CN112180081A - 一种小分子免疫层析检测方法以及试纸条和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于小分子检测领域，涉及一种小分子免疫层析检测方法以及试纸条和试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)待检测物与标记抗体的混合物在层析作用下在层析试纸上流动，依次经过检测区和质控区；所述标记抗体为抗目标小分子的抗体且标记有信号物质；所述检测区固定设置有抗原，所述抗原为具有修饰蛋白的目标小分子的衍生物；所述质控区固定设置有对应所述标记抗体的二抗；(2)根据所述检测区与所述质控区的信号强度获得所述待检测物中目标小分子的含量。本发明实现了在免疫层析体系下对地西泮小分子检测的信号分析，完善了地西泮检测技术手段，利于将免疫层析检测技术进一步应用于实践。

Description

一种小分子免疫层析检测方法以及试纸条和试剂盒
技术领域
本发明属于小分子检测领域，具体地，涉及一种小分子免疫层析检测方法、一种小分子免疫层析检测试纸条以及一种小分子免疫层析检测试剂盒。
背景技术
基于色谱分离原理的免疫层析试纸，在小分子检测领域的测定原理是将待测物特异性抗原预先固定到试纸测定区。在毛细管力作用下，样品中的待测小分子与标记抗体流动到测定区位置，固定化抗原与溶液中待测物竞争结合溶液中标记抗体。测定区信号强度与待测小分子含量呈反比。
由于测定迅速、成本低廉、信号响应直观，易于现场使用，基于传统结构的免疫层析检测法在食品安全、临床医疗等多个领域已经得到越来越广泛的应用。
一些药物诸如兽药，由于使用过重的不规范，导致禁止检出指标仍时有检出，具有较大的潜在危害。比如，地西泮在水产品中的过量使用，会导致食用人群产生神经精神症状。因此，需要开发针对地西泮的快速、准确的检测方法，目前尚未见采用免疫层析检测方法对地西泮的检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子地西泮的免疫层析检测方法及检测试纸条和检测试剂盒。该检测方法灵敏，并可以实现不同信号响应元件的检测，应用范围广，利于为小分子检测提供更多样化的技术选择，具有广阔的市场前景。
为了实现上述目的，本发明提供一种小分子免疫层析检测方法，包括以下步骤：
(1)待检测物与标记抗体的混合物在层析作用下在层析试纸上流动，依次经过检测区和质控区；所述标记抗体为抗目标小分子的抗体且标记有信号物质；所述检测区固定设置有抗原，所述抗原为具有修饰蛋白的目标小分子的衍生物；所述质控区固定设置有对应所述标记抗体的二抗；
(2)根据所述检测区与所述质控区的信号强度获得所述待检测物中目标小分子的含量。
本发明中，待测物与标记抗体的混合物在层析作用下在层析试纸流动，到达检测区时待检小分子和检测区固定化的抗原竞争竞争结合标记抗体，若待测物中含有目标小分子，则混合物经过检测区时产生较弱或者无标记信号检出；若待测样中不含有小分子，则在检测区可检出明显的标记信号。通过检测区和质控区的信号强度判断待检测物中小分子物质的含量，更准确，更灵敏。
根据本发明，优选地，所述信号物质选自荧光化合物、荧光量子点、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金、基于胶体金或者金核银壳材料作为表面增强拉曼检测的材料或酶中的任意一种。
根据本发明的检测方法，所述修饰蛋白优选为通用识别性蛋白，通用识别性蛋白作为待测小分子的结合物质，应用范围广。具体地，所述修饰蛋白可以为卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)或鸡卵白蛋白(THY)。
本发明的方法可用于检测各种满足本发明原理的目标小分子。例如，镇静剂，如地西泮(diazepam，DAP)；化学染料，如孔雀石绿；农药，如有机磷类农药；兽药，如氯霉素类药物、四环素类药物；添加剂，如三聚氰胺；真菌毒素，如黄曲霉类毒素和单端孢霉烯族类毒素等小分子，可用于食品安全、临床诊断等领域。
根据本发明一种具体实施方式，所述目标小分子为地西泮；所述抗体的标记材料为胶体金(GNP)。
根据本发明的方法，优选地，步骤(1)中，所述混合物中含有缓冲液，所述缓冲液的组成包括：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1-4％，果糖3-7％，PEG 1-3％，Tween-20 1-5％。
根据本发明的方法，优选地，孵育体系中，所述标记抗体的浓度为0.2-0.8mg/mL。
本发明提供的检测方法可以根据试验情况，制备不同材料信号响应下的标准曲线图，并根据不同材料的信号响应强度判断小分子的含量。
本发明的第二方面提供一种小分子免疫层析检测试纸条，该试纸条包括样品垫、吸水垫和固定有硝酸纤维膜的底板，所述样品垫和所述吸水垫设置于所述底板上且分别位于所述硝酸纤维膜的两侧；其中，
所述样品垫用于承载待检测物和标记抗体的混合物；所述标记抗体为抗目标小分子的抗体且标记有信号物质；
所述硝酸纤维膜设置有检测区和质控区；所述检测区固定设置有抗原，所述抗原为具有修饰蛋白的目标小分子的衍生物；所述质控区固定设置有对应所述标记抗体的二抗。
本发明的试纸条中，所述信号物质、所述修饰蛋白、所述目标小分子如前所述，在此不再赘述。本发明对试纸条上各组分的量并无特别限定，本领域技术人员可基于本发明的原理并根据实际需要确定。
在对待测物检测时，含有待测小分子的待检物、标记抗体混合得到的混合物加入层析试纸，经吸水垫的吸水力，混合物进入反应区，若待测样中含有待测小分子，在检测区待测小分子与包被抗原竞争结合标记抗体上的结合位点。待测小分子含量越高，与包被原结合的标记抗体越少，得到的标记分子信号越弱。通过对检测区和质控区的标记材料信号强度判断待检测物中待测小分子的含量，同时可以消除层析时间、温度等因素的干扰；而若待测物中不含有待测小分子，则在检测区可以检出明显的标记分子信号。本发明提供的小分子检测试纸条，为小分子检测提供便利。
本发明中，所述底板可以为不吸水材料，PVC或其它硬质材料；样品垫可以为吸滤纸或玻璃纤维膜；吸水垫可以为吸水纸。
另外，本发明中，术语“检测区”和“质控区”仅是用于功能性区分，所述“区”的形式可以为“线”或具有一定几何形状的“区域”。根据本发明一种具体实施方式，所述检测区和质控区以检测线和质控线的形式存在。
本发明的第三方面提供一种小分子免疫层析检测试剂盒，该试剂盒包括：
上述小分子免疫层析检测试纸条；
孵育液，所述孵育液的组成如下：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1-4％，果糖3-7％，PEG 1-3％，Tween-20 1-5％；以及，
任选的目标小分子的标准曲线图卡片，便于参照标准曲线图得到小分子的含量。
本发明中，术语“目标小分子”、“待测小分子”的含义相同，均指想要检测的小分子。术语“待测样品”、“待测物”指检测的对象。
根据本发明一种具体实施方式，以待测小分子为DAP，修饰蛋白为BSA，信号分子为GNP为例，在实际检测中，随着层析过程的进行，发生下列反应：
待测小分子DAP、GNP标记抗体混合得到混合物，所述标记抗体为抗DAP抗体，所述抗原为DAP与修饰蛋白BSA形成的衍生物(DAP-BSA)，作为检测物T线与待测小分子DAP竞争结合GNP修饰抗体表面的结合位点；
所述混合物依次经过检测区和质控区，所述检测区固定设置有待测小分子与修饰蛋白形成的衍生物(DAP-BSA)，所述质控区固定设置有对应所述标记抗体的二抗(goatanti-mice antibody)；
根据所述检测区与所述质控区的信号强度判断所述待检测物中小分子DAP的含量。
溶液中一定含量的待测小分子DAP与检测区抗原竞争结合标记抗体GNP-DAP-mAb上结合位点，溶液中待测小分子DAP含量越多；GNP-DAP-mAb-DAP-BSA越少，检测区可视化信号越弱；即待测物含量与检测区信号强度呈反比；质控区的羊抗鼠二抗与标记抗体结合；由于检测区标记抗体含量的多少决定可视化信号响应的强度，且检测区信号的强度与待测小分子含量呈反比，质控区可视化信号与待测小分子含量呈正比，通过对比检测区信号的相对强度判断待测小分子的含量。
本发明提供的小分子地西泮免疫层析检测试纸，通过对抗体的标记实现对待测物的检测；在检测区实现“竞争”结合反应，检测区与质控区位于硝酸纤维膜垫上，与试纸长轴垂直分布，检测区包被可识别标记抗体的抗体，即经BSA修饰的小分子衍生物(DAP-BSA)；质控区包被对应标记抗体的二抗如羊抗鼠二抗(goat anti-mice antibody)。
与现有小分子检测技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明中，实现了在免疫层析体系下对地西泮小分子检测的信号分析，完善了地西泮检测技术手段，利于将免疫层析检测技术进一步应用于实践。
(2)本发明可用于食品安全、临床诊断、检验检疫等诸多领域，具有广阔的市场前景。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明实施例1涉及的小分子地西泮胶体金检测试纸条的原理示意图；
图2为本发明实施例2中的基于不同标记材料的标准曲线图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
地西泮的抗体(anti-DAP-mAb)通过如下方法制备得到：首先对DAP进行羧基化改造，进一步通过活性酯法与BSA偶联获得完全抗原DAP-BSA。通过对动物的免疫获取分泌抗体的细胞，与瘤细胞融合后进一步优选细胞株。将优选的细胞株注入小鼠腹腔获得含抗体的腹水，纯化后得到DAP的高特异性抗体。
实施例1
本实施例以检测地西泮为例说明本发明检测试纸条的制备。修饰蛋白选用BSA，检测区包被元件选用DAP-BSA，标记抗体信号物质选用胶体金(GNP)。
试纸条的制备方法包括以下步骤：
1)NC膜检测区包被DAP-BSA，包被过程如下：用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液(甲醇含量15％)将DAP-BSA稀释到0.5mg/ml，用Isoflow喷金划膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的检测区，包被量为1.0μl/cm；将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
2)NC膜质控区包被羊抗鼠二抗(goat anti-mice antibody)，包被过程如下：用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液与甲醇的混合液(甲醇含量15％)将羊抗鼠二抗稀释为浓度0.5mg/mL，用Isoflow喷金划膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的质控区，包被量为1.0μl/cm；将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
3)制备标记抗体：将20nm胶体金(GNP)与待测物地西泮的抗体(anti-DAP-mAb)进行静电吸附，使二者实现非共价键结合，制得GNP标记的抗体(GNP-DAP-mAb)。
4)在底板上依次组装NC膜、玻璃纤维垫、吸水纸垫制备成试纸条；在2-8℃的环境中储存，有效期12个月。
实施例2
本实施例以地西泮的检测为例说明本发明的检测方法，以实施例1制得的试纸条进行试验：
制备标准曲线：
采用磷酸缓冲液将地西泮(diazepam，DAP)标准品制备为不同浓度的DAP溶液：1.28ng/mL、0.64ng/mL、0.32ng/mL、0.16ng/mL、0.08ng/mL、0.04ng/mL、0.02ng/mL、0.01ng/mL。所述磷酸缓冲液的浓度为0.05mol L-1，pH6.6(含蔗糖2％、果糖5％、PEG200001％、甲醇5％、Tween-20 1％)
将0.1μg/100μL DAP-BSA溶液与1mg/mL标记抗体GNP-DAP-mAb溶液的混合液加入玻璃纤维垫，经吸水垫的吸力作用，依次经过反应膜(NC膜)检测区和质控区，经过检测区时，标记抗体GNP-DAP-mAb与检测区DAP-BSA相结合；在检测区未被结合的标记抗体在经过质控区时与羊抗鼠二抗相结合。
溶液加入免疫层析试纸层析反应进行10min后用不同读数仪读取可视化，通过检测测定区与质控区显色条带的相对信号强度进行结果定量与可视化的半定量判读，分析记录结果。
得到的数据制得的标准曲线如图2所示。
从图2标准曲线计算可知，DAP胶体金可视化最低检测浓度为2.74ng mL-1。
实施例3
本实施例以水产品中DAP为例，说明利用本发明的方法对待检测样本进行检测，步骤如下：
待检测样本：鱼肉中加入DAP；加标浓度如表1所示。
实施例1制得的试纸平衡至室温。
DAP加标的匀浆鱼肉5g用5ml pH6.6 0.05mol L-1磷酸缓冲液(含蔗糖2％、果糖5％、PEG200001％、甲醇5％、Tween-20 1％)进行混合，混合物充分混匀后后静置30min，然后在4000转下离心10min，获得上清液作为待测液进行免疫层析过程。
通过检测试纸条测定区与质控区显色条带的信号相对强度进行结果定量判读。根据实施例2中获得的标准曲线，计算检测结果，如表1所示。
表1 DAP样品检测结果
加标浓度(ng mL<sup>-1</sup>) GNP-ICA(ng mL<sup>-1</sup>)<sup>a</sup>
样品1 1.3 1.1±0.08
样品2 2.5 2.5±0.13
样品3 5.0 4.6±0.38
a 均数 ± 标准差。
从表1检测结果可以看出，本发明提供的检测方法可实现对DAP的胶体金检测。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种小分子免疫层析检测方法，包括以下步骤：
(1)待检测物与标记抗体的混合物在层析作用下在层析试纸上流动，依次经过检测区和质控区；所述标记抗体为抗目标小分子的抗体且标记有信号物质；所述检测区固定设置有抗原，所述抗原为具有修饰蛋白的目标小分子的衍生物；所述质控区固定设置有对应所述标记抗体的二抗；
(2)根据所述检测区与所述质控区的信号强度获得所述待检测物中目标小分子的含量。
2.根据权利要求1所述的小分子免疫层析检测方法，其中，所述信号物质选自荧光化合物、荧光量子点、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金、基于胶体金或者金核银壳材料作为表面增强拉曼检测的材料或酶中的任意一种。
3.根据权利要求权利要求1所述的小分子免疫层析检测方法，其中，所述修饰蛋白为通用识别性蛋白，优选为卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鸡卵白蛋白。
4.根据权利要求权利要求1所述的小分子免疫层析检测方法，其中，所述目标小分子为镇静剂、化学染料、农药、兽药、添加剂和污染物中至少一种；优选为地西泮、孔雀石绿、有机磷类农药、氯霉素类药物、四环素类药物、三聚氰胺和黄曲霉类毒素中的至少一种。
5.根据权利要求权利要求1所述的小分子免疫层析检测方法，其中，步骤(1)中，所述混合物中含有缓冲液，所述缓冲液的组成包括：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1-4％，果糖3-7％，PEG 1-3％，Tween-20 1-5％；
所述混合物中，所述标记抗体的浓度为0.2-0.8mg/mL。
6.一种小分子免疫层析检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括样品垫、吸水垫和固定有硝酸纤维膜的底板，所述样品垫和所述吸水垫设置于所述底板上且分别位于所述硝酸纤维膜的两侧；其中，
所述样品垫用于承载待检测物和标记抗体的混合物；所述标记抗体为抗目标小分子的抗体且标记有信号物质；
所述硝酸纤维膜设置有检测区和质控区；所述检测区固定设置有抗原，所述抗原为具有修饰蛋白的目标小分子的衍生物；所述质控区固定设置有对应所述标记抗体的二抗。
7.根据权利要求6所述的小分子免疫层析检测试纸条，其中，所述信号物质选自荧光化合物、荧光量子点、生物素、放射性同位素、电子致密物质、胶体金、基于胶体金或者金核银壳材料作为表面增强拉曼检测的材料或酶中的任意一种。
8.据权利要求6所述的小分子免疫层析检测试纸条，其中，所述修饰蛋白为通用识别性蛋白，优选为卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鸡卵白蛋白。
9.据权利要求6所述的小分子免疫层析检测试纸条，其中，所述目标小分子为镇静剂、化学染料、农药、兽药、添加剂和污染物中至少一种；优选为地西泮、孔雀石绿、有机磷类农药、氯霉素类药物、四环素类药物、三聚氰胺和黄曲霉类毒素中的至少一种。
10.一种小分子免疫层析检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
权利要求6-9中任意一项所述的小分子三重免疫层析检测试纸条；
孵育液，所述孵育液的组成如下：以0.04-0.06mol/L磷酸盐缓冲液为基准，添加有以下重量百分数的物质：蔗糖1-4％，果糖3-7％，PEG 1-3％，Tween-20 1-5％；以及，
任选的目标小分子的标准曲线图卡片。
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