CN112168785A - 熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途。发明人采用主动载药的方法制备了脂质体制剂，所述脂质体制剂包括脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，所述熊果酸位于脂质体膜内或者脂质体膜中。脂质体制剂可用于治疗肿瘤或者抗炎。相比于其被动载药脂质体，主动载药脂质具有更稳定，更缓释，更高的生物利用度。

Description

熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药剂学领域，具体为一种熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途。
背景技术
熊果酸是一种五环三萜类化合物中，与齐墩果酸是同分异构体(熊果酸分子结构见式I)，分子式为C30H48O3，分子量为456，主要存在于药用植物和水果的表皮，叶子，花朵及果实中。通过一系列比较成熟的提取，分离，纯化方法可以将熊果酸从植物中较纯地提取出来。
Figure BDA0002116806540000011
近几年有关熊果酸的抗癌症作用的研究和报道很多，癌症的种类包括乳腺癌，结肠癌，多发性骨髓癌，膀胱癌，胰脏癌,皮肤癌等。这些药效学实验基本都是直接考察药物在不同肿瘤细胞系上的效果，或用啮齿类动物模型(人来源的肿瘤细胞在裸鼠上建立的模型/小鼠来源肿瘤细胞在小鼠或大鼠上建立模型)得到的结果。熊果酸对不同肿瘤细胞的作用机制虽然不尽相同，但对某些肿瘤细胞都有抑制其增殖，促进其凋亡，除了本身抗癌作用外，熊果酸和其他药物合用往往可以增强其他药物的作用，起到协同的作用。
熊果酸是一种高脂溶性，低溶解度的药物，水溶液中的溶解度很低，这也是导致它在体内的生物利用度低的主要原因。因此很多研究都是通过制剂的手段提高其溶解度进而提高其生物利用度。目前研究较多的纳米给药体系，如固体分散体，纳米晶等剂型可以通过提高其在体内的溶出速度和溶解度来提高生物利用度。纳米晶虽然提高了药物的溶出速度，但药物本质上溶解度没有改变，其生物利用度提高不大；固体分散体通过改变药物晶形，从结晶型转变为无定性，使药物本身溶解度提高，虽然提高了几倍，但其溶解度仍小于0.7mg/mL。
其他有关熊果酸纳米载体的研究还尝试采用树枝状粒子,纳米粒，多孔硅纳米粒子，和脂质体等。但大部分制剂的稳定性尤其在体内的稳定性存在问题，进而影响其生物利用度。其中Tingting Zhao等报道了一种熊果酸脂质体，但由于熊果酸载在膜上，更准确地说是脂质混悬液，药物在体内的环境下很容易从脂质膜中析出，就失去了载体的作用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途，用于解决现有技术中熊果酸脂质体稳定性差的问题，提高药物的生物利用度，改变熊果酸的体内分布，使药物在肿瘤组织中富集。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种熊果酸脂质体制剂，包括脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，所述熊果酸位于脂质体膜内或者脂质体膜中。
进一步地，所述熊果酸脂质体制剂具体包括位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，所述熊果酸包封在所述脂质体内水相和脂质体膜中。位于所述脂质体内水相中的熊果酸可以以游离状态存在。也可以与熊果酸-钙复合物形式存在。或者，部分熊果酸以所述游离状态、部分以熊果酸-钙复合物形式存在。进一步地，所述内水相包括醋酸钙水溶液。
进一步地，所述醋酸钙水溶液醋酸钙的浓度可以是25～500mM。所述醋酸钙水溶液醋酸钙的浓度可以200～500mM。所述醋酸钙水溶液醋酸钙的浓度可以300～500mM。所述醋酸钙水溶液醋酸钙的浓度可以是200～300mM。
进一步地，所述醋酸钙水溶液的pH为7～9。更优选地，pH为8。
进一步地，所述内水相中还包括环糊精。优选为β-环糊精，更优选为羟丙基-β-环糊精。
进一步地，所述内水相中环糊精的浓度为4～7％，更优选为5％。
进一步地，所述外水相包括三羟甲基氨基甲烷。较佳地，所述外水相的pH为7～9。
进一步地，所述脂质体粒径在50-100nm之间，PDI在0.05-0.1之间。进一步地，所述PDI为0.058～0.078。
本发明的另外一个方面提供了上述熊果酸脂质体制剂的制备方法，所述方法为采用主动载药的方法。
进一步地，所述方法具体包括以下步骤：
1.制备内水相含有醋酸钙溶液，外水相含有三羟甲基氨基甲烷的空白脂质体；
2.将空白脂质体与熊果酸-二甲双胍复盐混合，震荡，除去游离药物，加入含有外水相溶剂稀释。
进一步地，所述熊果酸-二甲双胍复盐可以采用以下方法制备：将熊果酸和二甲双胍在溶剂中混匀，搅拌，蒸发。例如具体可以采用以下方法：含有二甲双胍混合物，置于100mL圆底烧瓶中，加入乙腈，室温下搅拌10min，加入精密称取的熊果酸，继续搅拌16h，然后抽真空旋蒸4h，水浴温度为50℃。
进一步地，所述熊果酸-二甲双胍复盐与空白脂质体的摩尔比为0.05～0.25：1，更优选为0.1:1。
进一步地，所述熊果酸-二甲双胍复盐为羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物。
进一步地，所述步骤(2)中的空白脂质体经过外水相透析处理过。
进一步地，所述外水相的pH为7～9。
本发明的另外一个方面提供了上述方法的熊果酸脂质体制剂。
本发明的另外一个方面提供了上述熊果酸脂质体制剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤和抗炎。
进一步的，所述肿瘤可以是乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、多发性骨髓癌、膀胱癌、胰脏癌或皮肤癌中的任意一种。
如上所述，本发明的熊果酸脂质体制剂及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
本申请用环糊精包合熊果酸复盐的思路极大的提高了熊果酸在水溶液中的溶解度，不仅为制备其脂质体制剂提供了较好的前提条件，也为制备其他熊果酸制剂提供了基础。
首次制备了熊果酸主动载药脂质体制剂，制备的主动载药脂质体粒径在50-100nm之间，PDI在0.05-0.1之间，包封率达到80％。相比于其被动载药脂质体，主动载药脂质具有更稳定，更缓释，更高的生物利用度。DSC结果间接表明熊果酸载入脂质体内部。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中HPLC测定不同浓度羟丙基-β-环糊精/熊果酸包合物中熊果酸(A)的浓度以及羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物中熊果酸的浓度(B)。
图2a显示为本发明内水相不同浓度的醋酸钙制备的脂质体包封率。
图2b显示为本发明不同初始药物浓度制备的脂质体包封率。
图3显示为本发明中主动载药脂质体载药前后的冷冻透射电镜图。
图4显示为本发明中两种处方载药脂质体的DSC图。
图5显示为本发明不同处方脂质体体外释放量-时间曲线图(A)、粒径和PDI变化图(B)。
图6显示为本发明主动载药脂质体在放置一定时间前后粒径和PDI统计结果图。
图7显示为两种处方的熊果酸脂质体尾静脉给药后血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
本发明提供一种熊果酸脂质体制剂，包括脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，所述熊果酸位于脂质体膜内或者脂质体膜中。
所述脂质体膜类似于生物膜。
所述脂质体膜材料含有磷脂和胆固醇。本发明对于材料的选择及其含量并无特别的限制，只要形成稳定的无泄露的呈双分子结构的脂质体膜即可。一般情况下，只要磷脂和胆固醇的摩尔比范围在(80～50)：(20～50)时即可形成稳定的无泄漏的呈双分子层结构的脂质体膜。这些均在本领域技术人员所能知晓的知识范围内。
本发明实施例中列举了：所述磷脂选用氢化豆磷脂(HSPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。但是，并不仅限于此。
所述熊果酸脂质体制剂具体包括位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，熊果酸包封在所述内水相和脂质体膜中。
于一实施例中，所述内水相包括醋酸钙水溶液。于一实施例中，所述醋酸钙水溶液醋酸钙的浓度是25～500mM；于一实施例中，醋酸钙的浓度是200～500mM，于一实施例中，醋酸钙的浓度是300～500mM，于一实施例中，醋酸钙的浓度是200～300mM。
于一实施例中，所述醋酸钙水溶液的pH为7～9。
于一实施例中，所述内水相中还包括环糊精。优选为β-环糊精，更优选为羟丙基-β-环糊精。
于一实施例中，所述内水相中环糊精的浓度为4～7％。另一实施例中为5％。
于一实施例中，所述外水相包括三羟甲基氨基甲烷。较佳地，所述外水相的pH为7～9。
于一实施例中，所述脂质体粒径在50-100nm之间，PDI在0.05-0.1之间。
于一实施例中提供了上述熊果酸复盐脂质体制剂的制备方法，所述方法为采用主动载药的方法。
于一实施例中，所述方法具体包括以下步骤：
1.制备内水相含有醋酸钙溶液，外水相含有三羟甲基氨基甲烷的空白脂质体；
2.将空白脂质体与熊果酸-二甲双胍复盐混合，震荡，除去游离药物，加入含有外水相溶剂稀释。
于一实施例中，所述熊果酸-二甲双胍复盐可以采用以下方法制备：将熊果酸和二甲双胍在溶剂中混匀，搅拌，蒸发。例如具体可以采用以下方法：含有二甲双胍混合物，置于100mL圆底烧瓶中，加入乙腈，室温下搅拌10min，加入精密称取的熊果酸，继续搅拌16h，然后抽真空旋蒸4h，水浴温度为50℃。
于一实施例中，所述熊果酸-二甲双胍复盐与空白脂质体中脂质体颗粒的摩尔比为0.05～0.25:1。
于一实施例中，所述熊果酸-二甲双胍复盐为羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物。
于一实施例中，所述步骤(1)中的空白脂质体经过外水相透析处理过。
于一实施例中，所述外水相的pH为7～9。
于一实施例中提供了上述方法的熊果酸脂质体制剂。
于一实施例中提供了上述熊果酸脂质体制剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤和抗炎。
于一实施例中，所述肿瘤可以是乳腺癌，结肠癌，多发性骨髓癌，膀胱癌，胰脏癌,，皮肤癌。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例一 羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物的制备
1.1熊果酸复盐的制备
盐酸二甲双胍(4.01g,24.3mmol)溶于1N氢氧化钠溶液(24.2mL,24.2mmol)中，室温下搅拌30min。溶液冻干，放置4℃保存备用。
称取前述制备的含有二甲双胍混合物60mg，置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL乙腈，室温下搅拌10min，加入精密称取的熊果酸100mg，继续搅拌16h，然后抽真空旋蒸4h，水浴温度为50℃。
称取碳酸钠35mg，置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL乙腈，室温下搅拌10min，加入精密称取的熊果酸100mg，继续搅拌16h，然后抽真空旋蒸4h，水浴温度为50℃。
称取赖氨酸48mg，置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL乙腈，室温下搅拌10min，加入精密称取的熊果酸100mg，继续搅拌16h，然后抽真空旋蒸4h，水浴温度为50℃。
1.2羟丙基-β-环糊精/熊果酸包合物的制备
分别称取0.2g，0.4g，0.8g，1.2g羟丙基-β-环糊精至5mL EP管中，分别加入4mL10％蔗糖溶液，超声使其完全溶解后，每管加入过量熊果酸，4℃恒温磁力搅拌24h，保证每个EP管中有多余量熊果酸固体，取上清过0.22μm滤膜，HPLC测定不同浓度羟丙基-β-环糊精/熊果酸包合物中熊果酸的浓度。从图1中(A)可看出，熊果酸本身在水溶液中的饱和溶解度是测不到的。但随着溶液中羟丙基-β-环糊精浓度的增加，其熊果酸包合物中熊果酸的浓度也随之升高。30％羟丙基-β-环糊精/熊果酸包合物溶液中熊果酸的浓度可以达到1mg/mL，远远高于熊果酸本身在水溶液中的溶解度。
1.3羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物的制备
分别称取0.2g，1.2g羟丙基-β-环糊精至5mL EP管中，分别加入4mL 10％蔗糖溶液，超声使其完全溶解后，每管加入过量熊果酸-二甲双胍复盐，熊果酸-碳酸复盐，熊果酸-赖氨酸复盐，4℃恒温磁力搅拌24h，保证每个EP管中有多余量熊果酸固体，取上清过0.22μm滤膜，HPLC测定不同浓度羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物中熊果酸的浓度，结果见图1。结果表明，不同熊果酸复盐的羟丙基-β-环糊精包合物中，熊果酸-二甲双胍复盐的羟丙基-β-环糊精包合物中熊果酸浓度最高，即使降低羟丙基-β-环糊精的浓度。说明羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物对熊果酸的增溶作用最明显。
1.4羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物在不同pH缓冲溶液中包合溶解度测定
称取0.2g羟丙基-β-环糊精至5mL EP管中，分别加入4mL 10％蔗糖溶液，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.0)，硼酸-氯化钾缓冲液(pH＝9.0)，氨-氯化铵缓冲液(pH＝10.0)，超声使其完全溶解后，每管加入过量熊果酸-二甲双胍复盐，4℃恒温磁力搅拌24h，保证每个EP管中有多余量熊果酸固体，取上清过0.22μm滤膜，HPLC测定不同浓度羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物中熊果酸的浓度。结果见图1(B)，结果表明，羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物在不同pH值的缓冲溶液中溶解度均较高，相比之下，在pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中溶解度较低(2.26mg/mL)。
因此可见5％羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物在pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中即可将熊果酸的溶解度提高到2mg/mL以上，故将此溶液用于后续实验。
1.5熊果酸与阳离子的沉淀反应
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.0):称取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800mL搅拌溶解，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0，加水稀释至1000mL，即可。
硼酸-氯化钾缓冲液(pH＝9.0):称取硼酸3.09g，加0.1mol/L氯化钾溶液500mL使其溶解，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210mL，即可。
氨-氯化铵缓冲液(pH＝10.0):称取氯化铵5.4g，加水20mL溶解后，加浓氨溶液35mL，再加水稀释至100mL。
10％蔗糖溶液：称取100mg蔗糖，加入1000mL水中，搅拌使蔗糖完全溶解。
分别取5％羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物溶液和各阳离子溶液等体积于0.5mL离心管中，涡旋1min后，10000rpm离心10min，观察有无沉淀。结果见表1，结果表明，除了精氨酸与精胺溶液外，5％羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物溶液与其他盐溶液混合后，都有沉淀产生。
表1熊果酸与不同盐形成沉淀物情况
Figure BDA0002116806540000081
注：“-”表示没有肉眼可见沉淀；“+”表示有肉眼可见沉淀
实施例二 熊果酸脂质体的制备和表征
2.1熊果酸被动载药脂质体的制备(Lipid-UA)
按处方比例称取各种脂质加入圆底烧瓶中，加入处方量熊果酸甲醇溶液，再加入适量氯仿，使其完全溶解，真空状态下旋蒸4h，除去有机溶剂后，以生理盐水为水合介质，加入处方量生理盐水，超声15min，将制备的脂质体分别用200nm，80nm和50nm孔径的聚碳酸酯膜挤出。挤出后脂质体放置4℃保存。
从表2结果中可以看出，当处方中含有高含量的胆固醇时，处方中熊果酸最多可占脂质的5％，当熊果酸的量大于5％时，熊果酸脂质体不能形成。由于熊果酸的的分子结构为五环三萜类，和胆固醇的结构有些类似，因此，推测降低处方中胆固醇的含量，再载入胆固醇，从表2结果可看出，当处方中胆固醇的量降低时，增加处方中的熊果酸比例，可以形成脂质体，但当熊果酸与药物的比例大于0.15时，脂质体不能形成。因此最终熊果酸被动载药处方选择低胆固醇，熊果酸与脂质的比例为0.1的处方作为熊果酸被动载药脂质体的最终处方。
表2熊果酸被动载药脂质体表征检测结果
Figure BDA0002116806540000082
Figure BDA0002116806540000091
2.2熊果酸主动载药脂质体的制备(UA-liposomes)
2.2.1空白脂质体的制备
按处方比例称取各种脂质于西林瓶中，加入适量无水乙醇，加热使脂质完全溶解，按处方量加入相同温度内水相(200mM醋酸钙溶液)，60℃恒温磁力搅拌30min后，分别用200nm，80nm，50nm孔径聚碳酸酯膜挤出。挤出后的空白脂质体分别用不同外水相溶液透析过夜(透析溶液与脂质体体积比为1000:1)，透析后的脂质体放置4℃保存。测定空白脂质体粒径和PDI以作为载药后脂质体对照。
2.2.2熊果酸主动载药脂质体的制备
按处方量分别加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.0)透析后的空白脂质体，三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.0)和5％羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物(三羟甲基氨基甲烷缓冲液,pH＝8.0)溶液于1.5mL EP管中，于恒温振荡器中60℃，700rpm恒温振荡40min。载药后的脂质体用超滤的方法除去游离药物，分别用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.0)以10倍体积稀释载药脂质体，分别超滤3次后收集超滤好的载药脂质体。测定不同外水相条件下载药脂质体的粒径，PDI和包封率。
2.3熊果酸主动载药内水相不同醋酸钙浓度及不同药物与脂质比的脂质体制备
分别配置不同浓度醋酸钙溶液(25mM,200mM，300mM，500mM)，分别用其制备空白脂质体，制备含有不同浓度醋酸钙为内水相的空白脂质体，用tris buffer(pH＝8.0)透析除去外水相，放置4℃保存。在tris buffer(pH＝8.0)条件下对含有不同浓度醋酸钙的空白脂质体载药，载药后除去游离药物，测定主动载药脂质体粒径、PDI和包封率。
熊果酸可以与钙离子形成不溶于水的沉淀，因此选择醋酸钙作为熊果酸主动载药脂质体的内水相，但是醋酸钙的浓度需要继续考察。内水相不同浓度的醋酸钙制备的脂质体包封率见图2a，粒径和PDI见表3。从图2a可以看出，随着内水相中醋酸钙浓度升高，载药脂质体的包封率也增加，当增加到300mM时，再增加醋酸钙的浓度，脂质体载药的包封率并没有显著提高。结合粒径和PDI的结果上看，当内水相醋酸钙浓度升高到500mM时，载药脂质体粒径和PDI也变大，说明整个体系均一性较其他组差。综合以上结果来看，选择200-300mM醋酸钙为主动载药脂质体内水相较为合适。
表3内水相不同Ac2Ca浓度制备的脂质体的表征
Figure BDA0002116806540000101
取相同体积内水相为200mM醋酸钙溶液的空白脂质体，分别加入不同体积5％羟丙基-β-环糊精/熊果酸-二甲双胍复盐包合物溶液，按前述方法，制备不同药物与脂质比例的主动载药脂质体，分别测定不同药物与脂质比例条件下，载药脂质体的粒径，PDI和包封率。考察在保证载药脂质体物理化学性状良好的前提下，主动载药脂质体处方中较为合适的药物与脂质比例。
载药脂质体包封率结果见图2b，粒径和PDI结果见表4。从图2b看出，在加入空白脂质体相同质量的情况下，增加加入初始载药药物量，载药脂质体的包封率降低。从载药脂质体的粒径和PDI结果可以看出，当初始药物与脂质体的比例大于0.25时，载药后脂质体粒径和PDI变大，说明加入的药物量超过处方中脂质能够承载的量。选择合适的药物与脂质的比例，可以充分的利用处方中的脂质，在保证载药脂质稳定性的前提下，最大程度的利用脂质，使处方中的脂质体每个都载有足够的药。综上所述，选择初始药物与脂质比例为0.1作为载药脂质体的初始药物与脂质的比例。
表4不同初始药物初始浓度下制备的脂质体的表征
Figure BDA0002116806540000102
Figure BDA0002116806540000111
2.4熊果酸脂质体粒径及分散度的测定
2.4.1 Zetasizer
取两种处方脂质体适量，用ddH2O稀释20倍后，放入激光粒度分析仪中测定。从表5可以看出，两种方法制备的熊果酸脂质体粒径均小于90nm，主动载药处方的脂质体PDI小于0.1，而被动载药处方脂质体的PDI在0.2左右，因此主动载药方法制备的熊果酸脂质体的均一度要好于被动载药。
表5熊果酸脂质体的激光分析结果
Figure BDA0002116806540000112
2.4.2 Cryo-TEM
取空白脂质体或载药脂质体(除去游离药物)适量，用ddH2O稀释至脂质浓度约为20mg/mL，取适量滴入铜网上，用液体乙烷将样品速冻，然后放入液氮中保存，用冷冻型透射电子显微镜测定空白脂质体的形貌，大小，及其分布。
主动载药脂质体载药前后的形态可从冷冻透射电镜的结果中看出，结果见图3，从图中可以看出载药前后脂质体的粒径和分散度变化不大，大部分都小于100nm，小的脂质体粒径在50nm左右，粒径的结果和激光粒度分析仪测定的粒径结果相差不大。从脂质体的形态上看，载药后的脂质体较载药前比较，其轮廓并没有其圆滑。载药后脂质体的内水相并未观察到明显的沉淀/结晶性的物质。
2.4.3测定不同参数制备的脂质体特征
制备醋酸钙浓度为25mM、300mM、500mM；羟丙基-β-环糊精的浓度为4％、6％、7％；初始药物与脂质体的比例为0.05、0.1、0.15、0.2以及0.25的脂质体，内水相pH为7、7.5、8、8.5以及9；外水相pH为7、7.5、8、8.5以及9的脂质体，即分别采用上述各种参数的组合制备主动载药脂质体，再采用如上述方法对其进行特征检测，获得与2.4.1以及2.4.2类似的实验结果，颗粒的粒径为50～100nm；PDI在0.05-0.1之间，较多的为0.058～0.078；包封率达到78～85％。
2.5熊果酸脂质体的热分析
熊果酸被动载药脂质体的热分析：分别精密量取生理盐水，空白脂质体及不同处方(药物与脂质比例不同)被动载药熊果酸脂质体溶液各0.5mL加入差示扫描量热仪的样品池中，以生理盐水作为对照溶液加入对照池中，从10℃开始，以1℃/min的升温速度，对对照池与样品池中的两组溶液进行热分析，温度升到到95℃结束测定。
熊果酸主动载药脂质体的热分析：分别精密量取tris buffer(pH＝8.0)，空白脂质体(除去外水相)，不同处方(药物与脂质比例不同)主动载药熊果酸脂质体溶液各0.5mL加入差示扫描量热仪的样品池中，以tris buffer(pH＝8.0)作为对照溶液加入对照池中，从10℃开始，以1℃/min的升温速度，对对照池与样品池中的两组溶液进行热分析，温度升到到95℃结束测定。
熊果酸两种载药方法载药前后分别用差示扫描量热仪对脂质体进行热分析，结果如表6和图4。从图中可以看出，在熊果酸脂质体的被动载药处方中，空白脂质体和载药脂质体均有一个比较尖锐的吸热峰，这个尖锐的吸热峰主要为脂质峰，并且是HSPC的吸热峰。从文献中可知，HSPC的相转变温度约为53℃，和被动载药处方的空白脂质体的脂质峰的相转变温度几乎一致。文献中测定脂质体处方中增加胆固醇的量可以使磷脂的相转变峰变宽，并且随着其量的增加越多，其峰宽变得越宽，这点也可以从表6中主动载药脂质体和被动载药脂质体的峰宽结果看出，主动载药脂质体中脂质的处方含有高剂量的胆固醇，而被动载药脂质的处方中不含有胆固醇，因此两者的脂质的峰宽结果看出，被动载药处方的峰宽远远小于主动载药处方的峰宽。并且同空白脂质体相比，当处方中熊果酸的量相对较低时，载药脂质体和空白脂质体的吸热峰温度几乎相同(结果见表6)；当处方中熊果酸的量增加到药物与脂质比为0.1时，载药脂质体的相转变温度比空白脂质体的相转变温度低了大约3℃(见表6)。相转变温度是指随着温度的增加脂质膜从胶晶态变为液晶态，脂质膜的流动性增加，透过性增加。从熊果酸被动载药脂质体的DSC结果中可以看出，当脂质膜中插入少量的熊果酸分子时，是不影响整个脂质膜的排列；当脂质膜插入的熊果酸量增加到一定程度时，会影响到脂质膜的排列，因此测定的相转变温度也随之发生变化。
主动载药脂质体的DSC结果见图4和表6。从图4中可以看出，载药前空白脂质体只有一个相转变温度峰，这个峰的温度和文献中HSPC的相转变温度峰的温度相近，再有文献中报道脂质体处方中胆固醇含量增加时可以使磷脂的相转变温度峰变宽，因此可以判断出空白脂质体的相转变温度峰主要是HSPC的相转变温度峰。载药后脂质体的DSC图谱中含有两个不同温度的峰，一个峰的温度和峰宽和空白脂质体的温度和峰宽相近，因此可以判断出为脂质的相转变温度峰，另外一个温度峰在80-90℃之间，因此推断第二个峰为熊果酸与内水相的钙离子形成的复合物的吸热峰。图4中可以看出，载药脂质体的处方中加入不同量的熊果酸，载药后脂质体均有两个吸热峰，其中脂质的相转变峰基本和空白脂质体的相转变温度一致，另外一个吸热峰的温度在初始药脂比为0.05和0.1时基本一致，当初始药脂比增加到0.18时，吸热峰的温度稍微变大。推测其原因主要是由于脂质体中载入熊果酸的量不同，其在内水相和钙离子形成的复合物的状态可能也不同。
表6脂质体的热分析结果
Figure BDA0002116806540000131
2.6熊果酸脂质体的体外释放
分别量取熊果酸脂质体(被动载药与主动载药)适量，用生理盐水稀释50倍，摇匀。在溶液中分别加入可以将加入的熊果酸完全吸附的阴离子树脂100mg，轻轻摇匀溶液，放入37℃恒温空气摇床中，100rpm，分别在0h，12h，24h，36h，48h，72h取出溶液，静置5min后，取上清溶液50μL后，加入20倍甲醇稀释，HPLC测定溶液中熊果酸含量。按如下公式计算每个时间点熊果酸脂质体的累积释放度：R测定时间点(％)＝(m初始溶液上清熊果酸质量-m测定时间点上清熊果酸质量)/(m初始溶液上清熊果酸质量)*100。72h后，测定两组溶液上清的粒径和PDI，考察不同处方熊果酸脂质体体外释放后的粒径及大小分布的变化，间接考察脂质体结构是否有变化及脂质体的稳定性。
从图5中A可以看出，相同的释放条件，主动载药处方的熊果酸脂质体要比被动载药脂质体在72h累计释放量小约40％，说明主动载药处方的熊果酸脂质体比被动载药处方更缓释，即熊果酸载入内水相比载在脂质膜上会更缓释。
从图5中的B可以看出，在37℃条件下，释放72h后，主动载药处方的脂质体在释放前后粒径和PDI变化不大，而被动载药脂质体释放释放前后粒径和PDI变化很大，释放实验结束后，被动载药处方脂质体的粒径在800-1000nm，PDI在0.8左右，从外观上看，溶液静置后上面的溶液中可以看见块状的白色物质，因此可以推断出被动载药处方的熊果酸脂质体药物释放后整个脂质体结构应该已经散开，不是脂质体的结构了。从以上两点可以看出，熊果酸主动载药脂质体与被动载药脂质体相比，体外释放更缓慢，稳定性更好。
2.6熊果酸脂质体稳定性研究
将熊果酸脂质体(主动载药)放置在2-8℃条件下，不同时间点，测定脂质体的粒径，PDI。按前述不同外水相熊果酸主动载药脂质体的制备中的方法超滤脂质体，测定其载药量。
主动载药处方的熊果酸脂质在4℃条件下放置一段时间后，测定其粒径，PDI和药物含量，从图6结果可以看出，放置大于3个月的时间后，载药脂质的粒径，PDI和载药量均变化不大，因此可以说明在4℃条件下熊果酸载药脂质体可以稳定保存至少3个月。
实施例三 熊果酸脂质体体内药动学研究
C57/BL6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)9只，雄性，体重在0.02-0.025kg之间。给药前一晚禁食，给药前将动物随机分为3组，尾静脉给药，剂量为10mg/kg。给药后，分别在0.083，0.25，0.5，1，2，4，8，24h小鼠眼眶取血，全血样品置于含有EDTA-K2抗凝管中，于1500g条件下离心10min，收集样品上层血浆于样品管中。生物样品放置于-20℃条件下保存待分析。
血药浓度-时间曲线
两种处方的熊果酸脂质体尾静脉给药后，检测不同时间点药物在血液中的浓度，以时间为横坐标，药物浓度的对数值为纵坐标，做血药浓度-时间曲线，结果如图7。从图7中可以看出，相同时间点，熊果酸被动载药处方制剂在体内消除速度要比其主动载药处方制剂消除的速度快，并且被动载药脂质体在体内的浓度从8h开始检测不到，但是主动载药处方脂质体可以检测到24h，虽然在24h时间点的药物浓度比较低。说明熊果酸主动载药处方在体内释放更缓慢。从图中还可以看出主动载药熊果酸脂质体在体内的消除分为两个阶段，前8h为第一阶段，药物浓度在体内下降比较快，8h以后药物浓度在体内下降速度变慢。
药动学参数计算
熊果酸两种处方脂质体制剂尾静脉给药后，根据体内药物浓度计算出的药物代谢动力学参数见表7。首先从药时曲线下面积(AUC)可以看出，熊果酸主动载药处方大约是被动载药处方的2倍，两者在体内的半衰期(T1/2)分别为7.11h和1.03h。清除速率常数(Cl)被动载药处方的熊果酸脂质体约为主动载药处方制剂的1.6倍。这些参数均说明，主动载药的熊果酸脂质体在体内缓释效果要更好。
表7不同熊果酸脂质体药物动学参数
Figure BDA0002116806540000151
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种熊果酸脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体制剂包括脂质体颗粒，所述脂质体颗粒包括载体，所述载体为具有双分子结构的脂质体膜，所述熊果酸位于脂质体膜内或者脂质体膜中。
2.根据权利要求1所述的熊果酸脂质体制剂，其特征在于，所述熊果酸脂质体制剂包括位于脂质体膜内的内水相和位于脂质体膜外的外水相，所述熊果酸包封在所述脂质体内水相和脂质体膜中。
3.根据权利要求1所述的熊果酸脂质体制剂，其特征在于：所述内水相包括醋酸钙水溶液，所述醋酸钙水溶液醋酸钙的浓度是25～500mM。
4.根据权利要求1所述的熊果酸脂质体制剂，其特征在于：所述内水相中还包括环糊精。
5.根据权利要求1所述的熊果酸脂质体制剂，其特征在于：所述外水相包括三羟甲基氨基甲烷，所述外水相的pH为7～9。
6.根据权利要求1所述的熊果酸脂质体制剂，其特征在于：所述脂质体粒径为50-100nm，PDI为0.05-0.1。
7.如权利要求1～6任意一项所述的熊果酸脂质体制剂的制备方法，所述方法为采用主动载药的方法，所述方法至少包括以下步骤：
(1)制备内水相含有醋酸钙溶液、外水相含有三羟甲基氨基甲烷的空白脂质体；
(2)将空白脂质体与熊果酸-二甲双胍复盐混合，震荡，除去游离药物，加入含有外水相溶剂稀释。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述熊果酸-二甲双胍复盐与空白脂质体的摩尔比为0.05～0.25:1；所述外水相的pH为7～9。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述熊果酸-二甲双胍复盐为羟丙基-β-环糊精/熊果酸复盐包合物。
10.如权利要求7-9所述的方法制备的熊果酸脂质体制剂。
11.如权利要求10所述的熊果酸脂质体制剂用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤或抗炎。
12.根据权利要求11所述用途，其特征在于：所述肿瘤是乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、多发性骨髓癌、膀胱癌、胰脏癌或皮肤癌中的任意一种。
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