CN112203640A - 抑制病原体感染的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开主题涉及抑制和治疗呼吸道病毒感染和呼吸道病毒传播的抗体、组合物和方法。特别是，本公开主题涉及采用将病毒截留在粘液内的组合物和抗体，从而抑制病毒穿过或通过粘液分泌物，抑制和治疗受试者病毒感染。

Description

抑制病原体感染的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2018年3月21日提交、名称为“Compositions and Methods forInhibiting Pathogen Infection in the Lung”的美国临时专利申请No.62/646,220的优先权，通过引用，该临时申请全文纳入本申请中。
引用纳入
本说明书中提及的所有公开和专利申请以引用的方式全部纳入本申请中，其引用的程度就如同已详细地及单独地将各个公开和专利申请内容以引用的方式纳入一般。
特别是，通过引用，将2015年4月24日提交的美国专利申请No.14/438,511全文纳入本申请中。按照35U.S.§371条规定，所述美国专利申请No.14/438,511要求2013年10月29日提交的、名称为“Compositions and Methods for Inhibiting Pathogen Infection”的PCT/US2013/067328的优先权，而PCT/US2013/067328要求了2012年10月29日提交的美国临时专利申请No.61/719,689的优先权。
关于联邦资助研究的声明
本发明得到美国政府支持，是在美国国立卫生研究院拨款项目UL1TR001111和R43AI138728中完成的发明。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本公开的主题涉及抑制和治疗病原体感染及提供避孕的抗体、组合物和方法。特别是，本公开的主题涉及采用将病原体截留在粘液内的组合物和抗体，从而抑制病原体或精子穿过或通过粘液分泌物，抑制和治疗受试者病原体感染及提供避孕。所述主题进一步涉及通过检测能够将病原体截留在粘液内的抗体而监测疫苗有效性的方法。例如，本公开的主题涉及抑制和治疗呼吸道病毒感染及呼吸道病毒传播的抗体、组合物和方法，包括采用将病毒截留在呼吸道粘液中的组合物和抗体，从而抑制病毒穿过粘液分泌物。
背景技术
通过MHC I类-相关新生儿Fc受体，大量IgG被转运到雌性生殖道粘液分泌物内(Liet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:4388(2011)，导致IgG的含量至少比IgA高10倍(Usala et al.,J.Reprod.Med.34:292(1989))。但是，尽管IgG占有优势，但是，人们并不清楚分泌的IgG预防阴道感染的精确机制。以前的动物研究已经表明，当阴道内(Burton etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:11181(2011)；Sherwood et al.,NatureBiotechnol.14:468(1996)；Veazey et al.,Nature Med.9:343(2003)；Whaley et al.,J.Infect.Dis,169:647(1994))或甚至静脉内(Hessell et al.,PLoS Pathogens 5:e1000433(2009)；Mascola et al.,Nature Med.6:207(2000))施用时，抗体(Ab)可以有效阻止阴道病原体，包括人类免疫缺陷性病毒(HIV)和单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)的侵袭。许多研究人员重点研究了中和Ab，这种Ab在恒河猴身上施用时，在用量足够高时，可以对猿-人类免疫缺陷病毒(SHIV)侵袭提供消除性免疫(Burton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:11181(2011))。在同样的研究中，非-中和抗体或中和性较差的抗体最多仅提供部分保护，有些感染动物显示出病毒载量减少。Hessell等和Mascola等的研究表明，即使采用弱中和抗体，某些动物亦表现出全面保护，而其它动物病毒血亦减少(Hessell et al.,PLoS Pathogens 5:e1000433(2009)；Mascola et al.,Nature Med.6:207(2000))。
有几项研究探索了上皮组织上粘液分泌物内IgG的可能保护作用，性传播病毒要达到靶细胞，不可避免地会遇到这些粘液分泌物且必须穿过这些粘液分泌物。在健康的雌性生殖道分泌物中，血液和淋巴中人们熟悉的Ab效应子功能(例如，补体激活、调理作用，和ADCC)不存在或受到限制，通常几乎没有补体活性和很少(如果有的话)活性白细胞(Cone,In Handbook of Mucosal Immunology.P.L.Ogra et al.,editors.Academic Press,SanDiego,Calif.43-64(1999)；Hill et al.,Am.J.Obstet.Gynecol.166:720(1992)；Schumacher,Hum.Reprod.3:289(1988))。这些系统免疫保护的典型机理并不能令人满意地解释在里程碑式的秦国RV144 HIV疫苗试验中观察到的适中但明显的保护作用(Kresge,IAVI Report Vol 13,Number 5(2009)；Rerks-Ngarm et al.,N.Engl.J.Med.361:2209(2009))。尽管这种接种方案主要诱导了非中和Ab并且一旦感染，对感染的系统进程几乎没有保护作用，但却适当降低了HIV感染的风险，这表明这种保护可能是在感染之前发生的。更好地了解阴道粘膜免疫性的其它可能机理还可能对开发针对其它性传播感染，包括HSV的有效疫苗非常关键，已经证明，HSV逃避补体和其它典型的抗体-介导保护机制(Brockmanet al.,Vaccine 26Suppl 8:194(2008)；Hook et al.,J.Virol.80:4038(2006)；Lubinskiet al.,J.Exp.Med.190:1637(1999))。到目前为止，疱疹疫苗候选者尽管诱导了较高的中和血清抗体滴度和细胞免疫性，但仅仅实现了暂时的部分保护作用(Chentoufi et al.,Clin.Dev.Immunol.2012:187585(2012))。采用基于HSV-2糖蛋白D的亚单位疫苗开展了III期临床试验，结果表明，其对HSV-1感染表现出一些保护作用，但对HSV-2感染没有任何效果，对生殖器官疾病总体上没有任何效果(Belshe et al.,New Eng.J.Med.366:34(2012))。
因此，需要新的组合物，及采用所述组合物的方法，来预防和治疗传染性疾病及提供避孕。
例如，呼吸系统感染，如流感病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)感染是沉重的健康和经济负担。此外，呼吸道的粘膜内层是非呼吸道病毒，如埃博拉病毒，的侵入点。理想的情况是，通过将进入呼吸道的病毒粒子在其有机会接触细胞之前转运出呼吸道，可以防止肺内感染或通过肺部感染。
因此，需要新的组合物及采用所述组合物的方法，来预防和治疗病毒性传染病，包括特别是呼吸道疾病。
发明内容
病毒必须穿过粘膜才能到达和感染其靶细胞；实际上，HIV和人乳头瘤病毒(HPV)都能够快速扩散通过人类生殖器官粘液分泌物(Lai et al.,J.Virol.83:11196(2009)；Olmsted et al.,Biophys.J.81:1930(2001))。之前人们发现，与在生理盐水缓冲液中的扩散相比，IgG(11nm)在人类宫颈粘液中的扩散略微减慢，而大很多的病毒样颗粒，包括诺如病毒(38nm)衣壳和HPV(55nm)衣壳，并未被这种粘液减慢(Olmsted et al.,Biophys.J.81:1930(2001))。人们假设这种小很多的IgG分子的这种略微减慢现象是由于其与粘蛋白网络非常短暂(<1s)且亲和力较低的结合引起的(Olmsted et al.,Biophys.J.81:1930(2001))。换句话说，仅仅通过与粘蛋白之间短暂的低亲和力结合，IgG能够快速扩散通过粘液，并且因此理论上自由快速地积聚在病原体表面上。
正如本文所述，令人吃惊的是，与病原体表面结合的Ab通过确保在任何给定时间都存在至少一些与粘蛋白网络的低亲和力结合，能够有效地将病原体截留在粘液凝胶中(如图13所示)。例如，被截留在CVM中的病毒粒子无法到达其靶细胞，而是通过性交后排泄流出和/或通过自发热降解以及粘液中其它保护因子(如防御素)失活(Cole,Curr.Top.Microbiol.Immunol.306:199(2006)；Doss et al.,J.Leukoc.Biol.87:79(2010)。这一发现提供了一种预防和治疗感染、监测疫苗有效性和/或提供避孕的新方法。
因此，本文所述方法和组合物的一个方面涉及一种在糖基化位点包括寡糖的分离抗体，所述寡糖包括增强抗体粘液内截留能力的糖基化模式(glycosylation pattern)，其中所述抗体与靶病原体的表位特异性结合。一般说来，这些方法和组合物包括靶向(例如，肺、阴道等内的)粘液中靶病毒粒子的截留抗体。
另一方面涉及包括本发明所述抗体的组合物(例如，药物组合物)及试剂盒。
本发明的另一个方面涉及一种抑制受试者病原体感染或病原体感染引发的疾病或病症的方法，包括向所述受试者的粘膜施用有效剂量抑制感染的抗体(例如，适用于具有增强粘液截留能力的抗体)。
本发明的另一个方面涉及一种治疗受试者病原体感染或病原体感染引发的疾病或病症的方法，包括向所述受试者的粘膜施用有效剂量治疗感染的抗体。
本发明的另一个方面涉及一种监测接种靶向病原体疫苗的受试者疫苗接种有效性的方法，包括测定所述受试者粘液样品内在糖基化位点包括寡糖的抗体的含量，所述寡糖具有增强所述抗体粘液内截留能力的糖基化模式，其中所述抗体与所述靶病原体的表位特异性结合。
一般说来，病毒必须穿过呼吸道的粘液到达和感染上皮内的靶细胞。本发明部分基于这一发现：呼吸道内的抗体能够与病毒粒子结合，通过确保在任何给定时间都存在至少一些与粘蛋白网络的低-亲和力结合，有效地将病毒粒子截留在粘液凝胶中。被截留在粘液中的病毒粒子无法到达其靶细胞，而是将随着粘液从呼吸道排出去。这样提供了预防和治疗呼吸道感染的新方法。
因此，本发明的一个方面涉及治疗或预防受试者病毒感染的方法，所述病毒感染的特征在于受试者肺内的病毒粒子，所述方法包括经吸入途径施用抗体，例如，重组单克隆抗体分子，所述抗体包括人Fc部分和一组对所述病毒粒子具有特异性亲和力的CDR，从而治疗或预防感染。所述抗体可以例如，通过雾化器，在气溶胶组合物中施用。
本发明的另一个方面涉及包括抗体(例如，重组单克隆抗体分子)的组合物，所述抗体包括人Fc部分和一组对受试者肺中存在的病毒粒子具有特异性亲和力的CDR，其中所述组合物适合吸入。
本发明的另一个方面涉及一种包括本发明所述组合物的试剂盒。
例如，本文所述是治疗或预防有需要的受试者体内病原体所引发感染(例如，治疗和/或预防病毒粒子引发的病毒感染，治疗和/或预防细菌感染，治疗和/或预防真菌感染)的方法。例如，治疗和/或预防受试者体内病毒粒子所引发病毒感染的方法包括：经吸入途径向受试者施用对所述病毒粒子具有特异性亲和力的重组抗体，所述重组抗体包括人或人源化Fc区，其中所述重组抗体包括寡糖，所述寡糖具有增强所述重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与所述病毒粒子结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/病毒粒子复合物，从而治疗或预防所述感染。
mAb的施用指的是施用已经富集的具有增强粘膜截留的糖基化模化mAb的mAb群。
所述重组抗体，当未与靶(例如，病毒粒子)结合时，与粘液的相互作用较弱，因此，可以自由扩散通过粘液；但是，一旦与靶(例如，病毒粒子)结合而形成抗体/病毒粒子复合物，则可以将所述抗体/病毒粒子复合物截留在粘液内，使其被身体清除和/或破坏。粘液中抗体的浓度(特别是具有增强截留效率，例如，具有G0/G0F(即GnGn)糖基化模式)的mAb的浓度可以是，例如，50ng/mL或更高，(例如，100ng/mL或更高，200ng/mL或更高，500ng/mL或更高，1μg/mL或更高，10μg/mL或更高，12.5μg/mL或更高，15.0μg/mL或更高，20μg/mL或更高等，例如，0.1μg/mL至20μg/mL之间)。
一般说来，具有提高的粘膜截留能力的重组抗体可以在抗体的Fc区上包括与寡糖连接的N-连接糖基化位点。例如，所述糖基化模式可以包括每个支链上都具有末端N-乙酰氨基葡萄糖的Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1的双触角核心多糖结构。这种糖基化模式可以含或不含岩藻糖，和/或含或不含平分型GlcNAc。
在一些变化形式中，向患者施用的抗体群中的重组抗体的至少20％(例如，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％等，及特别是50％或更高，例如，55％或更高，60％或更高，65％或更高，80-100％之间等)具有糖基化模式，所述糖基化模式包括双触角核心多糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβl-4G1cNAcβ1，每个支链上具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。例如，抗体群中至少50％重组抗体具有糖基化模式，所述糖基化模式包括双触角核心多糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβl-4G1cNAcβ1，每个支链上具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。正如提到的那样，这种糖基化模式可以含或不含岩藻糖，和/或含或不含平分型GlcNAc。
正如提到的那样，这些方法中的任一种方法可以包括形成抗体/病毒粒子复合物及将抗体/病毒粒子复合物截留在粘液内。重组抗体可以配置为与病毒粒子的非-中和表位结合。施用可以包括施用低于-中和剂量水平的剂量。
这些方法中的任一种方法可以包括将病毒粒子在患者粘液内的运动性降低到不超过其在水中运动性的大约50％。例如，这些方法中的任一种方法可以包括将可以穿过患者粘液的病毒粒子的百分数减少至少10％(例如，至少15％，至少20％，至少25％等)。
所述重组抗体可以是人或人源化IgG或IgM单克隆抗体，或它们的片段或衍生物。
所述重组抗体可以配制为气溶胶组合物。例如，所述重组抗体可以配制为具有中性pH(例如，接近中性pH)；在一些变化形式中，所述重组抗体可以配制为低渗溶液。
施用可以包括施用采用新一代撞击器(Next Generation Impactor)测定的质量中位数气动粒径(MMAD)为2-5μm范围的重组抗体雾化组合物。
合适的给药方案可以包括每隔3至24小时经吸入途径给受试者施用一次所述重组抗体分子。剂量方案可以包括施用剂量大约5-100mg/天(例如，大约15-50mg/天，大约5-200mg/天，大约15-200mg/天，大约5-150mg/天，大约15-150mg/天，大约5-100mg/天，大约15-100mg/天等)。在一些变化形式中，所述剂量可配置为维持粘液中(例如，在大约至少1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，8小时，12小时，16小时，20小时，24小时等)持续浓度为大约0.5-1000μg/mL(例如，1μg/mL或更高，10μg/mL或更高，15μg/mL或更高，20μg/mL或更高，30μg/mL或更高，40μg/mL或更高，50μg/mL或更高，60μg/mL或更高，70μg/mL或更高，80μg/mL或更高，19μg/mL或更高，100μg/mL或更高，120μg/mL或更高，150μg/mL或更高等)。这种剂量方案可用于成年患者和/或婴幼儿患者。或者，对于儿童(包括婴幼儿)，剂量方案可以不同。
例如，在一些变化形式中，剂量方案可以按照体重。例如，对于儿童，剂量方案可以是每天0.1-25mg/kg(例如，每天0.5-20mg/kg，每天1-15mg/kg等)，例如，体重5kg婴儿，施用5-75mg/天。对于成年人，可以采用更高剂量，例如，>500mg/天至甚至1g/天。粘液中的浓度可以是0.05-1000μg/mL(例如，大约0.5-1000μg/mL)等。
正如本文所述，所公开主题的(具有增强粘液截留能力的)抗体未结合时能够扩散通过粘液，允许抗体与靶病原体或精子以期望的速率结合。但是，当抗体与靶(例如，病毒粒子)结合时，抗体-粘蛋白相互作用的累积效应将病原体或精子有效截留在粘液中。由于在未结合状态时，抗体可以快速扩散穿过粘液，因此，典型剂量的半衰期可能是12-24小时，允许每天施用一次或二次，尽管粘液自然更新和清除，仍然能够保持高于某一最低阈值。局部给药(例如，通过吸入)的未结合抗体不可能迅速从肺中清除，即使粘蛋白网络被迅速清除，抗体可能与流体环境处于稳定状态。
患者可能是婴儿(例如，人类婴儿)、儿童、成年人或老年人(例如，55岁或更大，60岁或更大，65岁或更大，70岁或更大，75岁或更大等)。在一些变化形式中，患者是免疫功能受损者(例如，由于已有疾病，由于化疗，由于骨髓移植等)。
在一些实施例中，病毒粒子可以选自呼吸系统病毒和/或通常未被视为呼吸系统病毒的病毒，包括但不限于：埃博拉病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、腺病毒、人鼻病毒、冠状病毒、诺如病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、汉坦病毒、中东呼吸综合征(MERS)、博卡病毒、马尔堡病毒、肠病毒等。特别是，病毒可以是呼吸道合胞体病毒。
例如，本文所述是将呼吸系统病毒粒子固定在受试者肺部粘液中的方法，所述方法包括经吸入途径向受试者施用对病毒粒子具有特异性亲和力的重组抗体，从而所述重组抗体被截留在受试者的粘液内，所述重组抗体包括人或人源化Fc区，其中所述重组抗体包括寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，其中所述重组抗体被截留在受试者粘液中的浓度是50ng/mL或更高(例如，0.1μg/mL至20μg/mL之间)。
本文还描述了阻断、预防或消除呼吸道病毒粒子在受试者肺部粘液中增殖、浸润或扩散的方法，所述方法包括经吸入途径向受试者施用对病毒粒子具有特异性亲和力的重组抗体而固定病毒粒子，从而所述重组抗体被截留在受试者粘液内，所述重组抗体包括人或人源化Fc区，其中所述重组抗体包括寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式。
本文还描述了治疗病毒，包括，特别是引发呼吸系统疾病的病毒，的雾化溶液。一般说来，这些雾化溶液可以采用雾化器(例如，任何合适的雾化器)雾化，形成质量中位数气动粒径(MMAD)小于大约5μm直径的粒子。雾化溶液通常包括具有人或人源化Fc区和寡糖的重组抗体，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，从而重组抗体与病毒粒子结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/病毒粒子复合物，从而治疗或预防感染。雾化溶液粒子内的抗体浓度可以是10mg/mL至100mg/mL之间，pH是中性或中性(pH大约7)至弱酸性(pH大约4.5)之间。在一些变化形式中，雾化溶液相对肺组织可以是低渗或高渗溶液。由于本文所述组合物可以在肺组织外面(例如，粘液内)有效，因此，在一些变化形式中，优选高渗(包括适度高渗)溶液。例如，高渗生理盐水指的是氯化钠(NaCl)浓度高于生理盐水(0.9％)的任何生理盐水溶液。例如，高渗溶液可以包括2％、3％、5％等的NaCl。在一些变化形式中，雾化溶液可以是适度高渗溶液(例如，2％或3％NaCl)。在一些变化形式中，雾化溶液是等渗溶液。
在一些变化形式中，雾化溶液中包括糖、多元醇和/或氨基酸是有利的。例如，在一些变化形式中，所述配方可以包括以下一种或多种(或全部)：组氨酸、甘氨酸和/或甘露醇(例如，47mM组氨酸，4mM甘氨酸和5.6％甘露醇)。正如提到的那样，这些配方中的任何配方可以是高渗的。在一些变化形式中，所述配方可以包括NaCl和/或柠檬酸盐(例如，1.8％NaCl和10mM柠檬酸盐)。
病毒实例包括：埃博拉病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、流感病毒、腺病毒、人鼻病毒、冠状病毒、诺如病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、汉坦病毒、中东呼吸综合征(MERS)、博卡病毒和马尔堡病毒。
特别是，本文描述了经吸入治疗或预防受试者呼吸道合胞体病毒(RSV)的雾化溶液，所述雾化溶液包括具有人或人源化Fc区及寡糖的重组抗体，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与RSV结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/RSV复合物，从而治疗或预防感染，其中所述雾化溶液包括质量中位数气动粒径(MMAD)2-6μm(例如，3-4.5μm，小于6μm，小于5μm等)的粒子及粒子内抗体的浓度为10mg/mL至100mg/mL。
雾化溶液的pH可以是中性pH(例如，pH大约7)或处于中性和弱酸性之间(例如，大约4.5至7.4，大约4.5至7等)。
正如提到的那样，本文所述雾化溶液相对肺可以是高渗(包括适度高渗)溶液，可能使粘液变薄，轻微但保持抗体在粘液内。在一些变化形式中，雾化溶液相对肺可以是低渗(适度低渗)溶液。在一些变化形式中，雾化溶液是等渗溶液。
在这些实例的任一实例中，所述重组抗体可以在抗体Fc区上包括与寡糖连接的N-连接糖基化位点。例如，所述糖基化模式可以包括Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1的双触角核心多糖结构，每个支链上都具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。一般说来，所述重组抗体可以包括人或人源化IgG或IgM单克隆抗体，或它们的片段或衍生物。
例如，雾化溶液中的重组抗体可以包括帕利珠单抗，或帕利珠单抗的变体，包括但不限于莫维珠单抗(motavizumab)(或莫维珠单抗的变体)。
本文所述任何雾化溶液可以包括表面活性剂。表面活性剂可以是非离子型表面活性剂(例如，聚氧乙烯乙二醇辛基酚醚：例如C8H17–(C6H4)–(O-C2H4)1–25–OH；聚氧乙烯乙二醇烷基酚醚：例如C9H19–(C6H4)–(O-C2H4)1–25–OH；聚氧乙烯乙二醇山梨糖醇酐烷基酯；山梨糖醇酐烷基酯；聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物等)，阴离子表面活性剂(例如，丁二酸二辛基磺酸钠(DOSS)；全氟辛基磺酸盐(PFOS)；线性烷基苯磺酸盐；月桂基乙醚硫酸钠；木质素磺酸盐；硬脂酸钠等)，阳离子表面活性剂(例如，苯扎氯铵(BAC)、氯化十六烷吡啶(CPC)、氯化苄乙氧铵(BZT)等)及两性离子表面活性剂(例如，磺基甜菜碱，如CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐)、甜菜碱等)。
抗体浓度范围尤其重要。如上所述，粒子内抗体浓度可以是10mg/mL至100mg/mL(例如，大约12mg/mL至85mg/mL)。虽然抗体浓度可以不在此范围内，但是，其效果急剧下降。例如，在浓度大约10mg/mL(例如，5mg/mL)时，雾化溶液可能没有任何可感知的效果，或者效果显著降低。抗体浓度大于大约100mg/mL也没有效果，可能是由于mAb聚集，雾化溶液粘度增加所致。雾化溶液这种出乎意料的浓度依赖性至少部分解释了通常认为抗-RSV mAb无法被雾化的原因。
例如，本文描述了经吸入治疗或预防受试者呼吸道合胞体病毒(RSV)的雾化溶液，所述雾化溶液包括抗RSV F蛋白表位的重组抗体，所述重组抗体具有人或人源化Fc区及寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与RSV结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/RSV复合物，从而治疗或预防感染，其中所述雾化溶液包括质量中位数气动粒径(MMAD)2-6μm(例如，大约3-4.5μm，小于大约6μm，小于大约5μm等)的粒子，pH 7.0至8.5，且粒子内抗体的浓度是10mg/mL至100mg/mL。
RSV F蛋白的表位可以是在A抗原位点、位点II，和/或位点
Figure BDA0002793129270000071
和/或抗原位点VIII内，占据前面定义的主要抗原位点II和位点
Figure BDA0002793129270000072
之间的中间位置。
一般说来，本文所述方法和组合物(包括雾化溶液)可以靶向呼吸系统病毒。除上文所述RSV之外，本文所述方法和组合物可用于治疗以下病毒中的一种或多种：偏肺病毒、流感病毒、腺病毒和副流感病毒。例如，所述重组抗体可以靶向偏肺病毒，例如，人mAb54G10(J Infect Dis.2015Jan 15；211(2):216–225,doi:10.1093/infdis/jiu307)，单克隆抗体(MAb 338,MedImmune,Antiviral Research Volume 88,Issue 1,October 2010,Pages 31-37；https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2010.07.001)等。有关本文可以使用的抗偏肺病毒和/或RSV的mAb说明亦参见Journal of Virological Methods 254(2018)51–64(https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2018.01.011),J Virol.2006Aug；80(16):7799–7806(doi:10.1128/JVI.00318-06),J Gen Virol.2008Dec；89(Pt 12):3113–3118(doi:10.1099/vir.0.2008/005199-0),及Nat Microbiol.2017Jan 30；2:16272(doi:10.1038/nmicrobiol.2016.272)。抗偏肺病毒的两种mAb的另一个实例在US 9,498,531(请注意，图24A-25B包括这两个mAb的序列实例，在US 9,498,531中以HMB3210和HMB2430表示)中进行了描述。这些抗偏肺病毒的任何mAb都可以按照本文所述使用，类似于下面更详细描述的IN-001和IN-002。
例如，经吸入治疗或预防受试者呼吸系统病毒的雾化溶液可以包括：具有人或人源化Fc区和寡糖的重组抗体，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与呼吸系统病毒结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/呼吸系统病毒复合物，从而治疗或预防感染，其中所述雾化溶液包括质量中位数气动粒径(MMAD)大约2-6μm的粒子及粒子内抗体的浓度是10mg/mL至100mg/mL。正如提到的那样，呼吸系统病毒可以是以下病毒中的一种：呼吸道合胞体病毒(RSV)、偏肺病毒、流感病毒、腺病毒和副流感病毒。
附图说明
本发明的新特征特别在所附权利要求书中给出。参考采用本发明原理的说明性实施例中给出的下述详细说明及以下附图，可以更好地理解本发明的特征和优点：
图1A-1B表明，HSV-1在内源性抗-HSV-1IgG含量高的CVM样品中被固定不动，但在内源性抗-HSV-1IgG含量低的CVM样品中运动容易。向CVM中加入荧光HSV-1或对照粒子，并采用多种粒子跟踪方法分析它们的运动情况。(A)在均值的1个标准误内，在1s时间标度r时具有有效扩散性(Deff)的HSV-1(d～180nm)和对照粒子(d～200nm)的代表性20s轨迹。对照粒子包括粘膜-惰性(PEG-包被；PS-PEG)和粘膜-粘附(未包被；PS)聚苯乙烯微球，它们分别自由扩散和被截留在人CVM内。(B)来自独特捐献者的单个CVM样品(n＝12，每个实验独立开展)中PS-PEG、PS和HSV-1的几何平均值Deff(τ＝1s)和内源性抗-HSV-1IgG的关系。虚线代表Deff临界值，低于此值，粒子被永久性截留(1s内移动距离低于其直径)。示出了皮尔逊相关系数(r)。
图2A-2B示出了CVM中对照微球和HSV-1的转运特点。(A)来自独特捐献者的单个CVM样品(n＝12，每个实验独立开展)中对照微球(PS-PEG和PS)和HSV-1的阿尔法值(α)和内源性抗-HSV-1IgG的关系。α是log-log均方位移(<MSD>)vs.时间标度绘图的斜率(无障碍纯布朗扩散α＝1，例如，水中的粒子，随着粒子扩散障碍增加，α变得更小)。所有跟踪分析的α值都在表中列出。(B)短时间标度时被截留在CVM内的HSV-1病毒粒子即使在较长时间标度时亦同样保持固定不动。内源性抗-HSV-1IgG含量高的CVM样品内的HSV-1在15分钟以上时间段保持被限制在同一位置。时间戳(右下角，顶部中心放大；小时：分钟：秒)表示代表性影片的三幅图像经过的时间。
图3A-3C表明HSV-1在内源性抗-HSV-1IgG含量高的CVM样品内固定不动与总IgG、IgA或IgM的含量并无关系。来自独特捐献者的单个CVM样品(n＝12)中PS-PEG、PS和HSV-1的几何平均值Deff(τ＝1s)和总内源性(A)IgG，(B)IgA或(C)IgM的关系。虚线代表Deff临界值，低于此值，粒子被永久性截留(1s内移动距离低于其直径)。
图4A-4B表明，CVM中抗-HSV-1IgG的含量影响HSV-1的运动性，但并不影响PS-PEG或PS的运动性。(A)HSV-1在内源性抗-HSV-1IgG含量高的天然CVM样品中固定不动，但在透析脱除～90-95％总IgG的恒定样品量的同一CVM样品中运动容易。对照PS-PEG和PS粒子分别保持扩散和固定不动。虚线代表Deff临界值，低于此值，粒子被永久性截留(1s内移动距离低于其直径)。(B)向内源性抗-HSV-1IgG含量低的CVM样品中加入外源性抗-HSV-1IgG并不会改变CVM对纳米粒子的扩散阻隔性质。对照PS-PEG和PS粒子在低内源性(“Low endo”)、高内源性(“High endo”)和外源性添加抗-HSV-1IgG(“Low endo anti-HSV-1IgG”)的CVM中同样分别保持扩散和固定不动。PS-PEG或PS粒子在这三个条件下的平均Deff差异并不具有统计学显著性。虚线代表Deff临界值，低于此值，粒子被永久性截留(1s内移动距离低于其直径)。
图5A-5C表明，向内源性抗-HSV-1IgG含量低的CVM样品中加入抗-HSV-1多克隆人IgG有效截留了HSV-1。HSV-1的运动性通过在同一CVM样品的不同等份试样中加入不同含量的抗-HSV-1IgG进行定量。(A)不同含量总抗-HSV-1IgG(内源性和添加IgG总和)的CVM样品(n＝7，每个实验单独开展)中HSV-1的有效扩散性(Deff；τ＝1s)比较。不同颜色的圆圈代表不同的样品。(B)抗-HSV-1IgG的体外中和vs.截留能力。中和根据Vero细胞中HSV斑块形成减少检验；截留定义为Deff(τ＝1s)低于0.01μm2/s。每个治疗组样品的总IgG进行平均。误差棒代表SEM。*指示与各对照相比统计学上具有显著性差异(p<0.05)。(C)1μg/mL IgG处理样品中粒子的速度分布(圆环图)，及50％截留所需的总IgG预估浓度(μg/mL)(中心数字)。每个样品都示出了捐献者ID，颜色与(A)中相匹配。
图6A-6B表明了基于弱IgG-粘液相互作用，多克隆抗-HSV-1和单克隆抗-g人IgG截留HSV病毒粒子的情况。(A)HSV-1在采用1μg/mL多克隆抗-HSV-1IgG(“Anti-HSV-1pAb”)、293细胞中产生的单克隆抗-gD IgG(“Anti-gD mAb)或293细胞中产生的抗-生物素单克隆IgG(“对照”)处理的内源性抗-HSV-1IgG含量低的天然CVM样品中的运动性。虚线代表Deff临界值，低于此值，粒子被永久性截留(1s内移动距离低于其直径)。*表明与对照组相比统计学上具有显著性差异(p<0.01)；抗-HSV-1pAb组和抗-gD mAb组之间并不存在统计学上显著性差异。(B)采用荧光漂白恢复(FRAP)测定的不同Ab的CVM vs.生理盐水中的扩散系数之比(Dmuc/Dsal)。为了进行比较，包括FITC-标记的人IgG(“对照”)。阴影区表明了数值范围(分别是深灰＝平均值，浅灰＝平均值±标准偏差)。
图7A-7C表明，IgG-粘液相互作用与Fe-和糖基化有关。(A)通过SDS-PAGE证明了抗-HSV-1F(ab′)2的制备，(B)通过凝集素结合检验证明了去糖基化抗-HSV-1IgG的制备(IgG-结合ConA吸光度归一化为IgG的含量)。误差棒代表SEM。(C)HSV-1在采用不同HSV-1特异性Ab培养的内源性抗-HSV-1IgG含量低的CVM中的运动性(Deff；τ＝1s)：1μg/mL亲和纯化天然IgG(“完整(Intact)”),667ng/mL F(ab′)2，和1去糖基化IgG，和天然CVM中的HSV-1的对比情况(“没有(None)”)。不同样品(n＝4-5，每个实验独立开展)以不同颜色的圆圈表示；平均值以实线表示。虚线代表Deff临界值，低于此值，粒子被永久性截留(1s内移动距离低于其直径)。*指示统计学上具有显著性差异(p<0.05)。
图8A-8C表明，抗gG表位的非中和单克隆IgG1防止小鼠阴道HSV-2感染，但并未降低已感染小鼠的感染程度。(A)体外中和(％Neut.(中和))vs.(B)体内阻止HSV-2。根据Vero细胞中HSV斑块形成减少对中和进行检验。Depo-
Figure BDA0002793129270000091
-处理小鼠接种混合对照或抗-gGIgG的HSV-2。接种三天后，采用
Figure BDA0002793129270000092
HSV测试系统，检测阴道灌洗液中的病毒情况，对感染进行检验。(C)所有小鼠(实心圆)或仅感染小鼠(空心圆)阴道灌洗液中检测的HSV-2脱落度。当采用注射泵轻柔清洗去除小鼠CVM时，33μg/mL抗-gG IgG的体内保护作用消失。数据代表4个独立实验，每个实验每组都有n＝10只小鼠。误差棒代表SEM。*指示与各对照相比统计学上具有显著性差异(p<0.05)。
图9A-9C表明，轻柔清洗阴道去除小鼠CVM时，抗-gG IgG1提供的保护作用消失。(A)天然或轻柔清洗小鼠阴道采集的阴道分泌物中粘蛋白的浓度，YOYO-1染色用于轻柔清洗或常规灌洗和拭洗(棉签)小鼠中阴道上皮细胞损伤，及天然vs.轻柔清洗小鼠阴道组织的H&E染色横截面，N.D.＝无数据。(B)采用或不采用轻柔清洗去除阴道粘液时33μg/mL抗-gG IgG处理小鼠的％感染。(C)轻柔清洗并没有改变感染小鼠的感染程度。数据代表至少三次独立实验，每次实验每组n＝10只小鼠(每组共n＝30-40只小鼠)。误差棒代表SEM，*指示与各对照相比统计学上具有显著性差异(p<0.05)。
图10A-10B表明了鼠伤寒沙门氏菌在对照或抗-LPS单克隆IgG-处理小鼠胃肠粘液中的运动性。(A)能够实时测定从小鼠身上切除的粘液覆盖肠上皮组织中细菌运动性的显微镜设置。上皮不进行清洗，因此，生理粘液层完好无损。(B)天然vs.抗-LPS IgG1处理小鼠中可运动的鼠伤寒沙门氏菌的分数及其在粘液覆盖的胃肠道不同部分中的速度。采用抗-鞭毛Ab及IgG2a，亦观察到类似的现象。
图11A-11B表明了对照或抗-LPS单克隆IgG-处理小鼠胃肠粘液中单个鼠伤寒沙门氏菌的运动性。(A)运动分数和(B)平均速度。请注意，抗-LPS IgG组的平均速度是0.036μm/s，比对照组的平均速度低85-倍。
图12示出了N-聚糖在IgG-粘蛋白相互作用中的作用。在寡糖结构中，正方形是N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，三角形是岩藻糖，菱形是唾液酸(Neu5Gc)，浅灰圆圈是半乳糖(Gal)，深灰圆圈是甘露糖。
图13示出了提出的Ab-介导的病毒粘液截留机制。示意性示出(a平面)HSV容易穿过几乎没有内源性抗-HSV IgG的天然CVM，及(b平面)抗-HSV IgG通过与粘蛋白多种暂时性的低亲和力结合，将HSV截留在CVM内。仅仅通过与粘液形成寿命较短的低亲和力结合，游离Ab，如IgG，能够迅速扩散通过粘液且与病毒结合。当IgG分子积聚在病毒表面上时，它们在病毒和粘液凝胶之间形成多种低亲和力结合。足够数量的这些暂时性的低亲和力结合确保任何给定时间时病毒都被有效截留在粘液内，从而减少可以到达靶细胞的传染性病毒粒子的通量。箭头表示任何时刻将与粘蛋白相互作用的小部分(～10-20％)游离(非病毒-结合)IgG。
图14A-14B示出了埃博拉病毒-样颗粒(VLP)的表征。(A)蛋白质印迹分析证明了埃博拉糖蛋白(GP)的掺入。埃博拉VLP通过采用编码埃博拉GP和HIV Gag-mCherry的表达质粒转染293T细胞制备。空VLP(Null VLP)采用仅HIV Gag-mCherry转染的细胞制备。rGPdTM(重组埃博拉GP)作为110kd GP带的阳性对照。(B)采用ZMappTM或单个埃博拉-结合IgG(c2G4、c116C6FR1和c4G7)免疫沉淀的埃博拉VLP。正如本文所述，埃博拉-结合mAb经修饰，具有比通常的G0糖基化模式更高的糖基化模式，从而增强粘膜结合。本文所用抗体的G0含量是80％或更高(例如，85-95％)。rGPdTM作为GP带的阳性对照，而Null VLP和α-生物素作为阴性对照，证明了ZMappTM与埃博拉VLP结合的特异性。
图15A-15D示出了埃博拉VLP和尺寸相当聚苯乙烯纳米颗粒在人气道粘液(AM)中的扩散，其中所述聚苯乙烯纳米颗粒被羧化和呈粘膜-粘附性(PS-COOH)或采用聚乙二醇修饰和呈粘膜-惰性(PS-PEG)。(A)时间标度0.2667s时有效扩散性在总体平均值1个标准误内的VLP和各粒子的代表性轨迹。(B)时间标度0.2667s时单个粒子有效扩散性(Deff)的对数分布。虚线左边Log Deff值对应0.2667s内位移小于大约200nm的粒子(即粒径的大约2倍)，或Deff从水中理论扩散性减少近20-倍。(C)总体平均几何均方位移(<MSD>)和时间标度的关系。(D)不同样品时间标度0.2667s时总体几何Deff和可运动粒子的分数绘图，平均值以实线表示。数据代表8个独立AM样品的总体平均值。误差棒代表平均标准误(SEM)。*表示根据单-尾配对0.01，与PS-COOH相比具有统计学上显著性差异(p<0.05)。
图16A-16C示出了未处理(没有Ab)或采用ZMappTM处理或单个埃博拉-结合IgG(c2G4、c116C6FR1、c4G7)处理的人AM中埃博拉VLP的扩散。(A)时间标度0.2667s时有效扩散性在总体平均值1个标准误内的VLP的代表性轨迹。(B)总体平均几何均方位移(<MSD>)和时间标度的关系。(C)时间标度0.2667s时单个粒子有效扩散性(Deff)的对数分布。虚线左边Log Deff值对应0.2667s内位移小于大约200nm的粒子(即粒径的大约2倍)，或Deff从水中理论扩散性减少近20-倍。数据代表8-9个独立AM样品的总体平均值。误差棒代表平均标准误(SEM)。*表示根据单-尾配对学生t-检验，与没有任何Ab相比具有统计学上显著性差异(p<0.05)。
图17A-17B示出了埃博拉VLP在未处理(没有Ab)或采用ZMappTM处理或单个埃博拉-结合IgG(c2G4、c116C6FR1、c4G7)处理的人AM中的扩散和首次通过时间。(A)时间标度0.2667s时总体几何平均Deff和可运动粒子分数。(B)10％和50％VLP和各粒子扩散通过50μm厚粘液层的估计时间。数据代表8-9个独立AM样品的总体平均值。误差棒代表平均标准误(SEM)。*表示根据单-尾配对学生t-检验，与没有任何Ab相比具有统计学上显著性差异(p<0.05)。
图18A-18E示出了(例如，图18A-18D)代表性横向50μm厚冷冻组织切片，表明了采用(A、B)PBS或(C、D)ZMappTM处理的小鼠气管中埃博拉VLP的分布。红色对应埃博拉VLP，蓝色对应DAPI-染色细胞核。箭头表示气管的内衬。(E)与空白组织(“空白”)对比，采用PBS处理(“对照”)或ZMappTM处理(“ZMapp-处理”)的小鼠气管中埃博拉VLP信号的定量情况。数据表示n＝3只小鼠每组，每只小鼠平均10个组织切片。误差棒代表平均标准误(SEM)。*表示根据双-尾学生t-检验，假设不等方差，具有统计学上显著性差异(p<0.05)。
图19A-19B示出了人AM中RSV的扩散。(A)可运动RSV vs.被截留RSV的代表性轨迹。(B)单个粒子有效扩散性(Deff)的对数分布。
图20A-20B示出了(A)采用PBS或RespiraClear处理的荧光RSV(红色)接种的小鼠气管冷冻切片，RespiraClear是抗RSV的mAb的气溶胶制剂，是“粘膜-截留”抗体。在图20A-20B中，RespiraClear是帕利珠单抗的粘膜-截留形式，正如本文所述。例如，此实例中的RespiraClear是mAb，其具有帕利珠单抗重链和轻链可变区及具有Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβl-4G1cNAcβ1双触角核心多糖结构，每条支链上有末端N-乙酰氨基葡萄糖的糖基化模式。细胞采用DAPI染色。病毒被保留在PBS处理的小鼠气管内(左栏)，但在采用1μg/mL RespiraClear处理的小鼠气管内被清除出去(右栏)。病毒和处理都采用25μL剂量，采用雾化器(例如，PennCentury微型喷雾器)开展，小鼠在处理30分钟后处死。(B)组织学研究图像定量分析。研究采用n＝6只小鼠开展，每只小鼠分析至少10个切片。
图21表明，鼻内施用抗体后，棉鼠肺内传染性病毒的滴度降低。
图22A-22B示出了(A)新一代撞击器(NGI)图，该撞击器用于在Privigen沉积后验证气溶胶颗粒尺寸。右图是NGI三级的放大图像。(B)NGI以15L/min操作三分钟时，雾化Privigen的惰性撞击结果。误差棒表示平均值(n＝3)以上和以下一个标准偏差。
图23A-23C表明了采用振动筛雾化器将15mg/mL IN-002(一种莫维珠单抗的糖基化群体)雾化后气溶胶的特点及mAb的稳定性。图23A表明了15mg/mL IN-002溶液产生的气溶胶采用新一代撞击器(NGI)测定的气动粒径分布。图23B示出了与未雾化IN-002对比，从NGI不同级采集的雾化IN-002的人IgG ELISA结果。图23C示出了与未雾化IN-002对比，从NGI不同级采集的雾化IN-002的整个RSV-A2包被的ELISA结果。在图23B和23C中，～100％数值表明，ELISA检验检测出雾化IN-002和未雾化IN-002在结构和抗原亲和力方面没有任何差别。
图23D-23F表明了采用振动筛雾化器将5.4mg/mL IN-002雾化后气溶胶的特点及mAb的稳定性。图23D表明了5.4mg/mL IN-002溶液产生的气溶胶采用新一代撞击器(NGI)测定的气动粒径分布。图23E示出了与未雾化IN-002对比，从NGI不同级采集的雾化IN-002的人IgG ELISA结果。图23F示出了与未雾化IN-002对比，从NGI不同级采集的雾化IN-002的整个RSV-A2包被的ELISA结果。在图23E和23F中，～100％数值表明，ELISA检验检测出雾化IN-002和未雾化IN-002在结构和抗原亲和力方面没有任何差别。
图24A-E示出了RSV-感染羊羔的肺病理学。除非另外说明，在第3天开始，羊羔每天采用生理盐水或两种不同粘膜-截留的抗RSV mAb制剂处理(IN-001，帕利珠单抗的糖基化群体，及IN-002，莫维珠单抗的糖基化群体)。图像是在感染后第6天尸检时拍摄。图24A示出了未感染组织(阴性对照)和图24B示出了感染、生理盐水处理组织(阳性对照)。图24C示出了IN-001处理的感染羊羔的组织。图24D示出了IN-002处理的感染羊羔的组织。图24E示出了第2天用In-002处理的感染羊羔的组织。
图24F示出了不同动物肉眼病变的分数图，所述分数以涉及或具有RSV病变的肺组织百分数定量。*表示p<0.05；**表示p<0.005。
图25示出了在第0天时采用RSV感染新生羊羔的每克肺匀浆的传染性荧光病灶形成单位(FFU)，如图所示，在感染第2天或第3天后开始每天接受处理。羊羔在第6天处死。坐标中断下面的数值表示线性而非对数值(即数值零代表0FFU/g)。*表示p<0.05。
图26示出了每毫升支气管肺泡灌洗液(BALF)的传染性荧光病灶形成单位(FFU)。在此实例中，新生羊羔在第0天感染，并且在感染后第2天或第3天开始每天接受处理，如图所示。羊羔在第6天处死，此时采集BALF。坐标中断下面的数值表示线性而非对数值(即数值零代表0FFU/mL)。*表示p<0.05。
具体实施方式
本发明部分基于抗体和粘蛋白之间存在弱结合相互作用及所述抗体能够阻止病原体穿过粘液层的这一发现和特点。所述抗体-粘蛋白相互作用可以有利地在预防和治疗感染、提供避孕和监测疫苗有效性的方法中使用。
下面对本发明进行更详细的说明。这些说明并非是本发明可以实施的所有不同方式或本发明可以加入的所有特征的详细目录。例如，一个实施例中谈到的特征可以在其它实施例中采纳，特定实施例中阐明的特征也可以从该实施例中省略。此外，对本领域技术人员来说，根据本发明，本文建议的各种实施例的许多变化和添加将是显而易见的，它们并不背离本发明。因此，以下说明旨在阐明本发明的一些特定实施例，而不是穷举地指定其所有排列、组合和变形。
除非上下文另外声明，应该特别指出的是，本文描述的本发明的各种特征可以以任何组合形式使用。此外，本发明还设想在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文提出的任何特征或特征组合。例如，如果说明书声明一种复合物包含组分A、B和C，应该特别指出的是，A、B或C组分中的任一种组分，或它们的组合，都可以单独或在任何组合中省略和放弃。
除非特别规定，本发明使用的所有术语(包括技术名词和科学术语)的意义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。本发明说明中使用的术语仅仅是为了描述特定实施例，并不是用于限制本发明。
除非另有说明，否则本领域技术人员熟悉的标准方法可用于制备重组和合成多肽、抗体或其抗原结合片段，操作核酸序列和产生转化细胞。这些技术是本领域技术人员熟悉的。参见，例如，SAMBROOK et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL 2nd Ed.(Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)；F.M.AUSUBEL et al.CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
本文提到的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其它参考文献都通过引用而整体纳入本申请中。
定义
在本发明中，除非上下文中清楚表明，否则，单数形式“一”、“这个”也包括复数形式。
此外，本文所述“和/或”指的是和包括一个或多个相关列出项目的任何和所有可能组合，及缺少替代(“或”)中阐明的组合。
此外，本发明还设想在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文提出的任何特征或特征组合。
此外，提到可测量值，如本发明化合物或试剂的数量、剂量、时间、温度等时使用的词语“大约”指的是包括规定数值±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化范围。
除非另外说明，在说明书和权利要求书中，在所有情况下，表达各组分、性质如反应条件等数量的所有数字都理解为被词语“大约”修饰。因此，除非另外说明，在说明书和权利要求书中，数字参数都是近似值，根据本文公开主题期望达到的性质而异。
范围在本文可表示为从“大约”一个特定值，和/或至“大约”另一个特定值。还应理解的是，本文公开了许多数值，除数值本身以外，每个数值在本文还公开为特定数值的大约值。例如，如果公开数值“10”，则亦公开了“大约10”。还应理解的是，还公开了两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开了10和15，则亦公开了11、12、13和14。
连接词“基本上由……组成”意指权利要求的范围将被解释为包括权利要求中叙述的特定材料或步骤，“以及那些不会实质性影响本发明新颖的基本特征的材料或步骤”。参见，In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)(原文加粗)；亦参见MPEP§2111.03。
正如本文所述，除非另外说明，词语“多肽”包括肽和蛋白质。
“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，可能是RNA、DNA或DNA-RNA混合序列(包括天然和非天然核苷酸)，但是优选是单链或双链DNA序列。
本文所述“分离”抗体指的是与天然生物或病毒至少其它一些组分(例如，通常发现与抗体有关的细胞结构组分或其它多肽或核酸)分离的抗体或基本上不含天然生物或病毒至少其它一些组分的抗体。该词语亦包括合成制备的抗体。
词语“治疗”(及其语法变化形式)指的是受试者疾病严重程度减轻或至少部分改善或变好和/或至少一种临床症状减轻、缓解或减少和/或疾病进程延迟。
本文所述词语“预防”和“抑制”(及其语法变化形式)并非指疾病完全消失，包括减少疾病发生率、延迟疾病发作和/或减轻疾病发作后症状的任何类型的预防性治疗。
本文所述“有效”、“预防有效”或“治疗有效”剂量是足够为受试者提供某些改善或好处的剂量。或者，“有效”、“预防有效”或“治疗有效”剂量是延迟、减轻、缓解或减少受试者至少一种临床症状的剂量。本领域技术人员将了解的是，这些效果并不需要是全面或治愈，只要为受试者提供某些好处即可。
本文所述“截留能力”指的是与靶向病原体或精子特异性结合的抗体抑制病原体或精子移动穿过粘液的能力。截留能力可以采用本领域熟悉的方法及本文所述方法测定。截留能力是可以测定的数量，例如，将粘液凝胶内至少50％的病原体或精子的运动性降低至其在溶液中(例如，生理盐水)的运动性的至少十分之一时所需抗体的数量(例如，粘液中抗体的浓度)。粘液中的运动性可以采用本领域熟悉的方法及本文所述方法测定。或者，截留能力可以定量为穿过粘液的病原体或精子的百分减少量。
词语“增强截留能力”指的是与天然抗体和/或开展任何修饰和/或筛选之前的抗体相比，包括寡糖的抗体的截留能力有所提高。
谈到本发明公开主题的抗体时提到的词语“特异性结合”指的是本发明的抗体将与靶病原体或精子的表位(包括一个或多个表位)结合，但基本上不与其它不相关表位或分子结合。在一些实施例中，该词语指的是相对与其它不相关表位或分子结合，抗体至少大约60％，例如，至少大约70％、80％、90％或95％与靶表位结合。
抗体和组合物
本公开主题包括抑制和/或治疗病原体感染、清除粘膜表面病原体、提供避孕和/或监测疫苗有效性的抗体、组合物和方法。特别是，本公开的主题涉及能够将病原体和精子截留在粘液内的抗体和组合物，从而抑制病原体或精子穿过或通过粘液分泌物。
有关抗体如何在粘膜表面保护受试者的普遍观点假设病原体中和是主要的保护机制。令人吃惊且出乎意料的是，根据这种普遍观点，本发明人本文公开的是，防止受试者粘膜表面感染并不一定需要进行中和。实际上，本文表明，抗体剂量低于中和病原体表位所需剂量时，也可以相当有效地抑制感染。实际上，本文表明，采用不中和病原体表位的抗体，也可以相当有效地抑制感染。
抗体是粘液中发现的天然抗体。目前有关抗体-介导粘膜保护的观点是：分泌型IgA(sIgA)抗体对于保护非常重要，因为在胃肠道中发现了大量这种同种型。进一步认为，IgG在粘膜保护中没有作用。但是，IgG是生殖分泌物中的主要同种型，呼吸系统粘液分泌物中发现存在大量IgG。与科学界普遍的观点相反的是，本文表明，粘液(如CVM)中发现的某些抗体，例如，IgG，可以迅速扩散通过粘液，仅因与粘液中粘蛋白的短暂、微弱的粘附作用而略微减慢。这种快速扩散允许抗体迅速积聚在病原体或精子表面上。当病原体表面积聚多个抗体时，多个抗体和粘液之间的粘附作用足以将结合的病原体或精子截留在粘液中，从而预防感染/提供避孕。被截留在CVM中的病原体或精子无法到达其粘膜表面内的靶细胞，而是通过性交后排泄流出和/或通过自发热降解以及粘液中其它保护因子(如防御素)失活(Cole,Curr.Top.Microbiol.Immunol.306:199(2006)；Doss et al.,J.Leukoc.Biol.87:79(2010)。正如本文所公开的那样，这种病原体截留活性无需中和即可提供保护，可以在低于中和剂量条件下和/或采用不中和病原体表位的抗体有效抑制感染。
本发明还发现：抗体与粘蛋白形成的低亲和力相互作用不仅具有Fe-依赖性，而且还受抗体糖基化影响。
因此，本公开主题包括一种在糖基化位点包括寡糖的分离抗体，所述寡糖包括、基本上由或由与(提供)增强所述抗体粘液截留能力有关的模式组成，其中所述抗体与靶病原体或精子的表位特异性结合。这种抗体的独特的糖基化模式/独特的寡糖组分设计用于当多个抗体与靶病原体或精子结合时，最大限度地提高抗体的截留能力，不会过度阻碍未结合抗体轻松扩散穿过粘液，与靶病原体或精子迅速结合的能力。在一些实施例中，与其在溶液(例如，生理盐水或水)中的运动性相比，所述抗体在粘液中的运动性降低不超过大约50％，例如，不超过大约40％、30％、20％、10％或5％，并且根据多个结合抗体，将靶病原体或精子有效截留在粘液内(例如，至少50％病原体或精子减慢至少90％)。在一些实施例中，所述抗体将至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％或更多病原体或精子的运动性降低至少90％，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％或更高。在其它实施例中，所述抗体将能够穿过粘液的病原体或精子的百分数减少至少10％，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。根据本文公开，熟悉本领域的技术人员很容易鉴定/设计提供所需截留能力的寡糖模式。在其它实施例中，所述抗体与靶病原体或精子表位的结合率足够高，从而其积聚在所述靶病原体或精子表面上的抗体含量足够高，从而在粘液中抗体浓度低于5μg/mL(例如，低于1μg/mL或0.1μg/mL)的条件下在1小时内(例如，30分钟内或15分钟内)将靶向病原体或精子截留在粘液内。
在一些实施例中，所述寡糖组分与所述抗体Fc区的N-连接糖基化位点结合。N-连接糖基化位点可以是抗体Fc区上的天冬酰胺残基，例如，Asn 297天冬酰胺残基。所述氨基酸编号是相对人IgG分子标准氨基酸结构。
人IgG-Fc上的N-聚糖结构通常以共享共同核心糖序列的双触角核心结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr为主(如图12所示)，“触角”由有助于将其它糖与所述核心连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GlcNAcT)启动。在人类血清中发现的IgG中，最常见的结构是每个支链上同时包含N-乙酰氨基葡萄糖及一个末端半乳糖(39％)、两个末端半乳糖(20％)、或一个末端半乳糖和一个末端唾液酸(15％)的那些结构。总之，包括至少一个末端半乳糖的抗体占IgG-Fc糖型的大约74％。纯GnGn形式(每个支链含N-乙酰氨基葡萄糖，不含末端半乳糖或唾液酸)占IgG-Fc糖型的大约26％。
在一些实施例中，与抗体连接的寡糖组分(即聚糖)，包括、基本上由或由图12所述的核心结构组成。在一些实施例中，所述与抗体连接的聚糖包括、基本上由或由图12所述的核心结构且减去岩藻糖残基组成。在一些实施例中，所述与抗体连接的聚糖包括、基本上由或由图12所述的完整结构组成。在其它实施例中，所述聚糖并不包含任何半乳糖残基。在一些实施例中，所述聚糖包括图12所述结构及不包括半乳糖的其它糖类残基。有人认为，半乳糖的存在损害截留能力，但并不受此理论限制。糖型不包含半乳糖的抗体仅占自然界发现的全部糖型的很少一部分。采用富集期望糖型(不管是天然或修饰聚糖)的大量抗体用于截留粘液中的病原体和精子非常有利。
在一些实施例中，本发明的抗体是具有不同寡糖组分的抗体的混合物。在一些实施例中，所述抗体混合物包括至少大约30％具有图12所述核心聚糖结构，含或不含岩藻糖残基的抗体，例如，至少大约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在其它实施例中，所述抗体混合物包括至少大约5％具有图12所述完整聚糖结构的抗体，例如，至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施例中，所述抗体混合物包括至少大约30％具有图12所述核心聚糖结构的抗体，例如，至少大约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高及至少大约5％图12所述完整聚糖结构的抗体，例如，至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在一些实施例中，所述抗体混合物是人类细胞系，例如，293细胞系，例如，293T细胞系产生的混合物。
所述抗体用于结合靶病原体，将病原体截留在粘液中，从而抑制病原体引发的感染。所述抗体的靶病原体包括通过粘膜感染受试者的任何病原体。病原体可以是藻类、细菌、真菌、寄生虫(肠虫、原生动物)、病毒和亚病毒感染因子类别。靶病原体进一步包括包含带表位的抗原的合成系统，例如，包含连接蛋白的粒子或颗粒(例如，聚苯乙烯微球)，例如，可以用于生物恐怖主义。
病原体包括那些导致性传播疾病的病原体(按照所述病原体引发的疾病列出)，包括但不限于淋病奈瑟氏菌(淋病)；沙眼衣原体(衣原体属，性病性淋巴肉芽肿)；梅毒密螺旋体(梅毒)；杜克雷嗜血杆菌(软下疳)；肉芽肿杆菌或肉芽肿荚膜杆菌(杜诺凡病)，生殖支原体，解脲支原体(支原体属)；人类免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2(HIV、AIDS)；HTLV-1(T-淋巴细胞1型病毒)；单纯疱疹1型和2型病毒(HSV-1和HSV-2)；EB病毒；细胞巨化病毒；人类疱疹病毒6型；水痘-带状疱疹病毒；人类乳突病毒(生殖器疣)；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒(病毒性肝炎)；传染性软疣病毒(MCV)；阴道毛滴虫(阴道滴虫病)；及酵母菌，例如，白色念珠菌(外阴阴道念珠菌病)。所述抗体和组合物还对体液接触传播的其它疾病具有活性，这些疾病性接触也可以传播，并且能够通过施用本发明组合物预防。因此，词语“性传播疾病(STD)”此处解释为包括不管生殖器官是否是病原体位点都能够在性接触期间传播的任何疾病。
病原体还包括那些引发呼吸系统疾病的病原体，包括但不限于流感(包括甲型流感、乙型流感和丙型流感)；严重急性呼吸综合征(SARS)；呼吸道合胞体病毒(RSV)；副流感；腺病毒；人鼻病毒；冠状病毒；和诺如病毒。
其它病原体包括但不限于沙门氏菌和大肠杆菌。
病原体包括那些影响非人类动物，例如，牲畜，例如猪的病原体(例如，猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、假狂犬病病毒(PRV)、日本脑炎病毒(JEV)、布鲁氏菌、钩端螺旋体、沙门氏菌，和细胞内劳森菌、多杀性巴氏杆菌、猪痢疾短螺旋体、猪肺炎支原体)，反刍动物的病原体(例如，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)、牛丘疹性口内炎病毒(BPSV)、伪牛痘病毒(PCPV)、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、睡眠嗜血杆菌、Haemophilus agnii、牛莫拉氏菌、牛肺疫支原体、环形泰勒虫、鸟型副结核分枝杆菌)，有蹄类动物(例如，流产布鲁氏杆菌、牛型结核杆菌、小泰勒虫、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、结节性皮炎病毒)，马的病原体(例如，马红球菌、霍乱沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒、马链球菌)，家禽的病原体(例如，鸡痘病毒、新城鸡瘟病毒、马立克氏病病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV))等。
词语病毒和病毒病原体在本文互换使用，进一步指的是各种病毒菌株，例如，流感包括新的流感菌株，这是熟悉本领域的技术人员将容易辨别的。词语细菌和细菌病原体在本文互换使用，进一步指的是细菌病原体的耐抗生素或耐多药菌株。正如谈到细菌病原体时所使用的那样，词语“耐抗生素菌株”或“耐多药菌株”指的是能够耐受本领域治疗细菌病原体所用抗生素或药物影响的细菌病原体(即细菌病原体的非-耐受菌株)。
在一些实施例中，设想本发明公开主题的抗体能够与包含类脂包膜的病毒广泛结合，并不一定对一种病毒具有特异性。
正如上文所述，我们吃惊地发现，低于中和剂量的抗体可用于将靶病原体或精子有效截留在粘液内。因此，在一些实施例中，其中所述抗体与靶病原体的中和表位特异性结合，可以采用低于中和剂量。低于中和剂量是低于实现中和所需剂量的剂量。例如，正如下文所述，在采用靶向HSV的多克隆抗-HSV gG抗体时，有效中和剂量是大约5μg/mL。但是，在剂量低于5μg/mL，甚至在剂量低于1μg/mL时，抗体也可以实现有效截留。
正如熟悉本领域的技术人员将认识到的那样，一些实施例中截留细菌病原体的合适剂量可以高于截留病毒病原体的合适剂量。进一步认识到的是，不同病原体、粘膜表面及个体之间的合适剂量可能不同。还将认识到的是，不同受试者和不同粘膜表面具有不同的最佳聚糖模式及最佳抗体-粘蛋白亲和力，从而导致了不同的最佳剂量。
本文进一步提出的是，可以采用与靶病原体非中和表位选择性结合的抗体将靶病原体有效截留在粘液内。因此，在一些实施例中，所述抗体与非中和表位，例如，一个或多个非中和表位特异性结合。
本公开主题进一步包括与靶病原体保守表位选择性结合的抗体，靶向保守表位的益处是将保留所述抗体对所述病原体新菌株的效力。过去曾经避免靶向所述表位，因为它们被视为无效靶；但是，本文公开认为，非中和表位可以作为有效靶和/或低于中和剂量可以有效抑制感染，以前排除的靶病原体的保守表位可视为有效靶。
本发明的抗体可用于与精子结合，将精子截留在粘液内，抑制精子对卵子的授精。可作为抗体靶的精子特异性抗原是本领域熟悉的。参见，例如，美国专利Nos.8,211,666、8,137,918、8,110,668、8,012,932、7,339,029、7,230,073和7,125,550，通过引用，这些专利全文纳入本申请中。
正如上文所述，据确定，抗体与粘蛋白形成的低亲和力结合作用受抗体糖基化的影响，并且还具有Fc-依赖性。因此，本公开主题包括具有保留和/或工程改造Fc区的抗体。所述抗体可以是，例如，IgG、IgA、IgM、IgD或IgE中的一种或多种抗体。在一些实施例中，所述抗体是IgG。在一些实施例中，所述抗体是IgG的一个或多个亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或它们的任何组合。
在一些实施例中，所述抗体与靶病原体或精子的表位的结合率和/或结合亲和力足够高，从而其积聚在所述靶病原体或精子表面上的抗体含量足够高，从而在施用浓度低于大约5μg/mL的抗体后的1小时内截留所述靶向病原体或精子。此种情况下的词语“截留”指的是减少穿过粘液的进一步运动。在一些实施例中，靶病原体或精子在大约30分钟内，例如，施用所述抗体后的大约25、20、15或10分钟之后被截留。在一些实施例中，所述抗体在抗体浓度低于大约4、3、2或1μg/mL时截留靶病原体或精子。
下述讨论概述了产生抗体的技术；但是，熟悉本领域的技术人员将认识到，下述方法的许多变化形式是本领域熟悉的。
本文使用的词语“抗体”指的是所有类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以来源于任何物种，包括(例如)小鼠、大鼠、兔子、马、山羊、绵羊、骆驼或人类，或可以是嵌合或人源化抗体。参见，例如，Walker etal.,Molec.Immunol.26:403(1989)。所述抗体可以是按照美国专利No.4,474,893或美国专利No.4,816,567中公开的方法制备的重组单克隆抗体。所述抗体还可以是按照美国专利No.4,676,980中公开的方法化学构建的。
本发明范围中包括的抗体片段包括，例如，Fab、Fab′、F(ab)2和Fv片段；域抗体，双特异性抗体；疫苗抗体；线性抗体；单链抗体分子；及抗体片段形成的多特异性抗体。所述片段可以采用人们熟悉的方法制备。例如，F(ab′)2片段可以通过抗体分子胃蛋白酶消化制备，Fab片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生。或者，可以构建Fab表达库，快速且简单地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse et al.,Science 254:1275(1989))。在一些实施例中，本文使用的词语“抗体片段”还可以包括能够与靶病原体或精子结合及与粘蛋白缔合的任何蛋白质构建体，从而将靶病原体或精子截留在粘液内。
本发明的抗体可以进行改变或突变，以获得与抗体制备物种以外物种的相容性。例如，抗体可以是人源化或骆驼源化抗体。非人类(例如，鼠科动物)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原-结合序列)，包含源自非人类免疫球蛋白的最少序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来源于受体互补决定区(CDR)的残基被具有期望特异性、亲和力和能力且来源于非人类物种(例如，小鼠、大鼠或兔子)(供体抗体)的CDR残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人类残基取代。人源化抗体还可以包括受体抗体或引进CDR或框架序列中都未发现的残基。通常，人源化抗体将基本上包括至少一个，通常两个可变区，其中所有或基本上所有CDR区与那些非人类免疫球蛋白的CDR区对应，所有或基本上所有框架(FR)区(即CDR区之间的序列)是人免疫球蛋白共有序列的那些构架区。人源化抗体最好还包括至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones etal.,Nature 321:522(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323(1988)；and Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593(1992))。
人源化非人类抗体的方法是本领域熟悉的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引进的一个或多个氨基酸残基。这些非-人类氨基酸残基通常称为“导入”残基，通常是来自“导入”可变区。人源化基本上可以按照Winter和合作者(Jones et al.,Nature 321:522(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988))的方法，以啮齿动物CDR或CDR序列代替相应的人抗体序列执行。因此，所述“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上不到一个完整的人可变区被来自非人类物种的相应序列代替。实际上，人源化抗体通常是其中某些CDR残基(例如，所有CDR或部分CDR)和可能某些FR残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基所取代。
人类抗体还可以采用本领域熟悉的各种方法制备，包括噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole et al.和Boerner et al.的方法也可以用于制备人单克隆抗体(Coleet al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)和Boerner et al.,J.Immunol.147:86(1991))。同样，人源抗体可以向转基因动物(例如，其中内源性免疫球蛋白基因部分或全部灭活的小鼠)中引入人免疫球蛋白基因座制备。挑战后，观察人源抗体产生情况，各个方面与人类中看到的非常类似，包括基因重组、组装和抗体谱。此方法在，例如，美国专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及下述科学出版物中进行了描述：Marks et al.,Bio/Technology 10:779(1992)；Lonberg et al.,Nature 368:856(1994)；Morrison,Nature 368:812(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65(1995)。
免疫原(抗原)用于制备与靶向多肽特异性反应的抗体。例如，长度至少5个(例如，至少7个或10个)氨基酸或更长的重组或合成多肽和肽是制备单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。在一个实施例中，免疫原多肽结合物也作为免疫原。所述肽以纯、部分纯或不纯形式使用。适合靶病原体和精子的多肽和表位是本领域熟悉的。多核苷酸和多肽序列从公共序列数据库，如
Figure BDA0002793129270000181
中可以获得。与靶病原体和精子特异性结合的大量中和及非中和抗体已经在本领域中进行了描述，它们可作为制备本发明抗体的初始材料。或者，可以采用本文描述的及本领域熟悉的方法产生抗靶病原体和精子的新抗体。
重组多肽在真核细胞或原核细胞中表达，并采用标准方法提纯。然后，将多肽，或其合成形式，注射到能够产生抗体的动物体内。可以产生单克隆或多克隆抗体用于后续免疫分析，测定是否存在多肽及多肽的含量。
产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员熟悉的。简单地说，将免疫原，例如，纯化或合成肽，与合适的载体(例如，谷胱甘肽-S-转移酶，血蓝蛋白等)连接的肽，或包括在免疫载体(如重组牛痘病毒)中的肽任选与佐剂混合，并将动物用所述混合物进行免疫。通过采集试验血样，测定对感兴趣肽的反应性滴度，监测动物对免疫原制剂的免疫反应。当抗体对免疫原的滴度适当较高时，从动物采集血样，并制备抗血清。需要时，对抗血清进一步分离，富集对所述肽具有反应性的抗体。通过对动物进行免疫，例如，如上文所述，采用包括与载体蛋白共价连接(结合)的多肽的免疫原结合物，产生抗所述多肽的抗体，包括其结合片段和单链重组形式。一般说来，感兴趣的免疫原是含至少大约10个氨基酸的多肽，在另一个实施例中，所述多肽长度至少大约20个氨基酸，在另一个实施例中，所述片段长度至少大约30个氨基酸。例如，所述多肽可以包括从乳头状瘤病毒L2蛋白N-末端开始的1至200个氨基酸残基。免疫原结合物通常通过将所述多肽与载体蛋白(例如，作为融合蛋白)偶联制备，或者，它们在免疫载体中重组表达而制备。
单克隆抗体采用分泌所需抗体的细胞制备。这些抗体筛选与正常或修饰肽结合，或筛选激动活性或拮抗活性。特异性单克隆抗体和多克隆抗体通常将以至少大约50mM KD结合，例如，至少大约1mM，例如，至少大约0.1mM或更佳。在一些情况下，可以从各种哺乳动物宿主，例如，小鼠、啮齿动物、灵长类动物、人类等制备单克隆抗体。制备所述单克隆抗体的方法在Kohler and Milstein 1975Nature 256:495-497中进行了描述。简而言之，这种方法是通过向动物注射免疫原进行，例如，单独注射免疫原肽或注射任选与载体蛋白连接的免疫原肽。然后，处死动物，从其脾脏采集细胞，与骨髓瘤细胞融合。结果得到能够体外繁殖的杂交细胞或“杂交瘤细胞”。然后，筛选杂交瘤细胞群体，分离单个克隆，每个克隆分泌针对免疫原的单个抗体。采用这种方式，得到的单个抗体是响应免疫原物质上识别的特异性位点而产生的来源于免疫动物的永生化克隆单个B细胞的产物。
永生化的替代方法包括采用EB病毒、癌基因或逆转录酶病毒转化，或采用本领域熟悉的其它方法。对单个永生化细胞得到的克隆进行筛选，产生对所述抗原具有期望特异性和亲和性的抗体，并且所述细胞产生单克隆抗体的收率可以采用各种方法提高，包括注射到脊椎动物(优选哺乳动物)宿主的腹膜腔内。本发明的多肽和抗体可以经修饰或不经修饰使用，包括嵌合抗体，如人源化鼠抗体。其它合适的方法涉及噬菌体或类似载体重组抗体文库筛选。参见，Huse et al.1989Science 246:1275-1281；and Ward et al.1989Nature341:544-546。
对靶多肽具有特异性的抗体还可以通过本领域熟悉的噬菌体展示方法得到。
抗体有时候可以通过与提供可检测信号的物质共价或非共价连接进行标记。范围广泛的标记和结合技术是人们熟悉的，并且在科学和专利文献中进行了广泛的报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光单元、化学发光单元、磁粒等。所述抗体用于检测或诊断其上发现有抗原的微生物的存在性。
制备拥有感兴趣糖基化模式的抗体的方法可以采用本领域技术人员熟悉的任何方法。例如，在一些实施例中，可以采用哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞及NS0-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞产生具有期望糖基化模式的抗体。在一些实施例中，可以采用人细胞系，例如，293细胞。在一些实施例中，可以采用非哺乳动物细胞。所述细胞系可以经基因工程改造，产生具有期望寡糖的抗体。所述细胞系可以具有更改的一种或多种影响糖基化模式的酶，例如，糖基转移酶的表达。糖基转移酶包括但不限于半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、N-乙酰氨基半乳糖转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、葡萄糖醛酸基转移酶、.唾液酸转换酶、甘露糖转移酶、葡萄糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶、寡糖基转移酶或它们的任何组合。具体实例包括但不限于寡糖基转移酶、UDP-N-乙酰-D-氨基半乳糖:多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶、GDP-岩藻糖蛋白质:O-岩藻糖基转移酶1、GDP-岩藻糖蛋白质:O-岩藻糖基转移酶2、蛋白质:O-葡萄糖基转移酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖:肽N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、蛋白质:O-甘露糖基转移酶,β1,4半乳糖基转移酶及它们的任何组合。参与蛋白质糖基化的酶是本领域熟悉的，可以采用常规方法操作。参见，例如，美国专利Nos.8,383,106,8,367,374,8,080,415,8,025,879,8,021,856,7,906,329,and 7,846,434，通过引用，这些专利全文纳入本申请中。在其它实施例中，聚糖可以采用特定模式合成，并与抗体连接。在其它实施例中，可以对具有混合糖基化模式的抗体进行分离，从而分离出具有期望糖基化模式的抗体。
正如熟悉本领域的技术人员认识到的那样，本公开主题的抗体还可以形成合适的组合物(例如，药物组合物)向受试者施用，从而治疗或预防靶病原体引发的感染或靶病原体引发感染导致的疾病或病症或提供避孕。在一个实施例中，所述组合物包括、基本上由或由预防或治疗有效剂量的本发明抗体及药学上可接受的载体组成。
包含本文公开抗体的药物组合物可以与本领域常用的任何合适的药物溶媒、赋形剂或载体一起配制，包括用于此用途的传统材料，例如，生理盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及它们的组合。正如熟悉本领域的技术人员将认识到的那样，具体采用的溶媒、赋形剂或载体将依受试者及受试者的状况而异，各种施用模式将适合本发明组合物。适合本申请公开药物组合物的施用方法包括但不限于局部、经口、鼻内、经颊、吸入、肛门和阴道给药，其中所述施用将所述抗体输送到目标粘膜。
所述组合物可以是适合将抗体输送到粘膜表面的任何类型的组合物，可以是本领域熟悉的任何形式，包括固体、半固体或液体形式或洗剂形式，水包油或油包水乳液，水凝胶组合物。组合物包括但不限于凝胶、膏、栓剂、洗剂、胚珠剂、泡沫、膜、喷雾剂、软膏、阴道栓、胶囊、片剂、胶状物、霜剂、乳剂、分散体、脂质体、粉末/滑石粉或其它固体、悬浮液、溶液、乳液、微乳液、纳米乳液、液体、气溶胶、微胶囊、延时释放胶囊、控释制剂、持续释放制剂或生物粘附凝胶(例如，粘膜粘附热凝组合物)或嵌在基质内减慢或控制抗体向其施用或接触表面释放的其它形式。本文特别感兴趣的是适合气溶胶给药的雾化组合物。
所述组合物可以包含传统添加剂(例如，防腐剂)、促进穿过的溶剂及软化剂。局部制剂还可以包括传统载体，如霜或软膏基质、乙醇或油醇。还设想了与本公开主题结合使用的其它施用制剂，包括鼻内施用。本领域熟悉的、适合输送抗体或含抗体组合物到受试者一种或多种粘膜的所有制剂、装置和方法可以与本公开主题一起结合使用。
本文所述方法中使用的组合物可以包括不会对组合物的各组分，包括抗体、抗微生物剂和/或精子功能抑制剂的抑制和/或避孕效果造成不良影响或其它影响的其它制剂。例如，药物组合物中可以使用固体、液体或固体和液体混合物药学上可接受载体的混合物、稀释剂、溶媒或赋形剂。生理学上可接受的、基本上惰性的合适载体包括水、聚乙二醇、矿物油或凡士林、丙二醇、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、纤维素衍生物、多聚羧酸、交联聚丙烯酸(如卡波姆)；及其它聚合物，如聚(赖氨酸)、聚(谷氨酸)、聚(马来酸)、聚(乳酸)，热聚天冬氨酸，及脂肪族-芳香族树脂；甘油、淀粉、乳糖、二水硫酸钙、白土、蔗糖、滑石粉、明胶、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸、糖浆、花生油、橄榄油、生理盐水等。
用于本发明方法的本文所述的药物组合物可以进一步包括稀释剂、填料、粘合剂、着色剂、稳定剂、香料、胶凝剂、抗氧剂、保湿剂、防腐剂、酸和本领域技术人员熟悉的其它要素。例如，合适的防腐剂是本领域熟悉的，包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯甲酸和苄醇。
组合物可以是粉末或液体，可以包括一种或多种非活性成分和/或载体，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等。可以添加用于提供期望颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它期望特点的其它非活性成分的实例有红氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食用白墨水等。类似的稀释剂可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊可以制备作为持续释放产品，在数小时内持续释放药物。压缩片剂可以是遮盖任何不愉快的气味和防止片剂受空气影响的糖衣或膜衣片，或者是在胃肠道内选择性分解的肠溶包衣片。口服液体剂型可以包含着色和调味剂，增加患者的接受度。
所述组合物可以包括含所述抗体的粉末或气溶胶化或雾化溶液或悬浮液。所述粉末化、气溶胶化或雾化组合物，当分散时，优选平均粒径或液滴尺寸为大约0.1至大约200纳米。
所述抗体可以配制为经鼻施用或采用任何合适的手段向受试者肺部施用，例如，由受试者吸入包含所述抗体的可吸入颗粒的气溶悬浮液。可吸入颗粒可以是液体或固体。词语“气溶胶”包括任何气体悬浮相，其能够被吸入到细支气管或鼻腔通道内。特别是，气溶胶包括气体悬浮液滴，这些液滴可以采用剂量计量吸入器或雾化器或喷雾器产生。气溶胶还包括悬浮在空气或其它载气中的干粉组合物，可以通过，例如，从吸入器装置吹入而输送。参见Ganderton&Jones,Drug Delivery to the Respiratory Tract,Ellis Harwood(1987)；Gonda(1990)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313；and Raeburn et al.,J.Pharmacol.Toxicol.Meth.27:143(1992)。包括所述抗体的液体颗粒气溶胶可以采用任何合适的手段制备，例如，采用压力驱动气溶胶雾化器、振动筛雾化器或超声雾化器，正如本领域技术人员熟悉的那样。参见，例如，美国专利No.4,501,729。同样，包括所述抗体的固体颗粒气溶胶可以采用任何固体颗粒药物气溶胶产生器，采用药物领域熟悉的方法制备。
或者，可以局部而非全身施用本发明的抗体，例如，以储库或缓释制剂的形式。
正如本文所述，本公开主题的抗体未结合时能够扩散穿过粘液，允许抗体与靶病原体或精子以期望的结合率结合。还期望当抗体与病原体或精子结合时，抗体-粘蛋白相互作用的累积效应将病原体或精子有效截留在粘液中。为了促进达到这种目标，在一些实施例中，希望提供一种包括不止一种抗体的组合物，其中每个抗体与靶病原体或精子的不同表位特异性结合。所述组合物能够使与病原体或精子结合的抗体数量增加，从而增强抗体-粘蛋白相互作用，将病原体或精子截留在粘液内。
在本公开主题的一些实施例中，一种组合物包括第一抗体和第二抗体，正如本文所述，其中第一抗体与靶病原体或精子的第一表位特异性结合，第二抗体与靶病原体或精子的第二表位特异性结合，其中所述第一表位与所述第二表位不同。在一些实施例中，所述组合物包括三个或更多个不同抗体，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，其中每个抗体与靶病原体或精子的不同表位特异性结合。
在本公开主题的一些实施例中，一种组合物包括与HSV gG表面糖蛋白特异性结合的第一抗体，与HSV gD表面糖蛋白特异性结合的第二抗体，和/或与HSV gB表面糖蛋白特异性结合的第三抗体。
还希望提供一种能够治疗或预防不止一种靶病原体所引发感染的组合物。在本公开主题的一些实施例中，一种组合物包括第一抗体和第二抗体，正如本文所述，其中第一抗体与第一靶病原体的表位特异性结合，第二抗体与第二靶病原体的表位特异性结合。在一些实施例中，所述组合物包括三个或更多个不同抗体，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，其中每个抗体与不同靶病原体的表位特异性结合。
在其它实施例中，一种组合物治疗或预防由一种或多种靶病原体引发的感染。在本公开主题的一些实施例中，一种组合物包括第一抗体和第二抗体，正如本文所述，其中第一抗体与精子的表位特异性结合，第二抗体与靶病原体的表位特异性结合。在一些实施例中，所述组合物包括三个或更多个不同抗体，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，其中一个或多个抗体与精子的不同表位结合，及一个或多个抗体与靶病原体或多个靶病原体的表位特异性结合。
在一些实施例中，所述药物组合物可以进一步包括其它活性剂，例如，预防剂或治疗剂。例如，其它活性剂可以是抗微生物剂，正如本领域技术人员熟悉的那样。抗微生物剂可以是对藻类、细菌、真菌、寄生虫(蠕虫、原生动物)、病毒和亚病毒剂有活性的制剂。因此，所述抗微生物剂可以是抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫或抗原生动物制剂。所述抗微生物剂优选对传染性疾病有活性。
合适的抗病毒剂包括，例如，病毒失活剂，如非离子、阴离子和阳离子表面活性剂，及C31 G(氧化胺和烷基甜菜碱)、聚双胍、二十二烷醇、酰肉碱类似物、辛基甘油和抗菌肽，如蛙皮素、短杆菌肽、蜂毒素和逆细胞周期素(retrocyclins)。温和的表面活性剂，例如，去水山梨糖醇月桂酸酯，可以有利地作为本文所述组合物的抗病毒剂。本文所述组合物中可以有利地利用的其它抗病毒剂包括核苷酸或核苷类似物，如替诺福韦、阿昔洛韦、金刚胺、地达诺新、膦甲酸、更昔洛韦、利巴韦林、阿糖腺苷、扎西他滨和齐多夫定。其它可以使用的抗病毒剂包括非-核苷逆转录酶抑制剂，例如UC-781(硫代羧酰苯胺)、吡啶酮、TIBO、奈韦拉平、地拉夫定、胡桐内酯A、卡普韦林和依法韦仑。在这些逆转录酶抑制剂中，已经表现出较差口服生物利用率的制剂及其类似物特别适合与本发明的抗体和组合物一起向粘膜组织施用，以预防HIV性传播。可以使用的其它抗病毒剂是HIV侵入阻断剂类别中的那些抗病毒剂，例如，蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin-N)、环糊精、角叉菜胶、硫酸化或磺化聚合物、扁桃酸缩聚物、单克隆抗体、趋化因子受体拮抗剂，如TAK-779、SCH-C/D和AMD-3100，及融合抑制剂，如T-20和1249。
合适的抗菌剂包括抗生素，如氨基糖甙类、头孢菌素类，包括第一代、第二代和第三代头孢菌素；大环内酯，包括红霉素、青霉素，包括天然青霉素、抗青霉素酶青霉素、氨基青霉素、广谱青霉素；磺胺、四环素、氟喹诺酮、甲硝达唑和尿路防腐剂。
合适的抗真菌剂包括两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶、氟康唑、碘化钾、伊曲康唑、克霉唑、咪康唑、酮康唑和托萘酯。
合适的抗原虫剂包括抗疟疾剂，如氯喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎宁、治疟宁和甲氟喹；抗阿米巴药，如二醇草酰胺、吐根碱、双碘喹啉、甲硝达唑、巴龙霉素和奎纳克林；羟乙基磺酸戊双脒、阿托伐醌和依氟鸟氨酸。
本公开主题进一步包括试剂盒，包括本文所述抗体或包含所述抗体的组合物；及任选施用所述抗体或组合物的装置。在一些实施例中，所述试剂盒包括多个抗体和/或含所述抗体的组合物。在一些实施例中，所述试剂盒中提供的多个抗体中的每个抗体可以与靶病原体或精子的不同表位特异性结合。在其它实施例中，所述试剂盒中提供的多个抗体中的每个抗体可以与不同靶病原体的表位或精子的表位特异性结合。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括其它活性剂，例如，本领域熟悉的抗微生物剂，如抗生素、抗病毒剂或其它抗微生物剂，或精子-功能抑制剂。
感染预防和治疗
本公开主题进一步包括抑制或治疗受试者靶病原体引发的感染，包括向受试者粘膜施用本文公开的抗体和/或组合物。粘膜可以选自，例如，呼吸道粘膜(例如，鼻粘膜、肺粘膜)、生殖系统粘膜(例如，生殖器粘膜、子宫粘膜、阴道粘膜)、眼睛粘膜和胃肠粘膜(例如，口腔粘膜、肛周粘膜)，及它们的任何组合。在一些实施例中，所述方法包括其它步骤，例如，分离抗体，配制分离抗体的组合物，测定施用抗体前受试者粘液内抗体的含量，及测定施用抗体后受试者粘液内抗体的含量中的一个或多个步骤。
根据本文所述的方法，本发明的抗体和组合物通过将所述组合物通常输送到感染部位而服用或施用。感染部位可以是已经存在感染的部位(实际感染部位)或可能发生感染的部位(未感染个人的可能感染部位)。在一些实施例中，所述抗体和组合物可以局部给药。在其它实施例中，所述抗体和组合物可以全身给药，从而所述抗体分泌到受试者粘液内。因此，上述组合物可以经呼吸道，例如，鼻腔和肺给药。
可以施用有效剂量的抗体。本文使用的抗体抑制感染的“有效剂量”指的是足够抑制靶病原体引发感染的剂量。本文使用的抗体治疗感染的“有效剂量”指的是足够抑制靶病原体从受试者感染细胞扩散到未感染细胞和/或抑制靶病原体从感染受试者扩散到另一个受试者，例如，非感染受试者的剂量。有效剂量可以是足够将靶病原体截留在粘液内的剂量。正如本领域技术人员将认识到的那样，所述剂量依患者和靶病原体而异。所需的精确剂量将因受试者不同而变化，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、采用的具体载体或佐剂、施用模式等。因此，有效剂量将依具体情况而异，特定情况下合适的有效剂量可以由熟悉本领域的技术人员仅仅通过常规实验确定。在一些情况中，与靶病原体或精子特异性结合的所述抗体的有效剂量可以是在粘液中实现抗体浓度为大约0.1μg/mL至大约1000μg/mL，例如大约0.5μg/mL至大约100μg/mL，例如大约1μg/mL至大约50μg/mL或它们之中任何范围的剂量。在一些实施例中，所述抗体可以分两步或更多步施用，每步采用不同的剂量。例如，一开始可以施用更高剂量，清除暴露或感染受试者粘液内存在的靶病原体，确保粘液中保留足够数量的抗体提供保护，例如，提供大约24小时保护。在后面阶段，可以施用更低剂量，维持抗体保护水平。在其它实施例中，可以向可能接触病原体的受试者施用保护剂量，如果发生感染，可以施用更高剂量。
正如熟悉本领域技术人员认识的那样，词语“抑制”并非指完全消除所有情况下感染可能性的能力。相反，熟悉本领域的技术人员将了解的是，词语“抑制”指的是减少病原体穿过粘液越过粘膜，从而使受试者发生感染的机会，例如，当所述病原体被粘液中的截留抗体结合时，减少病原体感染机会。所述感染可能性降低可以相对未施用本发明抗体的对照进行测定。在一些实施例中，相对对照，抑制可能性降低大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
在一些实施例中，抑制或治疗受试者的感染可以包括将病原体截留在粘液内。因此，在一些实施例中，提供了一种将靶病原体截留在粘液中的方法，所述方法包括向受试者粘膜施用本文所述的抗体或组合物。
在一些实施例中，抑制或治疗受试者感染的方法，和/或将病原体截留在受试者粘液内的方法，涉及向受试者粘膜施用包含分离抗体的组合物，所述分离抗体与靶病原体的非中和表位特异性结合。所述抗体可以是非中和抗体。在一些实施例中，所述非中和抗体的浓度高于预先确定量。
在一些实施例中，抑制或治疗受试者感染的方法，和/或将病原体截留在受试者粘液内的方法，涉及向受试者粘膜施用包含分离抗体的组合物，所述分离抗体与靶病原体的中和表位特异性结合，其中所述抗体施用剂量低于中和剂量。
正如本文所使用的那样，词语“受试者”指的是人和其它动物。因此，按照本公开主题，提供动物治疗。因此，本公开主题用于治疗哺乳动物，如人类，以及那些因为濒危而重要的哺乳动物，如东北虎；具有经济重要性的动物，如农场饲养的动物；和/或对人类具有社会重要性的动物，如宠物或动物园的动物。所述动物的实例包括但不限于：食肉动物如猫和狗；猪，包括生猪和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物如牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；及马。因此，还提供牲畜治疗，包括但不限于家猪、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)、家禽等。
需要抑制感染或感染引发疾病或病症的受试者是已经鉴定为具有感染风险的受试者。在一些实施例中，受试者被鉴定为已经接触靶病原体。在其它实施例中，受试者与感染或可能感染的其它受试者接触过，例如，受试者与感染受试者一起生活、工作和/或上学。
需要治疗感染或感染引发疾病或病症的受试者是已经诊断为感染病原体或怀疑感染病原体，例如，出现感染症状的受试者。
在本发明的特定实施例中，按不同时间间隔(例如，每小时、每天、每周、每月等)，施用不止一次(例如，两次、三次、四次或更多次)所述抗体、组合物或包含所述组合物的装置来达到预防和/或治疗效果。
在一些实施例中，所述方法包括施用抗体，及进一步施用其它活性剂，例如，预防剂或治疗剂，例如，抗微生物剂，如抗生素、抗病毒剂或本领域技术人员熟悉的其它抗微生物剂。其它活性剂可以与本发明的抗体和组合物同时施用。其它活性剂可以在所述抗体的同一组合物中或在独立的组合物中施用。正如本文所使用的那样，词语“同时”指的是时间上足够接近，以产生联合效果(就是说，同时可以是同时，或可以是在短期内彼此前后发生的两个或多个事件)。
监测疫苗有效性
已经发现本发明抗体在预防和治疗病原体引发感染和/或病原体感染引发疾病或病症方面的用途，本发明的另一个方面涉及检测受试者体内所述抗体的存在，从而确定受试者预防可能感染的程度。例如，可以对已经针对特定病原体进行接种的受试者进行监测，监测具有粘液或其它体液，例如唾液截留能力的抗体的存在和含量。如果粘液内未出现所述抗体或其含量未达到预防或治疗水平，可以给受试者加强接种和/或接种不同疫苗，从而产生有效的抗体数量。例如，监测受试者，确保粘液中的抗体水平至少等于之前已经接触病原体的受试者体内观察到的抗体水平。
因此，一个实施例涉及一种监测已经接种靶向病原体疫苗的受试者疫苗接种有效性的方法，包括测定所述受试者粘液样品内抗体的含量，所述抗体在糖基化位点包括寡糖，所述寡糖具有增强所述抗体粘液截留能力的糖基化模式，其中所述抗体与所述靶病原体的表位特异性结合，其中所述抗体含量指示疫苗接种的有效性。
采集的粘液可以来自其中预期发现所述抗体的合适的粘膜表面。粘液样品可以采用本领域日常使用的方法从受试者获得。同样，其它体液(如唾液)样品可以采用本领域日常使用的方法从受试者获得。
可以采用各种检验方法检测和/或定量所述抗体。例如，可以采用各种免疫测定法检测本发明的抗体。所述免疫测定法通常涉及测定蛋白质或肽(即抗原)与其特异性抗体之间的抗原/抗体复合物形成情况。
本发明的免疫测定法可以是竞争性的或非竞争性的，这两种类型的测定方法都是本领域熟悉的且非常完善的方法。在竞争性结合测定法中，抗原或抗体与可以检测的标记抗原或抗体竞争与固体表面结合的捕捉位点特异性结合。与捕捉剂结合的标记抗原或抗体的浓度与样品中游离抗原或抗体的含量成反比。
本发明的非竞争性测定法可以是，例如，夹心测定法，其中，例如，抗原在两个抗体之间结合。其中一个抗体作为捕捉剂，并且与固体表面结合。另一个抗体进行标记，并通过，例如，肉眼或仪器手段用于测定或检测得到的抗原/抗体复合物。正如本领域熟悉的那样，可以采用多种抗体和标记抗体组合。在一些实施例中，抗原/抗体复合物可以采用能够与人免疫球蛋白恒定区特异性结合的其它蛋白，如蛋白A、蛋白L或蛋白G检测。这些蛋白是链球菌细胞壁的正常组分。它们表现出与各物种免疫球蛋白恒定区非常强烈的非免疫性反应活性。(参见，例如Kronval et al.,J.Immunol.,111:1401(1973)；Akerstrom et al.,J.Immunol.,135:2589(1985))。
在一些实施例中，非竞争性测定不必是夹心测定。例如，样品中的抗体或抗原可以直接与固体表面结合。然后，可以分别采用标记抗原或抗体，检测样品中的抗体或抗原。
在一些实施例中，根据人们熟悉的方法，抗体和/或蛋白可以与固体载体(例如，微球、平板、载玻片、培养皿、膜或孔)(例如，共价或非共价)结合或链接或连接。根据人们熟悉的方法，抗体还可以与可检测基团，如放射性标记(如35S、125I、32P、13H、14C、131I)、酶标记(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、金珠、化学发光标记、配体(例如生物素)和/或荧光标记(例如，荧光素)结合或链接或连接。
各种天然的和合成的有机和无机聚合物可以作为固体表面材料。非限制性聚合物实例包括聚乙烯、聚丙烯、聚(4-丁基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸脂、聚(聚对苯二甲酸乙二酯)、人造纤维、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅树脂、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、硝化纤维素等。其它可以使用的材料包括但不限于纸、玻璃、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、水泥等。此外，可以采用形成凝胶，如蛋白(如明胶)、脂多糖、硅酸盐、琼脂糖和聚丙烯酰胺的物质。形成几种水相的聚合物，例如葡聚糖，聚亚烷基二醇或表面活性剂，如磷脂，长链(12-24个碳原子)烷基铵盐等也是合适的。当固体表面是多孔状时，根据系统的性质，可以采用各种孔径。
可以采用各种免疫测定系统，包括但不限于放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、“夹心”测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集试验、免疫荧光测定、荧光激活细胞分选(FACS)测定、免疫组化测定、蛋白A免疫测定、蛋白G免疫测定、蛋白I免疫测定、生物素/抗生素蛋白测定、生物素/抗生蛋白链菌素测定、免疫电泳测定、沉淀/絮凝反应、免疫印迹(蛋白质印迹；斑点/狭缝印迹)；免疫扩散测定、脂质体免疫测定、化学发光测定、文库筛选、表达阵列、免疫沉淀、竞争性结合测定和免疫组化染色。除了在其它地方进行了描述以外，这些测定和其它测定在Hampton et al.(SerologicalMethods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul,Mimi(1990))and Maddox et al.(J.Exp.Med.158:1211(1993)中进行了描述；通过引用，这些文献的全部内容均纳入本申请中，提供用于涉及免疫测定的教导)。
本发明的方法还可以采用各种固相系统，如美国专利No.5,879,881所述固相系统开展，以及采用干带侧流系统(如“试纸条”系统)，如美国专利公开No.2003/0073147中所述系统，通过引用，这些专利的全文内容纳入本申请中。
粘液样品内抗体的检测和定量可以进一步包括抗体糖基化模式的表征。糖基化模式的测定可以采用本领域熟悉的方法和本文所述的方法开展，包括聚糖测序和分离技术，例如，凝胶电泳、荧光激活分选及质谱。
上面已经对本发明进行了描述，将在下述实例中对这些方面进行更详细的说明，这些实例在此仅用于阐述目的，而非用于限制本发明。
实例1
材料和方法
荧光HSV-1的培养和纯化：HSV-1突变体166v(Elliott et al.,J.Virol.73:4110(1999))由理查德·考特尼(Richard Courtney)友情提供，除用于体内实验外，还用于所有显微镜和ELISA研究。该突变体166v编码以相对较高拷贝数包装到HSV-1内的VP22-绿色荧光蛋白(GFP)被膜蛋白(Heine et al.,J.Virol.14:640(1974))。向VP22蛋白加入GFP似乎对病毒复制没有任何不良影响(Elliott et al.,J.Virol.73:4110(1999))，166v的荧光始终比编码其它GFP融合蛋白的HSV-1突变体强烈。166v在含5％FBS,1×L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的DMEM(纽约格兰德岛Life Technologies公司)中维持的汇合单层HaCat细胞上以MOI为3的条件进行扩增。感染后16-18小时采集培养基，并以1000×g离心两次，每次5分钟，脱除细胞碎片。将得到的上清液分成30mL等分试样，并采用聚乙二醇(PEG)/盐溶液沉淀一个晚上。简单地说，向30mL粗病毒上清液中加入10mL 1.55M NaCl，然后加入10mL 40％PEG 8000(美国密苏里州圣路易斯Sigma公司)。在4℃培养一个晚上后，将所述病毒/PEG溶液在2555×g和4℃条件下离心1小时。然后，将病毒颗粒在1×PBS中重悬，并采用20-50％(w/w)连续蔗糖-PBS梯度在74,119×g条件下离心1小时。采集得到的病毒带，并按1:5在PBS中稀释，在30％(w/w)蔗糖-PBS溶液中分层，并在83,472×g条件下离心1.5小时，以沉淀病毒供进一步纯化。将纯化的病毒沉淀重悬在PBS中，并作为一次性使用的等分试样在-80℃下储存。
宫颈阴道粘液(CVM)采集和表征：CVM采集按照以前公开的方法进行(Lai et al.,J.Virol.83:11196(2009)；Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:598(2010))。简单地说，按照北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会批准的协议，采用自取样月经采集装置，从年龄20至32岁(27.4±0.9岁，平均值±SEM)的育
Figure BDA0002793129270000261
妇女获得未稀释的CVM分泌物，每个样品平均0.3g。对研究的性质和可能的后果进行解释后，获得了参与者的知情同意。参与者将所述装置插入阴道内至少30秒，取出，并将其放在50mL离心管内。将样品在230×g条件下离心2分钟，以收集分泌物。立即准备用于乳酸和Ab测定的CVM等分试样(采用1×PBS按1:5稀释，并在-80℃储存)及用于革兰氏染色的载玻片，剩余样品在4℃储存，直到开展显微镜检查，通常在几小时内。在整个月经周期随机采集样品，并根据标准化为28天周期的上次月经期日期估计经期阶段。根据肉眼观察，没有样品有排卵(没有样品显示出粘液成丝现象)。舍弃颜色或稠度不均匀的样品。捐献者表示，他们在捐献样品之前的3天内未使用阴道产品，也未进行未采取保护措施的性交。所有样品的pH<4.5；根据革兰氏染色和遵照以前所述评分标准的纽金特(Nugent)评分标准，没有样品出现细菌性阴道病(BY)(Nugent etal.,J.Clin.Microbiol.29:297(1991))。为了开展乳酸和Ab测定，将CVM等分试样解冻，并在21,130×g离心2分钟，得到含乳酸和Ab的无细胞上清液。采用DA-乳酸试剂盒(德国达姆施塔特R-Biopharm公司)，遵照生产商协议，但改为96-孔板规格，测定乳酸含量。
采用人同种型试剂盒(HGAMMAG-301K；马萨诸塞州比勒利卡Millipore公司)，遵照生产商协议，定量CVM中的总免疫球蛋白含量。简单地说，将20×储备同种型微球涡旋、超声处理、并稀释到IX，采用50μL按1:2微球:CVM体积比连续稀释的CVM上清液培养。1小时后，采用磁板将微球与CVM上清液分离，并用洗涤缓冲液洗涤2次。然后，采用25μL 1×抗-人κ和λ-PE培养1小时，清洗2次，并重悬在Luminex驱动液中。采用Luminex MAGPIX系统，测定指示CVM中存在免疫球蛋白含量的荧光强度，并采用Milliplex Analyst(v3.5.5.0；马萨诸塞州卡莱尔市Vigene Tech Inc.公司)开展数据分析。所有培养均在室温、暗处、剧烈搅拌条件下进行。
采用全病毒ELISA定量HSV-1特异性IgG。简单地说，将高亲和力96孔半区板(伊利诺斯州罗克福德Thermo Scientific公司)采用每孔25μL 20μg/mL(采用BCA测定)亲和力-纯化的完整HSV-1在4℃包被1个晚上。将所述板采用0.05％Tween PBS(PBS-T)溶液洗涤4次，并用5％牛奶封闭至少1小时，然后采用PBS-T洗涤，然后采用连续稀释的CVM上清液培养至少1小时。PBS－T洗涤后，采用F(ab′)2抗-人IgG Fc(山羊)-HRP结合物(709-1317；宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔Rockland)和1-Step Ultra TMB底物(伊利诺斯州罗克福德ThermoScientific公司)对病毒粒子－结合IgG进行定量，并与同一板上采用两次纯化抗-HSV-1IgG(假设纯度>90％)产生的标准进行比较。采用2N硫酸终止TMB转化，并采用BioTekSynergy2酶标仪在450nm测定吸光度。HSV-1特异性IgA和IgM含量都太低，无法采用这种方法检测。
抗-HSV-1IgG的制备和表征：采用亲和层析柱提纯，从静脉内免疫球蛋白提纯抗-HSV-1IgG(IVIg,
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≧98％IgG；宾夕法尼亚州普鲁士王市CSL Behring公司)。简单地说，通过在4℃采用Triton X-100培养1个晚上，然后在21,130×g、4℃条件下离心1.5小时，从纯化HSV-1提取HSV糖蛋白。按照生产商协议，将得到的含HSV糖蛋白的上清液与AminoLink Plus偶联树脂(伊利诺斯州罗克福德Thermo Scientific公司)偶联，并在使用前在4℃储存。为了提取HSV-1特异性IgG，首先将柱子加热到室温，并采用3mL平衡缓冲溶液(150mM NaCl,0.05％Tween,10mM pH 6的磷酸钠)清洗2次。然后，将柱子装载2mL IVIg缓冲溶液，采用50kDa MWCO浓缩器(马萨诸塞州图克斯伯里Corning公司)交换为平衡缓冲溶液，并在室温上下颠倒混合至少45分钟进行培养。采用1mL平衡缓冲溶液清洗，然后采用另外三轮洗涤缓冲液(每轮4ml：500mM NaCl、0.05％Tween、10mM pH 6磷酸钠)洗涤，脱除未结合的、非特异性Ab。然后，采用IgG洗脱缓冲液洗脱结合的Ab(伊利诺斯州罗克福德ThermoScientific公司)；每种洗脱液由3ml洗脱缓冲液组成，并收集到含100μL10mM pH 6磷酸钠的试管中，以中和洗脱液。将多轮洗脱的洗脱液收集到一起，浓缩，采用30kDa MWCO浓缩管，将缓冲液交换为PBS，加入叠氮化钠(最终浓度0.03％)，使用前在4℃储存。通过小鼠IgG添加IVIg进行测定，单轮纯化脱除99％以上非-特异性IgG。采用夹层ELISA测定纯化IgG的最终浓度，平板包被2μg/mL抗-人IgG Fc(德克萨斯州圣安东尼奥Alpha Diagnostics公司)，然后采用F(ab′)2抗-人IgG Fc(山羊)-HRP检测，并与序列稀释储备IVIg得到的标准曲线进行对比。
抗-HSV-1F(Ab′)2的制备和表征：采用F(ab′)2制备试剂盒(伊利诺斯州罗克福德Thermo Scientific公司)，将HSV-1特异性IgG片段化。简单地说，采用3kDa MWCO浓缩管(Amicon 0.5mL；马萨诸塞州比勒利卡Millipore公司)，将IgG脱盐，置换到IgG消化缓冲溶液中，并通过上下颠倒混合、采用胃蛋白酶在37℃培养3.5小时，然后采用蛋白A柱(伊利诺斯州罗克福德Thermo Scientific公司)和PBS洗涤纯化，脱除未消化的IgG。采用非-还原4-12％Bis-Tris凝胶和MOPS电泳缓冲液，证明了碎片化。凝胶采用考马斯蓝染色用于成像；请注意，凝胶图像在图3中采用了Pixlr图片编辑器，进行了去饱和和对比度-调节处理，从而得到黑白图像(整个图像采用同样的设置)。还开展了竞争性抑制ELISA分析，以确认纯化F(ab′)2封闭完整的抗-HSV-1IgG的结合。HSV-1包被孔采用1％牛奶或不同稀释抗-HSV-1F(ab′)2培养1小时，然后采用完整的HSV-1特异性IgG培养1小时，并采用F(ab)2抗-人IgG Fc(山羊)-HRP结合物对结合IgG进行定量。如上文所述，抗-HSV-1F(ab′)2的总含量采用夹心ELISA，板包被HSV-1病毒粒子进行定量，但通过抗-人IgG F(ab′)2(山羊)-HRP结合物(Rockland 209-1304)检测。
去糖基化抗-HSV-1IgG的制备和表征：在37℃，通过采用10μL PNGase和11tit10×G7反应缓冲液(马萨诸塞州伊普斯威奇New England Biolabs)培养24小时，将纯化抗-HSV-1IgG上的N-连接寡糖进行裂解。然后，采用蛋白质A柱回收IgG，用IgG洗脱缓冲液洗脱到100μL 10mM pH 6的磷酸钠中，然后使用30kDa MWCO浓缩管将缓冲液交换为PBS。去糖基IgG进一步采用固定有Con A-琼脂糖浆(加利福尼亚州伯林盖姆市Vector Labs)的0.8mL旋转柱纯化，并用平衡缓冲液(10mM HEPES，含0.15M NaCl，pH 7.5)洗涤三次，然后在室温上下颠倒混合培养45分钟。培养后，将所述柱在5000×g转动1分钟，收集其中包含去糖基IgG的流穿液，并用平衡缓冲液洗涤3次，以最大限度地提高回收率。将流穿液和洗涤液汇合，采用30kDa MWCO浓缩管将缓冲液交换为PBS，补充加入叠氮化钠(最终浓度0.03％)，于4℃储存至使用。如上文所述测定去糖基IgG的总含量。去糖基化采用凝集素-ELISA测定法确认。简单地说，将高亲和力96孔板在4℃按每孔50μL 1μg/mL纯化去糖基化HSV-1IgG包被1个晚上。平板采用PBS-T洗涤4次，采用1×Carbo Free溶液(加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs)按300μL/孔封闭至少1小时，然后采用PBS-T洗涤，然后采用1μg/mL生物素化Con A凝集素(加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs)按50μL/孔培养至少2小时。采用PBS-T洗涤后，IgG-结合凝集素采用抗-生物素-HRP结合物(加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs)和1-Step UltraTMB底物进行定量，并与包被亲和-纯化HSV-1IgG或IVIg的孔进行比较。TMB转化采用2N硫酸终止，并采用BioTek Synergy 2酶标仪在460nm测定吸光度，并归一化到与采用F(ab′)2抗-人IgG Fc(山羊)-HRP结合物定量的与包被孔结合的IgG含量。
中和测定：将纯化HSV-1(～550PFU；5μL)采用95μL不同终浓度的HSV-1特异性IgG溶液培养1小时，同时上下颠倒混合。然后，采用210μL培养基稀释混合物，其中将双份150μL液体转移到6孔板中的单层汇合肾细胞。在吸出HSV-1/Ab混合物，并采用2mL PBS洗涤孔之前，将平板在37℃培养1小时，同时定期摇动，以确保平板不干透。然后，将平板在37℃、含1×L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的2％羧甲基纤维素-EMEM中培养3天，然后采用1％结晶紫溶液染色，对所得噬斑手动计数，并与对照孔进行比较，以测定中和程度。
CVM中HSV-1的多粒子跟踪：为了模拟碱性精液对CVM的中和作用，我们采用少量(～3％v/v)3N NaOH将CVM滴定到pH 6.8-7.1，并采用经pH4、7和10缓冲溶液校正的微型pH电极(新罕布什尔州贝德福德Microelectrodes公司)确认pH。样品不处理或加入含量已知的纯化抗-HSV-1IgG或对照(抗-生物素)IgG处理。对照微球由红色或绿色荧光200nm羧基-修饰聚苯乙烯颗粒(俄勒冈州尤金Molecular Probes公司)组成，未包被(PS；粘膜-粘附)或共价结合低分子量(2kDa)胺官能化聚乙二醇(PEG；德国图宾根Rapp Polymere)得到包被颗粒(PS-PEG；粘膜-惰性)，如以前所述(Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:1482(2007))。向定制玻璃室内的20μL CVM中加入5％v/v的荧光病毒粒子或对照微球(大约108-109粒/mL)，并在显微镜检查前在37℃培养1小时。采用安装在倒置落射荧光显微镜(AxioObserver D1；纽约索恩伍德Zeiss公司)上面的EMCCD相机(Evolve 512；亚利桑那州土桑市Photometrics公司)记录颗粒的平移运动，该相机配备Alpha Plan-Apo 100×/1.46NA物镜、环境(温度和CO2)控制室及LED光源(Lumencor Light Engine DAPI/GFP/543/623/690)。采用MetaMorph成像软件(加利福尼亚州森尼韦尔市Molecular Devices公司)以66.7ms的时间分辨率和10nm的空间分辨率(标称像素分辨率0.156μm/像素)捕捉视频(512×512,16-位图像深度)20秒。跟踪分辨率按照前面描述的方法，通过跟踪强胶粘剂固定的粒子位移来确定(Apgar et al.,Biophys.J.79:1095(2000))。如前所述，采用MetaMorph软件分析颗粒轨迹(Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:1482(2007)；Lai et al.,J Virol.83:11196(2009)；Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:598(2010))；调整图像对比度来改善颗粒可见度，但是整个视频采用相同的对比度，并不偏向任何颗粒群体。通过相邻像素的光强加权平均确定粒子质心的准确位置，得到子像素的跟踪分辨率。截留粒子定义为在1s的时间标度内有效扩散系数(Deff)<0.01μm2/s的粒子(即粒子在1s内的移动距离小于其直径)。在实验的子集中，已确认根据此标准定义为在20s期间被截留的粒子在超过15分钟的时间仍然被限制在同一位置。log-log均方位移(<MSD>)vs.时间标度图的斜率α提供了粒子运动性的进一步量度：对于无阻碍的纯布朗扩散，例如，水中颗粒，α＝1，当颗粒扩散阻碍增加时，α变得更小，永久截留颗粒α为零。对于每个条件，采用来自不同捐献者的CVM开展至少5个独立实验，每个实验中n≧100个颗粒。对于一组捐献者，对不同日期得到的样品开展至少两次类似观察，以确保重复性，但仅一个样品用于分析。
小鼠阴道HSV-2挑战模型：所有采用小鼠开展的实验都按照约翰霍普金斯大学动物保护和使用委员会批准的协议开展，满足E.E.C.指南(1986)和美国联邦指南(1985)的要求。雌性CF-1小鼠(6-8周大；马里兰州弗雷德里克Harlan)在使用前6-8天经右侧皮下注射Depo-Provera′(安宫黄体酮，2.5mg/小鼠)进行处理，Depo-
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使小鼠处于延长的类间情期状态，其中阴道上皮变薄，组织对感染的敏感性增加(Cone et al.,BMCInfect.Dis.6:90(2006))。将Depo-
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-处理的小鼠随机分成10只一组。小鼠阴道pH呈中性(Meysick et al.,J.Parasitol.78:157(1992))；因此，接种前未尝试改变阴道pH。将HSV-2(最终剂量2ID50；菌株G,弗吉尼亚州马纳萨斯ATCC)和培养基或不同浓度的对照(抗-生物素)或抗-gG IgG(8.F.141；加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology公司)混合，并在37℃培养1小时制备接种体。采用火抛光的50μL Wiretrol(宾夕法尼亚州布鲁莫尔Drummond公司)给小鼠接种20μL HSV-2溶液，并递送到阴道，火抛光是为了避免损害阴道上皮组织。在一些研究中，在HSV-2挑战之前，通过与注射泵连接的光滑的球形尖端管饲针以1mL/min采用～10mL正常生理盐水轻柔地清洗小鼠阴道。采用荧光测定粘蛋白检验，测定此方法的粘液清除情况，如前所述(Crowther et al.,Anal.Biochem.163:170(1987))。重要的是，与引起明显上皮损伤的传统灌洗和/或棉签擦拭阴道冲洗相比，这种轻柔清洗不会损伤阴道上皮，正如评估膜完整性的基于荧光的死细胞染色(YOYO-1)显微镜检查(Cone et al.,2006)所证实的那样，。YOYO-1以前用于显示清洁剂-类杀微生物剂的毒性，这种毒性导致对HSV感染的敏感性增加(Cone et al.,BMC Infect.Dis.6:90(2006))。由北卡罗来纳大学教堂山分校动物组织病理学实验室开展组织切片&H&E染色。接种三天后，通过检测阴道灌洗液中的病毒，对感染进行检验。简单地说，将50μL培养基移进移出阴道20次，稀释到0.2mL，放在靶细胞上(
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HSV Test System；俄亥俄州雅典市Diagnostic Hybrids公司)；一天后，按照生产商协议，鉴定感染细胞(病灶)。根据观察到的病灶的近似密度，将病毒脱落分数分为0-4个等级(“0”：0；“0.5”：<100；“1”：100-500；“2”:500-1000；“3”:1000+；“4”；饱和)。每个条件至少开展三次独立实验，每个实验组n＝10只动物(总计n≧30)。
统计学分析：单个CVM样品中内源性抗-HSV-1IgG含量和平均粒子或病毒Deff之间的相关性采用皮尔逊相关系数(r)衡量。统计学比较限于两组(试验组与同一实验中开展的合适对照组比较)。费希尔精确检验用于确定感染小鼠减少％的统计学显著性。所有其它比较均使用双尾学生t-检验(配对比较同一CVM样品的Ab-处理CVM vs天然CVM)。差异在0.05阿尔法水平被视为具有显著性。除非另外声明，所有数值均以平均值±SEM报告。
实例2
HSV在宫颈阴道粘液中的截留
采用高度流行的性传播病毒HSV-1(d～180nm)探索了粘液截留假设。新鲜未稀释的CVM主要从Nugent评分证明阴道微生物群以正常乳杆菌为主的捐献者获得(表1)。将以高拷贝数包装，同时维持天然病毒包膜完整性的表达VP22-GFP被膜蛋白构建体的HSV-1病毒粒子混合到pH中和的CVM中，对CVM进行pH中和是为了模拟碱性精液中和。然后，采用高时空分辨率，开展实时病毒粒子运动延时显微镜检查，采用长时间多粒子跟踪，对病毒粒子的运动进行定量。对不同捐献者CVM样品中HSV-1运动性的实质性差异进行观察(图1A)，12个CVM样品中的7个CVM样品，大多数病毒粒子在20秒内扩散几微米距离，而在剩余5个CVM样品中，大多数病毒粒子基本上被截留，20秒内运动距离小于其直径(<200nm)。
表1。CVM样品的表征：月经周期阶段，Nugent分数和％乳酸。
捐献者ID 周期日<sup>1</sup> 周期阶段<sup>3</sup> Nugent分数<sup>4</sup> ％乳酸<sup>5</sup>
F10 17 黄体 1 2.4±0.039
F12 25 黄体 2 0.81±0.081
F14 26 黄体 2 0.95±0.10
F18 11 卵泡 4 0.56±0.022
F9 N/A<sup>2</sup> N/A 0 0.93±0.062
F13 9 卵泡 0 1.1±0.031
F15 25 黄体 0 1.1±0.042
F17 N/A N/A 1 1.2±0.088
F2 15 黄体 2 0.74±0.073
F21 N/A N/A 0 1.5±0.081
F5 10 卵泡 0 1.4±0.074
F8 19 黄体 0 1.9±0.15
中值 0.5 1.10
SEM 0.37 0.15
Figure BDA0002793129270000301
1周期日计算为从上次月经期第一天开始，按周期长度为28天周期进行归一化的天数。
2N/A＝激素类避孕药
3C周期阶段根据归一化周期天数估算；根据肉眼检查缺乏粘液成丝现象判断，没有样品是排卵的。
4Nugent分数0-3对应“正常”(乳杆菌-为主)微生物群,4-6对应“中等”,7-10对应“细菌性阴道病”(BV)-一种与性传播感染(STI)风险更高有关的状态。Nugent分数评估由北卡罗来纳大学临床微生物学及免疫学实验室独立证明。
5数值以平均值±SEM表达。
灰色高亮表示CVM样品包含足够水平的天然抗HSV-1IgG来固定病毒粒子。
由于IgG是人CVM中的主要免疫球蛋白(Usala et al.,J.Reprod.Med.34:292(1989))，因此，采用全病毒ELISA测定，考察所有12个CVM样品中病毒粒子的运动性是否与内源性病毒特异性IgG有关(表2)。与所述假设非常吻合，HSV-1快速扩散通过所有几乎没有或没有可检测出的内源性抗-HSV-1IgG(<0.2μg/mL；检测限0.017μg/mL)的CVM样品，扩散速率仅仅比其在水中的预期扩散速率低几-倍(图1和2A)。与此相反的是，在内源性抗-HSV-1IgG含量较高(≧0.6μg/mL)的样品中，大多数HSV-1病毒粒子被有效截留。第一个20秒观察中被截留的HSV-1在至少15分钟内仍然被截留在同一位置(图2B)。在同一CVM样品中，尺寸与HSV-1相当、经工程改造具有粘膜-惰性包被(PS-PEG；d～200nm)的对照乳胶纳米粒子表现为快速扩散(图1和2A)，与之前人CVM中大孔(平均～340nm)的观察结果非常吻合((Laiet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:1482(2007)；Lai et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:598(2010))。因此，对IgG-包被HSV-1来说，粘液网间隔足够大(即使饱和时比直径最多大15-20nm)，从而缺少与粘蛋白凝胶的粘附作用，扩散相对无阻碍。同一尺寸的粘膜-粘附乳胶纳米颗粒(PS；d～200nm)在同一CVM分泌物中明显减慢或被固定不动(图1和2A)。重要的是，对PS-PEG和PS对照颗粒的观察证实，所有样品，包括那些内源性抗-HSV-1IgG含量低的样品的一般阻隔性能保持不变。HSV-1运动性仅与内源性HSV-1特异性IgG有关，与总IgG、IgA或IgM含量无关(图3)，在恒定样品体积条件下，通过透析从这些样品中脱除～90-95％总IgG后，HSV-1变得容易移动(图4A)，而PS微球保持固定不动(图4A)。
表2.CVM样品表征：Ab含量，抗-HSV-1IgG
Figure BDA0002793129270000311
公认的粘膜防御机制是“免疫排斥”，其中肠道内的微生物通过分泌的多价IgA和IgM凝集成团，这些团因为太大而无法扩散穿过粘液(Hamburger et al.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.308:173(2006)；Lai et al.,J Virol.4:603(2011))。但是，这些实验中几乎没有凝集的HSV-1，这与之前的发现一致：即IgG是相对较差的凝集物(Berzofsky et al.,In Fundamental Immunology.W.E.Paul,editor The Raven Press,New York,N.Y.421(1993))。总之，这些观察表明，内源性抗-HSV-1IgG含量较高的样品中的HSV-1病毒粒子是由于与CVM的多个低亲和力键而非通过物理(空间)阻塞而被减慢或截留。
为了证明CVM中HSV-1的截留是由与病毒粒子结合的IgG特异性介导的而非是由粘液中可能与较高内源性抗-HSV-1IgG有关的任何其它组分介导的，从人静脉内免疫球蛋白亲和纯化HSV-1特异性IgG(从纯临床IgG制剂开始)，并将纯化IgG混合到内源性抗-HSV-1IgG含量较低的CVM样品中。据发现，加入1μg/mL抗-HSV-1IgG截留HSV-1的能力与内源性抗-HSV-1IgG相当(图5A-5C；与未加入抗-HSV-1IgG的天然样品相比，p<0.05)。测试了更低抗-HSV-1IgG剂量，当加入～333ng/mL抗-HSV-1IgG时，观察到有效的病毒粒子截留(p<0.05)，加入100和33ng/mL抗-HSV-1IgG时，观察到部分截留(两者都p<0.05)。作为对照，在采用最高抗-HSV-1IgG剂量处理的CVM样品中，粘膜-粘附PS明显减慢或固定不动，粘膜-惰性PS-PEG自由扩散(图4B)，证明IgG并未通过改变粘液粘弹性或网络间隔而导致HSV-1截留。亲和纯化抗-HSV-1IgG在1μg/mL和～333ng/mL时几乎未显示出中和活性(图5B)，根据肾细胞中斑点形成减少，表明IgG和CVM之间的多种低亲和力键可以在IgG含量低于中和所需含量的条件下截留病毒粒子。HSV-1还被CVM中的人源化单克隆抗-gD IgG截留(图6A)，但未被对照—非特异性IgG截留(图6A)，强调了通过特定的抗体-病毒配队截留的特异性，而不是一般粘液阻隔性能的非-特异性相互作用或改变。与以前的研究非常一致的是(Olmstedet al.,Biophys.J.81:1930(2001)；Saltzman et al.,Biophys.J.66:508(1994))，与生理盐水相比，多克隆抗-HSV-1IgG和单克隆抗-gD IgG在CVM中仅略微减慢(图6B)，表明这两种抗体仅与CVM作为单个分子形成暂时性的低亲和力键，然而，一旦它们通过形成低亲和力但多价IgG-粘蛋白键，积聚在病毒表面上，则即可促进有效的病毒粒子截留。
接下来想要确定IgG和CVM之间低亲和力键的生化基础，所有IgG的Fc域在Asn297都有一个保守的N-糖基化位点，许多IgG效应子功能具有Fe-和Asn297聚糖-依赖性(Ha etal.,Glycobiology 21:1087(2011))。因此，从同一亲和纯化抗-HSV-1IgG制备F(ab′)2片段(图7A)和去糖基化IgG(图7B)，最大限度地减少HSV-1结合亲和力的任何变化(通过ELISA证明)，并测定了在加入到CVM中之前与这些修饰类似物预混合的HSV-1的运动性(预混合是为了最大限度地减少内源性HSV-1特异性IgG的干扰)。经发现，与完整IgG相比，F(ab′)2和去糖基化IgG的截留能力都大幅降低(图7C；p<0.05)，表明IgG与粘蛋白形成的低亲和力键不仅具有Fe-依赖性，而且还受Fe糖基化的影响。
为了确定将病毒截留在粘液中是否能够防止体内感染，对非中和单克隆IgG1减少HSV-2在pH中性小鼠阴道内传播的能力进行了评估。这种单克隆IgG1与相对稀疏的gG表面糖蛋白结合，并在体外测试的所有浓度均未表现出任何中和活性(图8A)；小鼠IgG1也几乎没有补体(Ey et al.,Mol.Immunol.17:699(1980)；Michaelsen et al.,Scand.J.Immunol.59:34(2004)；Neuberger et al.,Eur.J.Immunol,11:1012(1981))andADCC(Akiyama et al.,Cancer Res.44:5127(1984)；Kipps et al.,J Exp.Med.161:1(1985))活性。小鼠接受含或不含抗-gG IgG1的2个ID50 HSV-2阴道攻击，HSV感染通过检测接种三天后阴道灌洗液中的病毒脱落情况测定，这是一种比肉眼观察病变、从骶神经节分离病毒或死亡更灵敏的感染测定方法(Zeitlin et al.,Contraception 56:329(1997))。与单独的培养基或对照的非特异性IgG相比，浓度3.3μg/mL及以上的抗-gG IgG1明显防止了病毒感染，降低了平均病毒载量(图8B和8C,p<0.05)。有趣的是，抗-gG IgG1似乎仅降低成功的阴道HSV传播率；在感染小鼠中，阴道感染程度与接受对照IgG的小鼠相当，表明与对照IgG相比，加入的抗-gG IgG并不能够引发降低病毒在感染小鼠中扩散程度的效应子功能(图8C)，还使小鼠接受轻柔阴道清洗，清除粘液，且对上皮不造成可以检测到的创伤，对所述小鼠的保护作用进行评估(图9A)。CVM清除将对照小鼠的HSV-2敏感性从～70％提高到～100％(图9B)，但感染小鼠中HSV脱落程度并未增加(图9C)。这种敏感性的中度(～30％)增加可能是由于失去了CVM本身的天然保护：CVM层防止病毒和上皮之间直接接触，并包含如防御素等因子，这些因子可以进一步有助于总体减少流到上皮的感染性HSV。更重要的是，CVM清除完全消除了天然小鼠抗-gG IgG1提供的无法归因于天然免疫力的～50％额外保护(从～～0％至～20％感染)(图9B)。与粘液截留可能促进保护的假设一致，这些结果共同表明，当CVM存在时，观察到的抗-gG IgG1提供的协同保护增强作用最可能发生在HSV到达靶细胞之前，而不是通过促进细胞水平保护的免疫机制(例如，补体或ADCC)提供。这些观察还与小鼠IgG1的补体和ADCC活性较差一致，以及与许多之前已经表明HSV可以逃避补体和其它典型免疫保护机制的研究一致(Brockman et al.,Vaccine 26Suppl 8:194(2008)；Hooket al.,J.Virol.80:4038(2008)；Lubinski et al.,J.Exp.Med.190:1637(1999)；Yuan etal.,Nature Immunol.7:835(2006))。由于即使针对相对稀疏的表面抗原，非中和单克隆IgG也可以提供强大的保护，因此，针对更丰富的表面抗原(如gD和gB)的单克隆抗体，或那些经优化以最大限度地提高与粘液相互作用的那些单克隆抗体，可能在体内粘膜表面提供甚至更有效的保护。
抗体-粘蛋白亲和性的第一个证据可以追溯到30年以前，当时Kremer和Jager指出，人类不育通常是由抗-精子抗体引起的(Jager et al.,Fertil.Steril.36:792(1981)；Kremer et al.,Fertil.Steril.27:335(1976))。在抗-精子Ab含量较高的宫颈粘液样品中，他们发现，尽管鞭毛剧烈运动，但单个精子和凝集精子都不再前移，并就地摆动数小时，直到死亡。最近，Phalipon等表明，分泌型IgA可以通过分泌成分，在小鼠鼻涕分泌物内聚集致病的弗累克斯讷氏杆菌，并将这些细菌锚定在粘液凝胶上，从而将它们排斥在传染门户之外(Phalipon et al.,Immunity17:107(2002))。
在以上两个报道中，作者假设抗体牢固地粘附在粘蛋白上。同样，有人提出，粘蛋白样Fey结合蛋白(FcγBP)通过其与IgG Fc强烈结合的能力在粘液中起免疫作用(Kobayashi et at,Gut 51:169(2002))。但是，更新的证据表明，FcγBP的主要功能是通过共价交联Muc2粘蛋白来稳定胃肠粘液凝胶(Johansson et at,Proc.Natl.Acad.Set.U.S.A.108Suppl 1:4659(2011)；Johansson et at,J.Proteome Res.8:3549(2009))。IgG Fc-FcγBP-粘蛋白交联机制还直接与之前众多的研究相抵触，这些研究未检测到单个Ab与粘蛋白的任何明显结合(Clamp,Biochem.Soc.Trans.5:1579(1977)；Cone,In Handbook ofMucosal Immunology.P.L.Ogra et al.,editors.Academic Press,San Diego,Calif.43-64(1999)；Crowther et al.,Fed.Proc.44:691(1985)；Olmsted et al.,Biophys.J.81:1930(2001)；Saltzman et al.,Biophys.J.66:508(1994))。实际上，以前的FRAP实验(Olmsted et al.,Biophys.J.81:1930(2001))和那些本文的实验证明，IgG和其它Ab在人类生殖粘液中快速扩散，与其在水中的扩散相比，仅略微减慢。这一点只能由IgG和粘蛋白网络之间微弱且短暂的粘附作用解释，而无法由IgG和FcγBP的强大结合解释(Kobayashiet al.,J.Immunol.143:2567(1989))。FcγBP还广泛与所有IgG结合，并且所述相互作用因此受到竞争性抑制(Kobayashi et at,J.Immunol.143:2567(1989))。在目前将外源性HSV-1特异性IgG加入到CVM的实验中，样品中已经存在的IgG的总含量比加入的HSV-1特异性IgG的含量高数百倍至数千倍。因此，要使FcγBP引起观察到的截留现象，则FcγBP的摩尔量必须大于天然IgG，这是不可能的，因为在人生殖道液体的蛋白质组学筛选中并未常规鉴定出这种蛋白质(参见Andersch-Bjorkman et al.,Mol.Cell.Proteomics 6:708(2007))vs.(Dasari et al.,J.Proteome Res.6:1258(2007)；Shaw et al.,J.Proteome Res.6:2859(2007)；Tang et at,J.Proteome Res.6:2874(2007))。与之前的研究相比，通过考察IgG对粘液凝胶中病毒粒子的影响，而不是直接调查单个IgG分子和粘蛋白之间的相互作用，本结果不仅证明了多个表面-结合IgG对单个病毒的有效截留，而且还证明了IgG-粘蛋白之间的相互作用具有Fc-和聚糖-依赖性。
生殖道粘液截留病毒粒子应明显减少病毒感染的异性传播。女性的许多主要性传播的病毒感染(例如，HIV、HPV和HSV)的发生率平均是每100次至1000次性感染1次。这表明每次性行为这些病毒粒子如果能够感染靶细胞的话也非常少，因此，减少到达靶细胞的病毒粒子通量，应会成比例地减少传播率。完全阻断初步感染，而不是试图清除初步感染，可能对于一旦形成很难(如果不是不可能的话)治愈的感染(例如HSV、HIV)尤其重要。在最近的gD2-AS04 HSV疫苗试验中(Belshe et al.,New Engl J.Med.366:34(2012))，最初在血清反应阴性女性中观察到保护效果，但在男性或血清反应阳性女性中未观察到保护效果，更大规模的血清反应阴性女性研究表明，其对HSV-1仅有中等效果(对HSV-1感染～35％效果，对HSV-1生殖器官疾病58％效果)，但让人感兴趣的是，对HSV-2没有任何保护效果。在这两项研究中，疫苗在所有女性和男性中都引发中和血清Ab对HSV以及HSV-特异性细胞的免疫反应。但是，由于未监测Ab的粘膜水平，仍然不清楚几乎未观察到保护效果是否与粘膜Ab反应有关。产生足够的粘膜Ab水平可能仍然是有效HSV疫苗的主要瓶颈。诱导与“非中和”表面表位结合的分泌型Ab应与那些与中和表位结合的Ab一样有效地截留病原体，这种前景可能拓宽疫苗开发的潜在抗原靶，尤其是针对那些快速发展的中和表位的病毒粒子。
实例3
鼠伤寒沙门氏菌在胃肠粘液中的截留
Fe-介导的粘液病原体截留，直接阻断侵入门户感染，这可能代表了一种非常有效的机制，通过这种机制，免疫系统能够快速适应并增强多种粘膜表面，以抵抗各种快速演变的病原体。开发了一种显微镜设置，能够实时测定从小鼠身上切除的粘液覆盖肠上皮组织中细菌的运动性(图10A)。我们发现，鼠伤寒沙门氏菌很容易透过包被小鼠胃肠道(十二指肠、空肠和回肠)的未稀释粘液分泌物，但通过局部施用抗-LPS和抗-鞭毛IgG而有效地被固定不动(图10B)。这种固定并未抑制鞭毛拍击器(Ab-包被沙门氏菌在缓冲液中保持高度运动性)，并且没有导致聚集(即与经典的聚集类免疫排斥机制无关)(图11A-11B)。此外，去糖基化抗-LPS抗体无法截留沙门氏菌，再一次强调了IgG-粘蛋白相互作用对Fc-N-聚糖的依赖性。这些研究强调了IgG-粘蛋白相互作用在不同粘膜表面作用的能力，不仅在病毒病原体而且在细菌病原体上都能有效作用。在CVM(主要是Muc5b粘蛋白)和胃肠粘液(Muc2粘蛋白)中都观察到截留现象，表明Fe-粘蛋白亲和性的分子基础可能在主要分泌性粘蛋白中很常见-构成粘液凝胶的长且致密的糖基化纤维-并可能由聚糖介导，因为糖是粘蛋白的主要成分(以干重计高达80％(Lai et al.,Adv.Drug Deliv.Rev.61:158(2009)))。
实例4
N-聚糖在IgG-粘蛋白相互作用中的作用
为了进一步评估N-聚糖对IgG-粘蛋白相互作用的作用，在实例1的CVM测试中对具有不同糖基化模式的多种抗-gD抗体(“HSV8”)进行了试验。采用基于病毒的瞬时表达系统(magnICON)，在本氏烟植物中产生具有不同糖基化模式的抗体。转基因本氏烟作为寄主植物，在这种植物中，其中植物-特异性N-聚糖(具有核α1,3岩藻糖和β1,2木糖)通过RNAi抑制植物-特异性糖基转移酶而减少，而特异性糖基转移酶则过表达(例如，β1,4半乳糖基转移酶，参见www.jbc.org/content/284/31/20479.full)。提取物进行澄清，IgG通过蛋白A层析法纯化。测试的抗体包括HSV8-GnGn，其中大约95％抗体包含具有GlcNAc、甘露糖和末端GlcNAc的核心结构；HSV8-Gal，其中大约63％抗体具有一个或两个末端半乳糖残基，大约5％具有GnGn核心结构；HSV8-Agly，没有任何糖基化；及293细胞培养中产生的HSV8，其具有人类发现的糖基化模式的普遍多样性。请注意，HSV8-Gal代表大多数血清IgG糖型。我们惊奇地发现，HSV8-Gal在截留病毒方面的效力远不如HSV8-GnGn，表明与天然发现的Gal-末端糖基化的抗体相比，经工程改造而具有数量更多/程度更高GnGn糖基化的抗体预期在截留病毒粒子方面更有效。这种观察不仅进一步证明了对糖基化的依赖性，而且还强调了糖基化模式的准确性质的重要性。
如上文所述，本发明还部分基于抗体和粘蛋白之间弱结合相互作用及所述抗体阻止病毒粒子穿过粘液层渗透的能力这一发现和表征，通常如图13所示。所述抗体-粘蛋白相互作用可以有利地在预防和治疗呼吸系统感染病毒粒子侵入受试者的方法中使用。
如上文所述，本公开主题包括抑制和/或治疗病毒感染，和/或从呼吸道粘膜表面清除病毒粒子的抗体、组合物和方法。特别是，本公开主题涉及能够将病毒粒子截留在粘液内，从而抑制病毒粒子穿过或通过粘液分泌物的抗体和组合物。
本发明的一个方面涉及一种抗体，例如，重组单克隆抗体分子，包括人Fc部分和一组对受试者肺中存在的病毒粒子具有特异性亲和力的CDR。
在一些实施例中，所述抗体与单个病毒粒子上的单个表位特异性结合。在一些实施例中，所述抗体是多聚体构建体，例如，其中2个或多个Fab(例如，2、3、4、5或更多个)与单Fc域连接。Fab可以相同或不同，可以识别病毒粒子上的相同表位、相同病毒粒子上的不同表位或不同病毒粒子上的表位。所述多聚体构建体预期促进病毒和/或病毒感染细胞更有效地凝集，导致更有效地将它们从粘膜表面清除。所述多聚体抗体构建体可以通过借助柔性连接肽，连接多个Fab域制备。IgG对照抗体及每个基于Fab的多聚体抗体的重链和轻链基因序列可以首先任选进行密码子-优化，然后合成并克隆到哺乳动物表达载体内(例如，由Integrated DNA Technologies公司提供的那些载体)。对于每种形式，Fab-组分可以通过柔性连接肽分开(例如，包括大约6个GSSSS(SEQ ID NO:13)重复单元，例如，2、3、4、5、6、7或8个重复单元的氨基酸)。
在一些实施例中，所述抗体可以是针对一种以上病毒粒子的双特异性或多特异性构建体。在一个实例中，所述构建体可以与RSV和偏肺病毒(MPV)结合。在一些实施例中，可以通过，例如，将分开的正交突变组引入到Fab A vs Fab B中，以确保合适的重链和轻链配对来产生双特异性抗体(例如，Fab-IgG1，其中在紧邻IgG天然Fab的N-末端引入额外的Fab)(Lewis et al.,Nature Biotechnol.2014)。Fab A和Fab B可以与人IgG1 Ab的CH1/CL和Fc区组合。
CDR可以是本领域熟悉的任何CDR组或以后鉴定的与病毒粒子特异性结合的CDR。
在一些实施例中，所述病毒是埃博拉病毒，CDR选自已知抗-埃博拉病毒抗体中发现的任何CDR组合。
在一些实施例中，所述病毒是RSV，CDR选自已知抗-RSV抗体中发现的任何CDR组合。在一些实施例中，CDR选自US 8,562,996中(通过引用，该专利全文纳入本申请中)公开的任何抗体序列(称为帕利珠单抗，或SYNAGIS)，或其衍生物(例如，莫维珠单抗，Wu H etal,2007,J.Mol.Biol.368,652-665)。在一些实施例中，CDR可以是以下任何重链和轻链序列中的一种或多种。
重链可变区：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHY
APKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:1)
轻链可变区：
DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV(SEQ ID NO:2)重链可变区：
QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS TSGMSVG WIRQPPGKALEWLA
A
A
A
DIWWDDKKDYNPSLKS RLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCAR
H D
H D
SMITNWYFDV WGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0002793129270000361
轻链可变区：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC KCQLSVGYMH WYQQKPGKAPKLLIY
SASS
SASS
SASSR
SASSR
DTSKLAS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC FQGSGYPFT
F F
FF D
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:8)
V(SEQ ID NO:9)
V(SEQ ID NO:10)
V(SEQ ID NO:11)
V(SEQ ID NO:12)
如上文所述，本文所述的任何抗体可以是经配置与粘液瞬时结合的粘膜-截留抗体。例如，在一些实施例中，所述抗体在糖基化位点包括一种寡糖，所述寡糖包括、基本上由或由与增强所述抗体在粘液中的截留能力有关(提供)的模式组成，其中所述抗体与靶病毒粒子的表位特异性结合。抗体的这种独特的糖基化模式/独特的寡糖组分设计用于当多个抗体与靶病毒粒子结合时，最大限度地提高抗体的截留能力，不会过度阻碍未结合抗体轻松扩散穿过粘液，与靶病毒粒子迅速结合的能力。在一些实施例中，与其在溶液(例如，生理盐水或水)中的运动性相比，所述抗体在粘液中的运动性降低不超过大约50％，例如，不超过大约40％、30％、20％、10％或5％，并且根据多个结合抗体，将靶病毒粒子有效截留在粘液内(例如，至少50％病毒粒子减慢至少90％)。在一些实施例中，所述抗体将至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％或更多病毒粒子的运动性降低至少90％，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％或更多。在其它实施例中，所述抗体将能够穿过粘液的病毒粒子的百分数减少至少10％，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。根据本文公开，熟悉本领域的技术人员很容易鉴定/设计提供所需截留能力的寡糖模式。在其它实施例中，所述抗体与靶病毒粒子表位结合的速率足够高，从而其积聚在所述靶病毒粒子表面上的抗体含量足够高，从而在粘液中抗体浓度低于5μg/mL(例如，低于1μg/mL或0.1μg/mL)的条件下在1小时内(例如，30分钟内或15分钟内)将靶向病毒粒子截留在粘液内。
在一些实施例中，所述寡糖组分与所述抗体Fc区的N-连接糖基化位点结合。N-连接糖基化位点可以是抗体Fc区上的天冬酰胺残基，例如，Asn 297天冬酰胺残基。所述氨基酸编号是相对人IgG分子标准氨基酸结构。
如上文更详细所述，人IgG-Fc上的N-聚糖结构通常以共享共同核心糖序列的双触角核心结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr为主，“触角”由有助于将其它糖与所述核心连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GlcNAcT)启动。在人类血清中发现的IgG中，最常见的结构是每个支链上同时包含N-乙酰氨基葡萄糖及一个末端半乳糖(39％)，两个末端半乳糖(20％)，或一个末端半乳糖和一个末端唾液酸(15％)的那些结构。总之，包括至少一个末端半乳糖的抗体占IgG-Fc糖型的大约74％。纯GnGn形式(每个支链含N-乙酰氨基葡萄糖，不含末端半乳糖或唾液酸)占IgG-Fc糖型的大约26％。
在一些实施例中，所述聚糖并不包含任何半乳糖残基。有人认为，半乳糖的存在损害截留能力，但并不受此理论限制。糖型不包含半乳糖的抗体仅占自然界发现的全部糖型的很少一部分。采用富集期望糖型(不管是天然或修饰聚糖)的大量抗体用于截留粘液中的病原体非常有利。
在一些实施例中，本发明的抗体是具有不同寡糖组分的抗体的混合物。在一些实施例中，所述抗体混合物包括至少大约20％(例如，大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％等)具有上述核心聚糖结构，含或不含岩藻糖残基的抗体，例如，至少大约40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在一些实施例中，所述抗体混合物是人类细胞系，例如，293细胞系，例如，293T细胞系产生的混合物。在一些实施例中，所述抗体混合物是植物细胞或植物中产生的混合物。
所述抗体用于结合靶病毒粒子，将病原体截留在呼吸道粘液中，从而抑制病毒粒子引发的感染。所述抗体的靶病毒粒子包括通过粘膜感染受试者的任何病毒。靶病毒粒子进一步包括包含带表位的抗原的合成系统，例如，包含连接蛋白的粒子或颗粒(例如，聚苯乙烯微球)，例如，可以用于生物恐怖主义。
病毒包括那些引发呼吸系统疾病的病毒，包括但不限于流感(包括甲型流感、乙型流感和丙型流感)；严重急性呼吸综合征(SARS)；呼吸道合胞体病毒(RSV)；偏肺病毒；副流感；腺病毒；人鼻病毒；冠状病毒；和诺如病毒。病毒还包括那些并不一定引发呼吸系统疾病但可以通过侵入呼吸道而感染受试者的病毒，例如，埃博拉病毒。
病毒包括那些影响非人类动物的病毒，例如牲畜，如猪(例如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感、猪圆环病毒)，反刍动物(例如，RSV、腺病毒、呼肠孤病毒)，有蹄类动物(例如，博卡细小病毒),马(例如，马疱疹病毒-1型、马疱疹病毒-4型、马流感病毒)，家禽(例如，禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒(IBV))等。
词语病毒和病毒病原体在本文互换使用，进一步指的是各种病毒菌株，例如，流感包括新的流感菌株，这是熟悉本领域的技术人员将容易辨别的。
在一些实施例中，设想本发明公开主题的抗体能够与包含类脂包膜的病毒广泛结合，并不一定对一种病毒具有特异性。
我们吃惊地发现，低于中和剂量的抗体可用于将靶病毒粒子有效截留在粘液内。因此，在一些实施例中，其中所述抗体与靶病毒粒子的中和表位特异性结合，可以采用低于中和剂量。低于中和剂量是低于实现中和所需剂量的剂量。
正如本领域技术人员将认识到的那样，不同病毒粒子、粘膜表面及个体之间的合适剂量可能不同。还将认识到的是，不同受试者和不同粘膜表面具有不同的最佳聚糖模式及最佳抗体-粘蛋白亲和力，从而导致了不同的最佳剂量。
本文进一步提出的是，可以采用与靶病毒粒子非中和表位选择性结合的抗体将靶病毒粒子有效截留在粘液内。因此，在一些实施例中，所述抗体与非中和表位，例如，一个或多个非中和表位特异性结合。
本公开主题进一步包括与靶病毒粒子保守表位选择性结合的抗体。靶向保守表位的益处是保留所述抗体对所述病毒新菌株的效力。过去曾经避免靶向所述表位，因为它们被视为无效靶；但是，本文公开认为，非中和表位可以作为有效靶和/或低于中和剂量可以有效抑制感染，以前排除的靶病毒粒子的保守表位可视为有效靶。
正如上文所述，据确定，抗体与粘蛋白形成的低亲和力结合作用受抗体糖基化的影响，并且还具有Fc-依赖性。因此，本公开主题包括具有保留和/或工程改造Fc区的抗体。所述抗体可以是，例如，IgG、IgA、IgM、IgD或IgE中的一种或多种抗体。在一些实施例中，所述抗体是IgG。在一些实施例中，所述抗体是IgG的一个或多个亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或它们的任何组合。
在一些实施例中，所述抗体与靶病毒粒子表位的结合率和/或结合亲和力足够高，从而其积聚在病毒粒子表面上的抗体含量足够高，从而在施用浓度低于大约5μg/mL的抗体后的1小时内截留所述病毒粒子，但是可以使用过量抗体(例如，大约5μg/mL或更高，10μg/mL或更高，15μg/mL或更高，20μg/mL或更高，25μg/mL或更高，30μg/mL或更高，40μg/mL或更高，50μg/mL或更高，60μg/mL或更高，70μg/mL或更高，80μg/mL或更高，90μg/mL或更高，100μg/mL或更高等)。此种情况下的词语“截留”指的是减少穿过粘液的进一步运动。在一些实施例中，靶病毒粒子在大约30分钟内，例如，施用所述抗体大约25、20、15或10分钟之后被截留。在一些实施例中，所述抗体在抗体浓度低于大约4、3、2或1μg/mL时截留靶病毒粒子。
还设想了与本公开主题结合使用的其它施用制剂，包括鼻内施用。本领域熟悉的、适合输送抗体或含抗体组合物到受试者一种或多种粘膜的所有制剂、装置和方法可以与本公开主题一起结合使用。所述抗体可以配制为经鼻施用或采用任何合适的手段向受试者肺部施用，例如，由受试者吸入包含所述抗体的可吸入颗粒的气溶悬浮液。可吸入颗粒可以是液体或固体。词语“气溶胶”包括任何气体悬浮相，其能够被吸入到细支气管或鼻腔通道内。特别是，气溶胶包括气体悬浮液滴，这些液滴可以采用剂量计量吸入器或雾化器或喷雾器产生。气溶胶还包括悬浮在空气或其它载气中的干粉组合物，可以通过，例如，从吸入器装置吹入而输送。参见Ganderton&Jones,Drug Delivery to the Respiratory Tract,EllisHorwood(1987)；Gonda(1990)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems6:273-313；and Raeburn et al.,J.Pharmacol.Toxicol.Meth.27:143(1992)。包括所述抗体的液体颗粒气溶胶可以采用任何合适的手段制备，例如，采用压力驱动气溶胶雾化器、振动筛雾化器或超声雾化器，正如本领域技术人员熟悉的那样。参见，例如美国专利No.4,501,729。同样，包括所述抗体的固体颗粒气溶胶可以采用任何固体颗粒药物气溶胶产生器，采用药物领域熟悉的方法制备。在一些实施例中，选择所述雾化器和雾化条件，产生期望尺寸的气溶胶颗粒。在一个实施例中，雾化组合物的质量中位数气动粒径(MMAD)为2-5μm范围，粒径采用新一代撞击器测定。
在本公开主题的一些实施例中，一种组合物包括第一抗体和第二抗体，正如本文所述，其中第一抗体与靶病毒粒子的第一表位特异性结合，第二抗体与靶病毒粒子的第二表位特异性结合，其中所述第一表位与所述第二表位不同。在一些实施例中，所述组合物包括三个或更多个不同抗体，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，其中每个抗体与靶病毒粒子的不同表位特异性结合。
还希望提供一种能够治疗或预防不止一种靶病毒所引发感染的组合物。在本公开主题的一些实施例中，一种组合物包括第一抗体和第二抗体，正如本文所述，其中第一抗体与第一靶病毒粒子的表位特异性结合，第二抗体与第二靶病毒粒子的表位特异性结合。在一些实施例中，所述组合物包括三个或更多个不同抗体，例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同抗体，其中每个抗体与不同靶病毒粒子的表位特异性结合。
在一些实施例中，所述药物组合物可以进一步包括其它活性剂，例如，预防剂或治疗剂。例如，其它活性剂可以是抗微生物剂，正如本领域技术人员熟悉的那样。抗微生物剂可以是对藻类、细菌、真菌、寄生虫(蠕虫、原生动物)、病毒和亚病毒剂有活性的制剂。因此，所述抗微生物剂可以是抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫或抗原生动物制剂。所述抗微生物剂优选对传染性疾病有活性。合适的抗微生物剂实例(例如，一种或多种抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫或抗原生动物剂)包括上文所述的那些。
因此，本公开主题进一步包括治疗、抑制或预防受试者病毒感染的方法，所述病毒感染的特征在于受试者肺内的病毒粒子，所述方法包括经吸入路径施用重组单克隆抗体分子，所述重组单克隆抗体分子包括人Fc部分和一组对所述病毒具有特异性亲和力的CDR，从而治疗、抑制或预防感染。所述重组单克隆抗体分子可以是本文公开的抗体和/或组合物。在一些实施例中，所述方法包括其它步骤，例如，分离抗体，配制分离抗体的组合物，测定施用抗体前受试者粘液内抗体的含量，及测定施用抗体后受试者粘液内抗体的含量中的一个或多个步骤。
所述病毒粒子可以是本文讨论的任何病毒。在一些实施例中，所述病毒粒子是埃博拉病毒。在一些实施例中，所述病毒粒子是RSV。在一些实施例中，所述抗体包括本文公开的任何CDR序列。
根据本文所述的方法，本发明的抗体和组合物通过将所述组合物通常输送到肺，例如，通过吸入而服用或施用。受试者可以是肺内(实际感染部位)已经存在感染的个人或肺内可能发生感染的个人(未感染个人的可能感染部位)。在一些实施例中，所述抗体和组合物可以采用本领域熟悉的任何有效的方法输送到呼吸道，例如，鼻腔和肺。在一些实施例中，所述抗体和组合物可以直接输送到呼吸道。在其它实施例中，所述抗体和组合物可以全身给药，从而所述抗体分泌到受试者粘液内。因此，上述组合物可以输送到呼吸道的粘膜表面。
在一些实施例中，所述抗体经配制用于输送到呼吸道。在一些实施例中，所述分子配制为气溶胶组合物。在一些实施例中，所述气溶胶组合物适合雾化。可以采用任何合适类型的雾化器。在一个实施例中，气溶胶组合物可以通过振动筛雾化器雾化。在一些实施例中，选择所述雾化器和雾化条件，产生期望尺寸的气溶胶颗粒。在一个实施例中，雾化组合物的质量中位数气动粒径(MMAD)为2-5μm范围，粒径采用新一代撞击器测定。
可以施用有效剂量的抗体。本文使用的抗体抑制或预防感染的“有效剂量”指的是足够抑制或预防靶病毒粒子引发感染的剂量。本文使用的抗体治疗感染的“有效剂量”指的是足够抑制靶病毒粒子从受试者感染细胞扩散到未感染细胞和/或抑制靶病毒粒子从感染受试者扩散到另一个受试者，例如，非感染受试者的剂量。有效剂量可以是足够将靶病毒粒子截留在粘液内的剂量。正如本领域技术人员将认识到的那样，所述剂量依患者和靶病毒粒子而异。所需的精确用量将因受试者不同而变化，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、采用的具体载体或佐剂、施用模式等。因此，有效剂量将依具体情况而异，特定情况下合适的有效剂量可以由熟悉本领域的技术人员仅仅通过常规实验确定。在一些情况下，所述与靶病毒粒子特异性结合的抗体的有效剂量可以是实现抗体在粘液中的浓度为大约50ng/mL至大约1000μg/mL的剂量，例如，大约0.1μg/mL至大约100μg/mL，大约0.5μg/mL至大约100μg/mL，大约1μg/mL至大约50μg/mL，大约5μg/mL至大约500μg/mL，大约5μg/mL至大约300μg/mL，大约20μg/mL至大约200μg/mL，或它们之中任何范围的剂量(例如，0.5μg/mL至大约20μg/mL)。
在一些实施例中，所述抗体可以分两步或更多步施用，每步采用不同的剂量。例如，一开始可以施用更高剂量，清除暴露或感染受试者粘液内存在的靶病毒粒子，确保粘液中保留足够数量的抗体提供保护，例如，提供大约24小时保护。在后面阶段，可以施用更低剂量，维持抗体保护水平。在其它实施例中，可以向可能接触病毒的受试者施用保护剂量，如果发生感染，可以施用更高剂量。
在一些实施例中，所述抗体或组合物以固定间隔施用，直到达到效果。所述间隔可以是，例如，一天多次(例如，每隔1、2、3、4、5、6、8、12、18或24小时，例如，每隔3-24小时))，每隔24、48或72小时施用1次，或1周1次。
正如熟悉本领域技术人员认识的那样，词语“抑制”或“预防”并非指完全消除所有情况下感染可能性的能力。相反，熟悉本领域的技术人员将了解的是，词语“抑制”或“预防”指的是减少病毒粒子穿过粘液越过粘膜，从而使受试者发生感染的机会，例如，当所述病毒粒子被粘液中的截留抗体结合时，减少病毒粒子感染机会。所述感染可能性降低可以相对未施用本发明抗体的对照进行测定。在一些实施例中，相对对照，抑制可能性降低大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
在一些实施例中，抑制或治疗受试者的感染可以包括将病毒粒子截留在粘液内。因此，在一些实施例中，提供了一种将靶病毒粒子截留在粘液中的方法，所述方法包括向受试者粘膜施用本文所述的抗体或组合物。
在一些实施例中，抑制或治疗受试者感染的方法，和/或将病毒粒子截留在受试者粘液内的方法，涉及向受试者的呼吸道粘膜施用包含分离抗体的组合物，所述分离抗体与靶病毒粒子的非中和表位特异性结合。所述抗体可以是非中和抗体。在一些实施例中，所述非中和抗体的浓度高于预先确定量。
在一些实施例中，抑制或治疗受试者感染的方法，和/或将病毒粒子截留在受试者粘液内的方法，涉及向受试者呼吸道粘膜施用包含分离抗体的组合物，所述分离抗体与靶病毒粒子的中和表位特异性结合，其中所述抗体施用剂量低于中和剂量。
上面已经对本发明进行了描述，将在下述实例中对这些方面进行更详细的说明，这些实例在此仅用于阐述目的，而非用于限制本发明。
实例5
阻止埃博拉病毒在人气道粘液中的渗透
埃博拉病毒是线状病毒家族的成员，导致严重的和通常致命的出血热，容易感染许多细胞类型，包括免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。由于埃博拉具有广泛的组织嗜性，因此，对全身埃博拉感染的有效治疗通常需要全身施用高剂量的治疗分子。例如，ZMappTM是三种嵌合单克隆抗体的混合物，在2014-2016埃博拉疫情爆发期间，在几内亚、塞拉利昂和利比里亚的一项随机对照临床试验中以50mg/kg剂量方案对ZMappTM进行了评估。
一种可能的替代策略不是全身性治疗埃博拉病毒感染，而是在病毒粒子增殖和全身扩散之前阻断或治疗侵入门户处的感染。除了直接接触埃博拉阳性个体的血液、体液或皮肤发生传播之外，埃博拉病毒可能通过严重感染个体咳嗽、打喷嚏、呕吐或直接推进到粘膜上面的医疗程序产生的带病毒液滴传播给附近的人。词语基于飞沫的气溶胶传播可用于将这种潜在机制与严格的气溶胶病毒传播区分开来，后者通常被认为不可能是埃博拉的传播机制。虽然尚未证明埃博拉病毒在人体内的气溶胶传播，但是，已经在包括非人类灵长动物在内的几项动物研究中证明了这一点。鉴于埃博拉病毒可能通过气溶胶传播给人类，以及雾化线状病毒型生物战剂的可能威胁，我们试图调查沉积在粘膜表面上的埃博拉病毒的命运。
粘膜的特征在于可以截留不同外来颗粒和病原体的粘液分泌物层，通过天然粘液清除机制促进对它们的清除，最终减少到达靶细胞的病原体通量。人类气道粘液(AM)可能是部分导致许多呼吸系统病毒传播速度相对较慢的原因，而且还可能增强AM，以进一步限制到达下层上皮的病原体通量。如上所述，宫颈阴道粘液中的IgG抗体(Ab)能够通过积聚在病毒表面上的IgG与粘蛋白之间的多个低-亲和力Fc-粘蛋白键将病毒截留在粘液中，类似于
Figure BDA0002793129270000421
魔术贴。此外，人类AM中H1N1和H3N2流感病毒固定不动可能与存在和流感病毒结合的IgG和IgA有关。我们在此调查了局部施用抗埃博拉IgG是否可能类似地将埃博拉截留在气道粘液中，促进其从气道中清除。
埃博拉病毒样颗粒(VLP)采用编码Gag-mCherry和埃博拉GP的质粒转染293T细胞制备。将293T细胞维持在含10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司)(DMEM-10)中。所有细胞培养基都维持在37℃、加湿5％CO2氛围中。将293T细胞(2.0×106)接种在25cm2瓶(纽约罗切斯特市Thermo Scientific公司)内，并采用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(印第安纳州印第安纳波利斯市Roche Diagnostics公司)用表达质粒转染。将Gag-mCherry和埃博拉GP质粒以1:1比例混合(每种1.5μg)，并与9μL X-tremeGENE HP DNA转染试剂一起加入到500μL无血清DMEM中。将所述混合物在室温培养30分钟，然后加入到293T细胞培养物中。在37℃、5％CO2条件下培养3至5小时后，采用DMEM充分洗涤转染细胞，并在37℃、5％CO2条件下采用2mLDMEM-10培养24-48小时。然后，收集病毒颗粒-产生培养物的上清液，并在300×g条件下离心10分钟进行澄清，通过低蛋白结合0.45μm针式过滤器(马萨诸塞州贝德福德市Millipore公司)过滤，在221,630×g、4℃条件下离心2.5小时，通过25％w/v蔗糖Hepes-NaCl缓冲液部分纯化。将颗粒在4℃、10％蔗糖Hepes-NaCl缓冲液中重悬一个晚上，分成几份，在-80℃储存。
为了测定埃博拉GP蛋白掺入到VLP的情况，将蔗糖梯度-纯化VLP在含100mM Tris-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2％Triton X-100和蛋白酶抑制剂的缓冲液中在4℃裂解30分钟。采用重组埃博拉糖蛋白rGPdTM(#0501-001；马里兰州罗克维尔市IBT Bioservices公司)作为阳性对照。将样品在含2-巯基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，并在4％-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶(纽约格兰德岛Invitrogen公司)上分离，转移到硝化纤维素膜上，并采用浓度1:2,000的小鼠埃博拉GPII单克隆抗体(加利福尼亚州圣地亚哥市MyBiosource)探测，如图14A所示。ZMappTM和埃博拉VLP结合的特异性通过免疫沉淀法得到了证实。埃博拉VLP采用ZMappTM、单个埃博拉病毒-结合IgG，或α-生物素在4℃培养3小时。采用蛋白G微球拉下抗原-抗体复合物，并按照上文所述检测埃博拉GP，如图14B所示。采用NanoSight NS500(英国马尔文市马尔文仪器公司)，测定埃博拉VLP的流体动力学直径。将样品在20nm过滤PBS中稀释到浓度～108颗粒/mL，每个样品拍摄5个60秒视频。
通过富集埃博拉-结合mAb群体，从而包括大多数(例如，50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多等，如85％-95％等)Fc区上具有G0糖基化模式(例如，糖基化模式包括双触角核心聚糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβl-4G1cNAcβ1，每条支链上有末端N-乙酰氨基葡萄糖)的群体，对ZMappTM和本文采用的任何单个埃博拉-结合mAb进行修饰，从而增强粘液结合。天然抗-埃博拉mAb(例如，人类抗-埃博拉mAb)具有低得多的G0含量。
制备了尺寸大约100nm的荧光、羧基-修饰聚苯乙烯微球(PS-COOH)和聚乙二醇化纳米颗粒(PS-PEG)，并进行了表征。尺寸100nm的荧光、羧基-修饰聚苯乙烯微球(PS-COOH)购自Molecular Probes公司(俄勒冈州尤金市)。聚乙二醇化纳米颗粒(PS-PEG)通过羧基-胺反应，将2kDa胺-修饰PEG(德国图宾根市Rapp Polymere)与PS-COOH颗粒结合而制备。粒径和ζ-电势采用Zetasizer Nano ZS(马萨诸塞州绍斯伯勒马尔文仪器公司)，分别采用动态光散射和激光多普勒风速测量法测定。尺寸测定在25℃、90°散射角条件下进行。样品在10mM NaCl溶液中稀释，并按照仪器说明书开展测定。PEG结合通过近中性ζ-电势得到证明(表3)。
表3.PEG-修饰纳米颗粒的表征。提供了羧基-修饰微球的尺寸和ζ-电势进行比较。
Figure BDA0002793129270000431
*由生产商提供。
新鲜人类气道粘液(AM)从择期手术中接受全麻插管的健康成年患者(表4)获得，并遵照北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会认为是非人类学科研究的方案。手术后，从患者体内取出气管导管，通过轻柔离心分离收集覆盖在导管上的粘液。舍弃颜色不均匀或稠度不均匀或具有可见血污染的气道粘液。样品采集后立即采用蛋白酶抑制剂处理，从而最大限度地减少可能的酶促降解，并在4℃储存直至显微镜检查，通常在24小时内。
表4.气道粘液标本捐献者的人口统计信息
Figure BDA0002793129270000432
采用常规ELISA对AM中的总免疫球蛋白含量进行定量，并采用Luminex人同种型试剂盒(HGAMMAG-301K；马萨诸塞州比勒利卡Millipore公司)遵照生产商协议进行确认。简单地说，将20×储备同种型微球涡旋、超声处理、并稀释到IX，采用50μL按1:2体积比微球:AM连续稀释的AM上清液培养。1小时后，采用磁板将微球与AM上清液分离，并用洗涤缓冲液洗涤2次。然后，微球采用25μL 1×抗-人κ和λ-PE培养1小时，清洗2次，并重悬在Luminex驱动液中。采用Luminex MAGPIX系统，测定指示AM中存在免疫球蛋白含量的荧光强度，并采用Milliplex Analyst(v3.5.5.0；马萨诸塞州卡莱尔市Vigene Tech Inc.公司)开展数据分析。所有培养均在室温、暗处、剧烈搅拌条件下进行。总Ig和IgG同种型含量在(表5)中示出。
表5.气道粘液中免疫球蛋白含量的表征。
Figure BDA0002793129270000433
Figure BDA0002793129270000441
将稀释颗粒溶液(～108-109颗粒/mL,1μL)和不同Ab(2μL，至终浓度22μg/mL)加入到定制室内20μL新鲜未稀释的AM中，将样品在37℃培养1小时，然后开展显微镜检查进行多颗粒跟踪分析。所有条件均采用同一AM样品的等份试样进行试验，允许在各条件间进行直接比较。采用安装在倒置落射荧光显微镜(AxioObserver D1；纽约索恩伍德Zeiss公司)上面的EMCCD相机(Evolve 512；亚利桑那州土桑市Photometrics公司)记录AM中荧光颗粒的轨迹，该相机配备Alpha Plan-Apo 100×/1.46NA物镜、环境(温度和CO2)控制室及LED光源(Lumencor Light Engine DAPI/GFP/543/623/690)。采用MetaMorph成像软件(加利福尼亚州森尼韦尔市Molecular Devices公司)以66.7ms的时间分辨率和10nm的空间分辨率(标称像素分辨率0.156μm/像素)捕捉视频(512×512,16-位图像深度)20秒。跟踪分辨率通过跟踪强胶粘剂固定的粒子位移确定。粒子轨迹采用Video SpotTracker(北卡罗来纳州北卡罗来纳大学教堂山分校)分析。通过相邻像素的光强加权平均，确定粒子质心的准确位置，得到子像素的跟踪分辨率。每个实验每帧平均分析n≥130个粒子的轨迹(通常对应n≥300总轨迹)，并针对从独特受试者采集的AM，每个条件开展8-9个独立实验。粒子质心坐标转换为时间-平均均方位移(MSD)，计算为<Δr2(τ)>＝[x(t+τ)–x(t)]2+[y(t+τ)–y(t)]2(其中τ＝时间标度或时间滞后)，从此式计算MSD分布和Deff。移动粒子定义为0.2667s内可以移动大约200nm以上的粒子(即大约是粒径的2倍)。
MSD还可以表达为MSD＝4D0τα，其中α是log-log标度曲线的斜率，是粒子扩散阻碍程度的量度(无阻碍纯布朗运动α＝1；α<1表明，随着α下降，粒子阻碍增加)。15D颗粒跟踪的局限性是由于扩散到焦面之外，特别是200nm以下粒子，因此，无法跟踪快速扩散的粒子。因此，更长时间标度的MSD计算将低估这些粒子的真实运动性。因此，仅计算log-log MSD曲线线性部分的α(在这里，不超过τ＝0.6s)。计算α至扩展τ＝1s，得到不含Ab的AM中埃博拉VLP的α为0.71vs.0.80，但对采用ZMappTM或单个mAb处理的AM中埃博拉VLP的α值的影响可以忽略不计。
为了预测粒子群体行为，我们开展了首次通过时间分析，计算10％和50％粒子群体通过50μm厚粘液层的预期时间。假设粒子的扩散性D，到给定时间t为止粒子未通过厚度为L的粘液层的概率可以采用显式“残存函数”描述。采用T表示粒子穿过所述层花费的时间，这种“残存函数”的公式是
Figure BDA0002793129270000451
假设粒子中的不均匀群体具有独立的扩散性，{Di}具有各自的重量，{Di}withrespective weights{wi}其中{Di}with respective weights{wi}wherei从1至粒子数量N。则到时间t为止仍留在液层中的预期粒子分数等于下述加权残存函数：
Figure BDA0002793129270000452
我们设定wi为其中存在第i个粒子的帧数。对于每个加权，我们计算P(T＞t10)＝0.9和P(T＞t50)＝0.5的时间t10和t50。
采用等体积
Figure BDA0002793129270000453
水稀释
Figure BDA0002793129270000454
1X PBS到～150mOsm/kg制备轻度低渗缓冲液，采用该低渗缓冲液将埃博拉VLP输送到小鼠肺部(人们发现，低渗溶液促进至上皮的平流流动，允许我们更严格地评估ZMappTM Ab是否能够阻止埃博拉穿过AM层)。将ZMappTM混合物(c2G4、c116C6FR1和c4G7按1:1:1混合，每只小鼠共25μL)或低渗PBS首先负载到PennCentury Microsprayer(FMJ-250；宾夕法尼亚州温德穆尔市Penn Century公司),经雾化并输送到在异氟烷室中麻醉的Balb/c小鼠的气道(雌性，8-10周大)。15分钟后，将在低渗PBS中配制的埃博拉VLP采用微型喷雾器滴注到采用ZMappTM-处理的小鼠和对照小鼠，每只小鼠25μL。第三组小鼠采用两次低渗PBS滴注处理，从而测定小鼠肺组织的自身荧光。实验组和对照组每组有n＝3只小鼠。所有实验协议均经过北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物保护和使用委员会批准，并符合赫尔辛基宣言动物使用和保护公约。
为了调查埃博拉VLP的分布，在最终微型喷雾器滴注30分钟后，对小鼠执行安乐死，并解剖整个肺，包括气管。解剖的肺保持完整，采用1X PBS清洗，并包埋在100％最佳切割温度(OCT)化合物中，然后在-80℃冷冻。冷冻1个晚上之后，通过在-20℃冰冻切片，得到上气道10μm厚的横截面，并采用DAPI染色。采用Olympus FV1000 MPE激光扫描共焦显微镜(宾夕法尼亚州Center Valley市Olympus Life Science Solutions公司)以20倍放大倍率和下述激发/发射光谱对冷冻切片成像：TRITC(559/603nm)and DAPI(405/422nm)。荧光强度采用ImageJ(马里兰州毕士大市National Institutes of Health公司)定量，每只小鼠平均10个截面，并减去背景荧光。
数据平均值以平均值及平均标准误(SEM)表示。统计比较限定为两组。由于不同条件采用同一粘液样品的不同等份样品试验，因此，所有比较采用单尾配对学生t-检验。差异在0.05阿尔法水平被视为具有显著性。
我们发现，埃博拉病毒样粒子快速穿过人类气道粘液。野生型埃博拉病毒需要生物安全4级防护，几乎没有实验室可以达到。因此，为了调查埃博拉病毒在粘液中的命运，我们制备了荧光、非感染性埃博拉VLP，其核心包括HIV-1Gag-mCherry衣壳蛋白和表面上包括Zaire糖蛋白(GP),两者都来自2014-2016西非流行病的同一物种。这种相同策略以前用于制备HIV和流感VLP。通过蛋白质印迹法，证明了GP掺入到埃博拉VLP内(图14A)，且动态光散射表明，VLP具有的流体动力学直径是102±3nm。ZMappTM混合物中全部三种IgG均与VLP特异性结合，证明存在结构上完整的GP(图14B)。
为了避免采用高渗生理盐水稀释引发咳痰的影响，我们直接从刚刚取出的气管导管获得未稀释的人类气道粘液。埃博拉VLP在试验的所有AM分泌物中都很容易扩散，如图15A所示，显示出与类似尺寸聚乙二醇-包被聚苯乙烯(PS-PEG)纳米颗粒相当的扩散运动，所述纳米颗粒经工程改造以躲避粘蛋白粘附，并穿过各种粘液分泌物。在同一AM分泌物中，粘膜－粘附的类似尺寸的羧基-修饰聚苯乙烯(PS－COOH)纳米颗粒广泛固定不动，证明埃博拉VLP中观察到的快速扩散性并非由于降解的粘蛋白基质所致。在时间标度0.2667s时，几乎所有埃博拉VLP(所有样品中>75％，平均～90％)具有的扩散性都超过大约200nm，或粒径的两倍，如图15B所示。与其在缓冲液中的理论速度相比，埃博拉病毒的总体平均几何均方位移(<MSD>)仅减少～10-倍(图15C；在时间标度0.2667s时)，log<MSD>vs.log时间标度曲线的斜率α是0.80(无阻碍纯布朗扩散α＝1，例如，水中的颗粒，当布朗扩散阻碍增加，α变得更小，接近零)。埃博拉VLP的几何平均有效扩散性(<Deff>)是0.43μm2/s，比PS－COOH纳米粒子高大约150倍(图15D)。
沿主传导气道，支气管气道粘液内层的近似厚度是～50μm，整个粘液层可以在短达15-30分钟的时间内更新。因此，我们采用测定的AM中单个VLP的扩散性，开展了首次通过时间估计，从而确定了病毒扩散通过50μm厚AM层所需的时间。我们发现，在气道上沉积后，近10％埃博拉病毒粒子可以在大约5分钟内穿过管腔AM层，近50％可以在短达30分钟内穿过AM层(图17B)。这些结果表明，限制埃博拉快速穿过AM是通过减少到达下气道上皮的病毒粒子通量，从而减少埃博拉病毒感染的一种重要策略。
采用ZMappTM处理人类气道粘液，可以将埃博拉病毒样粒子固定不动。虽然AM样品中总Ig和IgG同种型含量差异较大(表5)，但是，埃博拉VLP在AM中的快速扩散显著一致，表明内源性抗体并不影响埃博拉VLP的运动性。接下来，我们评估了三种嵌合单克隆抗体(mAb)混合物ZMappTM形式的埃博拉-结合IgG是否可以增强AM对埃博拉病毒扩散的阻隔性能。向AM中加入适量埃博拉-结合IgG，有效减少了埃博拉VLP的运动性，大多数VLP在至少20秒以内的移动距离远小于其直径(图16A)。实际上，ZMappTM-处理AM中埃博拉VLP的<Deff>与不含Ab的同一天然AM分泌物中的<Deff>相比降低～27-倍(图17A)。同样，可移动VLP的分数从90％减少至29％(图16B)，而<MSD>比缓冲液中的理论VLP速度低260-倍以上(图16C；时间标度0.2667s时)。从log<MSD>vs.log时间标度斜率α为0.34也可以明显表明对快速扩散的阻碍增加。天然(即无Ab)AM和ZMappTM-处理AM中VLP的荧光似乎在尺寸和亮度方面都相同，表明ZMappTM并未引起凝集(即多个埃博拉VLP聚集)。因此，测定的埃博拉VLP运动性下降最可能是由于单个VLP的固定，而这种固定是因VLP－结合Ab阵列和粘蛋白之间的多价相互作用引起的。
为了测定ZMappTM混合物中的任何特定mAb(c2G4,c116C6FR1,c4G7)是否都可以赋予优越的“粘膜-截留”能力，我们测定了采用单个Ab处理的同一AM样品不同等份试样中埃博拉VLP的运动性。让人感兴趣的是，所有三种mAb，包括一种对埃博拉病毒具有较差中和活性的mAb，在减少AM中埃博拉VLP的运动性方面都具有类似效果，如图16A所示。相对不含任何Ab的对照及与ZMappTM类似，在采用c2G4、c116C6FR1和c4G7分别处理的AM中，埃博拉VLP的<Deff>分别减少～28-、22-和25-倍。同样，可移动埃博拉VLP的分数分别减少到27％、33％和30％。
为了更好地阐明前述VLP运动性的变化如何改变到达靶细胞的病毒粒子的通量，我们按照上文所述开展了首次通过时间分析。10％埃博拉VLP扩散通过50μm厚粘液层的预期时间从天然AM的～0.1小时(即大约5分钟)分别增加到到ZMappTM-、c2G4-、c116C6FR1-和c4G7-处理AM的2.2、2.1、1.6和1.7小时。同样，50％VLP穿过所述粘液层的估计时间从天然AM的0.5小时分别增加到23、22、20和22小时。由于粘膜纤毛清除在15-30分钟发生，这些结果表明，除缺乏埃博拉-结合IgG的天然AM之外，绝大多数埃博拉病毒粒子将在它们穿过AM之前被快速截留，并从ZMappTM-处理的气道清除出去。
局部施用ZMappTM可以促进埃博拉病毒从肺气道快速清除：最后，我们试图评估ZMappTM-诱导的病毒在离体粘液分泌物中截留是否将转化为针对埃博拉穿过AM的屏障得到改善，从而改变体内肺气道中的分布。采用气溶胶输送装置(例如，PennCentury微型喷雾器)，我们向小鼠肺部施用ZMappTM或PBS，然后30分钟后加入荧光埃博拉VLP。在处理的对照小鼠中，我们在整个肺气道观察到与埃博拉VLP有关的大量红色荧光，包括指示粘膜穿过和下气道上皮积聚的荧光，如图17A和17B所示。相比之下，ZMappTM处理小鼠气道内存在的埃博拉VLP少得多(图18C,18D)，大概是由于VLP被截留在管腔粘液内且被快速清除。实际上，ZMappTM-处理小鼠肺组织内荧光水平几乎比对照小鼠低7-倍，仅比背景高3.5-倍。这些结果与前面的观察一致：与粘蛋白网络纤维结合的纳米颗粒无法穿过粘液层并到达下面的上皮。
埃博拉VLP容易穿过新鲜的人类AM分泌物，但是被抗原特异性IgG(例如，ZMappTM)有效固定在AM中不动。截留反过来促进埃博拉VLP从小鼠气道中快速清除。虽然埃博拉病毒通常不被视为空气传播的病原体，但是，埃博拉病毒的气溶胶传播从生物学上来说是合理的。埃博拉病毒存在于唾液、排泄物、血液或其它可以通过埃博拉病毒症状(例如，咳嗽、呕吐和腹泻)及通过医疗保健输送(例如，插管、吸入、输送雾化药物)而气溶胶化的体液中。人为喷嚏产生的大液滴的移动距离高达1-2m，而更小的液滴可以在数秒至几分钟内移动高达6-8m。研究还发现，埃博拉在气溶胶形式中存活数十分钟(如果不是数小时的话)。埃博拉病毒可以引发呼吸道中细胞感染，在鼻内和气溶胶暴露后，在豚鼠和非人类灵长动物中观察到了致命的呼吸系统感染。此外，埃博拉病毒已经表明在并未存在直接物理接触的感染猕猴和健康猕猴及感染猪和猕猴之间传播，可能是通过气溶胶或飞沫传播，虽然并不能完全排除动物饲养实践期间可能存在的交叉感染。在反对空气传播的争论中经常引用的一项研究发现：当肌肉内接种的猴子被关在由
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分隔器隔开的相邻无栅笼子内避免直接接触时，没有发现可检测到的埃博拉病毒传播；尽管如此，但仅在血液中检测到高病毒滴度，表明这些动物在因感染全身效应而死亡之前，其肺中的病毒滴度可能尚未达到呼吸系统传播必须的临界滴度。相反，最近的人体研究报告指出，呼吸系统分泌物中存在大量埃博拉病毒，病理学研究也发现肺组织中存在病毒抗原。最后，以气溶胶方式传播武器化形式的这些病毒，对军方且可能对普通公众都构成巨大的威胁。据报道，马堡病毒已经开发了武器化形式的病毒版本。总之，这些报道充分证明了人们对埃博拉病毒的气溶胶传播持续关注，以及需要探索在粘膜处预防和治疗埃博拉病毒传播的策略，尤其是如果埃博拉病毒或其它线性病毒被武器化的话。
虽然粘液分泌会增加对感染的响应，但是，粘液通常被视为病原体的被动而非适应性阻隔，因此，在大多数粘膜感染的研究中被忽视。尽管实际上，大量Ab，包括IgG和IgA都分泌到AM中，但是Ab能够与粘液协同作用从而增强粘液扩散屏障性这一观念尚未得到充分探讨。此处，与我们最近发现IgG可以将HSV-1截留在人宫颈阴道粘液中高度吻合的是，我们证明了ZMappTM形式的埃博拉-结合mAb可以促进将大多数埃博拉VLP有效截留在AM中。Ab-介导截留埃博拉VLP显著减少了最初暴露几分钟内预期穿过粘液层的病毒粒子分数。由于被截留的病毒通过气道的天然粘膜纤毛被快速清除，ZMappTM-介导的埃博拉截留将可能减少到达气道上皮的病毒总通量，从而可能降低感染的可能性和/或严重程度，而不仅仅是延迟感染的发作。与这种假设一致，我们观察到局部输送(例如，通过气溶胶)ZMappTM到小鼠肺内大幅减少了30分钟内保留在传导气道中的荧光埃博拉VLP的含量。IgG-介导的病毒粘液截留似乎是不同粘膜表面的通用保护性免疫功能，能够在病毒传播侵入门户处直接提供保护。
基于Ab的粘膜Ab预防和/或治疗概念设计用于与粘液联合截留病原体，是抵抗传染性疾病的保护性方法库中的一种非常独特且互补的方法。首先，所述概念从根本上将呼吸系统病毒的第一防线移到细胞外粘液凝胶而非细胞靶，这一点对于抵抗毒性特别强和/或无法治愈(例如，HIV、埃博拉)的病毒尤其重要。其次，将病毒截留在粘液中的Ab并不需要结合以中和表位；这一点极大地拓宽了可以开发用于实现保护的潜在抗原靶。实际上，ZMappTM混合物中的一种mAb实际上是较差的中和剂。再次，由于粘膜传播期间病毒载量可能较低，高风险暴露事件之前或之后粘膜表面需要的mAb总剂量可能大幅低于治疗增殖全身性感染需要的mAb。因此，局部施用ZMappTM是最高风险埃博拉感染人群(例如医疗保健人员)尤其有用的预防措施或紧急干预措施，用于减少暴露事件后患病机率以及降低进入循环的病毒载量。
实例6
阻止呼吸道合胞体病毒穿过人气道粘液
在美国，RSV是细支气管炎、肺炎和病毒死亡的主要原因，在2岁以下儿童中，每年>350万例RSV感染和>125,000例住院。疗养所RSV感染5-10％，导致177,000次住院，感染老年人中肺炎率(10-20％)和死亡率(每年～14,000例)显著。帕利珠单抗(亦称为SYNAGIS)是开发用于治疗RSV的mAb。虽然其在降低RSV-相关住院风险方面效果适中，但是，SYNAGIS仅提供给非常少的儿童群体使用。按照CDC，目前未用于RSV治疗。
SYNAGIS通常通过注射施用。虽然它可能降低感染RSV的风险，但是，SYNAGIS在治疗RSV感染方面并没有效果。令人吃惊的是，根据此处描述的说明，这可能是由于流到气道中的mAb数量不够。换句话说，肌内注射可能仅仅有足够mAb到达肺腔，适度降低RSV感染率，尤其是由于通常RSV暴露的病毒滴度较低。但是，一旦发生感染，mAb的数量不足以限制更高滴度RSV的扩散。鉴于RSV将感染性病毒粒子排到到管腔内的独特的病理生理学，我们认为，肺内高浓mAb将是比全身或肌内给药更有效的治疗方法。在棉鼠研究中，多克隆IgG肺部给药治疗RSV比肌内给药效果强160-倍。
为了使AM中的单个RSV病毒粒子形象化，我们通过将结合AF488染料与病毒表面结合对RSV进行荧光标记，将可以与RSV结合的总mAb减少了～10％-20％。当混合到从气管内导管采集的新鲜、生理学性人AM中时，大部分RSV(～28％±7％)在测试的全部12个独立AM标本中均快速扩散(图19A-19B)。大部分被截留RSV(虚线左边所有RSV)可能是由于成年人AM内的内源性RSV-结合Ab所致；我们预期幼儿AM中可移动RSV的分数将更高，幼儿不太可能具有大量内源性RSV-结合Ab。在相同AM标本的等份样品中，我们将我们的“粘膜-截留”帕利珠单抗混合到AM内，最终浓度为1μg/mL，发现实际上所有RSV都被固定不动(即至少在20秒电影期间，移动距离小于其直径(d～100nm，如虚线所示))。我们在浓度低至50ng/mL时亦观察到类似的截留效力。加入非-结合IgG对照(抗聚乙二醇(PEG)人IgG1)，并未减慢RSV的扩散。如上所述，通过病毒粒子-结合Ab，病毒粒子可以被有效地固定在人AM中。
本文所述的“粘膜-截留”帕利珠单抗包括帕利珠单抗的重链和轻链可变区及包括Fc区上增强粘膜截留的糖基化模式。例如，粘膜-截留帕利珠单抗可以是一组mAb，其中至少一些百分比的mAb群体具有帕利珠单抗(或帕利珠单抗的衍生物)的重链和/或轻链可变区，并包含G0/G0F(即GnGn)糖基化模式，从而它们促进将病毒截留在粘液中。例如，在一些变化形式中，所述粘膜截留抗体群体(例如，粘膜-截留帕利珠单抗)至少60％重组抗体具有糖基化模式，所述糖基化模式包括双触角核心多糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβl-4G1cNAcβ1，每个支链上具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。
此外，抗RSV的粘膜-截留mAb将RSV从小鼠气道中快速清除。为了证明粘液截留促进从气道快速清除，我们开展了一项体内研究，其中将荧光RSV施用到Balb/c小鼠(8-10周大)气道，然后施用PBS或抗RSV的粘膜－截留Ab，最后在30分钟后执行安乐死，对气管和气道进行冷冻切片。如冷冻切片图像所示，在施用后短达30分钟的时间内，与PBS对照相比，局部施用RSV-截留IgG有效降低了残留在小鼠气道内的RSV含量，其含量与RSV接种之前15分钟同一RSV-截留IgG处理小鼠内的含量相当(n＝6；图20A-20B)。局部施用对照IgG，观察到类似的PBS结果(n＝2)。这些结果强调了抗RVS粘膜-截留IgG在快速清除感染者气道内RSV方面的能力。
鼻内施用抗RSV“粘膜-截留”mAb有效降低了棉鼠感染性RSV滴度。根据我们上述观察，抗RSV粘膜-截留mAb能够将RSV截留在人AM中，促进RSV在小鼠肺内快速清除，接下来，我们对局部施用同一mAb是否能够治疗RSV感染进行评估。棉鼠仍然是RSV感染第一体内模型的黄金标准。在此研究中，我们在第0天接种RSV菌株A2(100μL；1x106PFU/小鼠)。经过48小时让感染增殖后，我们采用2种日剂量(即分别在第2天和第3天施用一次)的抗RSV粘膜-截留mAb(具有与SYNAGIS相同的FAB，经修饰具有本文所述的增强粘膜截留能力；N＝9)、对照IGG(例如，HGN-194，一种抗HIV的MAB；N＝8)或溶媒对照(例如，生理盐水；N＝8)处理3组小鼠。所有处理均鼻内施用，在第4天从所有小鼠收获肺，速冻，最后均化，采用免疫斑块试验开展病毒血分析。具有增强粘膜截留能力的抗-RSV抗体(粘膜-截留mAb)在棉鼠肺中介导感染性病毒滴度平均减少>100-倍，包括3只棉鼠表现出没有可以检测出的病毒血，强调了这种治疗的潜在有效性。这一点在图21中进行了阐明。
为了证明我们可以通过雾化输入mAb到肺部气道，我们采用PARI现成的eRapid系统，开展了雾化的初步表征。采用Copley新一代撞击器(NGI)，如图22A所示。我们采用25mg/mL人IVIG溶液
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在15L/min操作3分钟，试验了eRapid装置。惯性冲击结果分析基于抗体质量相对冲击阶段截止直径的分布，这一分析表明质量中位数气动粒径(MMAD)为4.5±0.21μm(GSD＝1.57±0.01)，细粒分数为66.5±6.2％(指示NGI 3级及以下沉积的质量分数，在15L/min时，截止直径是5.39μm)。这些结果强调了我们采用尺寸范围支持肺粘膜沉积(1-5μm)的振动筛雾化器可以产生气溶胶液滴。4.5μm MMAD与eFlow雾化器生产商提供的数值非常吻合。为了进一步验证IgG稳定雾化，我们对雾化的IgG 开展凝胶电泳分析。我们并未观察到重链和轻链分离或聚集，回收IgG的浓度是输入浓度的93％-108％。这些结果证明了雾化器给药的能力。
实例7
雾化mAb
采用15L/min操作致动3分钟的惯性撞击器(NGI，美国MSP公司)测定惯性撞击和气动粒径分布(APSD)。不采用任何预-分离器，NGI在冰箱中冷却至少90分钟，以减少给药期间雾化产品蒸发。向雾化器中加入浓度25mg/mL Privigen(CSL Behring)(PARI eFlow，如图23A-23C所示)，撞击试验重复开展三次。定制吹嘴适配器采用聚二甲基硅氧烷(PDMS，道康宁公司)制造。每级撞击器上沉积的Privigen采用5mL生理盐水收集，并采用LuminexMAGPIX(德克萨斯州奥斯汀市)，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法定量。通过测定NGI每级尺寸过小粒子的累积质量分数，对照相应气动截止直径的对数绘图，并求解中值粒径，这样可以测定APSD和随后测定质量中位数气动粒径(MMAD)。几何尺寸分布(GSD)通过粒径分布第84个百分位和第16个百分位的粒径之比的平方根计算得到，细粒分数定义为3级及以下(粒子<5.39μm)收集的IgG相对总沉积质量的比例。测定RSV-特异性IgG(参见，例如DOI:10.1038/s41467-017-00739-6)。
虽然采用振动筛雾化器雾化纯化的人或人源化单克隆抗体(mAb)，但是，可以采用任何合适的雾化器，包括(但不限于)：喷射雾化器、振动网雾化器等。此外，虽然本文所述方法和实例阐明了“湿式”雾化器制剂，但是，在一些变化形式中，可以使用干式/粉末吸入器制剂。
如图23A-23C所示，可以形成液滴尺寸(例如，小于大约5μm)适合输送到患者气道内的雾化溶液(例如，气溶胶液滴)，所述雾化溶液包含抗RSV的F蛋白的A抗原位点表位的重组抗体，所述重组抗体包括富集具有寡糖的群体，所述寡糖具有增强所述重组抗体粘液截留能力的糖基化模式。在图23A中，该实例的质量中位数气动粒径(MMAD)是大约4.6μm(GSD＝2.2)，5.4μm以下气溶胶的质量分数是53％，是采用浓度15mg/mL的IN-002产生的。在图23A中，喷射量是大约103％，小于5.39μm的分数是大约52.6％；小于3.3μm的分数是大约30.1％。这些气溶胶的特点适合输送至肺气道。重要的是，液滴中包含的IN-002似乎是稳定的，正如采用结合IgG-Fab的包被抗体开展的总人IgG ELISA测定所示。从新一代撞击器(NGI)不同级收集的雾化IN-002的测定信号与未雾化IN-002对照具有非常强的可比性。同样，抗原亲和性似乎得以保留，如基于RSV-A2包被的全-RSV ELISA测定及采用抗-人IgG二次辣根过氧化物酶结合物的检测所示，如图23B所示。在图23C中，从新一代撞击器(NGI)不同级收集的雾化IN-002的信号与未雾化IN-002对照具有非常强的可比性。
浓度更低的mAb(例如，针对呼吸系统病毒粒子的mAb，如IN-001和IN-002)，输送效果没有这么好。例如，图23D-23F表明，与更高浓度mAb(例如，15mg/mL)相比，更低浓度(例如，5.4mg/mL)雾化时，会导致完整mAb损失更多(ELISA定量)，且与病毒抗原结合的亲和力也损失(如图23A-23C)所示。
申请人发现，对于受试者吸入所述雾化溶液开展呼吸道合胞体病毒治疗或预防来说，存在一个最佳浓度范围。特别是，雾化溶液包括重组抗体(例如，帕利珠单抗，或帕利珠单抗变体，如莫维珠单抗)，所述重组抗体具有人或人源化Fc区和寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液截留能力的糖基化模式，其中所述雾化溶液包括具有质量中位数气动粒径(MMAD)的粒子。这种MMAD尺寸范围的粒子中的最佳抗体浓度是大约10mg/mL至大约100mg/mL，特别是大于10mg/mL和小于100mg/mL(例如，11mg/mL至大约100mg/ml，12mg/mL至100mg/mL，13mg/mL至100mg/mL，14mg/mL至100mg/mL，15mg/mL至100mg/mL)。低于此范围，治疗效果没有这么好或甚至无效。在一些变化形式中，这种治疗是仅在感染后2-3天施用和优化。
采用PARI LC SprintTM雾化器向羊羔施用RSV病毒(例如，6mL RSV M37菌株，1.1x107FFU/mL，含20％蔗糖的培养基)或对照培养基(来自HEp-2细胞，不含RSV)。将3份2-mL含病毒培养基或对照培养基在23分钟期间向每个动物施用，导致每只羊羔共吸入大约3mL。每只接种RSV的羊羔接受1.29x107总FFU/动物的计算有效剂量。采用Aerogen Solo雾化器输送上述雾化溶液。
在感染后第2天或第3天，采用生理盐水或两种不同的粘膜-截留mAb—IN-001和IN-002处理新生羊羔。以靶吸入剂量～0.9mg/kg施用雾化IN-001(在第3天开始，并在第4天和第5天也施用)。以靶吸入剂量～0.8mg/kg施用雾化IN-002(在第3天开始，并在第4天和第5天也施用)。以靶吸入剂量～0.3mg/kg施用雾化IN-002(低剂量)，在第2天开始，并在第3天、第4天和第5天也施用。靶吸入剂量这样计算(DOI：10.1080/19420862.2018.1470727)。
开胸，取出肺，并对肉眼病变进行评分，如图24A-24E和24F所示。原位和体外拍摄肺部。取出后，在BALF采集程序之前，对每个肺叶的百分实质型受累进行评分。然后，分开左肺和右肺，切除每个肺叶。从所有动物的每个肺叶收集组织样品。简单地说，将并非用于BALF收集的每个肺叶的一个样品(即4个肺叶-右前侧、左前侧、左中和左后侧)在液氮中开展速冻用于qRT-PCR。将来自这些肺叶中每个肺叶的两个样品放在组织盒内，并放在10％-中性缓冲福尔马林(NBF)中，用于组织学和免疫组织化学分析，将来自这些肺叶中每个肺叶的1个代表性肺样品(～1g)放进1个冷冻管(每个肺样品1个冷冻管-即每只羊羔4个冷冻管)中，并在液氮中立即速冻，然后转移到-80℃储存。
如图24A-24E所示，从第0天接种感染性RSV(Memphis R37菌株)到3-5天大羊羔体内，并在感染后第2天或第3天开始治疗，对采用雾化粘膜-截留mAb治疗RSV感染的有效性进行评估。在第6天从动物身上收获肺，对肺组织中发现的肉眼病变进行评分，这种肉眼病变反映了这些动物肺部的RSV感染程度。如图24C-24E所示，与生理盐水对照相比，肺部施用粘膜-截留mAb(IN-001和IN-002)有效减少了肉眼病变(图24B)。实际上，许多动物不存在肉眼可见的RSV-诱导的病变，肺部病理学与未感染羊羔相比似乎没有区别。
在第6天执行安乐死后，立即采集每只动物的支气管肺泡灌洗液(BALF)样品。右后侧肺叶BALF采集到5mL低温双改良Iscove's培养基(DMIM)中，该培养基含42.5％Iscove's改良Dulbecco's培养基、7.5％甘油、1％热灭活FBS、49％DMEM和5μg/mL硫酸卡那霉素。为了采集BALF，在肺解剖后，采用与电子移液器连接的10mL血清吸管(采用5mL DMIM)对1至20只羊羔冲洗右后侧肺叶至主支气管5次，采集大约2.6-3.0mLBALF。100μL右后侧肺叶BALF用于采用ISU开展RSV载量qRT-PCR评估，1.2mL(其中采用850μL)用于采用ISU开展FFU分析；如下文所述。此外，采用5份独立的1mL无菌0.9％生理盐水(采用1mL移液管)冲洗右中肺叶至主支气管5次，采集每只动物右中肺叶的BALF，大多数情况下，大约回收2-3.5mL。
对BALF和肺组织开展感染性病灶形成单位(FFU)检测，结果如图25所示。将每只羊羔的BALF样品放在冰上1.5mL小瓶中，并在尸检采集后尽快在标准感染性病灶检验中使用。在感染性病灶检验中使用之前，采集的BALF样品首先在1780x g条件下微离心分离5分钟，使任何大碎片沉淀，然后，采用移液管取出800-850μL澄清上清液(确保避免每根管底部存在碎片；碎片可能堵塞0.45μm过滤器)，并在15,600x g条件下应用和转动通过850μL-容量0.45μm Costar SPIN-X过滤器(美国伊利诺伊州汉诺威帕克市Fisher Scientific)5分钟。此时，BALF样品被视为已准备好用于感染性病灶检验。
此外，在用于感染性病灶检验之前，采用OMNI TH均化器将0.5g采集的肺样品(从每只动物5个肺叶中的每个肺叶选取0.1g；右前侧、附件、左前侧、左中和左后侧)立即在置于冰上的5mL DMIM中均化80秒。将1mL每种均化液转移到无菌1.5mL小瓶中，并在1780x g条件下微离心5分钟，使大碎片沉淀。采用移液管取出800-850μL每种澄清的上清液，并应用到新的SPIN-X柱，该柱在15,600x g条件下转动5分钟。每个肺样品重复该程序2次或3次(每次采用新的SPIN-X柱)。此时，肺样品均化液被视为已准备好用于感染性病灶检验。
简单地说，在含10％热灭活胎牛血清(FBS)和50μg/mL硫酸卡那霉素的DMEM培养基中，在12孔培养板中将HEp-2细胞培养到70％融合。将收集的BALF样品在3000x g条件下微离心5分钟，使大碎片沉淀。每种上清液取出850μL，并在15,600x g条件下转动通过850μL-容量0.45μm Costar SPIN-X过滤器5分钟。每个过滤器-澄清的BALF样品在全浓度及1:10、1:100、1:1000和1:10000四个额外系列稀释浓度开展分析。向12-孔板的孔内加入200μL每个样品稀释液，每个样品一式两份(例如，每个样品使用整个12-孔培养板)；每个板上的两个对照孔接受无病毒细胞培养基。培养板在37℃和5％CO2的CO2培养器中培养80分钟，每20分钟用手摇动。向每个孔中加入1mL培养基，让细胞培养48小时，然后，取出培养基，采用60％丙酮/40％甲醇溶液固定细胞1分钟。取出固定溶液，并让培养板在空气中晾干2分钟，然后每个孔采用1mL TBS-0.05％Tween 20、pH 7.4-7.6(TBST)在轻微转动条件下重新水合1分钟。为了阻止非特异性结合，将1mL 3％BSA(美国伊利诺伊州汉诺威帕克市FisherScientific公司)TBST溶液加入到所有室温孔中，并轻微摇动30分钟。将多克隆山羊抗-RSV(所有抗原)一抗(马萨诸塞州比勒利卡EMD Millipore公司)采用含3％BSA的TBST以1:800稀释；将325μL这种稀释液加入到每个孔内，让培养板在4℃培养1个晚上，同时轻微摇动。第二天，采用TBST，将培养板轻柔地晃动3次，每次5分钟，然后，向每个孔中加入325μL采用含3％BSA的TBST以1:800稀释的二抗[兔抗-山羊IgG(H+L)的Alexa
Figure BDA0002793129270000521
488F(ab’)2片段,Molecular Probes/Life Technologies]，在室温培养30分钟，同时轻柔地转动轨道。采用TBST冲洗培养板2次，每次5分钟，在开展显微镜检查之前，向每个孔中加入1mL TBST。采用安装在倒置荧光显微镜(Olympus CKX41，美国宾夕法尼亚州Center Valley市)上面的FITC/GFP滤波器检测是否存在发荧光的感染性病灶。5个或更多个发荧光细胞簇被计为单个感染性病灶事件。采用下述公式计算滴度：在1:100-稀释的(平行样)样品中，平均20个计数表明原始BALF样品的滴度为10000，因为[20个计数x稀释因子100x 1,000μL/mL]/200μL评估＝10,000感染性病灶-形成单位/mL(FFU/mL)。对于肺部均化液计算：在1:100-稀释的样品中，平均20个计数表明原始肺样品的滴度为110,000FFU/g肺组织，因为11x[20个计数x稀释因子100x1000μL/mL]/200μL评估＝110,000感染性病灶“FFU”/g。这些结果将乘以样品损失分数
如图25所示，通过肺均化液标准病灶-形成单位检验，定量评估处死时羊羔肺中的感染性病毒载量。图26示出了支气管肺泡灌洗液(BALF)。在肺均化液中，观察到FFU显著减少(IN-001)或没有可检测到的FFU(当采用IN-002处理时，从第3天开始全剂量施用或从第2天开始但剂量减少)。从同一羊羔获得的BALF也得到了类似结果，采用IN-002处理将感染性病毒载量减少了近4个数量级。这些结果强调了施用粘膜-截留mAb治疗RSV的有效性。
上述说明是为了阐明本发明，不应视为限制本发明。本发明由下述权利要求定义，与所述权利要求相当的内容也包括在本发明中。
序列表
<110> 北卡罗来纳大学教堂山分校
S•莱
杨兵
J•麦卡伦
<120> 抑制病原体感染的组合物和方法
<130> 5470-843WO
<150> US 62/646,220
<151> 2018-03-21
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Met Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Arg Asn Tyr
20 25 30
Ile Ile Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Val Leu Gly Thr Val His Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Thr Ala Leu Val Val Ser Thr Thr Tyr Leu Pro His Tyr
100 105 110
Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Val Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
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Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
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Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
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115 120
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
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Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Phe Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Phe Tyr Pro Phe Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Phe Phe Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Ser Ser Ser Ser
1 5

Claims (28)

1.一种治疗或预防吸入雾化溶液的受试者呼吸道合胞体病毒(RSV)的雾化溶液，所述雾化溶液包括重组抗体，所述重组抗体具有人或人源化Fc区和寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液内截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与RSV结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/RSV复合物，从而治疗或预防感染，其中所述雾化溶液包括质量中位数气动粒径(MMAD)为2-6μm且粒子中抗体的浓度是10mg/mL至100mg/mL的粒子。
2.根据权利要求1所述的雾化溶液，其中所述雾化溶液的pH是大约4.5至7。
3.根据权利要求1-2任一项所述的雾化溶液，其中所述雾化溶液的pH近似中性。
4.根据权利要求1-3任一项所述的雾化溶液，其中所述雾化溶液相对肺是高渗的。
5.根据权利要求1-4任一项所述的雾化溶液，其中所述重组抗体在抗体Fc区上包括与寡糖连接的N-连接糖基化位点。
6.根据权利要求1-5任一项所述的雾化溶液，其中所述糖基化模式包括双触角核心多糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1，其每个支链上都具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。
7.根据权利要求1-6任一项所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括人或人源化IgG或IgM单克隆抗体或其片段或其衍生物。
8.根据权利要求1-7任一项所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括帕利珠单抗，或帕利珠单抗变体。
9.根据权利要求1-7任一项所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括莫维珠单抗。
10.根据权利要求1-9任一项所述的雾化溶液，进一步包括表面活性剂。
11.根据权利要求1-10任一项所述的雾化溶液，其中粒子内所述抗体的浓度是12mg/mL至85mg/mL。
12.一种治疗或预防吸入雾化溶液的受试者呼吸道合胞体病毒(RSV)的雾化溶液，所述雾化溶液包括抗RSV F蛋白表位的重组抗体，所述重组抗体具有人或人源化Fc区和寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液内截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与RSV结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/RSV复合物，从而治疗或预防感染，其中所述雾化溶液包括质量中位数气动粒径(MMAD)为2-6μm、pH为4.5至7且粒子中抗体的浓度是12mg/mL至100mg/mL的粒子。
13.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中所述雾化溶液相对肺是高渗的。
14.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中所述重组抗体在抗体Fc区上包括与寡糖连接的N-连接糖基化位点。
15.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中所述糖基化模式包括双触角核心多糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1，其每个支链上都具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。
16.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括人或人源化IgG或IgM单克隆抗体或其片段或其衍生物。
17.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括帕利珠单抗，或帕利珠单抗变体。
18.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括莫维珠单抗。
19.根据权利要求12所述的雾化溶液，进一步包括表面活性剂。
20.根据权利要求12所述的雾化溶液，其中粒子内所述抗体的浓度是12mg/mL至85mg/mL。
21.一种治疗或预防吸入雾化溶液的受试者呼吸道病毒的雾化溶液，所述雾化溶液包括重组抗体，所述重组抗体具有人或人源化Fc区和寡糖，所述寡糖具有增强重组抗体粘液内截留能力的糖基化模式，从而所述重组抗体与呼吸道病毒结合，形成被截留在受试者粘液内的抗体/呼吸道病毒复合物，从而治疗或预防感染，其中所述雾化溶液包括质量中位数气动粒径(MMAD)为大约2-6μm且粒子内抗体的浓度是10mg/mL至100mg/mL的粒子。
22.根据权利要求21所述的雾化溶液，其中所述呼吸道病毒是以下病毒中的一种：呼吸道合胞体病毒(RSV)、偏肺病毒、流感病毒、腺病毒和副流感病毒。
23.根据权利要求21所述的雾化溶液，其中所述雾化溶液的pH是4.5至7。
24.根据权利要求21-23任一项所述的雾化溶液，其中所述雾化溶液相对肺是高渗的。
25.根据权利要求21-24任一项所述的雾化溶液，其中所述重组抗体在抗体Fc区上包括与寡糖连接的N-连接糖基化位点。
26.根据权利要求21-25任一项所述的雾化溶液，其中所述糖基化模式包括双触角核心多糖结构Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1，其每个支链上都具有末端N-乙酰氨基葡萄糖。
27.根据权利要求21-26任一项所述的雾化溶液，其中所述重组抗体包括人或人源化IgG或IgM单克隆抗体或其片段或其衍生物。
28.根据权利要求21-27任一项所述的雾化溶液，其中粒子内所述抗体的浓度是12mg/mL至85mg/mL。
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