISTOL MYERSKIBB)，MPDL3280A(ROCHE)，YW243.55.S70，MPDL3280A，MEDI-4736，MSB-01和伊匹单抗(MDX-010，Yervoy)中的一种或多种。其他抗癌抗体是Daratumuab(抗CD38)和urelumab(BMS-663513，一种抗4CD137抗体)和奥法木单抗(抗CD20)。
除了上述药物之外，其他抗癌剂包括但不限于左旋门冬酰胺酶、乙酰甲酮、盐酸丙卡巴嗪、原卟啉-钴复合盐、血卟啉汞钠、拓扑异构酶I抑制剂(如依立替康、拓扑替康等)、拓扑异构酶II抑制剂(如索布唑烷等)、分化诱导剂(如维甲酸、维生素D等)、α-阻断剂(如盐酸坦索罗辛、萘哌地尔、乌拉地尔、阿夫唑嗪、特拉唑嗪、哌唑嗪、西洛多辛等)、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如，阿达沃塞替布、阿法替尼、阿夫利贝普、阿昔替尼、贝伐单抗、博舒替尼、卡波扎替尼、西妥昔单抗、考比替尼、克唑替尼、达沙替尼、恩替尼、厄达非替尼、埃罗替尼、福他马替尼、吉非替尼、伊布替尼、伊马替尼、拉帕替尼、伦瓦替尼、木利替尼、尼罗替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、帕纳替尼、兰尼单抗、瑞格拉非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、su6656、托法替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维莫非尼等)、内皮素受体拮抗剂(如阿特拉森坦等)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米等)、Hsp 90抑制剂(如17-AAG等)、螺内酯、米诺地尔、11α-羟基孕酮、骨吸收抑制/转移抑制剂(例如唑来膦酸、阿仑膦酸、帕米膦酸、依地膦酸、氯膦酸)等。
激素治疗剂的非限制性实例包括己烯雌酚二磷酸酯、二乙基苯乙烯醇(diethylstylbestrol)、氯烯雌醚、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、地诺孕素、阿索普尼、烯丙雌醇、孕三烯酮、诺美孕酮、他德南、美帕曲星、雷洛昔芬、奥梅洛昔芬、左美昔芬、抗雌激素(如柠檬酸他莫昔芬、柠檬酸托瑞米芬等)、ER调节器(例如氟维司群)、人绝经期促性腺激素、卵泡刺激素、丸剂、美雄烷、睾酮、氨基谷蛋白酰亚胺、LH-RH激动剂(如醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、表硫甾烷醇、炔雌醇磺酸盐、芳香酶抑制剂(如盐酸法多唑、阿那曲唑、曲唑、依西美坦、沃罗唑、福美司坦等)、抗雄激素(如氟他胺、比卡他胺、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制剂(例如，非那雄胺、度他雄胺、爱普列特等)、肾上腺皮质激素药物(例如，地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安奈德等)、雄激素合成抑制剂(例如，阿比特龙等)、以及类视黄醇和延缓类视黄醇代谢的药物(例如，利阿唑等)等和LH-RH激动剂(如醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林)。
在另一个实施方式中，癌症疗法可以包括益生菌、天然物质和营养药物(例如绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和白藜芦醇)、激素治疗(例如选择性雄激素受体调节剂(SARMs)，如依诺博沙姆(奥斯他林，MK-2866，GTx-024)、BMS-564,929、LGD-4033、AC-262,356、JNJ-28330835、LGD-3303、S-40503和S-23)、抗炎剂(如COX-2抑制剂和非甾体抗炎药(NSAIDs)，如塞来昔布(Celexicob)、万络、美洛昔康、布洛芬、萘普生(Anaprox、Naprosyn)、双氯芬酸(Cambia、Cataflam、Voltaren)、依托度酸(Lodine)、非诺洛芬(Nalfon)、氟比洛芬(Ansaid)和奥沙普秦(Daypro))、降胆固醇药物如他汀类(如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀等)、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂如iniparib(BSI 201)、BMN-673、Olaparib(AZD-2281)、Rucaparib(AG014699、PF-01367338)、Veliparib(ABT-888)、MK 4827、BGB-290和3-氨基苯甲酰胺、哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)的抑制剂、PI3K和IGF1R以及类维生素A。
在其他实施方式中，至少一种附加药物是靶向药物。本文使用的术语“靶向药物”是指通过干扰肿瘤生长所需的特定“靶向”分子来阻断癌细胞生长的治疗剂。参见上述Pasquetto，所述文献通过引用结合于此。在一个方面，靶向药物包括但不限于达沙替尼、伊马替尼、尼洛替尼、波舒尼布、勒斯塔替尼、鲁索替尼、克唑替尼、凡德他尼(vandetabib)、卡波替尼、地尼洛芬、依维莫司和替莫罗莫司等。
其他化疗剂或抗癌剂包括，例如，抗肿瘤酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、生长抑制剂、造血生长因子、免疫调节剂、趋化因子、细胞因子(例如白细胞介素2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或FLT 3-配体)、细胞迁移阻滞剂和血管生成抑制剂。血管生成抑制剂包括但不限于血管抑素、内皮抑素、血小板反应素、白细胞介素-12、金属蛋白酶1、2和3的组织抑制剂(TIMP-1、TIMP-2和T1MP-3)以及抗VEGF。
另一方面，所述至少一种附加药物可以包含维生素D分解代谢的抑制剂，例如，酶24-羟化酶的抑制剂。24-羟化酶将维生素D活性形式的循环水平降低至主要由粪便排泄的活性较低的形式。这种抑制剂的非限制性例子包括大豆异黄酮和染料木黄酮。可与式(I)或(II)化合物一起给药的其他组合包括但不限于吉西他滨和纳布-紫杉醇，以及依托泊苷和顺铂。
在另一方面，与本文公开的式(I)化合物联合施用给受试者的至少一种额外药物可包含微小RNA(miRNA)、miRNA的上调剂或下调剂或其组合。关于miRNA分析的最新研究表明了与正常组织相比，miRNA在乳腺癌中的表达差异。例如，miR-155、miR-21、miR-27、miR10b在本质上是上调和致癌的，而miR-125(a和b)、miR145和miR205是下调的。其他研究表明miR-140表达的缺失会导致乳腺癌进展的增加。作为非限制性实例，本发明的组合物可以与miR-125a、miR-125b、miR-200、miR-145、miR-205、miR-146a、let-7a-d、miR-26a、miR-34、miR-31、miR-101、miR-200b、miR-335、miR-126、miR-206、miR-17-5p和miR-140或其上调剂联合施用给受试者。其他非限制性实例，本发明的组合物可以与miR-155、miR-10b、miR21、miR-27和miR-520c以及miR-373的下调因子联合给药于受试者。
在另一方面，与本文公开的式(I)化合物联合施用给受试者的至少一种额外药物可包含DNA甲基化调节剂。众所周知，DNA甲基化和参与DNA甲基化的蛋白质的异常发生在癌症中。因此，本发明包括组合物和将DNA甲基化调节剂与本发明的式(I)化合物联合给药的治疗方法。在一些实施方式中，DNA甲基化调节剂是DNA甲基化抑制剂。DNA甲基化抑制剂的例子包括但不限于5-氮杂胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷、MG98或DNA甲基化激活剂如S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
非药物疗法的例子有外科手术、放射疗法、基因疗法、温热疗法、冷冻疗法、激光烧灼等及其任意组合。
实施例
以下实施例仅用于说明目的，并不对本发明权利要求的范围有任何限制。
实施例1：Cpd.11Ms和主要细胞毒性代谢物的生产。
材料和方法
Cpd.11Ms的合成和代谢
根据WO2014031012中描述的方法，使用起始化合物1(3,4-二氟苯甲醛)制备中间化合物2(3-氟-4-(甲磺酰基)苯甲醛)、化合物3(3-氟-4-(甲磺酰基)苯甲酸)和化合物4(5-氟-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酸)。化合物1-4也可以商业获得。酰氯化合物5是通过在加入DMF和草酰氯之前将化合物4悬浮在二氯甲烷和乙腈中以提供均匀的溶液而获得的。除去溶剂和过量的草酰氯后，将所得的粗酰氯化合物5溶解在二氯甲烷和THF中，冷却至-10℃，然后加入1-乙基哌嗪的二氯甲烷溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌，过滤收集所得沉淀，然后干燥，得到化合物6的粗盐酸盐((4-乙基哌嗪-1-基)(5-氟-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)甲酮)，然后将其悬浮在乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液处理。所得水相用乙酸乙酯进一步萃取，合并的有机层用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，所得固体溶解在二氯甲烷中，通过加入二异丙醚沉淀。过滤收集沉淀并干燥，得到化合物6((4-乙基哌嗪-1-基)(5-氟-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)甲酮)。
将化合物6溶解在DMF中，并在加入溴化锂之前冷却至0℃。形成了含有一些未溶解的溴化锂的粘性红色溶液。将反应混合物冷却至-5℃，加入1-氮丙啶乙醇形成糊状物。搅拌反应混合物，直到TLC(二氯甲烷/甲醇为24:1)显示没有原料残留。在2.5℃下加入去离子水，所得暗黄色溶液用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，所得黄色油进一步浓缩以除去残留的痕量DMF。将残余物溶解在乙酸乙酯中，装载到硅胶柱上，用二氯甲烷/甲醇为65:1和24:1的梯度洗脱进行色谱分离，收集副产物，在二氯甲烷/甲醇为19:1的条件下收集所需产物。浓缩含有产物的合并馏分，得到黄色固体形式的化合物7(5-(2-溴乙基)(2-羟乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯基)(4-乙基哌嗪-1-基)甲酮)。
将化合物7溶解在二氯甲烷中，冷却至-5℃，然后加入三乙胺和甲磺酸酐，后者先溶解在二氯甲烷中。反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液处理，水相用二氯甲烷萃取。用无水硫酸钠干燥合并的有机层并浓缩。将残余物溶解在乙酸乙酯中，装载到硅胶柱上，通过使用乙酸乙酯/甲醇32:1和19:1的梯度洗脱进行色谱分离，以收集副产物，并使用二氯甲烷/甲醇19:1收集、合并和浓缩含有化合物11(2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-1-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲磺酸盐，其为黄色玻璃状固体形式)的馏分。将化合物11溶解在二氯甲烷和甲醇中，并冷却至0℃。加入甲磺酸以形成溶液。将反应混合物在0℃搅拌，并在搅拌下升温至室温。除去溶剂后，浓缩所得黄色玻璃状固体，得到黄色粉末形式的化合物11Ms(4-(5-((2-溴乙基)(2-((甲磺酰基)氧基)乙基)氨基)-4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基)-1-乙基哌嗪-1-甲磺酸盐)。
通过应用常规分析技术，如TLC、1H NMR或HPLC，证实了反应过程中起始原料或中间体的完全转化、以上所列所得化合物的纯度和分子量。
Cpd.11氘代变体Cpd.11Ms-d8的合成
商业上可获得的氘代哌嗪(Pip-d8)的Boc保护按照文献程序进行。简而言之，将Pip-d8(2.00g，21.23mmol)溶解在甲醇(80ml)中，得到无色溶液。一份加入TFA(1.626ml，21.23mmol)，并将混合物搅拌15分钟，在此基础上形成稀薄的白色悬浮液。反应温度从20℃升至23℃。随后加入水(80ml)，混合物变成透明无色溶液，反应温度进一步升至28℃。混合物搅拌30分钟，同时冷却至室温。在2h内向混合物中滴加二碳酸二叔丁酯(4.63g，21.23mmol)和碘(0.109ml，2.123mmol)在甲醇(160ml)中的溶液。继续反应在室温下过夜，根据GCMS分析，形成Boc-Pip-d8(83.9％)和二-Boc-Pip-d8副产物(14.6％)的混合物。反应混合物为暗红色至棕色透明溶液，真空浓缩以除去甲醇和碘。这样得到了微黄色悬浮液(约50ml)。向搅拌的悬浮液中加入氢氧化钠水溶液(20％(w/v)，7ml)，直到pH达到11-12。悬浮液通过P3玻璃过滤器过滤，残留物(可能含有二-Boc副产物)用氢氧化钠水溶液(6％(w/v)，10ml)洗涤。滤液用乙酸乙酯(3×100ml)萃取，合并的有机相用盐水(60ml)洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩，得到3.43g无色透明油状Boc-Pip-d8，静置后结晶。GCMS分析显示Boc-Pip-d8制剂的纯度为99.6％。
氘代1-乙基哌嗪(Boc-Eipp-D8)的制备是使用Boc-Pip-d8(3.44g，17.70mmol)进行的，其在1颈烧瓶(100ml)中与乙腈(33ml)混合得到混浊溶液。将混浊溶液在冰浴上冷却15分钟，然后加入DIPEA(4.63ml，1.5当量(eq))和1-溴乙烷(1.98ml，1.5当量mmol)。移走冷却浴，混合物在室温下搅拌过夜。GCMS分析显示Boc-Eip-D8已经完全转化和形成了97.3％的面积。将反应混合物(混浊溶液)倒入盐水(150ml)和乙酸乙酯(50ml)的搅拌混合物中。向搅拌的混合物中加入水(10ml)，直到形成透明的两相体系。分离各层，有机层用盐水(50ml)洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩至干，得到3.61g粗Boc-EPip-d8，为浑浊的浅黄色油状物。用庚烷/乙酸乙酯(1:1，5ml)稀释所述物质，过滤所得悬浮液。滤液通过快速色谱法纯化(80g二氧化硅；庚烷中20-100％EtOAc)。收集所有含产物的级分，浓缩至干，用DCM洗涤，得到3.04g透明无色油状的Boc-EPip-d8。GCMS分析显示纯度>99％，1HNMR分析证实了结构。
通过将Boc-EPip-d8(3.04g，13.67mmol)溶解在二氯甲烷(90ml)中，然后滴加三氟乙酸(15ml，14当量)，进行随后的Boc-去保护以获得EPip-d8。水浴冷却5分钟，保持反应温度低于20℃。反应在室温下持续2h。GCMS的分析表明，原料完全转化为所需的产品。真空条件下浓缩混合物，用二氯甲烷(3x5ml)洗涤，得到9.65g无色油状的Boc-EPip-d8粗TFA盐。用饱和碳酸钾水溶液(30ml)和二氯甲烷(2×30ml)将1g这种粗物质游离出来。用二氯甲烷/甲醇(9:1；3×20ml)萃取，用硫酸钠干燥并真空浓缩后得到210mg粗游离碱。这种物质是一种无色油，含有少量固体(GCMS分析纯度>98％)。剩余的Boc-EPip-d8粗TFA盐(8.65g)在甲基叔丁基醚(150ml)中研磨过夜，过滤和干燥后得到3.95g白色粉末的TFA盐Boc-EPip-d8。根据1H NMR分析，这种物质是二TFA盐，纯度很高。经溶剂校正后的分离产率和游离碱的材料损失为92％。用饱和碳酸钠水溶液(20ml)和二氯甲烷(3×30ml)将500mg这种纯Boc-EPip-d82TFA游离碱化，用硫酸钠干燥并真空浓缩后得到140mg游离碱EPip-d8(温度<40℃，压力>150mbar)。这种物质是不含固体无色透明的油。GCMS分析显示纯度>98％，1HNMR分析显示结构一致。然后在基于上述化合物5的反应中使用EPip-d8，生成氘化中间体Cpd.6-d8，并因此反应生成Cpd.7-d8、Cpd.11-d8和Cpd.11Ms-d8。
Cpd.11代谢物Cpd.11c、Cpd.11d及其氘化变体的合成
通过溶于水(5ml)，加入二氯甲烷(10ml)并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，使Cpd.11Ms(0.50g)呈游离碱形式。水相反萃取，合并的有机层真空浓缩，产生Cpd.11游离碱(0.470g；HPLC纯度：96.6％)。
Cpd.11c是通过将游离碱Cpd.11溶解在乙酸乙酯(7.5ml)和THF(5ml)中，脱气和添加钯/碳(10wt％；SigmaAldrich，6mol％)。混合物在氢气气氛(气球)下搅拌2.5h。形成了63％的所需产物。若观察到过度还原，则反应停止。混合物用0.45μm过滤器过滤，真空浓缩，得到黄色油状的Cpd.11c游离碱(0.485g，95％产率)。
Cpd.11d是通过使用Pt/C催化氢化的硝基还原产生的。玻璃瓶装有磁力搅拌器、游离碱Cpd.11(100mg，0.17mmol)、乙酸乙酯(1ml)和碳载铂(5wt％，80mg，0.12当量)。用穿孔的隔膜封闭所述小瓶，并将其置于平行的高压釜中，在20℃下在40psi的氢气压力下搅拌过夜。反应混合物随后用小硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯(2ml)漂洗。将滤液浓缩至干，得到60mg粗Cpd.11d游离碱。HPLC和LCMS分析显示纯度为87％。一些杂质被LCMS预处理去除(洗脱剂：MEcn/水碳酸氢铵)。含馏分的产物用二氯甲烷萃取，用硫酸钠干燥，浓缩至干(温度<30℃)。在通过Pt/C催化氢化进一步硝基还原后，产物然后通过Prep-SFC(洗脱剂：CO2/甲醇+20mmol氨)再提纯，得到灰白色泡沫状的Cpd.11d。HPLC分析显示纯度为98.9％。
氘化变体Cpd.11c-d8和Cpd.11d-d8是使用Cpd.11DBMS-D8和上述Cpd.11c和Cpd.11d的方案生产得到的。
结果
使用WO2014031012中公开的化合物进行的临床前研究确定了一系列硝基苯基氮芥前药，这些前药是通过HPLC、MS、NMR和元素分析进行合成和表征的。然而，所述文献既没有公开最合适的医用化合物，也没有公开最合适的医用用途。事实上，更广泛的临床前验证还需要建立一种化合物的合成方法，所述方法能够获得所需的化合物，其数量和质量足以将其开发为可用于治疗癌症的HAPs。
在WO2014031012中式(I)的4-烷基砜前药(特别是在图1A所示的那些)中，本发明的特定化合物在水溶性、耐受剂量和/或生物利用度方面最有前景。WO2014031012公开了一些式(I)的对称和不对称卤代烷磺酸盐的通用方案。为了得到对所选化合物的细胞毒性更敏感的癌细胞的更广泛的表征，选择化合物11(Cpd.11，在WO2014031012中鉴定为化合物311)作为参考化合物，用于确定优选的盐(甲磺酸盐，命名为Cpd.11Ms)和改进的生产方法。图1B中总结的这一过程以及相关的中间产物，可以概括为提供足够量的式(I)不对称卤代烷磺酸盐氮芥，用于在相关的基于细胞和动物的癌症模型中测试化合物，并评估临床前试验中进一步验证的具体用途。
一般来说，前药的生物活性，特别是式(I)的卤代烷磺酸盐的生物活性，是由它们在缺氧条件下被人酶代谢成细胞毒性化合物而产生的。然而，本发明中所述过程中的具体步骤可能与常氧或无氧条件有关。如图1C所示的基于Cpd.11结构的方法中举例说明的，替代结构(Cpd.11a、Cpd.11b、Cpd.11c和Cpd.11d，在体内具有可变的但通常短的半衰期)可由氧化状态和Cpd.11与在正常组织、肿瘤的常氧区和肿瘤的缺氧区中可变表达和活性的人酶的相互作用产生。在后一种情况下，氧的缺乏触发从Cpd.11a到Cpd.11b的关键转变，以允许产生细胞毒性化合物，然后在所述位置发挥它们的活性，并可能有助于生物体破坏整个肿瘤，单独或与免疫抗癌反应或疗法(如放疗、化疗和/或其他药物)联合。
额外的式(I)化合物可以制备为对应于体内产生的代谢物的合成化合物，或者制备为氘原子取代哌嗪环中的氢原子的氘化变体(图2)。除了它们的治疗活性之外，这些变体可以用于评估式(I)化合物的定位、代谢、积累和/或生物活性。
实施例2：Cpd.11Ms和Cpd.11c和Cpd.11d作为在缺氧条件下具有活性的抗癌剂的体外验证。
使用Cpd.11Ms的基于癌细胞系的分析
用于体外和/或体内研究并显示结果的受试癌细胞系可通过ATCC或DSMZ获得(莱布尼茨-研究所-德国微生物研究所)，并按癌症类型进行分组，见表I。
表I
其他癌细胞系仅进行了基于体外缺氧的细胞毒性试验，证实了Cpd.11d的敏感性，涵盖了这些和其他癌症亚型：对于乳腺癌、EFM-192A(鲁米那B)、EVSA-T(PR+/ER)和JIMT-1(HER 2+)；对于肺癌，其他几种非小细胞肺癌或小细胞肺癌细胞系；用于胰腺癌、癌(DAN-G,YAPC)、腺癌(HUP-T4)。所有细胞系都保存在细胞培养瓶中，并根据供应商的说明使用完整的培养基。
使用Cpd.11Ms、Cpd.11c和Cpd.11d的基于细胞的分析
IC50值是在缺氧(<0.01％O2)和/或常氧(21％O2)条件下使用基于刃天青的效价测定获得的。缺氧细胞毒性比(HCR)计算为缺氧时IC50值与常氧时IC50值之比(HCR＝常氧时IC50/缺氧时IC50)。
对于缺氧条件，每个细胞系的完整培养基(T25中25ml或T80中80ml)在使用前48h在缺氧室中平衡，以允许培养基和大气之间尽可能大的交换，在使用前每天搅拌烧瓶一次。用于细胞接种的96孔板和用于制备含有适当浓度待测化合物(如Cpd.11Ms)的母板的96孔板，以及缺氧条件下细胞接种所需的一次性试剂容器和移液管尖端，在使用前进行至少缺氧72h处理。用缺氧培养基制备缺氧处理细胞的母板，在缺氧预培养的塑料中，用标准细胞培养罩中的常氧培养基制备常氧处理细胞的母板。
从细胞悬浮液(70％细胞融合烧瓶)开始进行细胞接种。使用合适的细胞数量/体积计算通过执行生长曲线实验所确定的预定的细胞密度(通常为100μl/孔)。对于缺氧条件，将适当数量的细胞转移至缺氧室，并在缺氧完全培养基中稀释至适当的细胞浓度。让细胞在37℃的缺氧室中粘附2h。在常氧条件下，使用通常的细胞接种和完整的培养基方案(在96孔板中以100μl/孔的体积)。让细胞在常规细胞培养CO2培养箱中于37℃粘附2h。在这两种情况下，96孔板中剩余的空孔填充200μl缺氧或常氧介质以防止蒸发。
新鲜Cpd.11Ms原液在实验前解冻并避光。96孔微量滴定板在第一个柱中填充176.4μl完全常氧或缺氧培养基，在其他柱的孔中填充120μl完全常氧或缺氧培养基和2％DMSO。每孔3.6μl复合原液(Cpd.11、Cpd.11Ms、Cpd.11c或Cpd.11d；150mM)添加到第一个柱中。将第一个柱的溶液上下移液，将60μl移至第二个柱，在每次移液之间进行1/3系列稀释上下移液3次。这样一直重复到第11个柱。第12个柱不添加Cpd.11Ms。在使用前不超过30分钟的时间内将所述板准备好，并防止直接曝光。接种细胞后2h，向每个孔中加入100μl的母板，并将板在缺氧室或37℃的细胞培养培养箱中保留4h。4h后，将缺氧室中的板转移至常氧。在显微镜下对所有板(每个板几个随机孔)进行目视检查，并通过抽吸从所有板上移除培养基。用200μlPBS(RT)洗涤细胞一次，并将200μl新鲜常氧完全培养基(RT)加入每个孔(包括所有没有细胞的孔)。所有平板在标准细胞培养培养箱中于37℃常氧下孵育96h。
对于细胞生存力测定，刃天青最终工作溶液是通过将刃天青原液(0.1mg/ml)稀释1/10在相应细胞系的完全培养基(RT)中以获得0.01mg/ml刃天青的最终浓度而新鲜制备的。在常氧条件下培养96h后，在显微镜下对所有平板(每块平板上有几个随机孔)进行目视检查，并通过抽吸除去每个孔中的培养基。每孔加入刃天青最终工作溶液(200μl)(包括所有没有细胞的孔)，细胞在CO2培养箱中于37℃孵育2h。通过使用TECAN荧光读取器进行平板读数，测量激发535/35nm和发射610/20nm的荧光。RFU值(相对荧光单位)计算为RFU值的平均值，所述平均值与每板中含有相同培养基的无细胞孔进行比较，以获得每个板的空白值(从每个孔获得的RFU值中减去)。使用Graphpad棱镜进行统计数据分析。
基于三磷酸腺苷的体外效价商业测定(CellTiter-Glo 2.0发光细胞活力；Promega)用于评估51种人类癌细胞系(包括乳腺癌细胞系、胰腺癌细胞系和肺癌细胞系)的复合功效，这些细胞系适用于在常氧和缺氧条件下测定IC50。
结果
在一组癌细胞系中进行了式(I)化合物的第一类验证，其中在低氧或常氧条件下已经建立了细胞毒性活性，特别是通过计算常氧和低氧的中值抑制浓度(IC50)和反映低氧选择性细胞杀伤的缺氧细胞毒性比(HCR)，也用于其他HAPs如TH-302(Meng F等,2012)。表II总结了用Cpd.11Ms测试的一系列癌细胞系的数据。
表II
平均值来自至少2个独立实验
HCR＝缺氧细胞毒性比NRX＝常氧ANX＝缺氧SD＝标准偏差
Cpd.11Ms细胞毒性在癌细胞系中得到验证，这些癌细胞系是从具有不同分子特征的癌症中分离出来的：外分泌胰腺腺癌(对于BxPC-3和PANC-1)、非小细胞(对于NCI-H1650和NCI-H1975)和小细胞(对于DMS114)肺癌、HER2阳性(对于BT-474)、基底样(对于HCC1937)和间充质样(对于MDA-MB-231)乳腺癌细胞。对一组乳腺癌、肺癌和胰腺癌细胞系使用另一种测定法(基于三磷酸腺苷的效价测定法)产生额外的数据，获得IC50和HCR值，证实这种化合物细胞毒性的缺氧依赖性和特异性(图3A)。
所述分析可允许验证式(I)的对称和不对称卤代烷磺酸盐中的选定化合物，和/或(根据癌细胞系的选择)对其细胞毒性衍生物(例如图1C中Cpd.11Ms的示例)与肿瘤特异性低氧条件相关的特异性敏感的其他类型或亚型。例如，Cpd.11Ms在全身给药后可作为Cpd.11从生物学上获得，并可通过单电子还原酶转化为氧传感中间体Cpd.11a。所述中间体在低氧条件下产生时(如在肿瘤的特定区域发现的那些)，可进一步转化为氧不敏感的亚硝基衍生物Cpd.11b，然后通过氧不依赖的还原酶迅速转化为羟胺细胞毒素Cpd.11c和胺细胞毒素Cpd.11d，它们在低氧区域对癌细胞具有生物活性，并在活化时将细胞毒性代谢物重新分布或扩散至邻近细胞(旁观者效应)。事实上，同一组癌细胞系显示出Cpd.11Ms向羟胺细胞毒素Cpd.11c和胺细胞毒素Cpd.11d的强而快速的转化比率(图3B)，当通过化学合成制备并随后在常氧条件下在这种细胞系上直接测试时，两者都被证实对一组癌细胞系具有细胞毒性(图3C)。
如果对Cpd.11Ms的敏感性因细胞系而异，无论如何，在缺氧时对Cpd.11Ms的敏感性始终要高得多，获得的缺氧细胞毒性比值为10或更高。这些证据可以在生长单层或形成球体的其他癌细胞系中得到证实，其中低氧条件和药物效应或代谢可以使用显微镜、荧光探针和/或抗体进行更详细的评估。
实施例3：Cpd.11Ms在肺癌、胰腺癌和乳腺癌动物模型中的功效。
材料和方法
动物模型
所有动物模型都是在BALB/c裸鼠(6-8周龄，17-23g，保持在标准条件和饮食中)中建立的异种移植模型，遵循机构动物护理和使用委员会批准的协议。Cpd.11Ms使用2％DMSO(注射用的DMSO水溶液，起始于Cpd.11Ms主制剂(100-60mg/ml，2％DMSO注射用水溶液))配制。
肿瘤细胞接种后，每天检查动物的发病率和死亡率。治疗开始前，对所有动物称重，并用测径器测量肿瘤体积。当平均肿瘤大小达到约250mm3时，开始治疗。每个治疗组/对照组包含10只随机分配的小鼠，每天注射，持续5天。肿瘤细胞接种的日期表示为第0天(因此在第1、2、3、4和5天进行注射)。在常规监测时，检查动物的肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，如活动度、食物和水消耗量的视觉估计、体重增加/减少(在5天治疗期间每天测量体重，治疗后每周测量3次)、眼睛/头发垫(matting)和任何其他异常影响。死亡和观察到的临床症状是根据每个亚组中的动物数量记录的。在5天治疗期间每天测量肿瘤体积，治疗后每周三次使用卡尺进行二维测量，体积用mm3表示，公式为：V＝0.5a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径。给药以及肿瘤和体重测量的整个过程在层流柜中进行。当肿瘤大小达到1400-1600mm3时，通过颈椎脱臼对个体小鼠实施安乐死。计算存活率的替代终点并表示为TV×4(初始肿瘤体积乘以4)。实验结束时，采用独立样本检验对各组间肿瘤体积的差异进行统计分析。所有数据均在SPSS(统计产品和服务解决方案)18.0版(IBM，Armonk，NY，U.S)中进行分析。P值四舍五入到小数点后三位，但小于0.001的原始P值表示为P<0.001。所有测试都是双向的。P<0.05被认为具有统计学意义。
对于MDA-MB-436肿瘤(ATCC:HTB-130；传代:P4)，将细胞作为单层培养物在补充有10％热灭活胎牛血清的L-15培养基中，在37℃和100％空气气氛中体外保持。对于NCI-H69(ATCC:HTB-119；传代:P3)，肿瘤细胞在添加10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，温度为37℃，含5％CO2的空气气氛中在体外保持。对于PANC-1(ATCC:CRL-1469；传代:P2)，肿瘤细胞单层培养在添加有10％热灭活胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃和含5％CO2的空气气氛中在体外保持。肿瘤细胞通常每周通过胰蛋白酶-EDTA处理亚培养两次。收获以指数生长期生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。每只小鼠在0.1mlPBS中混合基质凝胶(1:1，康宁，#354234)接种1×107个肿瘤细胞(对于MDA-MB-436模型在右侧乳腺脂肪垫处原位接种，或者对于NCI-H69模型和PANC-1模型在右侧区域皮下接种)以用于肿瘤发展。这些材料和方法适用于特定人类癌细胞系的其他异种移植癌细胞模型，总结如下表III。
异种移植癌模型中低氧状态和DNA损伤的评估。
为了评价Cpd.11Ms治疗对诱导DNA损伤的影响，在小细胞肺癌模型DMS 114中进行了pH2AX染色的组织学分析和pH2AX和哌莫硝唑染色的共定位研究。在以600mg/kg的剂量单次施用Cpd.11Ms后6h评估DNA损伤。盐酸哌莫硝唑和pH2AX(组蛋白H2A.X，磷酸S139)抗体可通过商业上(抗哌莫硝唑盐酸盐，HP FITC Mab-1，HPI Hypoxyprobe Inc；抗组蛋白H2A.X(磷酸S139)抗体[EP854(2)Y]ChIP级，ab81299，Abcam)购买获得。从每个异种移植物样品中，获得3个非连续的5μm切片，每个切片之间的间距为50μm。从每个水平上，根据所需的染色，制备了两个或三个连续切片，并收集在两个或三个载玻片上：i)H&E和皮莫尼唑，或ii)H&E、皮莫尼唑和pH2AX。染色前切片在约37℃下干燥过夜。使用哈里斯苏木精和1％曙红在徕卡ST4040染色平台上进行苏木精-曙红(H&Es)染色。在抗原回收和随后的蛋白质封闭后，在研究组织切片上以1:48000的浓度孵育pH2AX抗体60分钟。使用3％过氧化氢(水溶液)淬灭内源辣根过氧化物酶(HRP)活性后，使用基于聚合物的辣根过氧化物酶驱动检测系统和免疫印迹DAB显色剂观察pH2AX的结合，在抗体结合位点产生棕色反应产物。然后将苏木精核复染剂应用于组织切片。在研究组织切片上以1:5000的浓度孵育皮莫尼唑(FITC偶联)抗体60分钟。用3％过氧化氢(水溶液)淬灭内源性辣根过氧化物酶(HRP)活性后，用辣根过氧化物酶偶联的兔抗FITC二级抗体(HPI Hypoxyprobe Inc,anti-FITC-HRP)和免疫印迹DAB显色剂观察到吡莫尼唑的结合，在抗体结合位点产生棕色反应产物。然后将苏木精核复染剂应用于组织切片。所述方案的其他步骤根据文献或制造商的说明进行。
结果
基于细胞的分析和对肿瘤缺氧的全面了解建议选择一系列异种移植模型，以专门验证Cpd.11Ms在乳腺癌、肺癌和胰腺癌中的疗效。在这种模型中获得的结果可以进一步转化为对式(I)的对称和不对称卤代烷磺酸盐的细胞毒性衍生物敏感的癌症(亚)类型的定义。
使用MDA-MB-436人细胞(TNBC三阴性乳腺癌的一种生长相对缓慢的肿瘤模型，对烷化剂或顺铂敏感)，在对体重无影响的情况下，仅用Cpd.11Ms的单个治疗周期就观察到强烈的反应，在治疗动物中肿瘤显著消退，相应的替代生存指数中值是载体治疗动物的两倍以上(图4)。在另一个三阴性乳腺癌异种移植模型中，使用MDA-MB-231乳腺癌细胞系获得了相当的疗效和无毒性数据，所述模型是一个相对快速生长的MDA-MB-231TNBC肿瘤模型，对烷化剂相当不敏感。单个治疗周期导致肿瘤生长速度降低。
类似地，使用NCI-H69人细胞(小细胞肺癌的一种相对快速生长的肿瘤模型，对烷化剂敏感)，在单一治疗周期中观察到类似的强烈反应，与载体治疗的动物相比，在没有体重影响的情况下，肿瘤在初始生长率降低后显著消退。在所述肿瘤模型中，Cpd.11Ms治疗动物的替代生存指数中值与载体治疗动物相比也增加了一倍(图5)。在另一个相对快速生长的肺癌异种移植模型中，使用NCI-H1650肺癌细胞系获得了参照数据，所述模型对烷化剂包括顺铂相当不敏感。Cpd.11Ms的单个治疗周期对替代生存指数中值有显著影响。
最后，使用PANC-1人细胞(PDAC胰腺癌的一种生长相对缓慢的肿瘤模型，对烷化剂不太敏感或不敏感)，观察单个治疗周期的反应，肿瘤生长明显延迟，导致替代存活指数中值显著增加(P＝0.0018)约50％(图6)。
使用NCI-H69人肺癌模型，使用在1周或3周内的连续(在第1、2、3、4和5天；在第1、2、3天)或非连续(在第1、4和7天)替代方案测试治疗反应水平(就肿瘤大小和生存力而言)。这种反应似乎与连续给药的次数有关，并且在3周内重复给药导致更长期的肿瘤控制，并且可以挽救后续的肿瘤逃逸或转移。
所述分析扩展到基于其他乳腺癌、肺癌或胰腺癌细胞系(在缺氧细胞培养条件下对Cpd.11Ms都敏感)的其他异种移植模型，但同时评估由这些细胞诱导的肿瘤缺氧状态和观察到的抗肿瘤效果之间的任何关系。主要结果总结在表III中。
表III
主要结论是，独立于癌症类型或对常见药物如顺铂的敏感性，低氧状态与至少可测量的抗肿瘤消退相关，而没有显示低氧区域的胰腺肿瘤异种移植模型(可能是由于实验之间的固有可变性和肿瘤接种的特定位置)似乎对Cpd.11Ms细胞毒性活性也不敏感。这些似乎被Cpd.11Ms特异性靶向的缺氧区域也是那些呈现DNA损伤和加合物浓度的区域，这可能解释了所述化合物的细胞毒性(图7)。当比较常氧(哌莫硝唑阴性)和低氧(哌莫硝唑阳性)区域(P＝0.023)时，在Cpd.11Ms治疗的动物中观察到显著更高的DNA损伤，而在载体治疗的对照组中没有观察到这种统计学上显著的差异。此外，当比较Cpd11Ms处理的动物和载体处理的动物时，观察到低氧(哌莫硝唑阳性)区域的DNA损伤显著增加(P＝0.038)，而常氧区域在统计学上没有显著差异。因此，这些结果进一步证实了缺氧特异性激活和随之而来的DNA损伤。Cpd.11Ms给药对缺氧的明显影响也通过不同治疗方案(400-800mg/kg，连续1-5天)的MDA-MB-46841肿瘤异种移植模型中的皮莫唑免疫组织化学染色得到证实。
这些数据可以在相同Cpd.11Ms的其他动物模型中进一步验证，和/或与在相同模型中产生的具有式(I)的其他对称和不对称卤代烷磺酸盐氮芥的数据进行比较，单独或与放射疗法或化合物组合，所述化合物如埃罗替尼(一种受体酪氨酸激酶抑制剂，作用于表皮生长因子受体并用作治疗非小细胞肺癌、胰腺癌和其他几种类型癌症的药物)，多柔比星(一种用于治疗多种类型癌症如乳腺癌、膀胱癌、卡波西肉瘤或淋巴瘤的化疗药物)、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂(一组新的检查点抑制剂，主要是与细胞表面存在的这些蛋白质中的任一种结合的抗体和作为多种类型癌症的一线治疗出现的免疫检查点抑制剂)、PARP抑制剂(或影响人类细胞中DNA修复的其他化合物)或白细胞介素-2(一种对细胞介导的免疫有活性的细胞因子，以不同的重组形式用于治疗癌症如恶性黑色素瘤或肾细胞癌)。根据一个或多个标准，如协同作用、给药剂量和/或给药频率的减少、更宽的治疗窗、克服(或避免)抗性、改善的癌症特异性免疫反应和/或减少不希望的副作用，将式(I)的对称和不对称的卤代烷磺酸盐氮芥(如Cpd.11Ms)与这些化合物中的任何一种(或属于同一类药物的化合物)同时或依次联合给药，可以改善呈现低氧特征的癌症的治疗反应。
实施例4：Cpd.11Ms作为抗癌剂的临床验证。
前面的实施例2和3已经给出了由式(I)化合物如Cpd.11Ms和式(II)化合物如Cpd.11c和Cpd.11d产生的临床前生物学和治疗学相关数据，这些数据支持对这类化合物(特别是Cpd.11Ms)作为实体瘤患者的抗肿瘤剂的评价，特别是当肿瘤表现为缺氧区域时。连同Cpd.11Ms(及其代谢物)的药代动力学、药理学和毒理学，这些来自使用式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥的临床前研究的数据，Cpd.11Ms可用于在治疗癌症患者和特定癌症类型的临床环境中建立临床验证。特别地，可以基于肿瘤微环境的特征，特别是氧扩散和消耗的梯度，导致大部分实体肿瘤中的缺氧亚区域来选择化合物例如Cpd.11Ms，其可以提供最相关功效的受试者和临床状况。肿瘤对这种氧供需失衡的适应与临床预后不良有关，类似的低氧特征已被确定为多种癌症类型的强不良预后特征，包括头颈癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、软组织肉瘤和脑肿瘤。此外，缺氧已被证明是更多种类实体瘤的负面因素，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌，以及血液恶性肿瘤。
缺氧不仅对整个肿瘤生物学，而且对治疗的反应性都有显著的影响，如对放射治疗(由于缺乏固定电离辐射造成的DNA损伤所需的氧气而引起)或通过文献中描述的多种生物学机制对化疗和免疫治疗(如抑制免疫反应性、诱导肿瘤血管生成、选择有利于癌症存活的基因型、在缺氧条件下诱导侵袭和转移)的缺氧特异性抗性。如临床前模型所示，化合物如Cpd.11Ms可抑制或阻断这种缺氧驱动机制，并可以以相对高的浓度配制和给药，具有体内毒理学和药代动力学特性，允许较大程度的暴露于前体药物，使其在缺氧部位以治疗相关水平进行活化。化合物如Cpd.11Ms可为患者提供对癌症的直接(或间接)治疗效果，特别是在需要对抗缺氧对其他标准护理治疗结果的负面影响的药物的情况下或患者中，并且其可以作为前药安全给药，所述前药在缺氧肿瘤区域中被选择性的激活，激活的代谢物重新分布到附近的细胞中(旁观者效应)。
式(I)的卤代烷磺酸盐的有效临床应用和给药，例如Cpd.11Ms，可以与患者选择或分层的方法(基于缺氧和/或对烷基化药效团的敏感性)相关联，这些方法可以是通常可获得的或专门为这些化合物开发的方法(包括基于液体活组织检查(血液)的CP-506基因标记)。为了评估临床使用和施用式(I)的卤代烷基磺酸盐氮芥如Cpd.11Ms的可行性，可以与其他低氧活化前药(HAPs)如evofosfamide(TH-302)和PR-104进行比较。在这些技术中，氧增强和动态对比增强磁共振成像(OE-MRI和DCE-MRI)、正电子发射断层扫描(PET)和其他基于放射学的方法是适用于各种癌症类型的技术，其允许以非侵入性方式检测和量化患者中的肿瘤缺氧含量，从而实现患者分层或患者选择。此外，应用这些基于放射组学的或成像技术(使用/不使用示踪剂)来跟踪治疗期间肿瘤的演变(在氧化和/或坏死方面)，可能有助于建立以标准量或增加量的Cpd.11Ms重复治疗周期的最佳时间。可用于确定优选药物方案、患者、临床阶段和/或癌症亚型的缺氧临床成像已在最近的几篇出版物中进行了综述(Challapalli A等,2017；Crispin-Ortuzar M等,2018；Liu JN等,2017；PujaraAC等,2019；SalemA等,2018)。
可选的，或者除了非侵入性技术之外，可以在Cpd.11Ms治疗之前和治疗期间从患者中获得肿瘤活检，用于分析以确定肿瘤氧化和坏死以及其他目的，例如Cpd.11Ms活性和定位的概念验证(以量化Cpd.11c或Cpd.11d代谢物或特定DNA加合物的存在以及肿瘤中DNA损伤的诱导)。此外，在用Cpd.11Ms治疗的一个或多个患者的肿瘤中的后验癌症特征可能有助于确定哪个特征将预测对Cpd.11Ms的癌症敏感性，例如，通过评估给定肿瘤中的缺氧基因特征或同源重组&DNA修复机制状态，如文献中所述(Oda K等,2017；Sunada S等,2018；Sztupinszki Z等,2018；Talens F等,2017；von Wahlde MK等,2017；Yang L and West CM,2018)或通过使用已经商业化的测试，如BRCA相关或HRD相关的测试，覆盖特定基因突变(如美国犹他州麦利亚德遗传学公司商业化的测试)。这些部分重叠的目的还可以支持使用液体活组织检查开发Cpd.11Ms特异性基因签名，方法是允许使用两种不同类型的样本和/或技术获得的结果相互关联。肿瘤活检的可用性将使我们能够在临床上确认使用液体活检来检测任何预示(缺乏)单个患者Cpd.11Ms治疗效果的信号的可行性，并支持Cpd.11Ms在更多癌症(子)类型中的整体临床发展。
对大鼠和狗静脉注射Cpd.11Ms的初步毒理学研究表明，在大鼠体内剂量等于或低于400mg/kg、狗体内剂量等于或低于100mg/kg时，骨髓、胸腺和淋巴结(已知有缺氧环境)等组织的潜在血液学毒性可降至最低。因此，人体受试者的这些水平分别相当于2360mg/m2和2000mg/m2。在小鼠模型中进行的功效研究表明，在连续3天(QD×3)或5天(QD×5)的单个周期中，通常使用600mg/kg(相当于人类使用1800mg/m2)的剂量，对癌症具有很高的疗效，这在重复周期中更为明显。替代给药方案还包括每周给药，每次3或4周，最多连续给药3或4次。此外，QD×3或QD×5的初始剂量也可以与较低频率的给药方案相结合，所述给药方案仍然可以对肿瘤的生长和发展产生治疗效果，例如在3至4周的周期中最多3或4周的剂量，或者每月一次(或每3-4周一次)的方案，所述方案可以与适当的标准护理方案平行治疗或不平行治疗。
式(I)的卤代烷基磺酸盐如Cpd.11Ms可以以最小毒性和高治疗效力给药的剂量水平在1200-2400mg/m2之间的范围内(对应于小鼠为400-800mg/kg)。这样的剂量和更高的剂量(高达8000mg/m2)预计在单一疗法中患者可以很好地耐受。在联合用药的情况下，可能需要较低的剂量(高达4000mg/m2)，例如常规化疗或放疗，以确保患者的安全，但这些仍有望达到治疗效果。这些标准的治疗方法以强烈增殖的细胞为目标，通常具有细胞周期依赖性活性。然而，由于缺乏营养和氧气，肿瘤的缺氧区域通常含有少得多的增殖细胞，并且这种肿瘤细胞通常对许多化疗更具抗性。此外，临床前模型显示，式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥如Cpd.11Ms对对顺铂和/或苯丁酸氮芥有抗性的特定癌细胞系具有高度细胞毒性。因此，由于其性质和生物效应(即低氧选择性激活和高效烷基化活性)，式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥如Cpd.11Ms呈现出非常不同的治疗部分，特别是与其他烷化剂相比，其可用于癌症单一疗法，但更优选用于癌症联合疗法，其包括标准护理治疗如化疗，以诱导更好的反应，增加无进展生存率，生活质量，并最终提高这些患者的总生存率。
式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥的临床前开发和验证阶段，如Cpd.11Ms，已经允许定义特定的优选药物制剂，其可以在符合临床验证研究的GMP条件下制造，例如作为在γ辐射下灭菌的粉末填充小瓶。Cpd.11Ms在这种灭菌条件下足够稳定，并且具有足够的水溶性，可以立即在注射用水中以100mg/ml的浓度进行稀释，添加到葡萄糖输注袋中。可以加入氢氧化钠以确保静脉注射的酸碱度可以接受。在式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥如Cpd.11Ms的临床前验证和毒理学过程中获得的发现可用作在选定的小患者群体中设计临床研究的基础，然后用于建立更大的临床研究，其中进一步定义了患者的纳入标准和概况，以更好地表征将受益于这种抗癌治疗的患者群体。事实上，缺氧与肿瘤侵袭性或恶性肿瘤相关，并且已知会诱导对标准护理疗法的抗性，而不是驱动增殖和肿瘤生长，因此式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥如Cpd.11Ms可与针对氧化良好的增殖细胞的其他治疗结合，以最大化其效力。
初步试验可设计为Cpd.11Ms的I期/II期研究、开放标签、非受控、多中心、多剂量递增研究。研究的初始部分(Ia期部分)将是对任何实体肿瘤患者的单一疗法剂量递增研究，这些患者已用尽所有现有的治疗选择。为了确定最大耐受剂量(MTD)和药代动力学特征，可以使用初始3+3受试者每剂量队列设计，其中每个患者通过连续三天超过2h的静脉输注接受Cpd.11Ms的起始剂量，随后是18天的观察期(QD×3方案，每3周)。由于这是人类研究中的首次，在招募下2名患者之前，对每组的第一名患者进行治疗并随访一周，以防止任何安全问题。一旦这三名患者完成他们的周期，将与临床研究人员举行会议，以评估治疗的安全性和耐受性。如果没有观察到剂量限制毒性(DLTs)，那么将评估下一个剂量水平，扩大到24名患者。如果三个受试者中有一个经历了DLT，那么队列将扩大到6个受试者。如果3名受试者中有2名或更多受试者，或6名受试者中有2名或更多受试者在一个剂量群组中经历了DLT效应，则所述剂量水平将被视为不耐受，MTD被定义为导致6名患者中≤1名在第一周期中经历DLT效应的最高剂量水平。剂量递增将根据系列队列中的修正斐波那契序列以递减的增量发生，每个患者可每21天接受一次Cpd.11Ms的指定剂量，只要研究者认为对患者有益。
一旦第三批Ia期部分被评估为耐受性良好，Ib期部分就可以开始与Ia期部分并行运行。第二部分也可以是剂量递增设计，但在组合设置中，特别是铂依托泊苷(具有/不具有抗PD1或抗PD-L1)，包括最多15名QD×3方案下的患者(每三周重复一次)。Cpd.11Ms联合铂依托泊苷的安全性和耐受性可作为小细胞肺癌(SCLC)患者的一线或二线治疗进行评估，SCLC仍是最具侵袭性的癌症类型之一，5年生存率低于5％。多项研究强调了小细胞肺癌肿瘤中缺氧的存在，这是一个非常高的未满足的需求，无论是治疗初治患者还是复发/难治性疾病患者，30多年来护理标准一直没有变化，除了最近FDA批准抗PD-L1与铂依托泊苷联合用于小细胞肺癌。一线SCLC治疗在很大程度上仍然是铂依托泊苷化疗，并且仍然非常需要延迟疾病进展和/或增加与健康相关的生活质量参数的毒性较低的治疗，SCLC是一种罕见疾病(ORPHA70573)，这意味着更快和专门的药物批准途径。
Cpd.11Ms的给药可能对已知复发率高的患者群体最有价值，因为重复治疗时的靶向不完全和/或耐药性增加。以上定义的3+3临床设计可用于确定可用于治疗扩大队列(包括每三周重复一次的QD×3方案下最多50名患者)的推荐II期剂量(RP2D)，以进一步评估联合用药的耐受性和安全性，并通过肿瘤消退进行初步疗效评估，相应的缓解时间、无进展生存期和总生存期更长。胰腺癌(与吉西他滨+/-n-白蛋白结合型紫杉醇联合)、三阴性乳腺癌(与n-白蛋白结合型紫杉醇联合)和非小细胞肺癌(与抗PD1或抗PD-L1疗法联合)也有类似的临床开发计划。
在Ia/Ib阶段和第二阶段研究期间，或在更大的随机研究中，治疗相关读数(read-out)的评估和比较可以与替代终点、生物标志物、药物代谢物和其他生物特征的评估相结合，这些替代终点、生物标志物、药物代谢物和其他生物特征可以通过在患者和临床样本中使用现有技术进行研究，并指导更适合给定患者群体和癌症类型或阶段的方案、剂量和/或组合的选择。基于这些临床和生物学发现，可以在临床环境中对目前接受与Cpd.11Ms给药剂量和方案相容的标准护理治疗的不同和更广泛的患者群体评估Cpd.11Ms或式(I)的其他卤代烷磺酸盐氮芥的组合使用的其他潜在设置，以确认临床可行性和预期疗效。如一些动物模型已经部分证实的，Cpd.11Ms可提供治疗相关效应的这类癌症的例子是三阴性乳腺癌(TNBC；与紫杉烷或蒽环类药物组合，甚至进一步与环磷酰胺或PARP抑制剂组合)、非小细胞肺癌(NSCLC；与顺铂单独或与紫杉烷、吉西他滨、培美曲塞、依托泊苷或检查点抑制剂如抗-PD-1或抗-PD-L1抗体联合使用)、小细胞肺癌(SCLC；进一步与检查点抑制剂如抗-PD-1或抗-PD-L1抗体、PARP抑制剂、卡铂、鲁比奈丁、伊立替康联合)、胰腺导管腺癌(PDAC；与吉西他滨和白蛋白结合型紫杉醇、FOLFOX或FOLFINIROX联合使用)、转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC；与多西他赛/卡巴他赛以及抗雄激素类药物、紫杉烷、铂、阿比特龙或恩扎鲁胺联合使用)、卵巢癌(与铂、卡铂和/或PARP抑制剂联合使用)。此外，这种疗法还可能包括放射疗法。
可与Cpd.11Ms或其他式(I)的卤代烷磺酸盐氮芥结合研究的额外标准护理治疗(可能需要在动物模型中进一步研究)是放射治疗(用于局部或局部侵入性治疗，如非小细胞肺癌或前列腺癌)，或作为手术前新辅助治疗(如mCRPC)。如果疗效得到证实，这种方法可以为人类癌症的临床发展提供广泛的适应症，也可以通过在上述癌症的早期预测和调整Cpd.11Ms或式(I)的其他卤代烷磺酸盐氮芥，或在缺氧区域(如胃肠癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、头颈癌或软组织肉瘤)存在的情况下，预测和调整其他癌症，如先前列为Cpd.11Ms敏感的癌症。在这种情况下，可以根据特定癌症和/或患者的生物学特征来调整治疗策略和药物方案，所述生物学特征可以在治疗之前和治疗期间进行测量(例如在血液样本或肿瘤活检中)。
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Claims (14)

1.化合物2-((2-溴乙基)(5-(4-乙基哌嗪-l-羰基)-2-(甲磺酰基)-4-硝基苯基)氨基)甲基磺酸乙酯的甲磺酸盐在制备治疗实体癌的药物中的用途，其中所述实体癌为乳腺癌或胰腺癌；以及
所述实体癌已经对同源重组和DNA修复机制状态进行了评估。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌，所述胰腺癌为胰腺导管癌。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述化合物被施用给先前已经采用放疗、化疗和/或免疫疗法进行治疗的受试者。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述化合物防止所述受试者中癌症的耐药性、免疫逃逸、复发或转移。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述化合物被配制用于肿瘤内、经动脉栓塞或口服给药。
6.权利要求1所述的化合物在制备用于治疗三阴性乳腺癌和/或胰腺导管癌的药物组合物中的用途，其中，所述药物组合物包含有效治疗量的权利要求1中所述的化合物和药学上可接受的赋形剂、佐剂、缓冲剂或稳定剂。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述化合物与其他治疗剂或疗法同时或依次施用给受试者，并且所述化合物以40mg/m2-4000mg/m2的剂量给药。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述化合物是一线疗法或二线疗法。
9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述其他疗法是放射疗法或化疗。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述其他疗法为化疗，所述化疗的药物选自顺铂、卡铂、紫杉醇、吉西他滨、多西他赛、阿霉素和白蛋白结合型紫杉醇。
11.根据权利要求7所述的用途，其中，所述其他疗法涉及施用PARP抑制剂。
12.根据权利要求7所述的用途，其中，所述其他疗法是免疫疗法。
13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述免疫疗法阻断、减少和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2的结合。
14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述免疫疗法使用的试剂选自纳武单抗、派姆单抗和伊匹单抗。
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