CN112190591A

CN112190591A - 核糖体蛋白rpl13抑制剂在制备抑制ires-依赖性翻译的病毒复制的药物中的应用

Info

Publication number: CN112190591A
Application number: CN201910610793.1A
Authority: CN
Inventors: 郭慧琛; 王晓佳; 孙萌萌; 韩世充; 孙世琪; 张韵; 茹嘉喜
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-07-08
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-07-08
Also published as: CN112190591B

Abstract

本发明公开了核糖体蛋白RPL13抑制剂在制备抑制IRES‑依赖性翻译的病毒复制的药物中的应用。所述核糖体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该SEQ ID No.1所示序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。所述核糖体蛋白RPL13抑制剂优选为RPL13 siRNA。实验证明，敲降RPL13后的宿主细胞，攻口蹄疫病毒(FMDV)2‑8小时内，每两小时测量一次病毒产量，结果发现病毒产量分别下降了1.7倍、8倍、18倍和25倍，此外还证明其它小核糖核酸病毒科如塞内卡病毒(SVA)和黄病毒科如猪瘟病毒(CSFV)的复制也依赖于RPL13，而敲降RPL13对宿主细胞的大体翻译活性没有影响。本发明提供了一种能够抑制IRES‑依赖性翻译的病毒复制的新药物，在生物医学领域将具有广阔的应用前景。

Description

核糖体蛋白RPL13抑制剂在制备抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种IRES-依赖性翻译的病毒复制所必需的细胞蛋白，还涉及该蛋白的抑制剂在抑制病毒中的应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

细胞有两种不同的蛋白质合成方式，最常见的机制是帽依赖性翻译，在起始因子eIF3介导下，eIF4F复合物促使mRNA和40s核糖体亚基结合到eIF4G中心区域，与此同时，多聚A尾结合蛋白(PAPB)促使3’端的多聚A尾与5’端帽子结构结合之后，核糖体复合物通过扫描机制从5’端到3’端进行翻译，寻找合适的起始密码子AUG进行翻译。

一般真核mRNA的翻译都需要5’帽子来介导核糖体结合，但小RNA病毒科成员RNA5’末端没有帽子结构，而有一个病毒编码的小蛋白质与基因组共价相连，小RNA病毒的蛋白翻译起始于5’非翻译区中的顺式调控元件，称为内部核糖体结合位点(IRES)。该元件能够在缺乏eIF4E因子的情况下，借助eIF4G、eIF3和eIF4A等翻译起始因子招募核糖体43S复合物。

这两种蛋白质的合成模式并不相同，帽依赖性翻译机制用于真核细胞中大多数mRNA的翻译，而当细胞处于病毒感染等应激条件下，帽依赖性翻译被阻滞，IRES依赖性翻译机制将介导对细胞增殖和存活较为关键的基因产物的翻译，以及具有IRES元件的病毒基因组的翻译，因此IRES被认为是潜在抗病毒药物的有效靶点。

核糖体几乎存在于所有细胞中，无论是原核细胞还是真核细胞都存在许多核糖体。真核生物核糖体由四种核糖体RNA(28S、18S、5.8S和5S rRNA)和79中核糖体蛋白(RP)组成，主要负责信使RNA(mRNA)的蛋白质合成。核糖体蛋白(RPs)除参与核糖体生物合成和蛋白翻译外，还可行使核糖体外功能，包括调控肿瘤发生、免疫信号传导、疾病发展，以及病毒复制过程。不同的病毒可以劫持特定的核糖体蛋白以实现最佳的病毒蛋白质的合成。例如核糖体蛋白RPL40促进弹状病毒科中水疱口炎病毒(VSV)和狂犬病毒基因组的帽依赖性翻译，但并不影响宿主细胞mRNA的帽依赖性翻译。此外核糖体蛋白RPL22、RPLP1/P2、RACK1、RPS5、RPS6和RPS25也可促进特定病毒蛋白的翻译。

口蹄疫病毒(FMDV)属于小核糖核酸病毒科内的Apthovirus属。FMDV可编码四种结构蛋白VP1至VP4，以及八种非结构蛋白：2A、2B、2C、3A、3B、3Dpol、前导蛋白酶Lpro和3Cpro。FMDV的IRES依赖性翻译是迄今为止研究较为前沿的IRES依赖性翻译之一，但其复杂的作用机制尚未完全研究清楚。在目前的研究中我们发现核糖体蛋白RPL13以解旋酶DDX3依赖性的方式在FMDV IRES翻译中起作用，并且这种翻译机制在小核糖核酸病毒科的塞内卡病毒(SVA)和黄病毒科的猪瘟病毒(CSFV)中是保守的。RPL13与已知结构的其它任何核糖体蛋白不同源，真核细胞的RPL13长末端延伸介导其自身与扩增片段末端之间接触，其可作为真核特异性蛋白质结合或核糖体蛋白的特异性延伸的平台。RPL13在一些胃肠道恶性肿瘤的发展中起着重要的作用，并且可能使癌细胞对凋亡刺激产生更强的抗性；RPL13的表达量减少对正常成纤维细胞系活性造成较少的抑制效应。本发明首次发现RPL13在IRES翻译中的重要功能，其通过IRES结合蛋白DDX3的招募来促进80S核糖体的组装。

本发明的提出对筛选有效的抗病毒靶点具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制的药物。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过在宿主细胞内敲降核糖体蛋白RPL13，从而抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制。实验证明，敲降RPL13后，攻FMDV 2-8小时内，每两小时测量一次病毒产量，结果发现病毒产量分别下降了1.7倍、8倍、18倍和25倍，除此之外还证明其它小核糖核酸病毒科如塞内卡病毒(SVA)和黄病毒科如猪瘟病毒(CSFV)的复制也依赖于RPL13。而敲降RPL13对宿主细胞自身蛋白的翻译没有影响。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了核糖体蛋白RPL13抑制剂在制备抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制的药物中的应用.

其中，优选的，所述核糖体蛋白RPL13的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该SEQID No.1所示的序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

其中，优选的，所述的核糖体蛋白RPL13抑制剂为RPL13 siRNA。

其中，优选的，所述的IRES-依赖性翻译的病毒包括口蹄疫病毒、塞内卡病毒及猪瘟病毒。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明为筛选IRES-依赖性翻译的病毒复制有效的抗病毒靶点提供了可行性依据，并且提供了一种能够抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制的新的药物，在生物医学领域将具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为敲降和过表达RPL13对FMDV复制的影响；

其中，A：用NC siRNA或RPL13 siRNA处理BHK-21细胞36h，然后感染0.5MOI FMDV，在感染后不同时间点，收获细胞并裂解，使用western blot检测RPL13、病毒蛋白(VP0、VP1、VP2和VP3)和actin蛋白的表达；B：攻毒后2-8小时内，每2小时采用TCID₅₀测定的病毒产量，p<0.01(**)；C：敲降RPL13后FMDV RNA的表达水平，p<0.05(*)，p<0.01(**)；D、E、F：在BHK21细胞中过表达RPL13对FMDV病毒复制的影响；G：在FMDV感染期间，BHK21细胞中RPL13 mRNA的水平，p<0.01(**)；

图2为RPL13和DDX3对FMDV复制子表达影响；

图3为RPL13与FMDV 5’UTR中IRES互作；

其中，A：用1MOI的FMDV感染BHK-21细胞，并在感染后5小时收集细胞裂解物；通过抗体特异性地将RNA-蛋白质复合物免疫沉淀；使用特异性FMDV IRES(456bp)或RPS16(441bp，作为对照)的引物对从这些免疫沉淀物中分离的总RNA进行RT-PCR检测；B：FMDV基因组的示意图；为了进一步证明RPL13与病毒基因组的结合位点，进行RNA-蛋白质互作测定；对应于FMDV基因组中的5'UTR，S-片段，Cre，IRES和3'UTR的RNA探针经生物素化后与BHK-21细胞提取物一起温育(顶部)；最后对洗脱的RNA-蛋白质复合物进行western blot检测(底部)；

图4为RPL13和DDX3对FMDV IRES依赖性翻译的影响；

其中，A：含有帽依赖性Renilla(Rluc)翻译的荧光素酶基因和FMDV IRES依赖性翻译的萤火虫(Fluc)荧光素酶基因的双荧光素酶质粒psiCHECK-FMDV-IRES的结构示意图；B：DDX3和RPL13对FMDV IRES翻译的影响(RACK1作为阳性对照)；

图5为RPL13和DDX3对帽依赖性翻译的影响；

其中，A：含有帽依赖性翻译的Renilla(Rluc)荧光素酶基因质粒的结构示意图；B：敲降RPL13和DDX3对帽依赖性翻译的影响；C：过表达RPL13和DDX3对帽依赖性翻译的影响；

图6为敲降RPL13对其他病毒IRES依赖性翻译的影响；

A：首先使用NC siRNA或RPL13 siRNA处理细胞，然后用双顺反子报告质粒psiCHECK-SVA-IRES或psiCHECK-CSFV-IRES转染；在转染后24小时，分析细胞裂解物中的双荧光报告分子活性；柱状图中的条形表示FLuc/RLuc活性(以百分比表示)，p<0.01(**)；B：敲降RPL13对SVA滴度影响；C：敲降RPL13对CSFV滴度的影响；D：敲降RPL13对SVA RNA水平的影响；E：敲降RPL13对CSFV RNA水平的影响；

图7为RPL13的敲降或过表达对细胞蛋白质合成的影响；

A、B：多核糖体谱显示宿主细胞蛋白质翻译不受RPL13增加或减少的影响；C、D：细胞活性实验显示，敲降RPL13和DDX3以及过表达RPL13和DDX3后不影响宿主细胞的活性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1敲降与过表达RPL13对病毒毒力的影响

一、方法：

1、细胞的准备

传代BHK-21、PK-15、IBRS-2和ST细胞：生长液含有10％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液，维持液用2％胎牛血清和100U青链霉素的DMEM培养液。37℃、5％CO₂温箱内培养。

2、病毒的增殖

由国家口蹄疫实验室(中国兰州)提供的血清型O的FMDV菌株(GenBank AccessionNo.JN998085.1)。细胞毒的增殖：按照细胞瓶培养液1/10的量接种病毒原液，待细胞病变达75％(一般为10小时)采用反复冻融法收获病毒，即将细胞瓶放入-80℃冻存，然后放置室温至全部融化，此时平摇细胞瓶使贴壁细胞脱壁，再次放入-80℃冻存，如此反复3次，使病毒从细胞中释放出来，离心后取上清液分别于-80℃冻存。

3、FMDV-EGFP复制子(rFMDV-EGFP)的构建

通过用EGFP报告基因取代FMDV O/HN/CHA/93(pOZK-K1234)的全长感染性克隆的Lb和P1基因构建亚基因组复制子rFMDV-EGFP(详细构建方案见文献：袁红，李平花，等.表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建[J].微生物学通报，2016，43(8)：1746-1752)。使用Lipofectamine LTX将用Not I线性化的复制子rFMDV-EGFP转染到BSR/T7细胞中。

4、病毒效价滴度的测定方法

细胞病变(cytopathic effect，CPE)为致细胞病变作用，指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，利用此种病变效应可进行病毒定量。病毒感染形成细胞病变常见合胞体(即多个细胞聚集一起形成多核的大细胞)与噬斑(细胞脱落形成空斑)两种。

毒力测定：将细胞毒倍比稀释得到细胞毒悬液，用96孔板培养BHK-21细胞至单层，向各孔中加入细胞毒悬液100μL/孔，做12个稀释度及8个重复，于37℃二氧化碳培养箱中放置72小时后观察产生细胞病变的孔数，重复3次。

TCID₅₀计算方法：制备96孔板单层细胞，将病毒做系列稀释，横向接种单层细胞板，每稀释度重复8孔，每日观察细胞病变，记录高于50和低于50％病变孔的病毒稀释度，计算比距，获得TCID₅₀结果。计算公式为：(高于50％的病变率-50％)/(高于50％病变率-小于50％病变率)＝比距；比距与接近50％病变率的病毒的稀释度的指数相加，就获得了指数。例如，比色计算或显微镜观察病毒的TCID₅₀在10^-7～10^-8之间，那么，指数-8与比距相加，获得的新的指数，就是TCID₅₀的指数。

5、免疫荧光染色：

特定处理后的细胞(转染或接毒等)经4％多聚甲醛(PFA)室温固定15min，PBST洗3遍后，0.1％TritonX-100室温处理细胞15min。PBST洗3遍后，用5％NBS在37℃条件下封闭处理细胞1h。然后用稀释于5％NBS中的一抗(1:200)在37℃孵育细胞1h，PBST洗5遍后；稀释于5％NBS中的荧光标记二抗(1：400)在37℃孵育细胞1h，PBST洗5遍后。DAPI染液室温孵育细胞约10min，PBST洗3遍后，置于荧光显微镜下观察。

6、实时荧光定量PCR法：

根据GenBank中已发表的病毒蛋白基因序列，采用分子生物学软件DNAStar进行核苷酸同源性分析，选择病毒复制相关的基因保守序列作为PCR扩增的靶序列。遵循荧光PCR引物设计原则，用Primer 5.0软件分别设计引物。

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(英潍捷基)提取总RNA，并利用莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(Promega)合成cDNA。然后使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)试剂盒，在Applied Biosystems 7500实时PCR系统中对cDNA进行实时定量PCR检测。qPCR检测用引物如下：

仓鼠源RPL13：

F 5’-AGCCGGAATGGCATGATACTG-3’

R 5’-TATCTCACTGTAGGGCACCTC-3’；

FMDV：

F 5’-CAAACCTGTGATGGCTTCGA-3’

R 5’-CCGGTACTCGTCAGGTCCA-3’；

SVA:

F 5’-CACCGACAACGCCGAGAC-3’

R 5’-GAGATCGGTCAAACAGGAATTTGAC-3’；

CSFV:

F 5’-AGCCCACCTCGAGATGCTA-3’

R 5’-CTATCAGGTCGTACTCCCATCAC-3’；

猪源GAPDH:

F 5’-ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA-3’

R 5’-GATCGAGTTGGGGCTGTGACT-3’；

仓鼠源GAPDH:

F 5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATC-3’

R 5’-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3’。

7、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)技术：

用1MOI FMDV感染细胞5小时。然后用PBS洗涤细胞两次，并使用RIPA裂解缓冲液破碎。将细胞裂解物以15,000×g离心10分钟以收集上清液用于随后的免疫沉淀。将裂解物与蛋白A-琼脂糖在冰上预孵育1小时以结合非特异性抗体。通过在4℃下以1,000×g离心10分钟沉淀非特异性复合物。回收上清液，用450μl裂解缓冲液各稀释100μl样品，然后加入8μl指定抗体或8μl不含抗体的缓冲液。在冰上孵育2小时。将预洗涤的蛋白质A-琼脂糖(在PBS中100μl；50:50)加入到每个样品中，然后将其在冰上敷育1小时。通过在4℃下以1,000×g离心5分钟沉淀RNA-蛋白质共免疫沉淀复合物，并用裂解缓冲液洗涤三次。将每个沉淀重悬于400μl蛋白酶K缓冲液(100mM Tris-HCl[pH 8.0]，12.5mM EDTA，150mM NaCl，1％SDS)中，并与100μg预消化的蛋白酶K在37℃温育30分钟。用TRIzol试剂(英潍捷基)从样品中提取RNA，使用PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa，大连，中国)进行RT-PCR扩增。

FMDV IRES特异性引物：

5'-CACAGGTTCCCACAACCGACAC-3'

5'-GCAGTGATAGTTAAGGAAAGGC-3'；

核糖体蛋白S16(RPS16)特异性引物：

5'-ATGCCTTCCAAGGGTCCTCTAC-3'

5'-TTATCGGTAAGATTTCTGGTAGC-3'。

将PCR产物在用Gel Red Nucleic Acid Gel Stain(Biotium，CA，USA)预染色的1％琼脂糖凝胶中分离。

8、RNA和蛋白互作试验：

质粒构建：分别载有对应于FMDV基因组5'UTR(SEQ ID NO.2)，S-片段(SEQ IDNO.3)，Cre(SEQ ID NO.4)，IRES(SEQ ID NO.5)和3'UTR片段(SEQ ID NO.6)的质粒委托金维智生物科技公司(中国苏州)构建，具体实施方案如下：分别合成上述基因，并分别添加5’NheI-3’BamHI酶切位点，然后克隆到载体pcDNA3.1(+)载体(英潍捷基)中。

体外转录及生物素标记RNA：用限制性内切酶BamHI将以上质粒酶切线性化，然后利用RiboMAX^TM Large Scale RNA Production Systems-T7(普洛麦格)试剂盒，根据生产商说明书进行体外转录，获得对应的纯RNA片段。然后利用Thermo Scientific Pierce RNA3’End Desthiobiotinylation Kit(皮尔斯生物科技)对以上RNA片段进行生物素化标记，即根据生产厂说明书，用T4 RNA连接酶将单一的生物素化核苷酸连接至对应RNA片段的3’端。

生物素化RNA与蛋白的互作试验：收集细胞裂解液，并用Pierce^TM BCA ProteinAssay Kit测定细胞裂解液浓度。然后利用Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-DownKit(Thermo科技)来检测生物素化RNA是否与目的蛋白互作。根据试剂盒说明书，先将50pmol生物素化RNA与50μl链霉素磁珠孵育结合，然后将其与200μg细胞裂解液进行孵育结合，最后从磁珠上洗脱特异的RNA和蛋白复合体，随后进行Western blot检测。

9、RNA干扰(RNAi)

靶向RPL13的小干扰RNA(siRNA)和阴性对照(NC)siRNA由吉玛基因(中国上海)合成。靶向特定基因的siRNA中使用的序列如下：

鼠RPL13 siRNA：5'-GCCCUACAGUGAGAUACCA-3'；

猪RPL13 siRNA：5’-GGAAUGGCAUGAUCCUGAA-3’；

鼠DDX3 siRNA：5’-GCAGUCGUGGACGUUCUAA-3’；

鼠RACK1 siRNA：5’-GGUCCAGGAUGAGAGUCAU-3’；

空白siRNA：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。

细胞生长至70％，使用Lipofectamine RNAi MAX(英潍捷基，美国)，根据制造商的说明书将siRNA转染细胞。

10、质粒构建和转染

通过常规逆转录PCR从BHK-21细胞扩增仓鼠RPL13和DDX3的全长cDNA。使用EcoR I和Xho I限制酶将cDNA克隆到pCMV-N-FLAG载体(碧云天生物技术，中国上海)中。

扩增仓鼠RPL13全长cDNA所用的引物序列：

5'-CCGGAATTCATGGCGCCCAGCCGGAATGG-3'

5'-CCGCTCGAGTCACTTTTTCTTTTCAACATCCTGCT-3'；

扩增仓鼠DDX3全长cDNA所用的引物序列：

5'-CCGGAATTCATGAGTCATGTGGCAGTGGAAAATG-3'

5'-CCGCTCGAGTCAGTTACCCCACCAGTCAACC-3'。

细胞生长至70％-80％，根据制造商的方案，使用Lipofectamine LTX(英潍捷基)将质粒转染到细胞中。

11、双顺反子报告质粒和单顺反子报告质粒

双荧光素酶质粒构建：

分别含有FMDV、SVA和CSFV IRES元件的双顺反子报告质粒psiCHECK-SVA-IRES、psiCHECK-SVA-IRES和psiCHECK-CSFV-IRES委托金维智生物科技公司(中国苏州)构建，具体实施方案如下：合成FMDV IRES、SVA IRES、CSFV IRES，并分别在其5’端添加PmeI酶切位点，3’端添加萤火虫(hluc+)荧光素酶基因的前10个氨基酸基因序列和ApaI酶切位点，同时利用内切酶PmeI(5端1663)和ApaI(3端2562)双酶切psiCHECK-2载体(普洛麦格)，将载体中Synthetic poly(A)、HSV-TK promoter、和hluc+的前10个氨基酸基因序列切除，然后分别将合成基因克隆至psiCHECK-2载体。合成基因的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

单顺反子报告质粒psiCHECK-1(普洛麦格)携带有SV40早期启动子和Renilla(Rluc)荧光素酶基因，可用于检测帽依赖性翻译活性。

12、免疫印迹法、病变法与实时荧光定量PCR法研究RPL13过表达或敲降对病毒复制的影响

免疫印迹：细胞经过表达或敲降RPL13处理后，感染FMDV特定时间后，用预冷的pH7.5PBS洗涤3遍，然后细胞刮刮下，超声裂解提取的细胞总蛋白3-5秒后，与5x SDS-PAGE上样缓冲液混合，煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，电泳后将凝胶上的蛋白通过电转膜仪转移到PVDF膜上。加相应一抗4℃孵育过夜。用PBST洗膜3x 5min，l:10000稀释HRP标记的相应二抗室温摇动孵育45min，洗膜3x 5min，使用Pierce TM ECL Western BlottingSubstrate(Pierce Biotechnology，Rockford，USA)使抗体-抗原复合物可视化。其中FMDV抗体为本实验室制备的针对FMDV的猪源多克隆抗体，RPL13抗体为购自abcam公司的兔源单克隆抗体，相关二抗均购自碧云天生物科技有限公司。所用病毒蛋白抗体以及RPL13抗体与actin抗体，均为1:1000稀释。

病变试验(TCID₅₀)：在感染后的不同时间，收获细胞培养基和细胞裂解物的上清液以确定病毒滴度。对于FMDV和SVA的TCID₅₀测量，在不含FBS的DMEM中制备连续十倍稀释病毒原液并加入到96孔板中。每个梯度设置8个重复，并向每个孔中加入100μl病毒稀释液。随后，将含有10％FBS的DMEM中的100μl BHK-21或IBRS-2细胞悬浮液以1.5×10⁶个细胞/ml加入各孔中并混合孔。在37℃，5％CO₂中孵育72小时后，计数具有或不具有细胞病变效应(CPE)的孔的数量。通过Reed-Muench方法计算每100μl的TCID₅₀。对于CSFV的TCID₅₀测量，先将ST细胞铺设于96孔板，待细胞长满后。将连续十倍稀释的病毒原液接种细胞，于37℃，5％CO₂条件下孵育1小时，待病毒入侵细胞后，除去病毒稀释液，清洗后换成含有2％FBS的细胞维持液，继续孵育48小时后，4％多聚甲醛固定细胞，0.1％TritonX-100破膜处理后，利用抗CSFV E2蛋白的鼠源单抗和标记FITC的抗鼠二抗进行免疫荧光试验，然后再通过观察绿色荧光来确定病毒感染孔数。

实时荧光定量PCR法(qPCR)：收集感染病毒不同时间的细胞裂解物，提取总RNA后，做反转录获得cDNA，然后用FMDV、SVA或CSFV的特异性引物分别检测病毒的RNA表达水平，均以GAPDH RNA表达水平作为内参。

二、结果

1、敲降和过表达RPL13对FMDV复制的影响

结果如图1所示。用NC siRNA或RPL13 siRNA处理BHK-21细胞36h，然后感染0.5MOIFMDV，在感染后不同时间点，收获细胞并裂解，使用western blot检测RPL13、病毒蛋白(VP0、VP1、VP2和VP3)和actin蛋白，可以发现敲降RPL13后导致病毒蛋白的表达水平显著下降(图1A)；在同样的实验条件下采用TCID₅₀测定病毒产量。攻毒后2-8小时内，每2小时检测一次病毒产量，我们发现病毒产量分别下降了1.7倍、8倍、18倍和25倍，p<0.01(**)(图1B)；敲降RPL13同样显著降低了FMDV RNA的表达水平，p<0.05(*)，p<0.01(**)(图1C)。然而在BHK21细胞中过表达RPL13对FMDV病毒的复制并没有显著的影响(图1D-F)。在FMDV感染期间，BHK-21细胞中RPL13 mRNA的水平逐渐增加，p<0.01(**)(图1G)。

2、RPL13和DDX3对FMDV复制子表达的影响。

结果如图2所示。我们使用具有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子rFMDV-EGFP，将BSR-T7细胞用NC siRNA，DDX3 siRNA或RPL13 siRNA转染36小时，或用FLAG-EV，FLAG-DDX3或FLAG-RPL13转染24小时。然后将复制子rFMDV-EGFP转染到细胞中。在转染后24小时，对细胞进行荧光分析。柱状图中的条形代表rFMDV-EGFP表达活性(以百分比表示)，p<0.01(**)。结果显示，在RPL13或DDX3敲降的BHK-21细胞中特异性荧光的数量显著减少。过表达DDX3显著促进复制子活性，而过表达RPL13不影响复制子活性。表明RPL13和DDX3正调控FMDV的复制。

3、RPL13与FMDV 5’UTR IRES互作

结果如图3所示。用1MOI的FMDV感染BHK-21细胞，并在感染后5小时收集细胞裂解物。利用RPL13特异性抗体进行免疫沉淀试验，以获得与RPL13蛋白结合的RNA-protein沉淀复合体。然后使用特异性FMDV IRES(456bp)或RPS16(441bp，作为对照)的引物对从这些免疫沉淀物中分离的总RNA进行RT-PCR检测。结果显示用RPL13抗体可共沉淀IRES(泳道3)，但没有检测到与RPS16 RNA(泳道8)共沉淀。用同种型IgG抗体(泳道4,9)或没有抗体(泳道5,10)进行互作试验后，不能检测到代表IRES或RPS16的RT-PCR条带。在RT-PCR阴性对照中使用H₂O作为模板也没有产生任何特异性条带(泳道6,11)。结果表明RPL13蛋白特异性地与FMDV IRES互作(图3A)。为了进一步证明RPL13与病毒基因组的结合位点，进行RNA-蛋白质体外互作试验。利用生物素标记对应于FMDV基因组中的5'UTR，S-片段，Cre，IRES和3'UTR片段，然后分别于BHK-21细胞提取物一起温育(顶部)。结果显示，如果使用生物素化的5’UTR或IRES，则RPL13被调取出来(底部)(图3B)，因此验证了RPL13与FMDV 5’UTR的IRES的特异性结合。

4、RPL13和DDX3对FMDV IRES依赖性翻译的影响

结果如图4所示。使用含有帽依赖性Renilla(Rluc)翻译的荧光素酶基因和FMDVIRES依赖性翻译的萤火虫(Fluc)荧光素酶基因的双荧光素酶质粒psiCHECK-FMDV-IRES，以测定FMDV IRES翻译活性。通过检测过表达或敲降DDX3和RPL13对FMDV IRES翻译活性的影响，我们发现当DDX3或RPL13被敲降时，FMDV IRES报告基因的活性显著降低，p<0.01(**)，其降低程度与敲降RACK1(阳性对照)对FMDV IRES翻译影响相当；RPL13的过表达几乎不影响IRES依赖性报告基因活性，而DDX3的过表达显著刺激了FMDV IRES的翻译，p<0.01(**)。结果表明RPL13和DDX3是FMDV IRES依赖性翻译的正调控因子。

5、RPL13和DDX3对帽依赖性翻译的影响。

结果如图5A-C所示。通过测量BHK-21和PK-15细胞中帽依赖性Renilla(Rluc)翻译的荧光素酶基因的活性，我们发现帽依赖性翻译不受RPL13或DDX3敲降或过表达的影响，这表明两种蛋白质对于帽依赖性翻译都不是必需的。因此RPL13和DDX3正调控FMDV的IRES依赖性翻译具有特异性。

6、RPL13的敲降对其他病毒IRES的翻译的影响

在RPL13敲降的细胞中测试了一系列病毒的IRES活性。首先使用NC siRNA或RPL13siRNA处理PK-15细胞36h，然后用双顺反子报告质粒psiCHECK-SVA-IRES或psiCHECK-CSFV-IRES转染细胞。在转染后24小时，分析细胞裂解物中的双报告分子活性。柱状图中的条形表示FLuc/RLuc活性(以百分比表示)，p<0.01(**)。用NC siRNA或RPL13 siRNA转染IBRS-2细胞36小时，然后用0.5MOI的SVA感染细胞。在指定的时间，收集上清液和细胞裂解物，并分别用TCID₅₀法和qPCR测定病毒产量和RNA表达水平，p<0.01(**)。用NC siRNA或RPL13 siRNA处理ST细胞36小时，然后用0.05MOI的CSFV感染细胞。在感染后12,24,48小时，测定病毒产量和RNA表达水平，p<0.01(**)。

结果如图6所示。结果显示敲降RPL13后塞内卡病毒(SVA)和猪瘟病毒(CSFV)的IRES活性分别降低至47％和45％(图6A)。此外，RPL13的敲降显著降低了SVA的病毒产量，在感染后4,8,12小时分别降低了12,8和15倍(图6B)，CFSV的病毒产量分别在感染后12,24,48小时降低了2.8,3.6和6.3倍(图6C)。此外，SVA和CFSV的mRNA水平显著降低(图6D和6E)。结果证明了SVA和CSFV的复制需要RPL13。

实施例2敲降与过表达RPL13对宿主细胞蛋白质合成的影响

1、多聚核糖体谱实验

细胞接种10cm培养皿，待细胞达到70％汇合后，细胞中过表达或敲降RPL13，并分别转染空载体或NC siRNA作为阴性对照。待过表达转染30h或敲降转染48后，用0.1mg/ml环己酰亚胺(CHX)(Sigma-Aldrich)在37℃下孵育细胞5分钟。随后，用含有CHX的4℃PBS洗涤细胞两次，并通过细胞刮擦收集细胞。将细胞重悬于1ml多聚核糖体提取缓冲液(20mMTris-HCl[pH 7.5]，5mM MgCl₂,100mM KCl，1％Triton X-100,0.1mg/ml CHX，1×蛋白酶抑制剂混合物[EDTA-]和50U/ml RNase抑制剂)，短暂涡旋，然后在冰上孵育1小时。将细胞裂解物在4℃下以15,000×g离心10分钟，收集上清，然后在线性10-50％(wt/vol)蔗糖梯度(稀释溶液由20mM Tris-HCl[pH 7.5]，5mM MgCl₂和100mM KCl组成)中进行超速离心以分离核糖体不同亚基组分。4℃条件下在Beckman SW41Ti转子中以35,000rpm离心3小时，离心后，使用Isco分馏器(Teledyne，USA)通过在管底部刺穿并用60％蔗糖溶液泵送梯度来分级收集梯度组分，同时测量其在254nm处的光密度(OD254)。

2、细胞活性实验

在96孔板中的细胞达到70％汇合后，细胞中过表达或敲降RPL13和DDX3，并分别转染空载体或NC siRNA作为阴性对照。待过表达转染30h或敲降转染48h后，用MTS法测定细胞活性，即每孔加入10μl MTS试剂，在37℃下孵育3h后，用酶标仪测量每个孔在490nm处的吸光度。

多核糖体谱显示宿主细胞蛋白质翻译不受RPL13增加或减少的影响(图7A、B)。细胞活性实验结果也显示在敲降或过表达RPL13后，宿主细胞的活性没有受到影响(图7C、D)。

研究结果进一步证明，FMDV的mRNA翻译起始和复制特异性依赖RPL13蛋白，这些发现突出了RPL13在翻译调控中的新功能，而RPL13对与宿主细胞自身翻译的影响可以忽略不计，因此该靶点可以作为抗病毒制剂的有效参考。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是较为容易的。因此，在不偏离本发明精神的基础所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

中国农业大学动物医学院

<120> 核糖体蛋白RPL13抑制剂在制备抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制的药物中的应用

<130> KLPI190232

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 210

<212> PRT

<213> RPL13

<400> 1

Ala Pro Ser Arg Asn Gly Met Val Leu Lys Pro His Phe His Lys 15

Asp Trp Gln Arg Arg Val Ala Thr Trp Phe Asn Gln Pro Ala Arg 30

Lys Ile Arg Arg Arg Lys Ala Arg Gln Ala Lys Ala Arg Arg Ile 45

Ala Pro Arg Pro Ala Ser Gly Pro Ile Arg Pro Ile Val Arg Cys 60

Pro Thr Val Arg Tyr His Thr Lys Val Arg Ala Gly Arg Gly Phe 75

Ser Leu Glu Glu Leu Arg Val Ala Gly Ile His Lys Lys Val Ala 90

Arg Thr Ile Gly Ile Ser Val Asp Pro Arg Arg Arg Asn Lys Ser 105

Thr Glu Ser Leu Gln Ala Asn Val Gln Arg Leu Lys Glu Tyr Arg 120

Ser Lys Leu Ile Leu Phe Pro Arg Lys Pro Ser Ala Pro Lys Lys 135

Gly Asp Ser Ser Ala Glu Glu Leu Lys Leu Ala Thr Gln Leu Thr 150

Gly Pro Val Met Pro Val Arg Asn Val Tyr Lys Lys Glu Lys Ala 165

Arg Val Ile Thr Glu Glu Glu Lys Asn Phe Lys Ala Phe Ala Ser 180

Leu Arg Met Ala Arg Ala Asn Ala Arg Leu Phe Gly Ile Arg Ala 195

Lys Arg Ala Lys Glu Ala Ala Glu Gln Asp Val Glu Lys Lys Lys 210

<210> 2

<211> 1124

<212> DNA

<213> FMDV 5’UTR

<400> 2

gctagcttga aaaggggcgc tagggtttca cccctaacat gccaacgaca gctcctgcgt 60

tgcactccac acttacgtct gtgcgcgcgc gggaaccgat ggactttcgt tcacccacct 120

gcagccggac tcacggcacc gcgtggccat tttagctgga ctgagcggac gaacgtcgct 180

tgcgcacctc gcgtgatcga ctagtactct taacactccg cctatttggt cgttagcgct 240

gtcctgggca ctcctgctgg gggccgttcg acgctctacg gtctcccccc cccgcgacaa 300

actacggtga tggggccgct tcgtgcgagc cgatcgcctg gtgtgtttcg gttgtcaccc 360

gaagcccgcc tttcaccccc cccccccccc cccccccccc cccccctaaa gtcttaccgt 420

cattcccgac gttaaaggga ggtaaccaca agatttgcgc cttcttgtcc gaagttagag 480

ggctgtaacc gcaaattttg aaccgccttt cccggcgtta acgggatgta atcacaagat 540

ggaccttcat ccggaagtaa aacggcaact tacacagttt tgcccgtttt catgagaaat 600

gggacgtcag cgcacgaaac gcgcagtcgc ttgaggagga cttgtacaaa cacgactcac 660

acaggttccc acaaccgaca caaaacgtgc aacttgaaat cccgcctggt ctttccaggt 720

ctagaggggt gacactttgt actgtgattg actccacgct cggcccactg gcgagtgtta 780

gtagtagtac tgttgcttcg tagcggagca tggtggccgt gggactccct ccttggtaac 840

aaggacccac ggggccgaaa gccacgtctc aggacccacc atgtgtgcaa ccccagcacg 900

gcaactttac cacgaaaacc actttaaggt gacactgaaa ctggtactca accactggtg 960

acaggctaag gatgcccttc aggtaccccg aggtaacacg cgacactcag gatctgagaa 1020

ggggattggg gcttctgtaa aagcgcccag tttaaaaagc ttctatgcct gaataggcga 1080

ccggaggccg gcgcctttcc ttaactatca ctgcttacgg atcc 1124

<210> 3

<211> 382

<212> DNA

<213> FMDV S Frag

<400> 3

gctagcttga aaaggggcgc tagggtttca cccctaacat gccaacgaca gctcctgcgt 60

tgcactccac acttacgtct gtgcgcgcgc gggaaccgat ggactttcgt tcacccacct 120

gcagccggac tcacggcacc gcgtggccat tttagctgga ctgagcggac gaacgtcgct 180

tgcgcacctc gcgtgatcga ctagtactct taacactccg cctatttggt cgttagcgct 240

gtcctgggca ctcctgctgg gggccgttcg acgctctacg gtctcccccc cccgcgacaa 300

actacggtga tggggccgct tcgtgcgagc cgatcgcctg gtgtgtttcg gttgtcaccc 360

gaagcccgcc tttcacggat cc 382

<210> 4

<211> 296

<212> DNA

<213> FMDV cre

<400> 4

gctagccccc cccccccccc cccccccccc ccccccctaa agtcttaccg tcattcccga 60

cgttaaaggg aggtaaccac aagatttgcg ccttcttgtc cgaagttaga gggctgtaac 120

cgcaaatttt gaaccgcctt tcccggcgtt aacgggatgt aatcacaaga tggaccttca 180

tccggaagta aaacggcaac ttacacagtt ttgcccgttt tcatgagaaa tgggacgtca 240

gcgcacgaaa cgcgcagtcg cttgaggagg acttgtacaa acacgactca ggatcc 296

<210> 5

<211> 471

<212> DNA

<213> FMDV S Frag

<400> 5

gctagccaca ggttcccaca accgacacaa aacgtgcaac ttgaaatccc gcctggtctt 60

tccaggtcta gaggggtgac actttgtact gtgattgact ccacgctcgg cccactggcg 120

agtgttagta gtagtactgt tgcttcgtag cggagcatgg tggccgtggg actccctcct 180

tggtaacaag gacccacggg gccgaaagcc acgtctcagg acccaccatg tgtgcaaccc 240

cagcacggca actttaccac gaaaaccact ttaaggtgac actgaaactg gtactcaacc 300

actggtgaca ggctaaggat gcccttcagg taccccgagg taacacgcga cactcaggat 360

ctgagaaggg gattggggct tctgtaaaag cgcccagttt aaaaagcttc tatgcctgaa 420

taggcgaccg gaggccggcg cctttcctta actatcactg cttacggatc c 471

<210> 6

<211> 138

<212> DNA

<213> FMDV 3’UTR

<400> 6

gctagctctc tcagatgtca caattggcag aaagactctg aggcgagcga cgccgtaagg 60

gtgaaaagcc tgaaagggct tttcccgttt cctttatccc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120

aaaaaaaaaa aaggatcc 138

<210> 7

<211> 499

<212> DNA

<213> FMDV IRES-hluc+

<400> 7

gtttaaacca caggttccca caaccgacac aaaacgtgca acttgaaatc ccgcctggtc 60

tttccaggtc tagaggggtg acactttgta ctgtgattga ctccacgctc ggcccactgg 120

cgagtgttag tagtagtact gttgcttcgt agcggagcat ggtggccgtg ggactccctc 180

cttggtaaca aggacccacg gggccgaaag ccacgtctca ggacccacca tgtgtgcaac 240

cccagcacgg caactttacc acgaaaacca ctttaaggtg acactgaaac tggtactcaa 300

ccactggtga caggctaagg atgcccttca ggtaccccga ggtaacacgc gacactcagg 360

atctgagaag gggattgggg cttctgtaaa agcgcccagt ttaaaaagct tctatgcctg 420

aataggcgac cggaggccgg cgcctttcct taactatcac tgcttacatg gccgatgcta 480

agaacattaa gaagggccc 499

<210> 8

<211> 746

<212> DNA

<213> SVA IRES-hluc+

<400> 8

gtttaaactt gaaagggggg gctgggccct catgcccagt ccttcctttc cccttccggg 60

gggtaaaccg gctgtgtttg ctagaggcac agaggagcaa catccaacct gcttttgtgg 120

ggaacggtgc ggctccaatt cctgcgtcgc caaaggtgtt agcgcaccca aacggcgcat 180

ctaccaatgc tattggtgtg gtctgcgagt tctagcctac tcgtttctcc cctactcact 240

catttacaca caaaaactgt gttgtaacta caagatttgg ccctcgcacg ggatgtgcga 300

caaccgcaag attgactcaa gcgcggaaag cgctgtaacc acatgctgtt agtcccttta 360

tggctgcgag atggctatcc acctcggatc actgaactgg agctcgaccc tccttagtaa 420

gggaaccgag aggccttcct gcaacaagct ccgacacaga gtccacgtga ttgctaccac 480

catgagtaca tggttctccc ctctcgaccc aggacttctt tttgaatatc cacggctcga 540

tccagagggt ggggcatgat ccccctagca tagcgagcta cagcgggaac tgtagctagg 600

ccttagcgtg ccttggatac tgcctgatag ggcgacggcc tagtcgtgtc ggttctatag 660

gtagcacata caaatatgca gaactctcat ttttctttcg atacagcctc tgcaatggcc 720

gatgctaaga acattaagaa gggccc 746

<210> 9

<211> 452

<212> DNA

<213> CSFA IRES-hluc+

<400> 9

gtttaaacgt atacgaggtt agttcattct cgtatgcatg attggacaaa acaaaatttc 60

aatttggttc agggcccccc tccagcgacg gccgaactgg gctagccatg cccatagtag 120

gactagcaaa cggagggact agccgtagtg gcgagctccc tgggtggtct aagtcctgag 180

tacaggacag tcgtcagtag ttcgacgtga gcagaagccc acctcgagat gctatgtgga 240

cgagggcatg cccaagacgc accttaaccc tagcgggggt cgctagggtg aaatcacacc 300

acgtgatggg agtacgacct gatagggcgc tgcagaggcc cactattagg ctagtataaa 360

aatctctgct gtacatggca catggagttg aatcattttg aacttttata caaaacagca 420

atggccgatg ctaagaacat taagaagggc cc 452

Claims

1.核糖体蛋白RPL13抑制剂在制备抑制IRES-依赖性翻译的病毒复制的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核糖体蛋白RPL13的氨基酸序列如SEQID No.1所示，或该SEQ ID No.1所示的序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的核糖体蛋白RPL13抑制剂为RPL13siRNA。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的IRES-依赖性翻译的病毒包括口蹄疫病毒、塞内卡病毒及猪瘟病毒。