CN112180025A - 检测水果中叶菌唑残留量的方法 - Google Patents

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Abstract

检测水果中叶菌唑残留量的方法。本方法包括三步，第一步提取，第二步净化，第三步测定和结果计算。本发明用于检测苹果、小麦中叶菌唑残留量。

Description

检测水果中叶菌唑残留量的方法
技术领域
本发明涉及一种检测水果中叶菌唑残留量的方法。
背景技术
叶菌唑是一种三唑类杀菌剂，其通用名metconazole，化学名 (1RS,5RS,1RS,5SR)-5-(4-氯苯基)-2,2-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-环戊醇。杀虫机理是通过抑制麦角淄醇生物合成中C-14脱甲基化酶活性达到杀菌的目的。该药主要用于防治小麦壳针孢、穗镰刀菌、叶锈病、条锈病、白粉病、颖枯病；大麦矮形锈病、白粉病、喙孢属；黑麦喙孢属、叶锈病；燕麦冠锈病，小黑麦(小麦与黑麦杂交) 叶锈病、壳针孢。对壳针孢属和锈病活性优异。兼具优良的保护及治疗作用。对小麦的颖枯病特别有效，预防、治疗效果俱佳。广泛应用于小麦、大麦、燕麦、黑麦、小黑麦等作物。叶菌唑是新的、广谱内吸性杀菌剂，既可茎叶处理又可作种子处理，可在植物体内吸收传导起到灭菌效果。同时，该药还可与戊唑醇、克菌丹等多种杀菌剂混用，防治某些病害，具有对非靶标生物低毒，用量低而杀菌活性高，环境前景佳等特点，对玉米、油菜籽、大豆、草坪、果树等的叶、穗发生的诸多病害有很高的防除效果。因此该品种在国外得到广泛应用。
叶菌唑有肝癌毒性、急性毒性、发育毒性、及神经毒性，由于使用广泛，叶菌唑通过环境进入人体的几率大，对人的身体健康影响较大。叶菌唑的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱法、气液色谱法-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法等，但尚未见叶菌唑在水果中残留行为方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、准确的在苹果和葡萄中检测叶菌唑残留量的检测水果中叶菌唑残留量的方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种检测水果中叶菌唑残留量的方法，本方法包括三步，第一步提取，第二步净化，第三步测定和结果计算。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的第一步提取是取待检测的水果样品，切成小段或小块，置于离心管中，加入乙腈匀浆，加入NaCl，再次匀浆，离心。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的乙腈的加入比例为：每1000mg水果样品加入1ml的乙腈；所述的NaCl的加入比例为：每1克水果样品加入500mg的NaCl；
当苹果或葡萄样品为脱水果或葡萄时，切成小段或小块后，加入适量水充分浸润，时间为5～30min，然后再加入乙腈进行匀浆；
所述的离心的参数为5000r/min离心5min。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的第二步净化是第一步离心后，取上层乙腈相，置于装有基质分散固相萃取剂的离心管中，混匀，离心，取上清液，选取旋转蒸发仪进行50℃旋蒸，流动相定容，过0.22μm有机系滤膜，得样品液。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的基质分散固相萃取剂由乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷键合相(C18)和石墨化炭黑(GCB)组成，PSA、C18和GCB三者的用量比例为100mg： 50mg：10mg；每1ml乙腈相对应的PSA、C18和GCB三者的用量分别为100mg、50mg、10mg；
所述的离心的参数为：5000r/min离心5min。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的第三步测定和结果计算是进行定性和定量测定或定性测定或定量测定；
所述的定性测定是检测样品中目标化合物的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作液一致；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在叶菌唑；若上述两个条件不能同时满足，则判断样品中不含叶菌唑；
所述的定量测定是采用液相色谱-质谱联用仪对样品液进行检测，测得样品液中叶菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中叶菌唑含量，然后根据样品液所代表样品的质量计算得到待检测的苹果 /葡萄样品中叶菌唑残留量。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的标准工作液为叶菌唑的标准工作液；
所述的空白基质标准液为不含叶菌唑的样品经第一步、第二步处理后得到的样品液。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的液相色谱-质谱/ 质谱联用仪为Agilent 1260-6460-Agilent，USA，色谱柱为Eclipse plus C18，柱长50mm，内径2.1mm，粒径0.0018mm。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的液相色谱和质谱条件为：流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：0.002mL；离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：4KV(-)；脱溶剂温度：325℃；脱溶剂气流量：8L/min；雾化器压力：35psi；所用流动相为0.1％(体积百分比)甲酸水溶液-甲醇，洗脱方式为梯度洗脱；
所述的洗脱方式的时间(min)为0.00、0.1％甲酸水为90、甲醇(％)为10，时间(min)为2.00、0.1％甲酸水为20、甲醇(％) 为80，时间(min)为8.00、0.1％甲酸水为20、甲醇(％)为80，时间(min)为8.01、0.1％甲酸水为90、甲醇(％)为10，时间 (min)为10.、0.1％甲酸水为90、甲醇(％)为10；
叶菌唑检测方式为多重反应监测(MRM)，具体方式为MRM扫描参数，离子类型为母离子、子离子1、子离子2，母离子的m/z质核比为320、碰撞能量为0、碰撞电压为0、驻留时间(ms)为0、加速电压为0，子离子1的m/z质核比为,70、碰撞能量为40、碰撞电压为110、驻留时间(ms)为250、加速电压为3，子离子2的m/z质核比为125、碰撞能量为25、碰撞电压为110、驻留时间(ms)为250、加速电压为3。
所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的标准曲线是通过以下方法得到的：配制系列浓度的叶菌唑标准工作液，在与样品液的检测条件相同的条件下进行HPLC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；
所述的系列浓度的叶菌唑标准工作液的浓度依次为0.00001、 0.00005、0.0001、0.0005、0.0001mg/mL，由叶菌唑标准品配置而成。
有益效果
1.本发明操作简便、快速、分离效果好，准确度和精密度均能达到定量分析的要求，具有灵敏度高、重复性好、准确。
2.本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于苹果/葡萄中叶菌唑残留量的检测，叶菌唑的平均回收率分别为92.0％～96.8％和 90.5～95.1％，平均相对标准偏差(RSD)分别为1.0％～4.3％和1.7～3.1％，检出限分别为0.001mg/kg和0.001mg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好。
3.本发明方法能满足我国、美国、欧盟对叶菌唑在苹果/葡萄中安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。
具体实施方式
实施例1
一种检测水果中叶菌唑残留量的方法，本方法包括三步，第一步提取，第二步净化，第三步测定和结果计算。
实施例2
实施例1所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的第一步提取是取待检测的水果样品，切成小段或小块，置于离心管中，加入乙腈匀浆，加入NaCl，再次匀浆，离心。
实施例3
实施例2所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的乙腈的加入比例为：每1000mg水果样品加入1ml的乙腈；所述的NaCl的加入比例为：每1克水果样品加入500mg的NaCl；
当苹果或葡萄样品为脱水果或葡萄时，切成小段或小块后，加入适量水充分浸润，时间为5～30min，然后再加入乙腈进行匀浆；
所述的离心的参数为5000r/min离心5min。
实施例4
实施例1所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的第二步净化是第一步离心后，取上层乙腈相，置于装有基质分散固相萃取剂的离心管中，混匀，离心，取上清液，选取旋转蒸发仪进行50℃旋蒸，流动相定容，过0.22μm有机系滤膜，得样品液。
实施例5
实施例4所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的基质分散固相萃取剂由乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷键合相 (C18)和石墨化炭黑(GCB)组成，PSA、C18和GCB三者的用量比例为100mg：50mg：10mg；每1ml乙腈相对应的PSA、C18和GCB 三者的用量分别为100mg、50mg、10mg；
所述的离心的参数为：5000r/min离心5min。
实施例6
实施例1所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的第三步测定和结果计算是进行定性和定量测定或定性测定或定量测定；
所述的定性测定是检测样品中目标化合物的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作液一致；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在叶菌唑；若上述两个条件不能同时满足，则判断样品中不含叶菌唑；
所述的定量测定是采用液相色谱-质谱联用仪对样品液进行检测，测得样品液中叶菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中叶菌唑含量，然后根据样品液所代表样品的质量计算得到待检测的苹果/葡萄样品中叶菌唑残留量。
实施例7
实施例6所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的标准工作液为叶菌唑的标准工作液；
所述的空白基质标准液为不含叶菌唑的样品经第一步、第二步处理后得到的样品液。
实施例8
实施例6所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的液相色谱-质谱/质谱联用仪为Agilent 1260-6460-Agilent，USA，色谱柱为 Eclipse plus C18，柱长50mm，内径2.1mm，粒径0.0018mm。
实施例9
实施例8所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的液相色谱和质谱条件为：流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量： 0.002mL；离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：4KV(-)；脱溶剂温度：325℃；脱溶剂气流量：8L/min；雾化器压力：35psi；所用流动相为0.1％(体积百分比)甲酸水溶液- 甲醇，洗脱方式为梯度洗脱；
所述的洗脱方式见表1；
表1
Figure RE-GDA0002267433550000071
Figure RE-GDA0002267433550000081
叶菌唑检测方式为多重反应监测(MRM)，具体方式见表2
MRM扫描参数所示；
表2
Figure RE-GDA0002267433550000082
实施例10
实施例6所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，所述的标准曲线是通过以下方法得到的：配制系列浓度的叶菌唑标准工作液，在与样品液的检测条件相同的条件下进行HPLC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；
所述的系列浓度的叶菌唑标准工作液的浓度依次为0.00001、 0.00005、0.0001、0.0005、0.0001mg/mL，由叶菌唑标准品配置而成。
实施例11
上述实施例所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，本发明所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例12
上述实施例所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，本发明使用的仪器与试剂：
T18 Basic均质器(IKA，Germany)；Agilent 1260-6460液相色谱仪-质谱/质谱联用仪(Agilent，USA)；VORTEX4基本型旋涡混合器(IKA，Germany)；Z326离心机(Hermle，Germany)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂(40～60μm)、十八烷基硅烷键合相 (C18)净化剂(40～60μm)、石墨化炭黑(GCB)净化剂(120-400 目)均购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。
试剂：乙腈(HPLC级，Merke，Germany)；氯化钠为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
标准物质：叶菌唑(纯度99.5％)，购自上海安谱科学仪器有限公司。
苹果中叶菌唑残留量的检测
(1)样品前处理：取待检测的苹果样品，切成长度10mm左右的小段，充分混匀；称取处理好的小麦样品10000mg，加入10mL乙腈，匀浆1min，加入5000mg氯化钠，再次匀浆1min，3800r/min离心 5min；取上清液6mL，转移至装有6000mgPSA、0.3gC18和60mgGCB 的15mL离心管中，3000r/min涡旋1min，4℃5000r/min离心5min，取上清液5mL于10mL离心管中，40℃氮气吹干，加1mL的流动相溶解残渣，混匀，过220mm滤膜，得样品液，移入进样瓶中待 HPLC-MS/MS测定。
(2)基质标准工作溶液的配制：
基质标准工作溶液的配制：准确称取10±0.1mg标准品(叶菌唑) 于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，分别定容得1mg/mL标准储备液；分别移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容得到 0.01mg/mL混合标准中间液；将混合标准中间液用小麦基质空白逐步稀释配成浓度分别为0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.005mg/mL 的混合基质标准溶液。
苹果基质空白：不含叶菌唑的苹果样品，按苹果前处理方法处理得到的待进样液。
(3)液相色谱-质谱/质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定：
将上述配制的不同浓度梯度的标准工作液分别注入HPLC-MS/MS，以外标法进行叶菌唑含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品液注入HPLC-MS/MS进行测定，测得样品液中叶菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中叶菌唑含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中叶菌唑残留量。其中，色谱条件为：优选的，所述液相色谱-质谱/质谱联用仪为Agilent 1260-6460-Agilent，USA，色谱柱为Eclipse plus C18，柱长50mm，内径2.1mm，粒径0.0018mm。
所述液相色谱和质谱条件为：流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：0.002mL；离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：4KV(-)；脱溶剂温度：325℃；脱溶剂气流量：8000mL/min；雾化器压力：35psi；所用流动相为0.1％(体积百分比) 甲酸水溶液-甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱方式见表1。
流动相采用梯度洗脱方式，见表3所示。
表3
时间(min) 0.1％甲酸水 甲醇(％)
0.00 90 10
2.00 20 80
8.00 20 80
8.01 90 10
10 90 10
检测方式：叶菌唑检测方式为多重反应监测(MRM)，如表4所示。
表4
Figure RE-GDA0002267433550000111
所得到的标准工作曲线如表5所示。
表5叶菌唑的苹果基质标准曲线
Figure RE-GDA0002267433550000112
Figure RE-GDA0002267433550000121
加标回收率和重复性：
在不含叶菌唑的苹果中加入0.001、0.1和1mg/kg 3个浓度水平的叶菌唑标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见表6。
表6叶菌唑在中的回收率和重复性(n＝5)
Figure RE-GDA0002267433550000122
从表6中可以看出，在3个加标水平上，叶菌唑的平均回收率为88.45％～93.57％，平均相对标准偏差(RSD)为2.93％～5.52％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
灵敏度：
以实际添加样品的最低检测浓度为检出限，本实施例叶菌唑在苹果的检出限为0.002mg/kg。
实施例13
上述实施例所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，葡萄中叶菌唑残留量的检测,
(1)样品前处理：取待检测的葡萄样品，切成长宽高各10mm 左右的小块,充分混匀；称取处理好的苹果样品10000mg，加入5mL 蒸馏水，加入10mL乙腈，匀浆1min，加入5000mg氯化钠，再次匀浆1min，3800r/min离心5min；取上清液6mL，转移至装有 600mgPSA、300mgC18和60mgGCB的15mL离心管中，3000r/min 涡旋1min，4℃5000r/min离心5min，取上清液5mL于10mL离心管中，40℃氮气吹干，加1mL的流动相溶解残渣，混匀，过0.00022mm 滤膜，得样品液，移入进样瓶中待HPLC-MS/MS测定。
(2)标准工作溶液的配制：
基质标准工作溶液的配制：准确称取10±0.1mg标准品(叶菌唑) 于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，分别定容得1mg/mL标准储备液；分别移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容得到 0.01mg/mL混合标准中间液；将混合标准中间液用苹果基质空白逐步稀释配成浓度分别为0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.005mg/mL 的混合基质标准溶液。
苹果基质空白：不含叶菌唑的苹果，按苹果的前处理方法处理得到的待进样液为苹果基质空白。
(3)液相色谱-质谱/质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定：
操作步骤、色谱和质谱条件与上述苹果样品中叶菌唑的测定一致。
以葡萄基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表7所示
表7叶菌唑的苹果基质标准曲线
名称 保留时间(min) 回归方程 相关系数
叶菌唑 5.889 Y＝25349x+5513 0.9929
加标回收率和重复性：
在不含叶菌唑的葡萄中加入0.001、0.1和1mg/kg3个浓度水平的叶菌唑标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见表8。
表8苹果中叶菌唑的回收率和重复性(n＝5)
Figure RE-GDA0002267433550000141
从表8中可以看出，在3个加标水平上，叶菌唑的平均回收率为 90.32％～91.63％，平均相对标准偏差(RSD)为2.25％～3.85％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
灵敏度：
以实际添加样品的最低检测浓度为检出限，本实施例中叶菌唑在葡萄的检出限为0.002mg/kg。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是:本方法包括三步，第一步提取，第二步净化，第三步测定和结果计算。
2.根据权利要求1所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是: 所述的第一步提取是取待检测的水果样品，切成小段或小块，置于离心管中，加入乙腈匀浆，加入NaCl，再次匀浆，离心。
3.根据权利要求2所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是: 所述的乙腈的加入比例为：每1000 mg水果样品加入1ml的乙腈；所述的NaCl的加入比例为：每1克水果样品加入500mg的NaCl；
当苹果或葡萄样品为脱水果或葡萄时，切成小段或小块后，加入适量水充分浸润，时间为5～30min，然后再加入乙腈进行匀浆；
所述的离心的参数为5000r/min离心5min。
4.根据权利要求1所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是: 所述的第二步净化是第一步离心后，取上层乙腈相，置于装有基质分散固相萃取剂的离心管中，混匀，离心，取上清液，选取旋转蒸发仪进行50℃旋蒸，流动相定容，过0.22µm有机系滤膜，得样品液。
5.根据权利要求4所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是:所述的基质分散固相萃取剂由乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷键合相（C18）和石墨化炭黑（GCB）组成， PSA、C18和GCB三者的用量比例为100mg：50 mg：10mg；每1ml乙腈相对应的PSA、C18和GCB三者的用量分别为100mg、50mg、10mg；
所述的离心的参数为：5000r/min离心5min。
6.根据权利要求1所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是: 所述的第三步测定和结果计算是进行定性和定量测定或定性测定或定量测定；
所述的定性测定是检测样品中目标化合物的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作液一致；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准液的离子相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在叶菌唑；若上述两个条件不能同时满足，则判断样品中不含叶菌唑；
所述的定量测定是采用液相色谱-质谱联用仪对样品液进行检测，测得样品液中叶菌唑的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中叶菌唑含量，然后根据样品液所代表样品的质量计算得到待检测的苹果/葡萄样品中叶菌唑残留量。
7.根据权利要求6所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是: 所述的标准工作液为叶菌唑的标准工作液；
所述的空白基质标准液为不含叶菌唑的样品经第一步、第二步处理后得到的样品液。
8.根据权利要求6所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是:所述的液相色谱-质谱/质谱联用仪为Agilent 1260-6460- Agilent，USA，色谱柱为Eclipse plus C18，柱长50mm，内径2.1mm，粒径0.0018 mm。
9.根据权利要求8所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是: 所述的液相色谱和质谱条件为：流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：0.002mL；离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：4KV(-)；脱溶剂温度：325℃；脱溶剂气流量：8L/min；雾化器压力：35psi；所用流动相为0.1%（体积百分比）甲酸水溶液-甲醇，洗脱方式为梯度洗脱；
所述的洗脱方式的时间（min）为0.00、0.1%甲酸水为90、甲醇（%）为10，时间（min）为2.00、0.1%甲酸水为20、甲醇（%）为80，时间（min）为8.00、0.1%甲酸水为20、甲醇（%）为80，时间（min）为8.01、0.1%甲酸水为90、甲醇（%）为10，时间（min）为10.、0.1%甲酸水为90、甲醇（%）为10；
叶菌唑检测方式为多重反应监测（MRM），具体方式为 MRM扫描参数，离子类型为母离子、子离子1、子离子2，母离子的m/z质核比为320、碰撞能量为0、碰撞电压为0、驻留时间（ms）为0、加速电压为0，子离子1的m/z质核比为,70、碰撞能量为40、碰撞电压为110、驻留时间（ms）为250、加速电压为3，子离子2的m/z质核比为125、碰撞能量为25、碰撞电压为110、驻留时间（ms）为250、加速电压为3。
10.根据权利要求6所述的检测水果中叶菌唑残留量的方法，其特征是:所述的标准曲线是通过以下方法得到的：配制系列浓度的叶菌唑标准工作液，在与样品液的检测条件相同的条件下进行HPLC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；
所述的系列浓度的叶菌唑标准工作液的浓度依次为0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.0001mg/mL，由叶菌唑标准品配置而成。
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