CN112209986A - 一种甾体类化合物、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甾体类化合物、制备方法及应用，所述的甾体类化合物的制备方法包括：以开口箭的叶为提取原料，采用醇提获得浸膏，浸膏再经有机溶剂萃取和柱色谱分离得到甾体类化合物。化合物1‑9均为甾体类成分，其中化合物1和4为强心苷类化合物，化合物2、3、5、6、7为螺甾烷型甾体皂苷或皂苷元，化合物8和9为呋甾烷型甾体皂苷。抗菌活性研究表明，化合物3对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)具有优异的抑菌活性。本发明初步揭示了开口箭抗菌活性的物质基础，对进一步设计和开发抗菌新药具有重要意义。

Description

一种甾体类化合物、制备方法及应用

技术领域

本发明属于天然化合物领域，具体涉及一种甾体类化合物、制备方法及应用。

背景技术

开口箭(Campylandra chinensis)为天门冬科开口箭属多年生草本植物，具有清热解毒、祛风除湿、散瘀止痛等功效，常用于治疗白喉、咽喉肿痛、风湿痹痛、跌打损伤、胃痛、痈肿疮毒、毒蛇咬伤等。特别是在神农架林区，干燥的开口箭的根及根茎切片常被用作泡水凉茶材料大量出售，对咽喉炎、喉头肿痛、口舌生疮、牙齿痛、嗓子疼、消炎散火有特效。

民间常以开口箭的根及根茎入药，但其根及根茎的获得主要依靠挖掘野生开口箭资源，叶子往往被丢弃。根及根茎的无节制挖掘对多年生的开口箭资源造成了毁灭性地破坏，目前在其主产区，即秦巴山区及神农架林区，野生开口箭资源已明显减少，妨碍了对其进行大规模的药用价值开发利用。

发明内容

本发明的目的是给出一种甾体类化合物、制备方法及应用。该类化合物首次从开口箭植物的叶片中提取分离，具有优异的抗菌活性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种甾体类化合物，包括以下式中的化合物：

一种甾体类化合物的制备方法，所述的甾体类化合物为本发明所述的甾体类化合物，制备方法包括：

以开口箭的叶为提取原料，采用醇提获得浸膏，浸膏再经有机溶剂萃取、柱色谱分离得到甾体类化合物。

可选的，采用醇提获得浸膏包括：以料液比1:10(g/mL)的比例加入甲醇，55℃热回流提取4次，每次5h，过滤后合并提取液，减压浓缩得开口箭叶甲醇提取物浸膏。

可选的，所述的有机溶剂萃取包括：浸膏混悬于水中，然后依次用溶剂石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取(v/v,1:1)，每种溶剂反复萃取3次，合并各层萃取液，获取二氯甲烷层组分和正丁醇层组分。

可选的，所述的柱色谱分离包括：

正相硅胶柱色谱法对二氯甲烷层组分进行粗分，以二氯甲烷-甲醇-水体系为洗脱液进行梯度洗脱，二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱的体积比依次为50:1:0→40:1:0→30:1:0→20:1:0→15:1:0→10:1:0→8:1:0.1→6:1:0.1→4:1:0.1→3:1:0.1→2:1:0.1，洗脱液每500mL收集一次；梯度洗脱下来的各流分经薄层硅胶板显色分离得到15个组分，按流动相方向依次组分名称分别为C1～C15；组分C4依次经正相硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3和化合物7；组分C5经正相硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离得到化合物5和化合物6；

正丁醇层组分经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱的体积比依次为20:1:0→15:1:0→10:1:0→8:1:0.1→6:1:0.1→5:1:0.1→4:1:0.1→3:1:0.1→2:1:0.1→1:1:0.1，按流出顺序，合并相同流分得到9个组分分别为B1～B9；组分B2经反相ODS柱色谱分离得化合物4；组分B3经反相ODS柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化得化合物1；组分B7经反复反相ODS柱色谱得化合物9；组分B8经反复反相ODS柱色谱得到化合物2和化合物8。

本发明所述的甾体类化合物用于制备抗菌药和/或杀菌剂的应用。

本发明所述的甾体类化合物用于制备治疗由枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌引起疾病药物的应用。

一种杀菌剂，所述的杀菌剂包含本发明所述的任一甾体类化合物。

一种抗菌剂，所述的抗菌剂包含本发明所述的任一甾体类化合物。

一种杀菌或抗菌方法，采用本发明所述的任一甾体类化合物进行。

本发明中，化合物1和2为新化合物，化合物3和6为首次从开口箭属植物中分离得到，化合物4为首次从开口箭植物中分离获得。化合物1-9均为甾体类成分，其中化合物1和4为强心苷类化合物，化合物2、3、5、6、7为螺甾烷型甾体皂苷或皂苷元，化合物8和9为呋甾烷型甾体皂苷。抗菌活性研究表明，化合物3对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)具有优异的抑菌活性。本发明初步揭示了开口箭抗菌活性的物质基础，对进一步设计和开发抗菌新药具有重要意义。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1为开口箭叶中化合物1-9的分离流程；

图2为化合物1的¹H-NMR谱图(500MHz)；

图3为化合物1的¹³C-NMR谱图(125MHz)；

图4为化合物1的DEPT135谱图(125MHz)；

图5为化合物1的COSY谱图(500MHz)；

图6为化合物1的HSQC谱图(500MHz)；

图7为化合物1的HMBC谱图(500MHz)；

图8为化合物1的NOESY谱图(500MHz)；

图9为化合物1的红外谱图；

图10为化合物1的高分辨质谱图；

图11为化合物2的¹H-NMR谱图I(500MHz)；

图12为化合物2的¹H-NMR谱图II(500MHz)；

图13为化合物2的¹³C-NMR谱图(125MHz)；

图14为化合物2的COSY谱图(500MHz)；

图15为化合物2的HSQC谱图(500MHz)；

图16为化合物2的HMBC谱图(500MHz)；

图17为化合物2的NOESY谱图(500MHz)；

图18为化合物2的红外谱图；

图19为化合物2的高分辨质谱图；

图20为化合物3的¹H-NMR谱图(500MHz)；

图21为化合物3的¹³C-NMR谱图(125MHz)；

图22为化合物3对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)抑制活性的对数曲线方程。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实验研究对本发明的技术方案做更加详细的描述，以下实验中使用的材料均为市场上可以买到的常用品，且如无特殊说明，溶剂之间的比例关系均以体积比计；溶液的浓度均为体积浓度；下述实验中进行各组分的分离，如无特殊说明，各个组分的名称均按照流出顺序、流动相流动顺序或分离的前后顺序命名；如无特殊说明，以下采用的分离实验方法均为现有技术中的常规实验方法。

一、术语解释:

S.aureus Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌；

B.subtilis Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌；

E.coli Escherichia coli 大肠埃希氏菌；

P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 铜绿假单胞杆菌；

C.albicans Candida Albicans 白色念珠菌；

DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜；

TLC Thin layer chromatography 薄层层析；

NMR Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振。

二、研究结果：

本发明首次采用多年生开口箭的叶作为研究对象，可在一定程度上减少对开口箭野生资源的破坏，有利于开口箭资源的可持续性利用，并可应用于畜牧业中动物饲料内抗生素类药物的安全替代品。此前国内外尚无针对开口箭叶化学成分的研究报道，开口箭叶中的活性物质基础并不明确，因此对其化学成分的阐明是开发利用开口箭叶资源的关键。

首次对开口箭叶进行了化学成分研究，从中共分离并鉴定甾体化合物9个(编号1-9)，其中，化合物1和2为新化合物，化合物3和6为首次从开口箭属植物中分离得到，化合物4为首次从开口箭植物中分离获得。化合物1和4为强心苷，化合物2、3、5、6、7为螺甾烷型甾体皂苷或皂苷元，化合物8和9为呋甾烷型甾体皂苷。本发明综合利用各种现代分离技术，首次对开口箭叶的化学成分进行了深入研究，并运用核磁共振波谱、高分辨质谱、红外光谱、紫外光谱等手段准确鉴定了化合物1-9的化学结构，他们的化学结构分别被鉴定为16-O-乙酰基-羟基杠柳苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖苷[16-O-acetyl-hydroxyperiplogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside](1),螺甾-25(27)-烯-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α,24β-八醇-24-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[spirost-25(27)-ene-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α,24β-octol-24-O-β-D-glucopyranoside](2)，5α-螺甾-25(27)-烯-1α,3α-二醇-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷[5α-spirost-25(27)-ene-1α,3α-diol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside](3)，夹竹桃苷元3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖苷[oleandrigenin3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside](4)、螺甾-25(27)-烯-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α-七醇[spirost-25(27)-ene-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α-heptol](5)、(25S)-5β-螺甾烷-3β-醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷[(25S)-5β-spirostan-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside](6)、(25R)-5β-螺甾烷-1β,3α-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(25R)-5β-spirostan-1β,3α-diol-3-O-β-D-glucopyranoside](7)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-5β-呋甾-1β,3β,22α,26-四醇-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(25S)-5β-furost-1β,3β,22α,26-tetrol-26-O-β-D-glucopyranoside](8)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-22-O-甲基-5β-呋甾-1β,3β,5β,22α,26-五醇-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[3-O-β-D-glucopyranosyl-(25S)-22-O-methyl-5β-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentaol-26-O-β-D-glucopyranoside](9)。

2.1化合物1-9的提取分离工艺

开口箭鲜叶采于中国湖北省神农架林区，将采回的开口箭叶用清水冲洗干净，置于阴暗通风处晾干。将干燥的开口箭叶(5kg)用粉碎机粉碎成粉，过20目筛，然后以料液比1:10(g/mL)的比例加入甲醇，55℃热回流提取4次，每次5小时，过滤后合并提取液，减压浓缩得开口箭叶甲醇提取物浸膏(734.0g)。

超声波辅助将该浸膏混悬于水中(10L)，然后依次用溶剂石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取(v/v,1:1)，每种溶剂反复萃取3次，合并各层萃取液，减压浓缩后分别得石油醚层组分(27.0g)、二氯甲烷层组分(90.3g)、乙酸乙酯层组分(8.4g)、正丁醇层组分(81.0g)和水层组分(515.0g)。

用正相硅胶柱色谱法对二氯甲烷层组分进行粗分，以二氯甲烷-甲醇-水体系为洗脱液进行梯度洗脱，具体如下：①装柱：选取200～300目硅胶，用纯二氯甲烷充分浸润后装柱。②拌样：称取硅胶90g，将溶解的浸膏溶液与硅胶充分混合，再使用旋转蒸发仪减压除去溶剂，干燥后研成细粉。④上样：将准备好的样品缓慢均匀的加入已准备好的硅胶柱中，加样时注意样品高度不能超过柱中液面。⑤梯度洗脱：采用二氯甲烷-甲醇-水(50:1:0→40:1:0→30:1:0→20:1:0→15:1:0→10:1:0→8:1:0.1→6:1:0.1→4:1:0.1→3:1:0.1→2:1:0.1)进行梯度洗脱，洗脱液每500mL收集一次。⑥合并流分：将梯度洗脱下来的各流分点薄层硅胶板，依据各流分TLC展开和10％硫酸乙醇溶液显色情况合并各流分，共得到15个组分(C1～C15)。组分C4再依次经正相硅胶柱色谱(氯仿-甲醇洗脱)、反相ODS柱(YMC Gel ODS-A-HG,50μm,日本YMC股份有限公司)色谱(丙酮-水洗脱)、Sephadex LH-20(美国GEhealthcare公司)凝胶柱色谱(氯仿-甲醇洗脱)分离得到化合物3(11.3mg)和7(15.6mg)。组分C5经正相硅胶柱色谱(氯仿-甲醇洗脱)、反相ODS柱色谱(丙酮-水洗脱)、Sephadex LH-20凝胶柱色谱(氯仿-甲醇洗脱)分离得到化合物5(37.3mg)和6(18.2mg)。

正丁醇层组分经硅胶柱色谱(200～300目)分离，二氯甲烷-甲醇-水(20:1:0→15:1:0→10:1:0→8:1:0.1→6:1:0.1→5:1:0.1→4:1:0.1→3:1:0.1→2:1:0.1→1:1:0.1)梯度洗脱，TLC分析合并相同流分，得到9个组分(B1～B9)。组分B2经反相ODS柱色谱(甲醇-水洗脱)得化合物4(623.4mg)。组分B3经反相ODS柱色谱(甲醇-水洗脱)和Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇-水洗脱)纯化得化合物1(24.8mg)。组分B7经反复反相ODS柱色谱(甲醇-水和丙酮-水洗脱)得化合物9(15.8mg)，组分B8经反复反相ODS柱色谱(甲醇-水和丙酮-水洗脱)得到化合物2(80.5mg)和8(111.5mg)。化合物1-9的分离流程如图1所示。

2.2化合物1-8的结构鉴定

2.2.1新化合物1

化合物1为白色无定型粉末，在正离子模式高分辨质谱(HR-ESI-MS)中，显示准分子离子峰m/z 779.34583[M+Na]⁺(C₃₇H₅₆O₁₆Na⁺计算值779.34606)，可推断化合物1的分子式为C₃₇H₅₆O₁₆。不饱和度为10。化合物1的红外光谱(IR)在3367,1738cm^-1处显示出羟基和酯羰基的特征信号峰。在¹H-NMR谱中，显示了强心苷类化合物特征的2个角甲基信号δ1.11(3H,s,Me-18),1.07(3H,s,Me-19)，1个乙酰基信号δ1.86(3H,s,Me-25)和1个五元不饱和内酯环的特征信号，即22位稀氢质子信号δ6.37(1H,s)和21位连氧亚甲基信号δ5.26(1H,d,J＝18.1Hz,H-21a),5.45(1H,d,J＝18.1Hz,H-21b)，表明化合物1为甲型强心苷类化合物。另外，在¹H-NMR谱中还可以观察到2个糖单元的端基质子信号，分别为δ5.24(1H,d,J＝8.2Hz,Glc-1″)和5.44(1H,br s,Rha-1′)，以及高场区Rha-6″的甲基信号δ1.28(3H,d,J＝6.2Hz)，说明化合物1具有由2个单糖单元组成的糖链，其中1个是鼠李糖基。化合物1的¹³C-NMR谱中共显示了37个碳信号，结合DEPT和HMQC谱，可将这些碳信号分别归属为1个五元不饱和内酯环(2个烯烃碳，1个酯羰基碳和1个连氧亚甲基碳)，1个乙酰基(1个羰基碳和1个甲基)，2个甲基碳信号，8个亚甲基信号，5个次甲基信号(含2个连氧碳)，4个季碳信号(含2个连氧碳)，以及1组鼠李糖单元信号[δ100.8(C-1′),72.2(C-2′),73.1(C-3′),85.3(C-4′),69.2(C-5′),18.7(C-6′)]和1组葡萄糖单元特征信号[δ107.2(C-1′),76.7(C-2′),78.9(C-3′),71.8(C-4′),78.9(C-5′),62.9(C-6′)]。以上数据与化合物4的核磁数据相似^[1]，故推测化合物1具有与化合物4较为相似的化学结构,不同之处在于该化合物多出1个连氧季碳，且A、B环的核磁数据与化合物4的数据具有较大差异。在HMBC谱中，H-3(δ4.29)、H-6(δ1.52和1.88)、H-7(δ1.27和2.29)、H-19(δ1.07)均与该连氧季碳(δ73.9)相关，可确定该季碳位于5位且连接一个羟基基团，从而引起A、B环的核磁数据有别于化合物4。通过分析化合物1的¹H-¹H COSY谱和NOESY谱中A、B环各质子信号之间出现的相关信号，并与文献中的A、B环上3β、5β羟基取代的碳氢数据对照^[2,3]，可以确定A、B环以cis方式连接，3位和5位上的羟基均为β构型。此外，葡萄糖端基质子的偶合常数为8.2Hz，确定该葡萄糖单元的端基构型为β型。综合以上信息，将化合物1鉴定为16-O-乙酰基-羟基杠柳苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖苷[16-O-acetyl-hydroxyperiplogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside]，其化学结构见式(一)。综合化合物1的¹H-NMR，¹³C-NMR，DEPT-135，¹H-¹H COSY，HSQC，HMBC及NOESY谱图信息，对其碳氢信号进行了全归属，新化合物1的¹H-和¹³C-NMR数据归属见表1，上述谱图见图1-10。

表1.化合物1的¹H-(500MHz)和¹³C-(125MHz)NMR数据(C₅D₅N)

2.2.2新化合物2

化合物2为无定型粉末，在HR-ESI-MS中显示准分子离子峰m/z 689.33807[M+H]⁺(C₃₃H₅₃O₁₅ ⁺计算值689.33790)，确定化合物2的分子式为C₃₃H₅₂O₁₅，不饱和度为8。IR光谱显示含羟基(3354cm^-1)官能团。在¹H-NMR谱中，高场区观察到3个特征甲基信号δ0.82(3H,s,Me-18)，1.96(3H,s,Me-19)，1.03(3H,d,J＝6.6Hz,Me-21)，低场区显示2个稀氢质子信号δ5.11(1H,br s,H-27a)和6.16(1H,br s,H-27b)，1个糖单元的端基质子信号δ5.08(1H,d,J＝8.0Hz,Glc-1′)。化合物1的¹³C-NMR谱中显示33个碳信号，其中包括1个末端双键[δ145.6(C-25)和108.9(C-27)]，1个半缩醛碳信号[δ111.9(C-22)]，3个甲基信号，5个亚甲基信号[含1个连氧亚甲基碳信号δ65.1(C-26)]，13个次甲基信号[含8个连氧次甲基碳信号δ79.7(C-1),67.4(C-2),75.8(C-3),70.0(C-4),73.8(C-6),72.1(C-7),82.2(C-16),74.4(C-24)],3个季碳信号[含1个连氧季碳信号δ78.5(C-5)],以及1组葡萄糖单元碳信号[δ104.3(C-1′),75.9(C-2′),79.0(C-3′),71.9(C-4′),78.7(C-5′),62.9(C-6′)]。以上波谱数据提示化合物2结构含有1个25(27)末端双键的多羟基螺甾烷苷元和1个葡萄糖单元。综合化合物2的¹H-NMR，¹³C-NMR，¹H-¹H COSY，HSQC，HMBC及NOESY谱图信息，对其碳氢信号进行了全归属，新化合物2的¹H-和¹³C-NMR数据归属见表2。经文献检索，发现化合物2具有与化合物5相似的NMR数据^[4,5]，不同之处在于该化合物F环上多出1个连氧次甲基和1个葡萄糖单元。在¹H-¹HCOSY谱中，可观察到H-23a[δ2.50(1H,m)]与H-23b[δ2.04(1H,m)]、H-23a与H-24[δ5.17(1H,m)]、H-23b与H-24均相关；在HMBC谱中，H-23a、H-23b、H-26b[δ4.10(1H,d,J＝12.2Hz)]、H-27a[δ6.16(1H,br s)]、H-27b[δ5.11(1H,br s)]以及葡萄糖的端基氢H-1′[δ5.08(1H,d,J＝8.0Hz)]均与C-24(δ74.4)相关，可确定该连氧碳(δ74.4)在F环的24位,葡萄糖单元通过端基连接在F环的24位。根据糖单元端基质子的偶合常数(8.0Hz)，并结合酸水解结果，可确定化合物2中含有β-D-葡萄糖基。化合物2的相对构型可以通过对其NOESY谱的详细解析得到确认。在NOESY谱中，观察到H-2[δ4.31(1H,m)]与H-9α[δ2.04(1H,m)]，H-4[δ5.31(1H,m)]与H-9α,H-2与H-4，H-3[δ4.75(1H,m)]与H-2，H-3与H-4，H-1[δ4.34(1H,m)]与H-19[δ1.96(3H,s)]之间均存在相关，但没有找到H-7[δ4.45(1H,m)]与H-9α之间相关信号，表明A、B环以cis方式连接，H-2,H-3,H-4均为α构型，H-7和5-OH为β构型。化合物2的A、B、C、D环的¹H-和¹³C-NMR数据与螺甾-25(27)-烯-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α-七醇的数据完全一致^[4,5]。因此将化合物2的结构鉴定为螺甾-25(27)-烯-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α,24β-八醇-24-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[spirost-25(27)-ene-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α,24β-octol-24-O-β-D-glucopyranoside]，其化学结构见式(二)，核磁数据见表2，具体的谱图见图11-19。

表2.化合物2的¹H-(500MHz)和¹³C-(125MHz)NMR数据(C₅D₅N)

2.2.3化合物3

化合物3为白色无定型粉末，在其¹H-NMR谱中，高场区显示螺甾烷型甾体母核的3个特征甲基信号,分别为δ0.83(3H,s,Me-18),1.14(3H,s,Me-19)和0.97(3H,d,J＝7.0Hz,Me-21)。低场区显示2个稀氢质子信号[δ4.79(1H,br s,H-27a)和4.76(1H,br s,H-27b)]，3个连氧的次甲基信号[δ4.46(1H,dd,J＝7.9,14.2Hz,H-16),4.17(1H,br s,H-1),3.92(1H,m,H-3)]，以及1个连氧亚甲基质子信号[δ4.29(1H,d,J＝12.1Hz,H-26a)和3.84(1H,d,J＝12.1Hz,H-26b)]。另外在¹H-NMR谱中还可以观察到2个糖单元的端基质子信号，分别为δ4.62(1H,d,J＝7.0Hz,Xyl-1′)和5.45(1H,d,J＝1.6Hz,Rha-1″)，同时氢谱高场区Rha-6″甲基信号[δ1.28(3H,d,J＝6.2Hz)]的存在说明化合物3具有由2个单糖单元组成的糖链，其中1个是鼠李糖基。在¹³C-NMR谱中，共显示了38个碳信号，除2个糖单元的11个碳信号外，还有27个碳信号的甾体苷元。甾体苷元上的特征碳信号主要包括：1个末端双键[δ144.9(C-25)和109.0(C-27)]，1个半缩醛碳信号[δ109.8(C-22)]，4个连氧碳信号[δ76.4(C-1),67.7(C-3),81.9(C-16),65.4(C-26)]。以上信息提示化合物3的苷元结构为具有25(27)末端双键的螺甾烷骨架。化合物3的¹³C-NMR谱数据与文献报道的bletilnoside B数据一致^[6]，因此将化合物3的结构鉴定为5α-螺甾-25(27)-烯-1α,3α-二醇-1-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷[5α-spirost-25(27)-ene-1α,3α-diol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranoside]，其化学结构见式(三)，碳氢信号的详细归属见表3，具体谱图见图20和21。该化合物是首次从开口箭属植物中分离获得。

表3.化合物3的¹H-(500MHz)和¹³C-(125MHz)NMR数据

^a Recorded in CD₃OD.

^b Recorded in C₅D₅N.

2.2.4化合物4-9

化合物4-9均为白色无定型粉末，他们的¹³C-和¹H-NMR谱数据分别见表4和表5。经对核磁数据分析，并与文献数据^[1,4,7-10]对照，可将他们的化学结构分别鉴定为夹竹桃苷元3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖苷[oleandrigenin3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside](4)、螺甾-25(27)-烯-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α-七醇[spirost-25(27)-ene-1β,2β,3β,4β,5β,6β,7α-heptol](5)、(25S)-5β-螺甾烷-3β-醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷[(25S)-5β-spirostan-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside](6)、(25R)-5β-螺甾烷-1β,3α-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[(25R)-5β-spirostan-1β,3α-diol-3-O-β-D-glucopyranoside](7)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-5β-呋甾-1β,3β,22α,26-四醇-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(25S)-5β-furost-1β,3β,22α,26-tetrol-26-O-β-D-glucopyranoside](8)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-22-O-甲基-5β-呋甾-1β,3β,5β,22α,26-五醇-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[3-O-β-D-glucopyranosyl-(25S)-22-O-methyl-5β-furost-1β,3β,5β,22α,26-pentaol-26-O-β-D-g lucopyranoside](9)。化合物4-9均为甾体类成分，见式(四)，其中化合物4为强心苷类型结构，化合物5为螺甾烷型甾苷元，化合物6和7为螺甾烷型甾体皂苷，化合物8和9为呋甾烷型甾体皂苷，其中化合物4和6是首次从开口箭植物中分离获得，具体核磁数据见表4和5。

式(四)；

【参考文献】

【1】Kamel,M.S.,Assaf,M.H.,Abe,Y.,et al.Cardiac glycosides fromCryptostegia grandiflora.Phytochemistry,2001,58(4),537-542.

【2】Zhang,L.,Xu,L.Z.,Yang,S.L.Two new cardenolides from the roots ofStreptocaulon griffithii.Journal of Asian Natural Products Research,2006,8(7),613-617.

【3】Xue,R.,Han,N.,Sakurai,H.,et al.Cytotoxic cardiac glycosides fromthe roots of Streptocaulon juventas.Planta Medica,2013,79(2),157-162.

【4】Miyahara,K.,Kudo,K.,Kumamoto,F.,et al.Studies on the steroidalconstituents of the rhizomes of Rhodea japonica Roth.and of Campylandraaurantiaca.Symposium on the chemistry of natural products,22^nd,1979,1-8.

【5】Liu,C.X.,Guo,Z.Y.,Xue,Y.H.,et al.(2012).Tupisteroide A-C,three newpolyhydroxylated steroidal constituents from the roots of Tupistrachinensis.Magnetic Resonance in Chemistry,2012,50,320-324.

【6】Park,J.E.,Woo,K.W.,Choi,S.U.,et al.Two new cytotoxic spirostane-steroidal saponins from the roots of Bletilla striata.Helvetica Chimica Acta,2014,97(1),56-63.

【7】Sharma,S.C.,Sharma,H.C.Oligofurostanosides from Asparagus curillusleaves.Phytochemistry,1993,33(3),683-686.

【8】Xiang,L.,Wang,Y.,Yi,X.,et al.Bioactive spirostanol saponins fromthe rhizome of Tupistra chinensis.Steroids,2016,108,39-46.

【9】Zou,K.,Wu,J.,Du,M.,et al.Diastereoisomeric saponins from therhizomes of Tupistra chinensis.Chinese Chemical Letters,2007,18(1),65-68.

【10】Zou,K.,Wu,J.,Liu,C.,et al.A furostanol saponin from the cytotoxicfraction of Tupistra chinensis rhizomes.Chinese Chemical Letters,2006,17(10),1335-1338.

表4.化合物4-9的¹³C-NMR数据(125MHz,C₅D₅N,δin ppm)

2.3抗菌活性评价

使用划线法将S.aureus、B.subtilis、E.coli、P.aeruginosa和C.albicans取得单个菌落于适合的培养基进行培养。将待测化合物使用DMSO溶解并稀释，分别采用倍比稀释法将药物终浓度稀释为7个浓度(分别为70.5、35.2、17.6、8.8、4.4、2.2、1.1μM)，待菌悬液浓度为2×10⁶cfu/mL时，将菌液加入96孔板中，每个孔中加入同等浓度等量的菌悬液，各组分分别重复三个复孔。上述实验的细菌和真菌分别在培养箱中37℃和30℃培养24h后，加入待测药物，继续培养24h后，使用酶标仪在波长分别为265nm(细菌)和530nm(真菌)处进行检测。

表6.化合物1-9在70.5μM浓度下抑菌活性的初筛结果

通过对化合物1-9进行抗菌活性初筛(表6)，发现其中化合物3对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、白色念珠菌(C.albicans)具有优异的抗菌活性，在最高浓度70.5μM时，对它们的抑制率分别为94.5％、96.0％、101.9％。

表7.化合物3抑菌活性的吸光度值(OD)

表8.化合物3对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)的抑制活性结果

^a Positive control against B. subtilis.；^b Positive control against S.aureus.；^c Positive control against C. albicans.

进一步对化合物3的抗菌活性(表7和8，图22)进行检测，发现化合物3对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)的抑菌活性IC₅₀值分别为7.6±0.03、6.8±0.09、3.5±0.12(表8),特别是其对B.subtilis和C.albicans的抑制作用要强于市售阳性对照药物，为进一步设计和开发抗菌新药提供科学依据。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种甾体类化合物，其特征在于，包括以下式中的化合物：

2.一种甾体类化合物的制备方法，其特征在于，所述的甾体类化合物为权利要求1所述的甾体类化合物，制备方法包括：

以开口箭的叶为提取原料，采用醇提获得浸膏，浸膏再经有机溶剂萃取和柱色谱分离得到甾体类化合物。

3.根据权利要求2所述的甾体类化合物的制备方法，其特征在于，采用醇提获得浸膏包括：以料液比1:10(g/mL)的比例加入甲醇，55℃热回流提取4次，每次5h，过滤后合并提取液，减压浓缩得开口箭叶甲醇提取物浸膏。

4.根据权利要求2或3所述的甾体类化合物的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂萃取包括：浸膏混悬于水中，然后依次用溶剂石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取(v/v,1:1)，每种溶剂反复萃取3次，合并各层萃取液，获取二氯甲烷层组分和正丁醇层组分。

5.根据权利要求2或3所述的甾体类化合物的制备方法，其特征在于，所述的柱色谱分离包括：

正相硅胶柱色谱法对二氯甲烷层组分进行粗分，以二氯甲烷-甲醇-水体系为洗脱液进行梯度洗脱，二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱的体积比依次为50:1:0→40:1:0→30:1:0→20:1:0→15:1:0→10:1:0→8:1:0.1→6:1:0.1→4:1:0.1→3:1:0.1→2:1:0.1，洗脱液每500mL收集一次；梯度洗脱下来的各流分经薄层硅胶板显色分离得到15个组分，按流动相方向依次组分名称分别为C1～C15；组分C4依次经正相硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离得到化合物3和化合物7；组分C5经正相硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离得到化合物5和化合物6；

正丁醇层组分经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱的体积比依次为20:1:0→15:1:0→10:1:0→8:1:0.1→6:1:0.1→5:1:0.1→4:1:0.1→3:1:0.1→2:1:0.1→1:1:0.1，按流出顺序，合并相同流分得到9个组分分别为B1～B9；组分B2经反相ODS柱色谱分离得化合物4；组分B3经反相ODS柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化得化合物1；组分B7经反复反相ODS柱色谱得化合物9；组分B8经反复反相ODS柱色谱得到化合物2和化合物8。

6.权利要求1所述的甾体类化合物用于制备抗菌药和/或杀菌剂的应用。

7.权利要求1所述的甾体类化合物用于制备治疗由枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或白色念珠菌引起疾病药物的应用。

8.一种杀菌剂，其特征在于，所述的杀菌剂包含权利要求1中所述的任一甾体类化合物。

9.一种抗菌剂，其特征在于，所述的抗菌剂包含权利要求1中所述的任一甾体类化合物。

10.一种杀菌或抗菌方法，其特征在于，采用权利要求1中所述的任一甾体类化合物进行。

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