CN112166325A - 用于改善有风险婴儿的营养的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脐带上皮中与皮肤蛋白有关的生物标志物，其对于生命后期患有特应性皮炎具有更好的预测性。这些生物标志物使得能够在更精确确定的风险婴儿群体中进行早期营养干预。

Description

用于改善有风险婴儿的营养的生物标志物
技术领域
本发明处于婴儿营养领域，特别是针对有患特应性皮炎风险的婴儿的婴儿营养。
背景技术
特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，其对医疗保健资源和患者的生活质量构成重大负担。它是一种复杂的疾病，具有多种临床表现和症状组合。AD影响多达20％的儿童和多达3％的成人；最近的数据表明，其流行率仍在上升，尤其是在低收入国家。AD的最初表现通常出现在生命早期，并且通常先于其他过敏性疾病如食物过敏、哮喘或过敏性鼻炎。在所有患有AD的患者中，有50％在其生命的第一年出现其他过敏症状，并且可能有多达85％的患者在5岁以下发病。出生后尽快开始预防AD是有利的。
对于患有过敏或特应性皮炎的婴儿，市场上有几种配方物，其中包含适合治疗过敏性疾病如过敏的成分，特别是变应原性降低的水解蛋白或具有游离氨基酸的配方物，从而治疗过敏，避免暴露于过敏原。由其中一个或两个患有特应性疾病的父母所生的婴儿被认为具有更高的患特应性疾病的风险。针对这一群体，除了优选的母乳喂养，几种婴儿配方物已经被开发。例如，市场上售有的低致敏性配方物，包含部分蛋白质水解物(部分水解的蛋白质)，其已被证明可以降低AD的发生率(Alexander and Cabana，2010，JPGN；50：422-430)。其他成分已被证明对AD具有有益作用。已公开了包含不可消化的低聚糖(如低聚半乳糖和长链低聚果糖)的婴儿配方物可降低生命早期特应性疾病的发病率(Moro et al，2006，Arch Dis Child；91：814-819)。存在产乳酸细菌(通常属于双歧杆菌属(Bifidobacterium)或乳杆菌属(Lactobacillus))的配方物已被公开具有治疗或预防特应性皮炎的有益作用(Kalliomaki et al，2001，Lancet 357：1076-1079；Chua et al，2017，JPGN 65：102-106)。
如上所述，为了确定婴儿当前是否有患特应性皮炎的风险，家族病史会被纳入考虑。但是这种方法是主观的，不是很精确；并非所有有风险的婴儿都被包括在内；例如，由于父母关于过敏性疾病的病史未知、未被回忆起或未被意识到。这可能导致相当数量的婴儿患特应性疾病，特别是特应性皮炎，这些婴儿最初没有被认为具有风险，因此没有服用上述有助于降低患特应性疾病风险的营养组合物之一。
因此，需要一种更精确和客观的方法来确定婴儿是否有患特应性疾病，特别是特应性皮炎(其是特应性疾病逐渐发生的第一步)的风险。在皮肤上进行研究以确定指示特应性湿疹风险增加的生物标志物更为客观，但涉及使用表皮活检。尽管这在青少年或成人中是可行的，但不希望从尚未患AD的婴儿和儿童中获得皮肤活检。因此，此方法不合适。另外，一些报告提到对脐带血进行分析以测定生物标志物如IgE水平，作为患特应性疾病的风险因素。然而，使用脐带血IgE作为预测标志物的价值已受到许多人的质疑，并且就其缺乏与AD和过敏的关联、灵敏度低和预测值低以及类似研究之间相互矛盾的结果而仍存在争议。来自脐带血的数据在很大程度上受到母亲状况的影响，例如受营养维生素D状况的影响。Bergmann et al(1997，Clin Exp Allergy 27(7)：752-760)得出结论，父母病史和脐带血IgE的预测能力不足以推荐其作为一级预防的筛查手段，并且大多数特应性表现和致敏发生在没有这些父母病史和脐血IgE水平的风险因素的婴儿中。此外，分析脐带血中预测AD的生物标志物的实用性受到限制，因为随着私有化脐带血储备的增加，现在很难为此目的而得到脐带血。父母宁愿将孩子的脐带血储存起来以备将来的突发情况之用，而不是分析脐带血以预测非致命性疾病AD。
发明内容
发明人已经发现，脐带上皮可用作容易获得的、非侵入性的表皮替代物以用于预测性生物标志物的发现。脐带在婴儿出生前与其表皮在解剖学上是邻接的，并且是不需要的，并作为医疗废物丢弃。已确定沿脐带全部长度的表皮可代表未成熟的皮肤。五种皮肤蛋白的存在和水平被测定，并且其与生命后期婴儿出生后3个月大时特应性皮炎的发生相关。结果表明，五种生物标志物中的三种与生命后期特应性皮炎的发生显著相关，当使用3种生物标志物的组合时，灵敏度得到提升，而5种生物标志物组合使用时，灵敏度进一步提高。用这种方法可以检测出所有在生命后期出现特应性皮炎的婴儿，与传统的风险评估相比，灵敏度更高。
因此，脐带上皮中某些生物标记物的存在能够捕获到更高比例的有患特应性皮炎和特应性皮炎之后的后续特应性疾病如过敏、鼻炎的风险的婴儿，并能在较早的阶段进行捕获，其通过给予适合的婴儿配方物改善早期的营养干预，所述婴儿配方物包含已知能预防或降低特应性皮炎和后续特应性疾病风险的成分，如益生菌、益生元和/或水解蛋白。本发明的另一个优点是，可以实现进行临床试验的改进，特别是可以实现效率的增加，因为它可以正确识别并因此招募有患特应性疾病风险的婴儿的适当研究人群来进行例如临床试验，其允许特别是在时间和成本方面更有效地开发用于预防和/或治疗特应性疾病的新的解决方案。
具体实施方式
本发明涉及一种用于确定婴儿患特应性疾病的风险的方法，其中该方法包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且其中样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比的偏差表明患特应性疾病的可能性增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
在优选的实施方案中，用于确定婴儿患特应性疾病的风险的方法还包括在至少一种生物标志物蛋白水平出现偏差的情况下为婴儿提供特应性疾病的定制饮食。
本发明涉及一种用于确定婴儿患特应性疾病的风险的方法，其中该方法包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且其中样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加表明患特应性疾病的可能性增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
在优选的实施方案中，用于确定婴儿患特应性疾病的风险的方法还包括在至少一种生物标志物蛋白水平增加的情况下为婴儿提供特应性疾病的定制饮食。
本发明还涉及一种用于为有患特应性疾病风险的婴儿定制饮食的方法，其包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且在样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有偏差的情况下为婴儿提供特应性疾病的定制饮食，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
本发明还涉及一种用于为有患特应性疾病风险的婴儿定制饮食的方法，其包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且在样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加的情况下为婴儿提供特应性疾病的定制饮食，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
本发明还涉及一种治疗婴儿特应性疾病的方法，其通过测量在包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中存在至少一种生物标志物蛋白水平的偏差并且如果发现至少一种生物标志物蛋白水平增加，通过给予特应性疾病定制饮食来治疗特应性疾病。
本发明还涉及一种用于降低婴儿患特应性疾病风险的方法，其通过测量在包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中存在至少一种生物标志物蛋白水平的偏差并且如果发现至少一种生物标志物蛋白水平增加，给予特应性疾病定制饮食，从而降低婴儿患特应性疾病的风险。
本发明还涉及一种治疗婴儿特应性疾病的方法，其通过测量在包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中存在至少一种生物标志物蛋白水平的增加并且如果发现至少一种生物标志物蛋白水平增加，通过给予特应性疾病定制饮食来治疗特应性疾病。
本发明还涉及一种用于降低婴儿患特应性疾病风险的方法，其通过测量在包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中存在至少一种生物标志物蛋白水平的增加并且如果发现至少一种生物标志物蛋白水平增加，给予特应性疾病定制饮食，从而降低婴儿患特应性疾病的风险。
在优选的实施方案中，在本发明的方法中，至少一种生物标志物蛋白选自兜甲蛋白(loricrin)、GATA-3，以及激肽释放酶-7(kallikrein-7)。更优选地，在本发明的方法中，测定兜甲蛋白的水平、GATA-3的水平，以及激肽释放酶-7的水平，并且其中与相同蛋白质的参考值相比，样品中兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7各自水平的增加表明患特应性疾病的风险增加。
在另一个优选的实施方案中，在本发明的方法中，除了在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平外，其中所述至少一种生物标志物蛋白选自兜甲蛋白、GATA-3，以及激肽释放酶-7，还在包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中，体外测定选自丝蛋白(fillagrin)和内批蛋白(involcrin)的生物标志物蛋白的水平，优选测定丝蛋白和内批蛋白的水平，并且其中与相同蛋白的参考值相比，样品中的丝蛋白和/或内批蛋白的水平增加表明发生特应性疾病的可能性增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同生物标志物蛋白的平均水平。
生物标志物/测定(assay)
从最广泛的意义上讲，本发明涉及来自婴儿脐带上皮细胞的蛋白质或蛋白质组合作为易患婴儿特应性疾病的标志物的用途。在一个实施方案中，来自婴儿的脐带上皮细胞的蛋白质是GATA 3。在一个实施方案中，来自婴儿的脐带上皮细胞的蛋白质是激肽释放酶-7(KLK7)。在一个实施方案中，来自婴儿的脐带上皮细胞的蛋白质是兜甲蛋白。在一个实施方案中，来自婴儿的脐带上皮细胞的蛋白质是丝蛋白。在一个实施方案中，来自婴儿的脐带上皮细胞的蛋白质是内批蛋白。在一个实施方案中，是来自脐带上皮细胞的蛋白质组合GATA 3、激肽释放酶-7和兜甲蛋白。在一个实施方案中，是来自脐带上皮细胞的蛋白质组合GATA 3、激肽释放酶-7、兜甲蛋白和丝蛋白。在一个实施方案中，是来自脐带上皮细胞的蛋白质组合GATA 3、激肽释放酶-7、兜甲蛋白和内批蛋白。在一个实施方案中，是来自脐带上皮细胞的蛋白质组合GATA 3、激肽释放酶-7、兜甲蛋白、丝蛋白和内批蛋白。
GATA-3是一种转录因子，其具有两个保守的锌指基序，可与DNA共有序列(A/T)GATA(A/G)结合。它在发育中的神经系统、胚胎肾脏、内耳、眼睛、皮肤和胸腺中表达，但主要发现于造血系统中。在造血细胞中，GATA-3由T细胞、自然杀伤细胞(NK)和NKT谱系细胞表达，并在沿Th2谱系分化的造血细胞中显著上调。在皮肤中，GATA-3在表皮和毛囊的内根鞘中表达，在这里调节毛囊的内根细胞谱系并维持出生后毛发的生长。已知GATA-3在免疫系统中发挥作用，在T细胞定型(Tcell commitment)和Th2免疫的发展中起着关键作用。它是Th2细胞分化的主要调节剂，也是Th2细胞因子表达的主要调节剂。当GATA-3结合到Th2细胞因子基因座的多个启动子位点时，通过染色质重塑来调节作为过敏性炎症介质的Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的表达。与它在促进Th2偏向的免疫答应中的作用相对应，发现GATA-3在各种过敏症(如哮喘和过敏性鼻炎)中上调，在这些情况下患者中检测到的GATA-3阳性细胞数量增加。除了其作为免疫系统主要调节剂的主要作用外，GATA-3还被证明在表皮屏障获得中起重要作用，特别重要的是在通过激肽释放酶1活化的表皮分化和脱皮的最终阶段。还发现GATA-3调节为维持表皮屏障完整性必不可少的脂质的生物合成。综上所述，如前所述，GATA-3的缺乏会导致适当的表皮末端分化和脂质合成方面的各种缺陷，导致功能失调的表皮屏障，可能导致AD发病。
激肽释放酶相关肽酶7(KLK7)是一种在表皮中发现的胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其功能是作为正常表皮脱皮的一部分裂解角化桥粒(corneodesmosomal)蛋白，有助于维持适当的表皮稳态和功能。在转基因小鼠中，已发现KLK7的过表达会导致慢性瘙痒性皮炎，其与人类的慢性AD类似。还已经报道了与Th1和Th17细胞因子KLK7刺激相比，刺激各种炎症细胞因子，如在AD中过表达的Th2细胞因子IL-4和IL-13，在正常人表皮角质细胞中显著诱导KLK7表达，从而降解了参与维持适当的表皮屏障所需的脂质加工的酶，导致功能失调的表皮屏障，而导致AD发病。
兜甲蛋白(LOR)是在表皮的颗粒层表达的富含甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的蛋白质。它是角质化包膜的主要成分之一，占其总蛋白质量的70-85％。在表皮中，LOR通过转谷氨酰胺酶与其他LOR分子和角质化包膜蛋白(如富含脯氨酸的小蛋白、角蛋白和FLG)交联。以及，LOR缺乏的小鼠会经历表皮屏障功能障碍，被掺入角质化包膜中的内批蛋白(IVL)和其他富含脯氨酸的小蛋白会补偿性上调，从而突出了LOR作为角质化包膜的基本组分以及维持功能性表皮屏障的重要性。
丝蛋白(FLG)最初通过分化颗粒层中的角质细胞而表达为透明角质颗粒中所含的丝聚合蛋白(profilaggrin)。在终末分化过程中，丝聚合蛋白被去磷酸化并裂解形成FLG，使角蛋白丝聚集在角质层的颗粒层和下层，促进细胞的塌陷，形成扁平的角质细胞。在角质层的表面，FLG降解为游离氨基酸，随后被代谢形成表皮水合必需的天然保湿因子(NMF)。然而，少量的FLG不会经历降解，而是被整合到角质化包膜中。
内批蛋白(IVL)是富含赖氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的蛋白质，可在角质化包膜形成过程中早期表达。它形成最初的支架，在角质化包膜形成过程中允许其他角化的包膜蛋白通过二硫键和Nε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异肽键来结合；脂质通过共价键来结合。角蛋白是角质细胞中的主要结构蛋白。在增殖的基底层中，K5和K14的表达占主导，而K1和K10则在角质化过程中稍后表达，随着角质细胞经历终末分化，朝着角质层向上移动，从而替代先前建立的K5/K14中间纤维网络。与聚集角蛋白纤维的FLG一起，构成表皮的蛋白质量的80-90％的角蛋白-FLG复合物可作为支架，在形成角质化包膜的过程中，在其上有其他角质化包膜蛋白与之交联。
在一个优选的实施方案中，生物标志物蛋白的水平是指相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH-EC 1.2.1.12)的水平(其优选同时测定并设定为1)进行归一化的生物标志物蛋白的水平。
参考值是健康参考组中的生物标志物蛋白的水平，健康参考组为3个月大时未患特应性疾病的婴儿组。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中，如果相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，其中兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350，丝蛋白≥0.098和/或内批蛋白≥6.040，则生物标志物蛋白的水平会增加。优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，以及激肽释放酶-7≥0.350。更优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350以及丝蛋白≥0.098。更优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350以及内批蛋白≥6.040。更优选，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350，丝蛋白≥0.098以及内批蛋白≥6.040。
确定生物标志物的最佳截止值以便获得最佳的灵敏度、特异性及减少假阳性和假阳性值结果的方法是本领域已知的。通常，这些涉及ROC曲线(接收器工作特性曲线)，其是一个图形图，它说明了二进制分类器系统的鉴别临界值变化时的诊断能力。通过绘制各种临界值设置下的真阳性率(TPR)相对于假阳性率(FPR)来创建ROC曲线。真阳性率也称为灵敏度。假阳性率也称为错误警报的结果(fall-out)或可能性，可以计算为(1-特异性)。因此，ROC曲线是灵敏度作为结果的函数。进一步参考实验实施例。
测定细胞中蛋白质水平的方法是已知的。优选地，测定蛋白质水平涉及检测方法，优选基于检测光谱的检测方法，如HPLC或LC/MS或显色检测。替代地或另外地，测定蛋白质水平可以涉及或基于抗体的检测方法，例如ELISA、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、蛋白质印迹、蛋白质免疫染色、RIA。用于测定蛋白质水平的一种非常合适的方法包括蛋白质印迹分析。
脐带上皮细腻易碎，应小心处理。
营养组合物
本发明还涉及一种营养组合物，其包含预防或帮助降低患特应性疾病的风险的成分，优选地包含选自水解蛋白、产乳酸细菌和不可消化的低聚糖中的至少一种，以用于预防婴儿的特应性疾病，包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且在样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有偏差的情况下给予婴儿所述营养组合物，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
在该实施方案的上下文中，应注意的是，样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比的偏差表明患特应性疾病的可能性增加。
本发明还涉及一种营养组合物，其包含选自水解蛋白、产乳酸细菌和不可消化的低聚糖中的至少一种，以用于预防婴儿的特应性疾病，包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种选自兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7的生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且在样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加的情况下给予婴儿所述营养组合物，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
在该实施方案的上下文中，应注意的是，样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加表明患特应性疾病的可能性增加。
在本发明的营养组合物的用途的一个优选实施方案中，兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7的水平增加。
在本发明的营养组合物的用途的另一个优选实施方案中，除了在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中至少一种生物标志物蛋白的水平外，其中所述至少一种生物标记蛋白选自兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7，还在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中选自丝蛋白和内批蛋白的生物标志物蛋白的水平，优选地测定丝蛋白和内批蛋白的水平，并且其中与相同生物标志物蛋白的参考值相比，样品中丝蛋白和/或内批蛋白的水平增加，优选两者的水平均增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同生物标志物蛋白的平均水平。
在本发明的营养组合物的用途的一个优选实施方案中，如果相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，其中兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350，丝蛋白≥0.098和/或内批蛋白≥6.040，则生物标志物蛋白的水平增加。优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，以及激肽释放酶-7≥0.350。更优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350以及丝蛋白≥0.098。更优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350以及内批蛋白≥6.040。更优选地，相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350，丝蛋白≥0.098以及内批蛋白≥6.040。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法或本发明的营养组合物的用途中，特应性疾病定制饮食包含水解蛋白、产乳酸细菌和不可消化的低聚糖中的至少一种。
用于本发明的用途的营养组合物(以下也称为本发明的组合物或本组合物)可以用作营养组合物、营养疗法、营养支持，用作医疗食品，用作特殊医疗目的的食品或用作营养补充剂。本发明的组合物优选是肠内(口服)组合物。将所述组合物经口服给予或计划经口服给予有此需要的受试者，特别是给予至儿童和婴儿，包括幼儿，优选年龄通常为0-36个月的婴儿或幼儿，更优选0-12个月的婴儿，最优选0-6个月。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物为婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物(也称为成长奶)，优选地是婴儿配方物或后续配方物，最优选地是婴儿配方物。术语“婴儿配方物”一致地在国际上得到监管机构的很好的定义并受到其的控制。特别是，CODEX STAN 73-1981“旨在用于婴儿的用于特殊医疗目的婴儿配方物的标准(Standard For Infant Formula and Formulas For SpecialMedical Purposes Intended for Infants)”已被广泛接受。其建议了营养价值和配方物组成，要求配制的牛奶每100毫升含有的能量不少于60kcal(250kJ)且不超过70kcal(295kJ)。FDA和其他管理机构已经根据其设定了营养要求。
优选地，本发明的优选肠内营养组合物用于向人类提供日常营养需求，特别是用于给予，特别是用于喂养人类，特别是婴儿。营养组合物不是人乳。
为了满足婴儿的热量需求，本发明的肠内组合物优选包含50至200kcal/100ml液体，更优选60至90kcal/100ml液体，甚至更优选60至75kcal/100ml液体。这种热量密度确保水和热量消耗之间的最佳比例。本发明组合物的渗透压(osmolarity)优选在150至420mOsmol/l之间，更优选在260至320mOsmol/l之间。低渗透压旨在减轻胃肠压力。
优选地，本发明的肠内组合物为液体形式，优选在博勒飞(Brookfield)粘度计中于20℃在100s-1的剪切速率下测量的粘度低于35mPa.s，更优选低于6mPa.s。合适地，本发明的肠内组合物为粉末形式，优选可以用水重构以形成液体，或为液体浓缩物形式，其应当用水稀释。当本发明的肠内组合物为液体形式时，每天给予的优选量在每天约80至2500ml，更优选约450至1000ml的范围内。
本发明的组合物优选包含脂质组分，优选本领域已知的适合婴儿营养的脂质组分。每100kcal的组合物中，本发明组合物的脂质组分优选提供2.9至6.0g，更优选4至6g。当为液体形式时，该组合物优选每100ml包含2.1至6.5g脂质，更优选每100ml包含3.0至4.0g脂质。基于干重计，本发明的婴儿或后续配方物优选包含12.5至40质量％的脂质，更优选19至30质量％。
本发明的组合物可以包含其他蛋白质物质。在本发明的上下文中，另外的“蛋白质”或“蛋白质物质”或“蛋白质等同物”涵盖蛋白质、肽、游离氨基酸和部分或广泛水解的蛋白质。本发明的组合物优选含有少于1质量％的完整哺乳动物(牛)的乳蛋白。该组合物可以包含选自以下的其他蛋白质组分：游离氨基酸、水解乳清蛋白和来自其他来源如大豆、豌豆、稻、胶原蛋白等的蛋白质，所述其他蛋白质组分以完整形式、部分水解形式，和/或广泛水解形式存在。
本发明的组合物优选含有至少50质量％的来自非人乳的蛋白质组分，更优选至少90质量％，基于总蛋白的干重计。
本发明的组合物优选含有4至25％，更优选5至20％，更优选7至16％，最优选7至12％的蛋白质，基于总热量计。当以液体形式存在时，本发明的组合物优选每100ml含有0.5至6.0g，更优选0.8至3.0g，甚至更优选1.0至2.5g的蛋白质。本发明的组合物优选包含至少7.0质量％，更优选至少8.0质量％，最优选至少9或至少10质量％的蛋白质，基于总组合物的干重计。优选地，本发明的组合物包含至多40质量％，更优选至多15质量％，优选至多20质量％的蛋白质，基于总组合物的干重计。
组合物可以包含可消化的碳水化合物(一种或多种)。通常，使用本领域已知适合用于婴儿营养组合物中的可消化碳水化合物，例如选自可消化的多糖(例如淀粉、麦芽糊精)、可消化的单糖(例如葡萄糖、果糖)，以及可消化的二糖(例如乳糖、蔗糖)。乳糖和/或麦芽糊精特别合适。在一个实施方案中，组合物不包含乳糖。
可消化的碳水化合物组分优选包含至少60质量％的乳糖，基于总的可消化的碳水化合物计，更优选至少75质量％，甚至更优选至少90质量％的乳糖，基于总的可消化的碳水化合物计。
水解蛋白
在一个实施方案中，用于本发明的用途的营养组合物包含水解蛋白。优选地，水解的蛋白质或蛋白质物质不引起过敏反应或是低致敏性的，如游离氨基酸和水解蛋白。所述组合物优选包含水解的乳清蛋白，优选部分水解的乳清蛋白。这样的蛋白质组分有助于降低患特应性疾病，特别是特应性皮炎的风险。
本发明的组合物优选含有少于1质量％的完整哺乳动物(牛)的乳蛋白。组合物可以包含选自以下的其他蛋白质组分：游离氨基酸、水解乳清蛋白和来自其他来源如大豆、豌豆、稻、胶原蛋白等的蛋白质，所述其他蛋白质组分以完整形式、部分水解形式，和/或广泛水解形式存在。
本发明的组合物优选含有至少50质量％的源自非人乳的蛋白质组分，更优选至少90质量％，基于总蛋白的干重计。本发明的组合物优选含有至少50质量％的源自非人乳的水解的蛋白质组分，更优选至少90质量％，基于总蛋白的干重计。优选地，组合物包含至少90质量％的水解的乳蛋白，优选部分水解的乳蛋白，基于总的蛋白质计。
蛋白质水解物(即水解的蛋白质)优选源自哺乳动物的乳，优选来自牛属(Bos)、野牛属(Bison)、水牛属(Bubalus)或山羊属(Capra)的乳，更优选来自牛属的乳，最优选来自牛乳(Bos taurus)。在一个优选的实施方案中，肽源自乳清蛋白。营养组合物优选包含至少50质量％，更优选至少70质量％，甚至更优选至少95质量％的水解乳清蛋白，基于总蛋白质计。合适的来源是酸乳清蛋白和脱矿质的甜乳清蛋白的混合物。酸乳清和甜乳清商购可得。甜乳清是凝乳凝结的奶酪的副产品，并包含酪蛋白糖巨肽(caseinoglycomacropeptide)(CGMP)，酸乳清(acid whey)(也称为酸的乳清(sour whey))是酸凝奶酪的副产品，并且不含CGMP。乳清蛋白的合适来源是脱矿质乳清(Deminal，Friesland Campina，theNetherlands)和/或乳清蛋白浓缩物(WPC80，Friesland Campina，the Netherlands)。乳清蛋白优选包含酸乳清，更优选至少50质量％，更优选至少70质量％的酸乳清，基于总的乳清蛋白计。与甜乳清蛋白相比，酸乳清具有改善的氨基酸特征(profile)。
水解可以使用微生物内肽酶和外肽酶的混合物来实现。优选地，使用内蛋白酶和外蛋白酶的混合物。组合物优选包含小于10质量％，优选小于6质量％的大小为5kDa或以上的肽或蛋白，基于总的蛋白质计。优选地，1质量％的存在于组合物中的肽或蛋白质的大小为1kDa或以上，基于总的蛋白质计，更优选至少5质量％，更优选至少10质量％，基于总的蛋白质计。可以通过本领域已知的尺寸排阻高压液相色谱法来测定蛋白水解产物中肽的尺寸分布。Saint-Sauveur等人“Immunomodulating properties of a whey protein isolate，its enzymatic digest and peptide fractions”Int.Dairy Journal(2008)，卷18(3)，第260-270页描述了其实例。简而言之，色谱图的总表面积被积分并分成质量范围，该质量范围表示为总表面积的百分比。使用具有已知分子量的肽/蛋白质来校准质量范围。
产乳酸细菌
在一个实施方案中，用于本发明的用途的营养组合物包含产乳酸细菌。所述组合物优选包含产乳酸细菌种的菌株，其有助于预防或治疗特应性疾病，优选特应性皮炎。细菌菌株优选为益生菌。合适的产乳酸细菌包括双歧杆菌属(Bifidobacteria)的菌株(例如短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、双歧双歧杆菌(B.bifidum))，乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、约翰逊氏乳杆菌(L.johnsonii)、植物乳杆菌(L.plantarum)、路氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳杆菌(L.casei)、乳乳杆菌(L.lactis)和链球菌属(Streptococcus)的菌株(例如嗜热链球菌(S.thermophilus))。短双歧杆菌和长双歧杆菌是尤其合适的产乳酸细菌。
用于本发明的用途的营养组合物优选包含双歧杆菌，优选短双歧杆菌。组合物优选包含属于双歧杆菌属，优选属于短双歧杆菌种的产乳酸细菌的菌株。与短双歧杆菌ATCC15700的类型菌株相比，短双歧杆菌优选具有至少95％的同一性的16S rRNA序列，更优选至少97％同一性(Stackebrandt&Goebel，1994，Int.J.Syst.Bacteriol.44：846-849)。可以从健康的人乳喂养婴儿的粪便中分离合适的短双歧杆菌菌株。通常，它们可以从产乳酸细菌生产商处商购获得，但是它们也可以直接从粪便中分离，鉴定、表征和生产。根据一个实施方案，本发明的组合物含有短双歧杆菌，其选自短双歧杆菌Bb-03(Rhodia/Danisco)、短双歧杆菌M-16V(Morinaga)、短双歧杆菌R0070(Institute Rosell，Lallemand)、短双歧杆菌BR03(Probiotical)、短双歧杆菌BR92(Cell Biotech)、DSM 20091、LMG 11613、YIT4065、FERM BP-6223和CNCM I-2219。短双歧杆菌可以是短双歧杆菌M-16V和短双歧杆菌CNCM I-2219，最优选短双歧杆菌M-16V。短双歧杆菌I-2219公开于WO 2004/093899中，由CompagnieGervais Danone于1999年5月31日保藏在法国巴黎巴斯德研究所微生物国家保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganisms，Institute Pasteur，Paris，France)。短双歧杆菌M-16V保藏为BCCM/LMG23729，可从森永乳业有限公司(Morinaga MilkIndustry Co.，Ltd)商购获得。
在本发明的上下文中，产乳酸细菌可以任意合适的浓度存在于组合物中，优选以治疗有效量或“有效治疗量”存在。优选地，本发明的组合物中包括的产乳酸细菌菌株的量为每克组合物干重104-1013cfu，优选105-1011cfu/g，最优选106-1010cfu/g。
不可消化的低聚糖
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种不可消化的低聚糖[NDO]。NDO的存在有助于预防或治疗特应性疾病，优选特应性皮炎。
有利地并且最优选地，不可消化的低聚糖是水溶性的(根据L.Prosky et al，J.Assoc.Anal.Chem 71：1017-1023，1988中公开的方法)，并且优选是聚合度(DP)为2至200的低聚糖。不可消化的低聚糖的平均DP优选低于200，更优选低于100，甚至更优选低于60，最优选低于40。
不可消化的低聚糖优选为益生元。它不会通过人体上消化道(小肠和胃)中存在的消化酶的作用在肠中被消化。不可消化的低聚糖被人肠微生物群发酵。例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糖糊精被认为是可消化的。不可消化低聚糖的原材料可以包含单糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、葡糖醛酸、GalNac等，但是它们不是不可消化的低聚糖的一部分。不可消化的低聚糖优选选自低聚果糖、不可消化的糊精、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡萄糖、低聚葡萄甘露糖、低聚半乳甘露糖、低聚甘露糖、壳低聚糖、糖醛酸低聚糖、唾液酸低聚糖和低聚岩藻糖及其混合物，优选低聚果糖。唾液酸低聚糖的实例为3-唾液酸乳糖、6”唾液酸乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、二唾液酸乳糖-N-四糖。低聚岩藻糖的实例为(未)硫酸化岩藻依聚糖(fucoidan)低聚糖、2’岩藻基半乳糖、3’岩藻基半乳糖、乳-N-岩藻五糖I、II、III、LNDH、乳二盐藻四糖、乳-N-二岩己糖I、II。
一种合适的低聚糖类型是短链低聚糖，其具有的平均聚合度小于10，优选至多8，优选在2-7范围内。短链低聚糖优选包含低聚半乳糖和/或低聚果糖(即scGOS和/或scFOS)。在一个实施方案中，组合物包含低聚半乳糖，优选β-低聚半乳糖，优选反式-低聚半乳糖。低聚半乳糖优选具有的平均聚合度在2-8，优选3-7的范围内，即在本发明的上下文中是短链低聚糖。(反式)低聚半乳糖例如可以商品名
Figure BDA0002792700490000151
GOS(Friesland Campina DomoIngredients，Netherlands)、Bimuno(Clasado)、Cup-oligo(Nissin Sugar)和Oligomate55(Yakult)获得。组合物优选包含短链低聚果糖和/或短链低聚半乳糖，优选至少短链低聚果糖。低聚果糖可以是具有的平均DP在上述(亚)范围内的菊粉水解产物；这样的FOS产品例如可作为Raftilose P95(Orafti)或与Cosucra一起商购获得。
另一种合适的低聚糖类型是长链低聚果糖(lcFOS)，其具有的平均聚合度大于10，通常在10-100，优选15-50，最优选20以上的范围内。长链低聚果糖的一种特殊类型是菊粉，如Raftilin HP。
本发明的组合物可以含有两种或更多种类型的不可消化的低聚糖的混合物，最优选两种不可消化的低聚糖的混合物。在NDO包含两种不同的低聚糖的混合物或由其组成的情况下，一种低聚糖可以是如上定义的短链，而一种低聚糖可以是如上定义的长链。最优选地，短链低聚糖和长链低聚糖以短链与长链的重量比1∶99-99∶1，更优选1∶1-99∶1，更优选4∶1-97∶3，甚至更优选5∶1-95∶5，甚至更优选7∶1-95∶5，甚至更优选8∶1-10∶1的范围内，最优选约9∶1存在。
在一个实施方案中，组合物包含低聚果糖和/或低聚半乳糖中的至少两种。合适的混合物包括长链低聚果糖与短链低聚果糖或短链低聚半乳糖的混合物，最优选长链低聚果糖与短链低聚果糖的混合物。
本发明的组合物优选包含0.05至20重量％的所述不可消化的低聚糖，更优选0.5至15重量％，甚至更优选1至10重量％，最优选2至10重量％，基于本发明组合物的干重计。当以液体形式存在时，本发明的组合物优选包含0.01至2.5重量％的不可消化的低聚糖，更优选0.05至1.5重量％，甚至更优选0.25至1.5重量％，最优选0.5至1.25重量％，基于100ml计。
当不可消化的低聚糖是混合物时，各个参数的平均值用于定义本发明。
如上文所定义的NDO和产乳酸细菌的组合也被称为“合生元”。据信，治疗有效量的NDO与产乳酸细菌一起存在可进一步提升预防或治疗特应性疾病，优选特应性皮炎的效果。优选的组合是双歧杆菌属，优选短双歧杆菌的菌株，以及低聚半乳糖和/或低聚果糖。
其他组分
组合物还可以包含长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。LC-PUFA是其中酰基链具有20至24个碳原子(优选20或22个碳原子)的长度并且其中酰基链在酰基链中所述碳原子之间包含至少两个不饱和键的脂肪酸。更优选地，本发明的组合物包含至少一种选自二十碳五烯酸(EPA，20:5n3)、二十二碳六烯酸(DHA，22:6n3)、花生四烯酸(ARA，20:4n6)和二十二碳五烯酸(DPA，22:5n3)，优选DHA、EPA和/或ARA的LC-PUFA。这种LC-PUFA对降低包括特应性皮炎在内的特应性疾病的风险具有进一步的有益作用。
本发明组合物中LC-PUFA的优选含量不超过总脂肪酸的15重量％，优选不超过10重量％，甚至更优选不超过5重量％。优选地，本发明的组合物包含总脂肪酸的至少0.2重量％，优选至少0.25重量％，更优选至少0.35重量％，甚至更优选至少0.5重量％的LC-PUFA，更优选DHA。本发明的组合物优选包含ARA和DHA，其中ARA/DHA的重量比优选大于0.25，优选大于0.5，更优选为0.75-2，甚至更优选为0.75-1.25。重量比优选低于20，更优选在0.5至5之间。DHA的量优选大于0.2重量％，更优选大于0.3重量％，更优选至少0.35重量％，甚至更优选为0.35-0.6重量％，以总脂肪酸计。
人类受试者
目标人类受试者或人群优选为有患特应性疾病如特应性皮炎、过敏，优选乳蛋白过敏、过敏性鼻炎和哮喘风险的人类受试者，优选为婴儿。用于本发明的用途的营养组合物可以用于0-3岁的人类受试者。在一个优选的实施方案中，营养组合物用于0-12个月的婴儿。在一个优选的实施方案中，营养组合物用于0-6个月的婴儿，更优选0-3个月的婴儿。
在另一个优选的实施方案中，如本文所述，特别是在步骤b)中，在将生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较之后，确定有增加后，直接将所述营养组合物用于婴儿，或者作为紧挨食用人乳或食用人乳之后的第一营养物或食用人乳的替代。
特应性疾病
本发明涉及确定婴儿患特应性疾病的风险，并且本发明还涉及预防婴儿中的特应性疾病或降低婴儿患特应性疾病的风险。在本发明的一个优选实施方案中，特应性疾病为特应性皮炎。
特应性皮炎(AD)，也称为特应性湿疹或过敏性湿疹，是一种慢性炎症性皮肤病，通常会影响婴儿和幼儿。它是一种复发-缓解型疾病，其特征为发作期间剧烈的瘙痒和反复出现的湿疹样病变。这种疾病通常出现于生命的最初几个月和儿童期中，在婴儿期开始，某些例外仅在青春期或成年期开始。随着时间的流逝，通常情况下有70％的病例会有所改善，大多数病例通常会在儿童期末缓解。然而，严重的情况可能会持续到青春期和成年期或在青春期和成年期复发。许多人相信，AD是特应性疾病逐渐发生的第一步，会导致大多数患病个体在后期生命中患有哮喘和过敏性鼻炎。临床上，AD是过敏的第一个指标。AD的最早迹象是皮肤干燥和粗糙，因为AD病变通常在生命的第一个月内不出现。在第一个月以后，湿疹主要出现在面部、脸颊和下巴，在鼻子和鼻旁区域；头皮；躯干；以及婴儿四肢的伸肌表面。在儿童、青少年和成人中，病变主要出现在颈部和弯曲区域如肘部内部和膝盖后部。除弯曲部位外，AD病变通常还可以出现在青少年和成人的手腕、脚踝、眼睑、手和脚上。无论年龄大小，剧烈瘙痒通常与AD相关。AD可以在任何年龄出现，并且可以基于发病年龄被分为三类：婴儿AD、儿童AD和青少年AD。在患有AD的患者中，有45％在生命的前六个月内患该病；60％在生命的第一年内患该病，以及95％在五岁前患该病。通常，发现发病年龄较早与更严重和持续的AD表型有关。确定AD的方法是本领域已知的。AD可由医师确定。一种评估AD严重程度的方法是SCORAD(特应性皮炎的严重程度评分；Consensus Report of the European TaskForce on Atopic Dermatitis.Dermatology 1993；186：23-31)。
实施例
实施例1：脐带上皮的表征
材料和方法
在分娩前征得母亲的知情同意，从出生的正常健康的婴儿总共收集到脐带(n＝15)。收集附有胎盘的三根脐带，并将其切成三个部分：近胚胎、中端和近胎盘。收集来自三个部分中每个部分的代表性碎片，将一个碎片冷冻，将另一碎片固定在福尔马林中，并用石蜡包埋，用于后续的组织学分析。对于其余收集到的脐带(n＝12)，仅从沿脐带的未知、随机位置获得单个脐带碎片。将这些来自沿脐带未知位置的脐带样本固定在福尔马林中，并用石蜡包埋以进行后续分析。
样品应小心处理。分娩后，将整个脐带从胎盘末端至脐带夹切下。将脐带碎片(每个2.5cm)放入装有10％中性缓冲的福尔马林(至少20X组织体积)的50mL Falcon管中，并用封口膜密封该管以确保无泄漏。
收集来自健康幼仔的完整小鼠脐带样品(n＝1)，该幼仔的表皮和胎盘附着在相对的两端，用于组织学检查。整块碎片固定在福尔马林中，石蜡包埋并纵向切片以用于后续的组织学分析。
对于冷冻样品，在室温下将脐带包埋在由聚乙二醇和聚乙烯醇组成的最佳切割温度(OCT)化合物中，并在液氮中冷冻，然后成为冷冻切片以用于组织学分析。对于福尔马林固定石蜡包埋的样品(FFPE)，将脐带固定在福尔马林中，然后用石蜡包埋并切片以用于组织学分析。分别在冷冻切片和石蜡包埋切片上进行免疫荧光(IF)和免疫组织化学(IHC)染色以使目的蛋白可视化。
进行苏木精和伊红(H&E)染色以测定冷冻切片和FFPE切片的形态和结构。对于FFPE切片，在H&E正确染色之前，将切片通过在二甲苯中孵育进行脱蜡，并通过使切片通过百分比降低的乙醇(100％，90％，80％和70％)来重新水化。对于H&E染色，将细胞核用苏木精染色5分钟，并用流动的自来水冲洗。然后用1％酸性醇分化切片30秒，然后用斯科特(Scott’s)的自来水溶液(蓝化溶液)染蓝2分钟，并在步骤之间用流动的自来水冲洗。接着，用伊红Y染料(Sigma)对细胞质进行染色，并通过增加醇的百分比使组织脱水，最后在安装前于二甲苯中孵育。在蔡司(Zeiss)显微镜成像仪下检查H&E染色的组织的干燥载玻片，以测定组织的形态和结构。
将包埋在OCT中的冷冻脐带样品进行冷冻切片，然后安装于Superfrost plus载玻片(Leica)上。然后将切片与一抗在4℃孵育过夜，并用Alexa Fluor 488荧光团缀合的二级山羊抗小鼠(GAM)或山羊抗兔(GAR)抗体(Invitrogen)检测。将染色的载玻片用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染以使细胞核可视化。使用蔡司(Zeiss)显微成像仪检查目的蛋白的表达模式，并对表达水平和模式进行定性评分。
将FFPE脐带样品切成薄片并安装于Superfrost plus载玻片(Leica)上。将载玻片放置在载玻片架中，并在干燥箱中于50℃加热过夜以促进组织的附着。在IHC染色之前，将切片在二甲苯中脱蜡并重新水化。接着，使用1X抗原暴露的柠檬酸缓冲液pH6溶液(Dako)加热暴露过夜，以回收组织切片的抗原，将组织切片中的内源性过氧化物酶通过与1％过氧化氢孵育30分钟淬灭，然后将组织切片中的非特异性位点用10％的山羊血清封闭20分钟。然后将这些切片与一抗在4℃下孵育过夜，并使用DAKO EnVisionTM+System(Dako)通过与HRP聚合物偶联的二抗探测来使抗原可视化。用苏木精对细胞核复染，将切片脱水并安装，以使用蔡司显微成像仪(Zeiss)进行显微镜可视化。
使用组织学方法发现，脐带(UC)上皮表现出可变的表型(薄单层、较厚的单层、双多层区域、单层和双多层之间的过渡区域以及具有较厚的双多层区域的内陷)。UC上皮细腻易碎，应小心处理。UC表型的异质性贯穿整个脐带。表皮和脐带之间没有从简单到分层的逐渐变化(数据未显示)。
确定皮肤和脐带(表皮)上的表皮相关蛋白表达谱是否可比。的确是这种情况，如表1所示。所有获得的样品的UC上皮均用靶向各种上皮生物标志物(角蛋白)的抗体染色，并将这些生物标志物的表达谱与作为参照的表皮进行比较，以测定UC上皮的性质。除角蛋白外，还研究了皮肤各个部位的几种生物标志物(例如，表皮：FLG、LOR、IVL；基底膜：胶原蛋白VII；真皮：波形蛋白)的表达谱，以测定UC上皮及其下层的沃顿胶结缔组织与皮肤的表皮和真皮之间的相似程度。测试了表皮相关蛋白如KLK7、CLDN1和ECAD，以测定UC上皮与表皮的相似性，因为这些蛋白也在表皮中表达。下表1总结了与表皮(表皮是分层上皮的典型实例)相比UC上皮中各种生物标志物的表达谱。
表1：UC和皮肤的表皮相关蛋白表达谱比较
Figure BDA0002792700490000201
Figure BDA0002792700490000211
为了表征UC上皮，对冷冻的和FFPE收集的UC进行几种染色方法。对来自沿UC长度未知位置的冷冻脐带切片的选定碎片进行IF染色，对来自三个UC子部分(胎儿端、中端和胎盘端)的代表性FFPE切片进行系统IHC染色，以测定角蛋白和表皮蛋白沿UC长度的分布，并对来自不同UC样品的代表性UC碎片进行了IHC染色。
发现UC上皮表达：分层的上皮相关角蛋白K10和K14；简单的上皮相关角蛋白K7/8、K18和K19；以及和增生相关的角蛋白K6和K16。发现在UC上皮和表皮中分层的上皮角蛋白K10和K14的分布模式相似。仅在表皮基底层上方的细胞层中表达的上基底层生物标志物K10，类似地仅在UC上皮多层区域的上层细胞中表达。表皮基底层的标志物K14，被发现在UC上皮的单层和多层区域中的整个UC上皮中都有表达。然而，与不表达任何简单上皮角蛋白的表皮不同，发现UC上皮在整个UC上皮中表达简单的上皮生物标记物K7、K8、K18和K19。UC上皮中K7、K8和K18的表达远低于K19。还发现K6和K16增生相关蛋白在整个UC上皮中都有表达。在所研究的三种表皮角质化包膜屏障蛋白中，IVL和LOR均在整个UC上皮中，由在UC的单层和多层区域中的所有上皮细胞表达。与在整个UC上皮中均匀强烈表达的IVL不同，LOR在多层区域的表层比在下层中的表达程度更高。
如同表皮，UC上皮也表达基底膜生物标志物胶原VII。UC的沃顿胶，如同皮肤的真皮，也表达波形蛋白，一种间充质细胞的标志物。类似地，在表皮中发现的表皮蛋白酶KLK7、紧密连接蛋白CLDN1和粘附连接蛋白ECAD也被发现在UC上皮中表达。发现KLK7的表达在UC上皮的表层中较高，而另一方面，发现CLDN1和ECAD在整个UC上皮中表达。
总之，表征了沿整个UC的长度的横截面和代表性的纵切面的UC上皮。UC上皮代表独特的过渡型上皮，其本身既不简单也未分层，因为它沿整个UC的长度同时表达简单上皮(K7、K8、K18、K19)和分层上皮(K10、K14、LOR、IVL)的标志物。UC上皮，特别是分层的多层区域可以被认为是尚未完全成熟的早期皮肤的代表。两种组织之间的表皮分化标志物表达的巨大相似性表明，UC上皮(可以通过非侵入性的方式符合伦理并轻松地获得)可用作表皮的替代物，代替婴儿或幼儿的表皮活检，以进行预测性生物标志物研究和监测早发性AD事件。
此外，从样本中获得UC的哪一部分并不重要。相反，我们认为，在将这些样品用于下游分析之前，将组织学用作初始质量检查步骤以确保收集到的组织的完整性将更为重要。
实施例2：识别脐带中特应性皮炎的潜在早期预测生物标志物
GUSTO出生队列共招募了1247名受试者。在这项脐带蛋白生物标志物先导研究中，选择了中国GUSTO受试者(n＝42)的分组。病例(n＝20)是在三个月时患有AD的受试者。对照组(n＝22)是在三个月内无AD，无家族AD史的受试者。下表2总结了脐带蛋白生物标志物研究队列的人口统计学和临床特征。通过在三个月、六个月、12个月、15个月、18个月和36个月完成的问卷调查获得人口统计学信息和临床随访数据。在18个月和36个月进行皮肤点刺测试(skin prick test)。在第18个月和第36个月的临床随访中出现AD时记录SCORAD。
表2：脐带蛋白生物标志物研究队列(n＝42)的人口统计学和临床特征
Figure BDA0002792700490000231
过敏是指哮喘、AD、过敏性鼻炎。家庭是指父母和兄弟姐妹。SCORAD，对特应性皮炎的评分。SCORAD平均值和标准差读数基于四个受试者，因为只有四个受试者在第18个月的临床随访期间有活性的AD。
由出生时收集的冷冻脐带(n＝42)制成的全脐带蛋白裂解物，以及健康婴儿和患有早期AD的婴儿的相应临床数据。
通过使用均化器在RIPA缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中均化粉碎的脐带样品，从整个脐带中提取蛋白质。一旦组织完全破裂，将碎片在3000rpm，4℃下离心2分钟。然后将混合物中的上清液在13200rpm，4℃下再次离心10分钟，以除去残留的不溶物质。然后将最终得到的上清液定量，并保存在-80℃下用于下游蛋白质印迹分析。
使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白质检测试剂盒(Pierce)测定样品的蛋白质浓度。从连续稀释液中制备25μl稀释的牛血清白蛋白标准品。将含有50份BCA溶液和1份4％的硫酸铜溶液的BCA工作试剂添加到标准品和蛋白质样品中，并简单混合。然后将该混合物在37℃下孵育30分钟，然后在540nm处读取吸光度。使用稀释的牛血清白蛋白标准品的吸光度值绘制标准曲线，并用于测定每种蛋白质样品的蛋白质浓度。
将20μg蛋白质样品上样到预制的Any kDTM
Figure BDA0002792700490000241
TGXTM凝胶(Bio-rad)中，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚二氟乙烯(PVDF)膜上。转移后，将PVDF膜用5％的脱脂奶封闭，然后在4℃下与一抗孵育过夜，然后用在下表8列出的稀释液中的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗进行探测。使用Immun-Star HRP化学发光底物试剂盒(Bio-rad)通过增强的化学发光检测结合的二抗。使用LICOR Odyssey成像仪(LI-COR)可视化蛋白条带，并通过使用LICOR Image Studio软件2.1版(LI-COR)测量的光密度法评估其强度，然后在针对GAPDH归一化后进行定量。
使用Windows的GraphPad Prism 6(GraphPad软件)分析和可视化蛋白质印迹实验数据。基于直方图的可视化分析假设正态性，并进行了Shapiro-Wilks检验。用光密度测定法测定蛋白质印迹蛋白条带的定量。将测试组的所有蛋白质密度针对各自的GAPDH带强度进行归一化。数据表达为平均值±平均值的标准误差。Mann Whitney U检验，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01(AD：n＝20，非AD：n＝22)。
使用Windows的SPSS 16.0(SPSS Inc.)进行接收器工作特性(ROC)分析，以测定每个单独的生物标志物的临界阈值。通过用以下公式计算Youden指数(J)来测定生物标志物的临界阈值：灵敏度+特异性-1。当灵敏度和特异性358都具有同等重要性时，与J的最大值对应的点表示生物标志物的最佳临界阈值。J的这个最大值对应于ROC曲线的最左上角，该最大值表示给出最高真阳性率和最低假阳性率的临界值。
大于计算的临界阈值的实验值代表与阳性预测结果对应的阳性测试结果。
复合生物标志物指数或已识别的潜在生物标志物组合板通过以下两种方法获得：黑盒建模和风险评分建模。两种建模方法均使用Windows的SPSS 16.0(SPSS Inc.)进行的多个二元逻辑回归分析(binary logistic regression analysis)。
在黑盒建模中，生物标志物变量之间的关系是未知的，无法解释。在这种建模方法中，通过多个二元逻辑回归将源自每个生物标志物的蛋白质印迹光密度分析的原始生物标志物水平进行组合，以得到范围在0至1(预测的概率)的组合的复合标志物得分。如上所述，基于这些组合的预测概率来计算组合的复合标志物临界阈值。大于组合的复合标志物临界阈值的实验值代表与阳性预测AD结果对应的阳性测试结果。
在风险评分建模中，将源自通过多个二元逻辑回归分析计算的几率比值(oddsratio)得出的预测AD的风险评分分配给每个单个的生物标志物。在这种建模方法中，首先如上所述测定每个单个的生物标志物的临界值。大于组合的复合标志物临界阈值的实验值代表与阳性预测结果对应的阳性测试结果。然后，通过多个二元逻辑回归将每个单个的生物标志物的预测结果的结果组合，以形成两个单独的风险评分模型。第一个模型组合了基于Mann Whitney U检验的三个(显著不同)生物标志物，第二个模型组合了所有五个经过测试的生物标志物。使用ROC分析，基于风险评分的总和，计算出组合的风险评分临界阈值。对于每个超过生物标志物临界阈值的单个生物标志物的阳性测试结果，均给出了相应的风险评分。单个生物标志物的阴性测试结果的风险评分为零。然后将给予每个受试者的所有单个生物标志物的风险评分相加，并与组合的风险评分临界阈值进行比较。每个受试者的计算出的总体风险评分均大于计算出的组合风险评分临界阈值，代表与AD阳性预测对应的阳性测试结果。
将五个因素：i)灵敏度、ii)特异性、iii)阳性预测值(PPV)、iv)阴性预测值(NPV)和v)区分能力进行比较，以评估单个和复合生物标志物。超过源自ROC分析的临界阈值的实验值(源自蛋白质印迹光密度法分析)表示对AD的阳性预测。然后将预测结果针对从临床数据获得的实际观察到的临床结果进行交叉制表。预测和观察到的结果数均用于计算灵敏度，真实阳性率或正确识别的实际阳性比例；特异性，真实阴性率或正确识别的阴性比例；阳性预测值，即为真实阳性的阳性结果所占的比例；阴性预测值，即为真实阴性的阴性结果所占的比例。
使用Windows的SPSS 16.0(SPSS Inc.)进行的ROC分析通过计算ROC曲线下的面积(AUROC)来测定单个生物标志物在区分AD和非AD方面的区分能力。0.50至0.60之间的AUROC值被认为是无用的测试；0.60至0.70之间的值被认为是较差的测试；0.70至0.80之间的值被认为是一般的测试；0.80至0.90之间的值被认为是良好的测试；0.90至1之间的值被认为是优异的测试。计算P值和95％置信区间。小于0.05的P值被认为统计学上显著。
使用Windows的GraphPad Prism 6(GraphPad软件)分析和可视化蛋白质印迹实验数据。基于直方图的可视化分析假设正态性，并进行Shapiro-Wilks检验。使用MannWhitney U检验进行AD病例与非AD对照组之间的显著性检验，以鉴定出可区分AD病例和非AD对照的潜在生物标志物。小于0.05的P值被认为统计学上显著。＊，P＜0.05，＊＊，P＜0.01，以及＊＊＊，P＜0.001表示AD组和非AD组之间的统计学显著差异。
结果
进行蛋白质印迹以测定脐带中的FLG、IVL、LOR、GATA3和KLK7表达。在所有脐带样品中均检测到FLG(～26kD)、IVL(～120kD)、LOR(～52kD)、GATA3(～48kD)和(前)-KLK7(～38kD)。蛋白质印迹光密度法分析显示，与没有患AD的婴儿相比，在三个月患有AD的婴儿中LOR(p＝0.010)、GATA-3(p＝0.008)和KLK7(p＝0.015)的水平受到显著差异化调节，AD受试者中的值更高。与没有患AD的婴儿相比，在三个月患有AD的婴儿中FLG和IVL的表达也更高，但这些相关性呈现一种趋势(p＜0.10)。
表2：有和没有AD的婴儿的脐带中生物标志物蛋白密度水平的中值
Figure BDA0002792700490000261
来自Mann Whitney U检验的P值。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01
通过进行ROC分析(ROC＝接收器工作特性，其中针对1-特异性对灵敏度作图，并计算AUROC(ROC曲线下的面积)、灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV))单独评估了每种蛋白质生物标志物以确定其作为AD预测生物标志物的潜力(参见表4)。
表4：FLG、IVL、LOR、GATA-3和KLK7作为AD的潜在预测生物标志物
Figure BDA0002792700490000271
PPV，阳性预测值；NPV，阴性预测值。＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。
LOR、GATA-3和KLK7水平是一般的生物标志物，因为它们的AUROC值在0.7至0.8之间。
表5：两种风险评分模型中每种生物标志物的风险评分
(5种生物标志物风险评分模型和3种生物标志物风险评分模型)
Figure BDA0002792700490000272
Figure BDA0002792700490000281
通过进行ROC分析和计算AUROC、灵敏度、特异性、PPV和NPV，对通过黑盒建模和风险评分建模创建的复合生物标志物指数或单个生物标志物的组合板进行评估，以测定其作为AD预测指标的潜力(表6)。
表6：源自黑盒建模和风险评分建模的复合标志物的评估
Figure BDA0002792700490000282
PPV，阳性预测值；NPV，阴性预测值。＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001。
三种蛋白源自黑盒的复合生物标志物有95％的时间可以正确预测在三个月患AD的人(假阴性率为5％)，并且有54.5％的时间可以正确预测那些未患AD的人(假阳性率为45.5％)。在那些具有阳性预测的人中，患AD的概率为65.5％，在那些具有阴性预测的人中，未患AD的概率为92.3％。
五种蛋白源自黑盒的复合生物标志物有75％的时间可以正确预测在三个月患AD的人(假阴性率为25％)，并且有86.4％的时间可以正确预测那些未患AD的人(假阳性率为14.6％)。在那些具有阳性预测的人中，患AD的概率为83.3％，在那些具有阴性预测的人中，未患AD的概率为79.2％。
三种蛋白源自风险评分的复合生物标志物有75％的时间可以正确预测在三个月患AD的人(假阴性率为25％)，并且有72.7％的时间可以正确预测那些未患AD的人(假阳性率为27.3％)。在那些具有阳性预测的人中，患AD的概率有71.4％，在那些具有阴性预测的人中，未患AD的概率为76.2％。
五种蛋白源自风险评分的复合生物标志物有100％的时间可以正确预测在三个月患AD的人(无假阴性)，并且有54.5％的时间可以正确预测那些未患AD的人(假阳性率为45.5％)。在那些具有阳性预测的人中，患AD的概率有66.7％，在那些具有阴性预测的人中，未患AD的概率为100％。如AUROC值从0.6至0.7之间(FLG和IVL)和0.7至0.8之间(LOR、GATA-3和KLK7)(表6)至0.8至0.9之间的显著增加所示，组合单个的生物标志物以形成复合生物标志物指数可以增加生物标志物在预测AD中的鉴别价值。基于从ROC曲线图测定的AUROC值，通过组合三个显著的生物标志物LOR、GATA-3和KLK7或所有五个测试的生物标志物确定的复合标志物是AD的良好预测生物标志物。
组合单个生物标志物以形成复合生物标志物在反映AD的多因素性质方面更为现实，并且还可以提高生物标志物的预测能力，如通过计算出的AUROC值的提高所示。因为其在三个月患AD的人与未患AD的人之间具有最佳的区分能力，源自经风险评分建模获得的所有五种生物标志物的组合的复合生物标志物表现出最佳的性能。然而，这种由五种生物标志物复合物组成的风险评分测试是高灵敏度-低特异性测试，灵敏度值为100％，特异性值为54.5％，PPV为66.7％，以及NPV为100％。这种复合生物标志物总是可以正确地预测那些最终会患AD的人，没有漏掉任何患该疾病的人(没有假阴性)，可以在54.5％的时间内正确预测出那些不会患有AD的人，并错误地预测45.5％不会患病的人会患有AD(假阳性)。该测试的假阳性预测率为45.5％。由于所提出的预防或治疗的营养组合物几乎没有副作用，因此仍然是临床上可接受的。
如权利要求中所述的这些生物标志物，特别是复合生物标志物，更特别地是导致100％测试灵敏度的具有五种生物标志物的复合生物标志物是有前景的，允许鉴定出所有患AD的高风险婴儿，从而可以将该高风险人群纳入早期预防性治疗方案，包括给予本发明权利要求中的特定营养组合物。此方案可能会限制AD的形成，可能会改变特应性进展的过程，并阻碍以后生命中过敏的进一步发展。

Claims (17)

1.一种用于确定婴儿患特应性疾病的风险的方法，其中该方法包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中的脐带上皮细胞的至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且其中样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加表明患特应性疾病的可能性增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的健康参考婴儿组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括在至少一种生物标志物蛋白的水平增加的情况下为婴儿提供特应性疾病的定制饮食。
3.一种为有患特应性疾病风险的婴儿定制饮食的方法，其包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中的脐带上皮细胞的至少一种生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且在样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加的情况下提供给婴儿特应性疾病定制饮食，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中特应性疾病定制饮食包含水解蛋白、产乳酸细菌和不可消化的低聚糖中的至少一种。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种生物标志蛋白选自兜甲蛋白、GATA-3，以及激肽释放酶-7。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定了兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7的水平，并且其中与相同蛋白的参考值相比，样品中兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7各自的水平增加表明患特应性疾病的风险增加。
7.根据权利要求6所述的方法，其中还在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中来自脐带上皮细胞的生物标志物蛋白的水平，所述生物标志物蛋白选自丝蛋白和内批蛋白，优选两者，并且其中与相同蛋白的参考值相比，样品中丝蛋白和/或内批蛋白，优选两者的水平增加表明患特应性疾病的可能性增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同生物标志物蛋白的平均水平。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，其中兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350，丝蛋白≥0.098和/或内批蛋白≥6.040，则生物标志物蛋白的水平增加。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述特应性疾病为特应性皮炎。
10.一种营养组合物，其包含选自水解蛋白、产乳酸细菌和不可消化的低聚糖中的至少一种，用于预防婴儿的特应性疾病，包括：
a)在体外测定包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中的脐带上皮细胞的至少一种选自兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7的生物标志物蛋白的水平，和
b)将至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值进行比较，
并且在样品中至少一种生物标志物蛋白的水平与参考值相比有增加的情况下给予婴儿所述营养组合物，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同的至少一种生物标志物蛋白的平均水平。
11.用于根据权利要求10所述用途的营养组合物，其中兜甲蛋白、GATA-3和激肽释放酶-7的水平增加。
12.用于根据权利要求10或11所述用途的营养组合物，其中还测定了在包含来自婴儿的脐带上皮细胞的样品中来自脐带上皮细胞的生物标志物蛋白的水平，所述生物标志物蛋白选自丝蛋白和内批蛋白，优选两者，并且其中与相同生物标志物蛋白的参考值相比，样品中丝蛋白和/或内批蛋白，优选两者的水平增加，其中参考值基于在三个月大时未患特应性疾病的对照组中相同生物标志物蛋白的平均水平。
13.用于根据权利要求10至12中任一项所述用途的营养组合物，其中如果相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平进行归一化的生物标志物蛋白的水平，其中兜甲蛋白≥6.040，GATA-3≥0.220，激肽释放酶-7≥0.350，丝蛋白≥0.098以及内批蛋白≥6.040，则生物标志物蛋白的水平增加。
14.用于根据权利要求10-13中任一项所述用途的营养组合物，其中所述特应性疾病为特应性皮炎。
15.用于根据权利要求10-14中任一项所述用途的营养组合物，其中营养组合物为婴儿配方物或后续配方物。
16.用于根据权利要求10-15中任一项所述用途的营养组合物，其中婴儿的年龄为0-6个月，更优选0-3个月。
17.用于根据权利要求10-16中任一项所述用途的营养组合物，其中在步骤b)中与生物标志物的水平比较之后确定增加后，直接给予所述营养组合物，或者将所述营养组合物作为紧挨食用人乳或食用人乳之后的第一营养物。
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