CN112190574B - 神经酰胺磷脂复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

神经酰胺磷脂复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种神经酰胺磷脂复合物及其制备方法。所述神经酰胺磷脂复合物由神经酰胺和磷脂复合而成。其制备方法包括将神经酰胺和磷脂在有机溶剂中进行混合，得到包含神经酰胺磷脂复合物的反应混合物。本发明提供的神经酰胺磷脂复合物的制备方法具备环保、简单、高效的优点，且制得的磷脂复合物具有提高神经酰胺溶解性、安全性及透皮吸收能力的特点，从而提高其生物利用度，增强其修复皮肤屏障的功效。

Description

神经酰胺磷脂复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明提供了一种神经酰胺磷脂复合物、神经酰胺磷脂复合物的制备方法及其应用。
背景技术
神经酰胺是细胞间脂质的重要组成成分，有助于维持皮肤“砖墙结构”的形成，促进皮肤屏障的修复，但神经酰胺在应用中存在油溶性一般、配方中应用性差、皮肤滞留量低等问题，限制了神经酰胺在药品和化妆品中的应用。
现有技术中神经酰胺复合物主要有神经酰胺脂质体、神经酰胺囊泡分散物和神经酰胺纳米乳液等。神经酰胺脂质体的制备方法为：将重量分数为0.1％-5％的神经酰胺、1％-20％磷脂、10％-70％甘油及25％-80％水等在60℃-80℃条件下依次混合乳化均匀，最后通过高压均质机处理，得到外观呈现透明或半透明状的神经酰胺脂质体，该制剂具有稳定性高、水分散性及生物相容性等特点。神经酰胺囊泡分散物通常是以蔗糖脂肪酸酯、鞘氨醇或其衍生物、水性成分作为其构成成分，该制剂增强神经酰胺等鞘氨醇的稳定性及保湿效果。神经酰胺纳米乳液的制备方法为：将10％-67％甘油、0.1％-4％胆固醇、0.1％-6％神经酰胺、0.1％-3％氢化磷脂、1％-12％辛基十二醇在70-90℃条件下混合均匀，向上述混合液加入重量份数为1％-25％的水，搅拌均匀，通过高压均质机处理，得到外观呈半透明或透明的神经酰胺纳米乳液，该制剂具有稳定性高、水分散性好、生物相容性好的特点。可见，现有的应用于神经酰胺的制剂技术在制备过程中所需原料较多、制备工程相对复杂。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明采用了一种环保、简单、高效的磷脂复合技术，磷脂复合技术具有操作简单、节省成本的特点，且制得的神经酰胺磷脂复合物具有提高神经酰胺溶解性、皮肤滞留量及透皮吸收能力的特点，从而提高其生物利用度，增强其修复皮肤屏障的功效。
在第一个方面，本发明提供了一种神经酰胺磷脂复合物，其由神经酰胺和磷脂复合而成。
根据本发明的一些实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：(0.5-20)。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：(1-8)。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：(5.5-6.5)。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：6。
根据本发明的一些实施方式，所述神经酰胺选自神经酰胺I、神经酰胺II、神经酰胺Ⅲ和神经酰胺VI中的至少一种。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺选自神经酰胺ⅢA和神经酰胺ⅢB。神经酰胺Ⅲ含非羟基化脂肪酸链，是修复皮肤屏障的重要脂质成分。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺为神经酰胺ⅢB。
根据本发明的实施方式，所述磷脂为天然磷脂和/或合成磷脂。
根据本发明的优选实施方式，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酸中的一种或几种，优选为由磷脂酰胆碱和选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酸中的一种或几种组成。
根据本发明的优选实施方式，所述磷脂为磷脂酰胆碱。
根据本发明的一些实施方式，在37℃，150rpm振荡5h后，所述神经酰胺磷脂复合物在正辛醇中的溶解度为2-5mg/ml。
根据本发明的优选实施方式，在37℃，150rpm振荡5h后，所述神经酰胺磷脂复合物在正辛醇中的溶解度为3-4mg/ml。
根据本发明的一些实施方式，在37℃，150rpm振荡5h后，所述神经酰胺磷脂复合物的表观油水分配系数为1.5-3。
根据本发明的优选实施方式，在37℃，150rpm振荡5h后，所述神经酰胺磷脂复合物的表观油水分配系数为1.5-2。
在第二个方面，本发明提供了一种神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其包括步骤1)：将神经酰胺和磷脂在有机溶剂中进行混合，得到包含神经酰胺磷脂复合物的反应混合物。
根据本发明的一些实施方式，所述混合在30℃-80℃的温度进行。
根据本发明的优选实施方式，所述混合在30℃-70℃的温度进行。
根据本发明的优选实施方式，所述混合在55℃-65℃的温度进行。
根据本发明的一些实施方式，所述混合的时间为0.5-5小时。
根据本发明的优选实施方式，所述混合的时间为1-3小时。
根据本发明的优选实施方式，所述混合的时间为1.5-2.5小时。
根据本发明的一些实施方式，所述混合通过磁力搅拌进行。
根据本发明的一些实施方式，所述制备方法还包括步骤2)：将包含神经酰胺磷脂复合物的反应混合物干燥，除去有机溶剂，得到所述神经酰胺磷脂复合物。
根据本发明的一些实施方式，所述干燥通过旋蒸干燥进行。
根据本发明的一些实施方式，所述神经酰胺选自神经酰胺I、神经酰胺II、神经酰胺Ⅲ和神经酰胺VI中的至少一种。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺选自神经酰胺ⅢA和神经酰胺ⅢB。神经酰胺Ⅲ含非羟基化脂肪酸链，是修复皮肤屏障的重要脂质成分。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺为神经酰胺ⅢB。
根据本发明的一些实施方式，所述磷脂为天然磷脂和/或合成磷脂。
根据本发明的优选实施方式，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酸中的一种或几种，优选为由磷脂酰胆碱和选自磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酸中的一种或几种组成。
根据本发明的优选实施方式，所述磷脂为磷脂酰胆碱。
由于神经酰胺ⅢB与磷脂结合的分子间作用力在能电离的溶剂中易被打破，选择在适宜的有机溶剂(不易电离)中进行反应。根据本发明的一些实施方式，所述有机溶剂选自乙醇、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、丁酮、正丁醇、二氧六烷和异丙醇中的一种或几种。
根据本发明的优选实施方式，所述有机溶剂为乙醇。
根据本发明的一些实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：(0.5-20)。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：(1-8)。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：(5.5-6.5)。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：6。
根据本发明的一些实施方式，所述神经酰胺在有机溶剂中的浓度为10mg/ml-40mg/ml。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺在有机溶剂中的浓度为10mg/ml-25mg/ml。
根据本发明的优选实施方式，所述神经酰胺在有机溶剂中的浓度为18-20mg/ml。
在第三个方面，本发明提供了一种根据第一个方面所述的神经酰胺磷脂复合物或根据第二个方面所述的制备方法得到的神经酰胺磷脂复合物在药物或化妆品中的应用。
本发明通过采用磷脂复合技术，采用环保、简单、高效的制备工艺，提高神经酰胺的溶解性、透皮吸收能力，增加其生物利用度。神经酰胺磷脂复合物提高了神经酰胺在油相配方中的溶解量，增加了神经酰胺的皮肤滞留量，增强了神经酰胺屏障修复的功效。
附图说明
图1显示了不同反应时间对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响。
图2显示了不同反应温度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响。
图3显示了不同投料比对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响。
图4显示了不同神经酰胺IIIB浓度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响。
图5显示了不同时间段内神经酰胺IIIB和根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的累积透过率。
图6为考察根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物乳液、神经酰胺与磷脂的物理混合物乳液以及空白乳液的刺激性的鸡胚绒毛尿囊膜实验结果图。
图7显示了乳液制备过程中物理混合物(左)和根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物(右)在油相中的溶解情况。
图8显示了志愿者使用根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物乳液前后水分含量的变化情况。
图9显示了志愿者使用根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物乳液前后水分散失的变化情况。
图10显示了志愿者使用不同乳液后不同时间段里水分含量的变化情况，其中bare是空白乳液，pc指添加磷脂的乳液，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图11显示了志愿者使用不同乳液后不同时间段里水分散失的变化情况，其中bare是空白乳液，pc指添加磷脂的乳液，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图12显示了两名志愿者分别使用根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物乳液后不同时间段内Slat变化值的变化情况。
图13显示了30min时不同皮肤深度下Slat变化值的变化情况，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图14显示了90min时不同皮肤深度下Slat变化值的变化情况，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图15显示了180min时不同皮肤深度下Slat变化值的变化情况，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图16是一名志愿者在使用根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液前后皮肤深度3μm下拉曼光谱的对比图。
图17显示了使用根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物乳液后志愿者皮肤不同深度下皮肤脂质峰面积的变化情况。
图18显示了30min时使用不同乳液后志愿者皮肤不同深度下皮肤脂质峰面积的变化情况，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图19显示了90min时使用不同乳液后志愿者皮肤不同深度下皮肤脂质峰面积的变化情况，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
图20显示了180min时使用不同乳液后志愿者皮肤不同深度下皮肤脂质峰面积的变化情况，pm指添加物理混合物的乳液，cerpc指添加根据本发明的一个实施方式的神经酰胺磷脂复合物的乳液。
具体实施方式
本发明通过以下实施例详细描述本发明，可使本专业技术人员更全面的理解本发明，但这些实施例并不对本发明的范围构成任何限制。
以下制备例和实施例中所用的磷脂均为磷脂混合物A，其由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酸组成，其中磷脂酰胆碱>50wt％。
制备例1
神经酰胺磷脂复合物：以摩尔比为1:6分别加入神经酰胺IIIB和磷脂混合物A，加入一定体积的无水乙醇使神经酰胺IIIB的浓度为20mg/ml，在反应温度为60℃、反应时间为2h的条件下进行磁力搅拌；将磁力搅拌后的产物旋蒸干燥，除去溶剂无水乙醇，加入惰性溶剂正己烷至干燥后的产物溶解，过滤除去未复合的神经酰胺IIIB，干燥除去正己烷，最终得到神经酰胺磷脂复合物。
制备例2
物理混合物：以摩尔比为1:6分别加入神经酰胺IIIB粉末和磷脂混合物A，室温下研磨15min，制备神经酰胺与磷脂的物理混合物。
实施例1反应时间对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响
以摩尔比为1:3分别加入神经酰胺IIIB和磷脂混合物A，加入一定体积的无水乙醇使神经酰胺IIIB的浓度为25mg/ml，在反应温度为40℃的条件下进行磁力搅拌，反应的时间分别为0.5h、1h、2h和3h；将磁力搅拌后的产物旋蒸干燥，除去溶剂无水乙醇，加入惰性溶剂正己烷至干燥后的产物溶解，溶解磷脂酰胆碱和神经酰胺磷脂复合物，过滤除去未复合的神经酰胺IIIB，干燥除去正己烷，最终得到不同反应时间的神经酰胺磷脂复合物。
反应时间对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响结果如图1所示。
实施例2反应温度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响
以摩尔比为1:3分别加入神经酰胺IIIB和磷脂混合物A，加入一定体积的无水乙醇使神经酰胺IIIB的浓度为25mg/ml，反应的时间为1h，在反应温度分别为30℃、40℃、50℃和60℃的条件下进行磁力搅拌；将磁力搅拌后的产物旋蒸干燥，除去溶剂无水乙醇，加入惰性溶剂正己烷至干燥后的产物溶解，过滤除去未复合的神经酰胺IIIB，干燥除去正己烷，最终得到不同反应温度下的神经酰胺磷脂复合物。
反应温度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响结果如图2所示。
实施例3神经酰胺IIIB与磷脂投料比对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响
以摩尔比分别为1:1、1:2、1:3、1:6和1:8的投料比分别加入神经酰胺IIIB和磷脂混合物A，加入无水乙醇使神经酰胺IIIB的浓度保持为25mg/ml，在反应温度为40℃、反应时间为1h的条件下进行磁力搅拌；将磁力搅拌后的产物旋蒸干燥，除去溶剂无水乙醇，加入惰性溶剂正己烷至干燥后的产物溶解，过滤除去未复合的神经酰胺IIIB，干燥除去正己烷，最终得到不同投料比条件下的神经酰胺磷脂复合物。
反应温度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响结果如图3所示。投料比在1:3时磷脂复合物的复合率已超过80％，而磷脂量加入过多则会导致磷脂复合物易黏壁，且在化妆品配方中添加过多的磷脂会影响产品的乳化体系、外观和肤感。
实施例4神经酰胺浓度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响
以摩尔比为1:3分别加入神经酰胺IIIB和磷脂混合物A，加入无水乙醇使神经酰胺IIIB的浓度分别10mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL，在反应温度为40℃、反应时间为1h的条件下进行磁力搅拌；将磁力搅拌后的产物旋蒸干燥，除去溶剂无水乙醇，加入惰性溶剂正己烷至干燥后的产物溶解，过滤除去未复合的神经酰胺IIIB，干燥除去正己烷，最终得到不同神经酰胺浓度下的神经酰胺磷脂复合物。
神经酰胺浓度对神经酰胺磷脂复合物的复合率的影响的结果如图4所示。神经酰胺浓度为25mg/mL时磷脂复合物的复合率已超过90％。
实施例5：溶解性和表观油水分配系数检测
分别检测神经酰胺IIIB、制备例1所得的神经酰胺磷脂复合物和制备例2所得的神经酰胺与磷脂的物理混合物的溶解性和表观油水分配系数，结果如表1所示。
溶解度的检测方法：将过量的神经酰胺IIIB、神经酰胺IIIB与磷脂的物理混合物、神经酰胺磷脂复合物分别置于含有5.0mL的水或5.0mL的正辛醇的EP管中，将EP管在150rpm下、37℃中恒温振荡5h，在离心机中以5000rpm的转速离心10min，吸取上清液1.0mL并稀释一定的倍数后使用HPLC-ELSD进样分析。
表观油水分配系数的检测方法：取等体积的正辛醇和蒸馏水在分液漏斗中混合，48h相互饱和、静置分层，其中上层为水饱和的正辛醇溶液，下层为正辛醇饱和的水溶液。在5.0mL水饱和的正辛醇溶液中分别加入过量的神经酰胺IIIB、神经酰胺IIIB与磷脂的物理混合物、神经酰胺磷脂复合物，再加入5.0mL正辛醇饱和的水溶液，在150rpm下、37℃中恒温振荡5h，在离心机中以5000rpm的转速离心10min，吸取上清液1.0mL并稀释一定的倍数后使用HPLC-ELSD进样分析。表观油水分配系数的计算公式为P＝log Co/Cw，其中Co表示水饱和正辛醇溶液中神经酰胺IIIB浓度，Cw表示正辛醇饱和水溶液中神经酰胺IIIB浓度。
表1
Figure BDA0002122460270000081
实施例6：透皮吸收能力检测
透皮吸收能力的检测方法：透皮吸收能力测定实验使用SKBM02560人工膜，经皮渗透范围为直径1.0cm的圆形区域，透皮扩散仪的上池是圆柱形结构，存放供给液，下部的腔室为接收槽，以潜水式电磁搅拌器维持接收池的动态环境。供给液用GTCC溶解神经酰胺IIIB及神经酰胺IIIB磷脂复合物，接受液采用接近皮肤生理环境的生理盐水(含15.0％乙醇)，实验组为含制备例1制备的神经酰胺磷脂复合物的供给液，对照组为含神经酰胺IIIB的供给液。接收池中精密加入6.0mL接受液，在37℃恒温水浴以400r/min进行恒速电磁搅拌；取供给液2.0mL(含28.5mg神经酰胺IIIB)于供给池中，于1、2、4、8、16、24h时，分别准确地吸取0.6mL接受槽中的溶液(补加等量37℃的生理盐水)，稀释一定倍数后，用0.22μm微孔滤膜过滤，神经酰胺IIIB浓度通过HPLC-ELSD的方法测定，并求算累积渗透率Qn(％)。
检测神经酰胺磷脂复合物和神经酰胺IIIB透过人工脂质膜
Figure BDA0002122460270000093
的量。
不同时间段内神经酰胺及其神经酰胺磷脂复合物透过人工脂质膜后进入接受液的含量表2和图5所示。
表2
Figure BDA0002122460270000091
-表示ELSD未检测到相关信号
实施例7：刺激性检测
按照表3所示配方配置制备例1的神经酰胺磷脂复合物、制备例2的神经酰胺与磷脂的物理混合物和磷脂的乳液。
表3
Figure BDA0002122460270000092
Figure BDA0002122460270000101
通过鸡胚绒毛尿囊膜实验考察神经酰胺磷脂复合物、物理混合物的乳液及空白乳液的刺激性。
鸡胚绒毛尿囊膜实验的操作方法：采用10日龄受精鸡胚作为实验样品，将0.3mL测试样品作用于鸡胚尿囊膜，作用3min后观察尿囊膜血管损伤，并对不同的血管效应或血管损伤程度进行评分，客观地体现人体眼刺激性反应。
采用终点评价法结果评分方法进行评分：计算终点评分(ES)，每只鸡胚记分＝每只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的和；ES＝6只鸡胚得分的数学总和。根据ES数值按表对受试物眼刺激性进行分类。
终点评价法结果评分方法如表4所示。
表4
Figure BDA0002122460270000102
刺激性试验结果表明三种乳液对皮肤均无刺激或轻度刺激性，如图6所示，相比于阳性对照的中度出血，神经酰胺磷脂复合物、物理混合物的乳液及空白乳液的终点评分ES值为7分、6分、6分，在无刺激或轻度刺激性的范围内，可正常地应用于后续的样品制作中。
实施例8：配方承载量检测
神经酰胺IIIB在常温下不溶于辛酸/癸酸甘油三酯，仅在熔融态下可溶。1g神经酰胺磷脂复合物在60℃时加热搅拌即可溶解于7g GTCC，冷却后无明显浑浊现象；而1g相同比例的物理混合物需在75℃时才可完全溶解于7g GTCC，但冷却后溶液出现浑浊。如图7所示，表明神经酰胺磷脂复合物提高了神经酰胺IIIB在乳液配方中的溶解性，且不易析出，而物理混合物则会在乳液制备过程中有神经酰胺IIIB析出的情况。当神经酰胺磷脂复合物的量超过2g时，搅拌后神经酰胺磷脂复合物难以完全溶解，可能是磷脂在GTCC中的溶解量已达到饱和。
实施例9：人体功效评价
招募5名志愿者，使用CorneometerCM825、TewameterTM300、XploRA INV拉曼光谱仪检测皮肤水分含量、经皮水分散失、脂质侧向堆积顺序、乳液的角质层滞留量等指标，评价神经酰胺磷脂复合物乳液、物理混合物乳液、添加磷脂的空白乳液及空白乳液的修复屏障的效果。
(1)皮肤水分含量、经皮水分散失检测
志愿者纳入要求：皮肤菲茨里克分型为Ⅱ、Ⅲ型，无皮肤病史，实验前72h内手臂处不能使用身体乳等护肤品，8h内不能洗澡。
测试流程：首先清洗手臂内侧，在恒温(23±2℃)、恒湿(20±3％)的环境中静坐20min后开始测试，先将水分含量或水分散失探头轻轻平放在志愿者手臂内侧的皮肤上，开始采集皮肤数据，水分含量采集五次数据取平均值，水分散失数据采集一次。
5名志愿者在使用神经酰胺磷脂复合物乳液前后水分含量、水分散失的变化情况如图8和图9所示。
5名志愿者使用不同样品乳液后水分含量、水分散失的变化情况如图10和图11所示(图10和图11的数据已减去未抹样时的水分含量和水分散失值)。
采用配对样本T检验分析使用神经酰胺磷脂复合物乳液前后皮肤生理指标变化，采用单因素方差分析检验比较不同添加物乳液的皮肤生理指标变化。结果表明各时间段使用神经酰胺磷脂复合物乳液后志愿者皮肤的水分含量相比有显著性提高(p<0.01)，而与使用30min后水分散失相比有显著性降低(p<0.05)，其余时间段均有下降趋势。在使用不同乳液后水分含量、水分散失的比较中，神经酰胺磷脂复合物乳液相比空白乳液及添加磷脂的乳液，在各时间段内水分含量显著提高(p<0.05)，整体水分含量的变化值也优于物理混合物乳液，但各样品乳液在水分散失的比较中均无显著差异，整体上相比与空白乳液及添加磷脂的乳液，神经酰胺磷脂复合物乳液使用后水分散失呈下降趋势，且在涂样30min时水分散失的降低程度优于物理混合物乳液。
(2)脂质侧向堆积顺序检测
检测方法：将手持探头轻轻平放在志愿者手臂内侧的皮肤上，寻找皮肤零点位置，调整Z轴位置，寻找清晰画面，但皮肤表面的确定是根据最终拍摄的光谱中1600-1700cm-1角蛋白峰强度一半所在皮肤深度，打开激光，调整功率至建议最大功率72％，开始拍摄。比值2880cm-1/2850cm-1代表脂质侧向堆积的排列顺序，用Slat表示。相比于未涂抹神经酰胺磷脂复合物乳液时，抹样后Slat值在皮肤深度6μm及15μm处增加，表明脂质排列的紧密程度更高，降低了脂质间的流动性。
其中两名志愿者涂抹神经酰胺磷脂复合物乳液后在不同时间段内Slat值的变化情况如图12所示，Slat变化值>0时有利于增加皮肤脂质排列的紧密程度。
由图13-15可以看出，90min时磷脂复合物乳液在皮肤深度6μm处Slat变化值显著高于物理混合物乳液(p＝0.019)(图14)。180min时磷脂复合物乳液在皮肤深度6μm、15μm处Slat变化值高于物理混合物乳液(p＝0.067、0.060)(图15)。因此，相比于物理混合物乳液，磷脂复合物乳液促进皮肤深度6μm下屏障功能的同时，有助于角质层与颗粒层连接处(15μm)脂质堆积的有序化，减少皮肤深层水分、营养成分流失。
(3)乳液的角质层滞留量检测
一名志愿者在使用磷脂复合物乳液前后皮肤深度3μm下的皮肤脂质相关拉曼信号峰变化情况的对比图如图16所示，在2800-3000cm-1范围内使用样品后脂质峰的信号明显增强，而这种变化是由涂抹磷脂复合物乳液后导致的，表明磷脂复合物乳液已渗透到该皮肤深度下，由此，可依据2820-2900cm-1/2910-2965cm-1脂质峰与角蛋白峰面积比(后续用脂质峰面积表示)的变化来分析磷脂复合物乳液在皮肤中的滞留情况。
检测方法同脂质侧向堆积顺序的检测。志愿者使用神经酰胺磷脂复合物乳液后不同时间段皮肤脂质峰面积的变化情况如图17所示，志愿者使用添加不同添加物乳液后在30min、90min、180min时皮肤脂质峰面积在不同皮肤深度下的变化情况的比较如图18-20所示，数据已减去0min的数值。
由图17分析可知，30min时皮肤表面到6μm下的位置渗透量较高，随着时间的变化，12-18μm深度下乳液的渗透量逐渐增加。
由图18分析可知，30min时磷脂复合物乳液在6μm、15μm处脂质峰面积高于物理混合物乳液(p＝0.065，p＝0.078)，可能是由于磷脂包覆着神经酰胺增加了乳液在皮肤中的滞留量。
由图19和图20分析可知，90min、180min时神经酰胺磷脂复合物乳液与物理混合物乳液相比，两者的脂质峰面积的变化值无明显差异。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (12)

1.一种神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其包括步骤1）：将神经酰胺和磷脂在有机溶剂中进行混合，混合温度为30℃-80℃，混合时间为0.5-5小时，得到包含神经酰胺磷脂复合物的反应混合物；步骤2）：将包含神经酰胺磷脂复合物的反应混合物干燥，除去有机溶剂，得到所述神经酰胺磷脂复合物；
所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：（3-8）；
所述神经酰胺在有机溶剂中的浓度为10mg/mL-25mg/mL；
所述神经酰胺为神经酰胺ⅢB；
所述磷脂由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酸组成，其中磷脂酰胆碱>50wt％。
2.根据权利要求1所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：（5.5-6.5）。
3.根据权利要求1所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述神经酰胺与磷脂的摩尔比为1：6。
4.根据权利要求1所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述神经酰胺在有机溶剂中的浓度为18mg/mL-22mg/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醇、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、丁酮、正丁醇、二氧六烷和异丙醇中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
7.根据权利要求1-4、6中任一项所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述混合温度为30℃-70℃；和/或所述混合的时间为1-3小时；和/或所述混合通过磁力搅拌进行。
8.根据权利要求7所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法，其特征在于，所述混合温度为55℃-65℃；和/或所述混合的时间为1.5-2.5小时。
9.一种由权利要求1-8中任一项所述的神经酰胺磷脂复合物的制备方法制备得到的神经酰胺磷脂复合物。
10.根据权利要求9所述的神经酰胺磷脂复合物，其特征在于，在37℃，150rpm振荡5h后，所述神经酰胺磷脂复合物在正辛醇中的溶解度为2-5mg/mL；其表观油水分配系数为1.5-3。
11.根据权利要求9所述的神经酰胺磷脂复合物，其特征在于，在37℃，150rpm振荡5h后，所述神经酰胺磷脂复合物在正辛醇中的溶解度为3-4mg/mL；其表观油水分配系数为1.5-2。
12.一种根据权利要求10-11中任一项所述的神经酰胺磷脂复合物或根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法得到的神经酰胺磷脂复合物在制备药物或化妆品中的应用。
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