CN112165933A - 用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新药形式的多糖包裹选自表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星的蒽环霉素，特别是被葡聚糖包裹，用于治疗特定的肿瘤。

Description

用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素
技术领域
本发明涉及一种多糖包裹蒽环霉素的新药形式，用于治疗特定的肿瘤，所述多糖选自表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星，特别是葡聚糖。该新形式的药物施用可以增加化学治疗剂的相对施用量，提高其靶向所需效果的部位，同时确保对机体的较低毒性，从而可以提高使用多糖包裹蒽环霉素进行的抗肿瘤(抗癌症)药疗法的有效性。
技术背景
蒽环霉素属于抗癌抗生素，被广泛用作各种肿瘤尤其是白血病、转移性乳腺癌、卵巢癌以及结肠癌和直肠癌的低剂量化学治疗药物。蒽环霉素干扰基本细胞过程的功能，包括DNA读取和复制以及细胞蛋白质合成。这些药物包括阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星、放线菌素和博来霉素。蒽环霉素具有非常相似的化学结构。蒽环霉素是化学治疗药物中最活跃的一组。它们对包括血液恶性肿瘤和实体瘤(淋巴瘤、胃癌、非小细胞肺癌、肉瘤、乳腺癌)在内的多种肿瘤都非常有效。在生产的许多衍生物中，目前有几种蒽环霉素被用作药物，包括阿霉素(DOX)、柔红霉素(DAU)、表柔比星(EPI)和伊达比星(IDA)[参见文献，第200项]。
蒽环霉素的临床使用受到肿瘤细胞耐药性和对健康组织毒性的发展的限制。蒽环霉素的特别严重的副作用包括恶心和呕吐、粘膜炎、口腔炎、脱发、骨髓抑制，这些症状在大多数情况下是可逆的。骨髓抑制虽然是可逆的，但使患者容易遭受严重的并发症，例如治疗期间的感染。蒽环霉素的施用还由于其高毒性而引起不可逆的副作用：如果意外地进行血管外施用，则施用部位的软组织坏死以及高心脏毒性(尤其是慢性充血性心肌病和心力衰竭的形式)。以当前形式服用蒽环霉素时，高心脏毒性会带来特别高的风险，因为蒽环霉素产生的自由基会引起心脏的肌浆网过氧化，从而导致钙2+介导的心肌坏死。所述毒性对心脏组织是选择性的，因为在心脏组织中不存在能够中和自由基的过氧化氢酶[参见文献，第207项]。
为限制副作用，已确定蒽环霉素DAU和DOX的最大推荐累积剂量应分别为500或450至600mg/m2[参见文献，第201项]。
在各种情况下，单独的蒽环霉素可以互换使用；但是，通常[参见文献，第202项]：
-阿霉素(DOX)用于治疗乳腺肿瘤、乳腺癌、小儿实体瘤、威尔姆氏瘤、肉瘤、软组织肉瘤、尤因肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤、淋巴白血病、粒细胞性白血病、急性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、子宫内膜癌、小细胞肺癌、胃癌、乳头状和滤泡性甲状腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤，
-柔红霉素(DAU)用于治疗白血病，尤其是急性淋巴细胞白血病和髓样白血病，
-伊达比星(IDA)用于治疗白血病，尤其是急性髓细胞性白血病、急性淋巴性白血病和乳腺癌；
-表柔比星(EPI)用于治疗乳腺癌、淋巴瘤(包括恶性淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤(包括软组织)、卵巢癌、白血病、小细胞肺癌、胃癌、膀胱肿瘤。
专利PL221351公开了一种从多糖及其衍生物获得纳米颗粒的方法，所述多糖及其衍生物是活性物质的载体，这是由于其特定的部分氧化形成醛基以及含有胺或其他具有R-NH2结合基团的化合物与醛反应，其中含有胺、酰胺或酰肼基团的活性物质可以是药物，例如柔红霉素、阿霉素。因此，PL221351公开了一种用多糖包裹蒽环霉素的生产方法。
第一种被授权用于医疗用途的基于纳米颗粒的药物(FDA 1995)是脂质体和阿霉素的组合。从那以后，纳米颗粒与蒽环霉素的几种组合已被批准用于治疗。但是，所有溶液均基于脂质体，并且仅涉及该组中的两种药物：阿霉素和柔红霉素[参见文献第208条]。
蒽环霉素尤其是阿霉素、柔红霉素、伊达比星、表柔比星在治疗肿瘤方面的功效因缺乏靶向药物向肿瘤性病变的组织的递送和低治疗指数以及较高毒性而降低。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的缺陷，并提供用于治疗特定肿瘤的新形式的蒽环霉素药物，其形式为包裹多糖、优选葡聚糖的阿霉素、柔红霉素、表柔比星和伊达比星，可以确保将药物有针对性地传递至具有肿瘤性病变的组织，与游离形式的蒽环霉素相比，具有更高的治疗指数，并且具有毒性降低的特点。
尽管已知纳米颗粒形式的各种形式的药物，包括抗肿瘤药物，但是没有用特定多糖包裹特定蒽环霉素用于治疗特定肿瘤的情况，通过使用新形式的药物，这种药物的毒性减小了，因此，它们可以以改良的形式使用，包括更高的剂量，从而获得更好的治疗效果。
令人惊讶地发现，用多糖更优选用葡聚糖包裹的选自阿霉素、柔红霉素、表柔比星和伊达比星的蒽环霉素，降低了药物的整体毒性并提高了其对受试者的耐受性，即使没有通过靶向粒子靶向各自的部位。
本发明涉及一种用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，所述蒽环霉素选自表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星，并且所述肿瘤选自小儿实体瘤、威尔姆氏肿瘤、肉瘤、软组织肉瘤、尤因肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性白血病、淋巴母细胞性白血病、粒细胞性白血病、髓样白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、肉瘤、软组织肉瘤、乳腺肿瘤、乳腺癌、肺肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、胃肿瘤、胃癌、膀胱癌、来自移行上皮细胞的乳头状膀胱癌、甲状腺癌、甲状腺癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、胰腺肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、大肠癌。
优选地，在用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素中，多糖选自葡聚糖、淀粉及其衍生物、直链淀粉及其衍生物、纤维素衍生物、糖原、透明质酸、肝素、海藻酸、角叉菜胶，更优选地，多糖选自葡聚糖、纤维素及其衍生物、直链淀粉、淀粉和肝素。
优选地，在用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素的应用中，所述肿瘤选自乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌。
优选地，在用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素的应用中，将特定多糖包裹的特定蒽环霉素以高于未用多糖包裹的相同蒽环霉素确定的最大耐受剂量(MTD)的剂量以及低于为特定多糖包裹的相同蒽环霉素所确定的最大耐受剂量的剂量施用于待治疗的受试者，其中所述受试者优选是哺乳动物，并且更优选所述受试者是人。
优选地，所述用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素是表柔比星，其用于治疗选自乳腺肿瘤、乳腺癌、淋巴瘤包括恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤包括软组织肉瘤、卵巢癌、宫颈癌、白血病、肺肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、大肠癌的肿瘤。
优选地，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素是用葡聚糖包裹的表柔比星。
优选地，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，当其为葡聚糖包裹的表柔比星时，用于治疗乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌。
在同样优选的实施方案中，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素以葡聚糖包裹的表柔比星的形式旨在治疗卵巢癌。
在一个特别优选的实施方案中，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素以葡聚糖包裹的表柔比星形式旨在治疗胰腺癌。
优选地，所述用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素是柔红霉素，其用于选自白血病、特别是急性淋巴细胞白血病和髓样白血病、乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌的肿瘤，更优选地，柔红霉素被葡聚糖包裹。
优选地，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素以葡聚糖包裹的柔红霉素形式，旨在治疗选自白血病，特别是急性淋巴细胞白血病和髓样白血病、卵巢癌、乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌的肿瘤。
同样优选地，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素是多糖包裹阿霉素，其用于治疗选自小儿实体瘤、威尔姆斯肿瘤、肉瘤、软组织肉瘤、尤因肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤、淋巴白血病、淋巴母细胞性白血病、粒幼细胞性白血病、急性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、乳腺肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、肺肿瘤、小细胞肺癌、胃癌、甲状腺癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、结肠直肠癌的肿瘤，其中优选用葡聚糖包裹阿霉素。
当用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素是用多糖包裹伊达比星时，优选用于治疗选自白血病，尤其是急性髓细胞白血病和急性淋巴性白血病、乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌的肿瘤，其中优选伊达比星用葡聚糖包裹。
在一个优选的实施方案中，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，用于肿瘤治疗的蒽环霉素颗粒的平均尺寸为10-500nm，更优选50-200nm，最优选70-160nm(直径处于水合状态)。
在本发明的所述实施方案中，在抗肿瘤疗法中，多糖包裹蒽环霉素可用于单一疗法、联合疗法，同时或顺序地。已知的化学治疗剂，例如顺铂或放射治疗剂可以是其他辅助成分。这种治疗减少了不良的副作用。
通常，多糖包裹蒽环霉素旨在用于静脉内施用，尽管在特定的实施方案中，例如在药物治疗中，对于膀胱癌的治疗，它们可用作膀胱内输注。
根据本发明的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素以最终的可注射制剂的形式包含水性和非水性等渗无菌溶液，任选地包含抗氧化剂、缓冲剂、等渗添加剂等。典型的载体是例如注射水或盐溶液。
通常，根据本发明的最终用途的制剂包含用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，该制剂通过将它们与载体或稀释剂稀释或混合而获得。
考虑到肿瘤的类型、治疗的类型、患者的年龄、患者的体重、患者的大致体表以及其他特殊情况如肝脏参数、肾脏、心脏病史等，确定用本发明的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素的剂量。本领域技术人员将能够确定特定患者的正确剂量。但是，单次施用不应超过为特定多糖包裹特定蒽环霉素所确定的最大耐受剂量。
说明书中提及的出版物及其中的参考文献也包括在本文中作为参考。
附图说明
为了更好地理解，已经在实施方式和附图中示出了本发明，其中：
图1显示了获得的含药物(A)NPs_EPI，B)NPs-DAU的纳米颗粒的直径分布。纳米颗粒在注射水中反复再次水化3小时后获得直径分布。
图2是对所选肿瘤系的细胞毒性的比较。在系A)A2780，B)A549，C)ACHN，D)AU565，E)COLO205，F)OVCAR-3，G)PANC1，H)HeLa和I)MCF7上具有包裹的表柔比星的纳米颗粒。名称Epi-是指单独施用的表柔比星，NPs_Epi是葡聚糖包裹的表柔比星的施用。
图3是对所选肿瘤系的细胞毒性的比较。在系A)A2780，B)MCF7 C)HeLa，D)OVCAR-3，E)AU565上具有包裹的柔红霉素的纳米颗粒。名称DAU-是指柔红霉素单独施用，NPs_DAU是葡聚糖包裹的柔红霉素的施用。
图4.该图显示了在确定葡聚糖纳米颗粒中包裹的表柔比星(NPs_Epi)的抗肿瘤功效期间，小鼠的肿瘤大小和体重的变化，以两种剂量施用：1/2MTD(3.75mg/kg bw的剂量)和3/4MTD(22.5mg/kg bw)，与对照(接受注射水)和非包裹的表柔比星的施用(剂量为15mg/kgbw)相比。
具体实施方式
提供以下实施例仅用于说明本发明并阐明其各个方面，而不是限制本发明，并且不应认为其等同于所附权利要求书中限定的本发明的总范围。在下面的实施例中，除非另有说明，否则采用本领域中使用的标准材料和方法，或者根据制造商对特定材料和方法的建议进行处理。
实施例
实施例1
多糖包裹蒽环霉素的生产
(a)葡聚糖包裹的表柔比星(NPs_EPI)的制备
按照专利PL221251(具体参见实施例2和4)中所述由多糖制备纳米颗粒的方法，使用分子量为70kDa(氧化度为5-15％)的葡聚糖和十二烷基胺盐酸盐，制备葡聚糖包裹的表柔比星。缠绕剂十二烷基胺在葡聚糖中产生的醛基的取代度为10-20％。表柔比星在葡聚糖中产生的醛基的取代度为4-10％。其他产生的醛基被丙氨酸取代。使用NanoSight LM 10(405nm激光)在水溶液中测得制备的纳米颗粒的平均粒径在80至140nm之间(图1A)。纳米颗粒干物质中确定的表柔比星含量为3.0-5％。将获得的纳米颗粒冷冻干燥并在4℃的温度下储存在密封容器中。在测试之前，将纳米颗粒在注射水中再次水化(悬浮)3小时。
(b)葡聚糖包裹的柔红霉素(NPs_DAU)的制备
根据专利PL221251(具体参见实施例2和4)中所述的由多糖制备纳米颗粒的方法，使用分子量为70kDa的葡聚糖(氧化度为5-15％)和十二烷基胺盐酸盐制备葡聚糖包裹的柔红霉素。缠绕剂十二烷基胺在葡聚糖中产生的醛基的取代度为10-20％。柔红霉素在葡聚糖中产生的醛基的取代度为4-10％。其他产生的醛基被丙氨酸取代。使用NanoSight LM 10(405nm激光)在水溶液中测量产生的纳米粒子的平均大小在80至140nm之间(图1B)。纳米颗粒干物质中确定的柔红霉素含量为3.0-5％。将获得的纳米颗粒冷冻干燥并在4℃的温度下储存在密封容器中。在测试之前，将纳米颗粒在注射水中再次水化(悬浮)3小时。
(c)葡聚糖包裹的阿霉素(NPs_DOX)的制备
根据专利PL221251(具体参见实施例2和4)中所述的由多糖制备纳米颗粒的方法，使用分子量为70kDa(氧化度为5-15％)的葡聚糖和十二烷基胺盐酸盐制备葡聚糖包裹的阿霉素。缠绕剂十二烷基胺在葡聚糖中产生的醛基的取代度为10-20％。阿霉素在葡聚糖中产生的醛基的取代度为4-10％。其他产生的醛基被丙氨酸取代。使用NanoSight LM 10(405nm激光)在水溶液中测得的纳米颗粒为80-150nm。纳米颗粒干物质中确定的阿霉素含量为3.0-5％。将获得的纳米颗粒冷冻干燥并在4℃的温度下储存在密封容器中。在测试之前，将纳米颗粒在注射水中再次水化(悬浮)3小时。
(d)葡聚糖包裹的伊达比星(NPs_IDA)的制备
根据专利PL221251(具体参见实施例2和4)中所述的由多糖制备纳米颗粒的方法，使用分子量为70kDa(氧化度为5-15％)的葡聚糖和十二烷基胺盐酸盐制备葡聚糖包裹的伊达比星。缠绕剂十二烷基胺在葡聚糖中产生的醛基的取代度为10-20％。伊达比星在葡聚糖中产生的醛基的取代度为4-10％。其他产生的醛基被丙氨酸取代。使用NanoSight LM 10(405nm激光)在水溶液中测得的平均粒径为80-150nm。纳米颗粒干物质中测定的伊达比星含量为3.0-5％。将获得的纳米颗粒冷冻干燥并在4℃的温度下储存在密封容器中。在测试之前，将纳米颗粒在注射水中再次水化(悬浮)3小时。
使用类似的方法来制备用另一种多糖：纤维素、直链淀粉、淀粉和肝素包裹表柔比星、柔红霉素、阿霉素和伊达比星的纳米颗粒。使用类似的方法从特定的多糖葡聚糖和纤维素、直链淀粉、淀粉、肝素中获得纳米颗粒，纳米颗粒不包含蒽环霉素，并作为进一步研究的对照。
实施例2
多糖包裹蒽环霉素对细胞系(结合药物的纳米颗粒)的细胞毒性测定
该研究的主题是确定包裹有多糖EPI、DAU、DOX、IDA的蒽环霉素组合对细胞系的细胞毒性。使用基于比色技术(MTT)的定量方法评估毒性[参见文献203项]。在该测试中，细胞中存在的琥珀色脱氢酶将可溶性四唑盐(3-4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物转化为还原形式。反应产生水不溶性紫色结晶的甲臜。形成的晶体数量取决于酶的活性，因此它与样品中活细胞的数量成正比。分光光度法测量需要使用有机溶剂溶解获得的晶体(异丙醇)。通过分光光度法在570nm波长下测量颜色强度的变化。对含有被测试的蒽环霉素的多种纳米溶液的稀释液(9)进行了测试。用于MTT测试的纳米颗粒的基线浓度为2.5mg纳米颗粒/ml。将结果与具有等摩尔药物浓度(等于包裹在纳米颗粒中的浓度)的纯药物获得的细胞毒性结果进行比较。还对不含药物的纳米颗粒进行了研究(载体本身的获得类似于含有药物的纳米颗粒)。未暴露于毒性物质的细胞用作毒性研究的对照。
研究方案[见文献204、205项]。
达到85-90％汇合后，使用0.25％的胰蛋白酶溶液对细胞进行胰蛋白酶处理。然后将细胞离心(1200rpm，5分钟)，并悬浮在适合特定细胞系的培养基中。培养基不含酚红。将细胞以每培养孔1000个细胞/100μl培养基的浓度铺板(96孔板)。将制备的板温育(37℃/5％CO2/22h至26h)。随后，将培养基替换为新鲜培养基(100μl)，其中包含适当浓度的测试纳米颗粒，并放置24小时(37℃/5％CO2)。在经过测试时间之后，除去培养基，并用50μl浓度为1mg/ml的MTT试剂溶液代替。将板温育2小时(37℃/5％CO2)。随后，除去MTT溶液，并加入100μl异丙醇。在振荡器上摇动平板2分钟后，读取570nm波长的结果(参考值为650nm)。未暴露于有毒物质(对照)的细胞的吸光度读数OD 570的平均值应高于0.7[参见文献206项]。
数据分析
活细胞数量的减少导致样品中代谢活性的降低。根据570nm的光密度进行的监测，这种减少与形成的蓝色和紫色甲臜的数量直接相关。以下公式(C.1)用于计算生存力相比对照的降低：
Figure BDA0002669802860000081
其中：·OD570e是测试样品的测试吸光度的平均值；·OD570b是对照的测试吸光度的平均值。
使用Dixon Q检验对获得的结果进行统计分析。
表1测试的细胞系
Figure BDA0002669802860000082
Figure BDA0002669802860000091
包含蒽环霉素的受试纳米颗粒制剂的毒性应类似于纯药物的毒性。因此，这样的纳米颗粒应该没有毒性。
不含蒽环霉素的多糖纳米颗粒的毒性分析
获得的结果证实了单独的载体，以葡聚糖纳米颗粒形式的多糖纳米颗粒形式，对所有测试的细胞系没有毒性。对于其他多糖载体(纤维素、直链淀粉、淀粉和肝素的纳米颗粒形式的载体)也获得了相似的结果。
最高浓度的纳米颗粒(2.5mg纳米颗粒/ml)可导致毒性降低多达20％(表1)。
表1.显示在HeLa细胞系上对葡聚糖载体进行MTT细胞毒性测试的结果
Figure BDA0002669802860000092
Figure BDA0002669802860000101
其中SD:n＝8时的标准偏差
含蒽环霉素的多糖纳米粒的毒性分析
对含蒽环霉素的纳米颗粒(根据实施例1生产)进行的研究大多显示出与纯药物(例如图2，DAU纳米颗粒对MCF-7细胞系和EPI纳米颗粒对COLO 205细胞系的毒性图)相似的毒性图。另一方面，对于一些细胞系观察到了更高的体外毒性，尽管使用了等摩尔的药物浓度(例如图3D(OVCAR3_NPs-DAU)DAU-葡聚糖纳米颗粒在OVCAR-3细胞系上的毒性图，图2A、B、C、F、G NPs_EPI的毒性图)。这样的结果表明，由于没有针对包裹在多糖纳米颗粒中的药物的防御机制或细胞对此类结构的吸收增加，所选细胞系以及相应的肿瘤对包裹在多糖纳米颗粒中的药物更敏感。对于以下实施例中公开的动物试验，选择对给定肿瘤系具有比纯药物更高的毒性反应或具有至少相同反应的肿瘤系。这样的选择取决于制剂对肿瘤的预期更高的功效或至少与多糖包裹形式的制剂的相同功效。所获得的结果示于图2和图3以及下表2中。
表2.显示了某些肿瘤细胞系的MTT NPs_Epi和NPs_Dau细胞毒性测试相对Epi和Dau的结果。其中：NPs_Epi/NPs_Dau：葡聚糖纳米颗粒包裹的表柔比星/柔红霉素；Epi、Dau是表柔比星和柔红霉素分别作为纯非胶囊药物施用；SD：是针对特定药物浓度或NPs-药物浓度的8次测试重复的标准偏差，以％表示。
Figure BDA0002669802860000102
Figure BDA0002669802860000111
Figure BDA0002669802860000121
Figure BDA0002669802860000131
Figure BDA0002669802860000141
Figure BDA0002669802860000151
Figure BDA0002669802860000161
实施例3
多糖包裹蒽环霉素的抗肿瘤效果的测定
A)测定葡聚糖包裹的表柔比星(NPs-EPI)的最大耐受剂量(MTD)
使用根据OECD方法425号的急性口服毒性-上下法，采用MTD测定方法对实施例1中生产的以葡聚糖包裹的表柔比星(NPs-EPI)形式的多糖包裹蒽环霉素进行急性毒性评估，测试材料的施用途径做了改变。
静脉内施用(i.v.；注射至尾静脉)是由表柔比星以目前使用的形式，即表柔比星盐酸盐(EPI)向患者施用而决定的，如果NPs-EPI的抗肿瘤功效被证实，则将施用NPs-EPI。
所使用的急性毒性评估方法是OECD推荐的替代方法(OECD方法425号)，其中考虑到了改善动物福利和3R原则(替代、减少、优化)的目的。
高-低剂量急性毒性评估方法包括以低于预期的中值致死剂量(LD50)的单剂量向个体动物施用测试材料。根据第一剂测试或参照材料施用后获得的效果，给下一个对象施用增加或减少固定系数的剂量。顺序地继续该过程，直到达到增加剂量(通过确定的系数)导致死亡，而下降(通过确定的系数)导致动物存活的剂量。
在实验A部分中确定NPs-EPI(葡聚糖包裹的表柔比星)的MTD之后，进行实验B部分以比较游离EPI(盐酸表柔比星的形式)的急性毒性和MTD，该游离EPI的剂量等于在构成MTD的剂量的所述药物与NPs的组合(EPI-NPs)中所含的药物的剂量。
B)游离EPI的急性毒性和MTD的比较评估，其剂量等于在构成MTD的剂量的所述药物与NPs的组合(EPI-NPs)中所含的药物的剂量
使用根据OECD方法425号的上下法进行EPI的急性毒性评估，其剂量应等于构成NPs-EPI的MTD剂量的含量(在实验A部分的实施期间确定)。
将葡聚糖包裹的表柔比星(NPs-EPI)和游离形式的表柔比星即盐酸表柔比星EPI，一次施用于小鼠至尾静脉。在施用NPs-EPI和EPI前两个小时，动物被剥夺了食物。NPs-EPI(测试材料)和EPI(参照材料)施用后30分钟，饲料再次提供给小鼠。在获得前一剂量施用的结果之后，对下一只动物进行另一剂量的施用。NPs-EPI的基线剂量相当于27.39mg EPI/kgbw(体重)。作为参照材料的EPI以30和31mg/kg bw的剂量施用，NPs-EPI和EPI以水溶液(注射水)形式施用，体积不超过0.18cm3/老鼠。
给予下一只动物的剂量取决于前一剂量的施用结果。如果动物在施用后48小时存活，则将下一只动物的剂量增加以大于1和小于1.3的修正系数(使用系数1.02；1.05；1.10和1.15)。如果动物死亡，则将下一个对象的剂量减少相同的系数。施用测试材料直至达到一个剂量，其中3只后续动物在施用最高剂量后存活。OECD 425号中，建议的剂量修正系数为3.2，但是由于EPI的最小治疗剂量和MTD之间的差异很小，因此有必要使用显著小于1.3的系数，所述药物的新制剂(NPs-EPI)通过该系数修正(未符合OECD 425的规定)。
照顾动物并执行计划的程序(是研究的一部分)的人员不知道对动物进行个体编码的方法。
因此，对于静脉注射小鼠，用多糖包裹蒽环霉素NPs-EPI的最大耐受剂量(MTD)确定为30mg/kg bw(基于EPI)(90mg/m2)。
C)包裹在葡聚糖纳米颗粒中的表柔比星在卵巢肿瘤中的抗肿瘤功效的测定
该研究的主题是，确定NPs-EPI治疗与经典形式的EPI在异种移植小鼠(卵巢肿瘤模型)中的抗肿瘤功效和潜在不良反应。该研究使用了根据实施例1制备的包裹在葡聚糖纳米颗粒(NPs-EPI)中的表柔比星。表柔比星不穿透血脑屏障，并且在三个阶段中被消除。生物学半衰期(t1/2)是15-45小时，大约平均40小时。
获取肿瘤研究模型
为了建立肿瘤模型，将来自CByJ.Cg-Foxn1<nu>/cmdb近交系的雌性小鼠植入OVCAR3系卵巢肿瘤细胞。麻醉后将体积为100μl的PBS和Matrigel中的5x105个卵巢肿瘤细胞(OVCAR3细胞)皮下注射(s.c.)到雌性小鼠的右侧。在细胞植入过程中，动物没有遭受任何疼痛，因为它们先前曾使用异氟烷进入轻度吸入性麻醉状态。肿瘤长到约150mm3，将小鼠分为3组：
K1/OVCAR3-对照组A，接受注射用水；
NPs/EPI/OVCAR3-接受葡聚糖纳米颗粒包裹的表柔比星(NPs-EPI)的组，剂量为22.5mg/kg体重(67.5mg/m2)-测试组B和测试组C接受的NPs-EPI量为3.75mg/kg bw(11.25mg/m2)；
EPI/OVCAR3-参照组D，接受以标准形式表柔比星盐酸盐作为表柔比星盐酸盐，剂量为15mg/kg体重(45mg/m2)。
除参照组外，所有小鼠均使用包裹在葡聚糖纳米颗粒中的EPI(NPs-EPI)或标准剂型的EPI(EPI)。在治疗期间，测量肿瘤的大小，并密切观察动物。治疗结束后，进行肿瘤测量、血液学检查以及内脏器官和肿瘤的宏观和组织病理学检查，以评估使用NPs-EPI抗肿瘤治疗相对于该药物的标准形式的有效性和安全性。
在K1/OVCAR3对照组上进行的程序(注射到尾静脉的水的施用)
对构成参考组(K1/OVCAR3)且符合在卵巢肿瘤小鼠模型(OVCAR3细胞系)中NPs-EPI的抗肿瘤功效评估对象的有诱导肿瘤的雌性，每隔一天施用注射水(10次施用)于尾静脉中。以0.18cm3/小鼠的体积施用注射用水(单次施用的持续时间-30秒/小鼠)。在静脉内施用注射水的过程中，动物没有经历与施用方法有关的任何疼痛，因为施用部位先前已经通过用10％利多卡因喷洒而麻醉了。注射用水施用10次。该组中的所有小鼠在第10次施用注射用水后一天被处死。
EPI/OVCAR3测试组-植入OVCAR3细胞系的卵巢肿瘤小鼠模型中的程序
对具有诱发肿瘤且符合在卵巢肿瘤小鼠模型–OVCAR3细胞系中EPI/OVCAR3抗肿瘤功效评估的雌性小鼠，将EPI注入尾静脉(持续时间–30秒/小鼠)，每天一次，每隔一天(2次施用)，以15mg/kg bw EPI的剂量(相当于葡聚糖纳米粒中表柔比星的1/2MTD)，以水溶液形式向小鼠施用，剂量不超过0.18cm3/小鼠。为了给动物施用相同剂量的EPI，在每次施用之前对动物称重，并且根据体重变化来改变所施用溶液的体积。在EPI溶液的静脉内施用期间，动物没有经历与施用方法相关的任何疼痛，因为通过用10％利多卡因喷雾将施用部位麻醉。
在植入了OVCAR3细胞的卵巢肿瘤小鼠模型中以3.75和22.5mg/kg bw的剂量在NPsEPI/OVCAR3测试组中施用NPs-EPI
对具有诱导性肿瘤且符合NPs-EPI在卵巢肿瘤小鼠模型(OVCAR3细胞系)中抗肿瘤功效评估要求的雌性小鼠，每天一次，每隔一天，将NPs-EPI注入尾静脉，以3.7mg/kg构成施用于小鼠的NPs-EPI的MTD的1/8，22.5mg/kg bw构成施用于小鼠的NPs-EPI的MTD的3/4的剂量，以水溶液形式向小鼠施用，剂量不超过0.18cm3/小鼠。为了给动物施用相同剂量的NPs-EPI，在每次施用之前对动物称重，并且根据体重的变化来改变所施用溶液的体积。在NPs-EPI溶液的静脉内施用过程中，动物没有经历与施用方法相关的任何疼痛，因为施用部位先前已通过用10％利多卡因喷洒而麻醉。
所获得的结果显示在图4A和B以及下面的表4-15中。
表4.静脉注射注射水期间K1/OVCAR组小鼠的体重(详细结果)
Figure BDA0002669802860000191
表5.静脉注射注射水期间K1/OVCAR组小鼠的肿瘤大小(详细结果)
Figure BDA0002669802860000192
表6.小鼠尸体剖检期间在注射水的K1/OVCAR组中的宏观观察结果(3号小鼠)
Figure BDA0002669802860000193
Figure BDA0002669802860000201
表7.以3.75mg/kg bw剂量静脉注射NPs-EPI期间NPsEPI/OVCAR3组小鼠的体重(详细结果)
Figure BDA0002669802860000202
表8以3.75mg/kg bw的剂量静脉注射NPs-EPI期间NPsEPI/OVCAR3组小鼠的肿瘤大小(详细结果).
Figure BDA0002669802860000203
Figure BDA0002669802860000211
表9.接受3.75mg/kg bw剂量NPs-EPI的NPsEPI/OVCAR3组尸检期间的宏观观察结果(小鼠#17).
小鼠外观 肛门区域充满粪便，小鼠是恶病质的，皮肤0.30mm厚
器官 内脏器官的宏观评估
肝 无明显变化
左肾 无明显变化
右肾 无明显变化
肾上腺 无明显变化
脾 大小为1.5cm x 0.4cm x 0.2cm(可能减小)
胰腺 无明显变化
肺 无明显变化
心脏 无明显变化
胸腺 无明显变化
肠 大肠充满液体食物成分，该成分妨碍对粘膜的准确评估
胃 无明显变化
生殖器官 无明显变化
膀胱 无明显变化
脑 无明显变化
肿瘤 在皮下组织中大小为7.58mm x 4.73mm，皮肤不动.
表10.在以22.50mg/kg bw的剂量静脉注射NPs-EPI期间，来自NPsEPI/OVCAR3组的小鼠的体重(详细结果).
Figure BDA0002669802860000212
Figure BDA0002669802860000221
***-尸检前的小鼠重量
表11.剂量为22.5mg/kg bw的NPs-EPI静脉注射时，NPsEPI/OVCAR3组小鼠的肿瘤大小(详细结果)
Figure BDA0002669802860000222
表12以22.5mg/kg bw的剂量接受NPs-EPI的4号小鼠的尸体剖检的宏观观察结果。
Figure BDA0002669802860000223
Figure BDA0002669802860000231
表13.以15mg/kg bw的剂量静脉注射EPI期间从EPI/OVCAR3组获得的小鼠体重(详细结果)
Figure BDA0002669802860000232
***–尸检后小鼠的重量
表14.以15mg/kg bw的剂量进行EPI静脉注射期间，EPI/OVCAR3组小鼠的肿瘤大小(详细结果)
Figure BDA0002669802860000233
Figure BDA0002669802860000241
*-施用EPI施用，小鼠直接死亡
表15.尸体剖检期间对接受剂量为15mg/kg bw的EPI的EPI/OVCAR3组的小鼠进行肉眼观察的结果(小鼠#5).
小鼠外观 肛门区域充满粪便，小鼠是恶病质的，皮肤0.21mm厚
器官 内脏的宏观评价
肝 肝表面颜色深樱桃色至棕色，一致性比充满血液的正常血管软，
左肾 一致性比正常软
右肾 一致性比正常软
肾上腺 无明显变化
脾 1.6cm x 0.4cm x 0.1cm大小，稍微小一点，颜色深棕
胰腺 无明显变化
肺 无明显变化
心脏 无明显变化
胸腺 无明显变化
肠 肠子中充满绿色食品成分，该成分妨碍对粘膜的准确评估
胃 无明显变化
生殖器官 无明显变化
膀胱 无明显变化
脑 无明显变化
肿瘤 在皮下组织中大小为5.80mm x 5.03mm，皮肤不动
对EPI/OVCAR3组的小鼠进行EPI施用后，在首次施用后的第4天(第二次施用后)立即导致小鼠死亡，第一次施用EPI后，一只小鼠直接死亡，而同时接受两种浓度NPs-EPI的NPs/EPI/OVCAR3组的小鼠存活到实验结束。
与K1/OVCAR对照组相比，接受EPI的EPI/OVCAR3组小鼠表现出严重的炎症和肝脏结构变化，以及脾脏颜色和结构变化。在接受NPs-EPI的NPsEPI/OVCAR3组中未观察到此类变化。纯药物会导致局部血管的严重损伤，肝脏损伤以及由于恶病质而需要处死动物，对于表柔比星以多糖包裹形式施用未观察到此类变化。
与对照组中的肿瘤大小相比，在接受两种浓度(图4A和B)NPs-EPI的NPsEPI/OVCAR3组的小鼠中，观察到诱导的卵巢肿瘤大小显著减少，当给予更高剂量的NPs-EPI时，观察到增加的肿瘤大小减小。
出人意料地，发现使用多糖包裹蒽环霉素代替其非包裹形式的蒽环霉素，例如NPs-EPI代替EPI，可充分降低药物毒性(尽管它不是具有附着靶细胞靶向因子的药物形式)，以允许静脉内施用更高剂量的药物并更快地减少肿瘤体积。
实施例4
在移植OVCAR3细胞系的小鼠卵巢肿瘤模型中使用游离形式的包裹表柔比星NPs-EPI和游离EPI的抗肿瘤疗效、安全性和副作用的比较
通过实施例1，制备了没有表柔比星的葡聚糖纳米颗粒NPs，包裹在葡聚糖纳米颗粒(NPs-EPI)中的含表柔比星的纳米颗粒。与实施例3相比，改变了施用方案，每3天基于表柔比星10mg/kg bw的量施用EPI或NPs-EPI的剂量，或施用作为对照的NPs。根据实施例3，获得构成卵巢肿瘤测试模型的小鼠，将其分为3组。
L-注射NPs的对照组；
J-以10mg/kg bw的量接受包裹在葡聚糖纳米颗粒(NPs-EPI)中的表柔比星的测试组
K-以10mg/kgbw的量接受盐酸表柔比星形式的表柔比星的测试组
下表16和17列出了以个体小鼠的肿瘤大小和平均肿瘤体积的形式获得的结果。
表16.向小鼠后续施用NPs-EPI,EPI和NPs后的肿瘤体积变化
Figure BDA0002669802860000261
E肿瘤体积相对于开始施用之前的体积的百分比增加(↑)或减少(↓)
F出于人道主义原因，该组中的所有小鼠都被处死
G组中的所有动物12次施用后
H组中的所有动物3-7次施用后
I组中的所有动物3次施用后
表17.向小鼠后续施用NPs-EPI、EPI和NPs后的平均肿瘤体积的变化的比较
Figure BDA0002669802860000262
G组中的所有动物12次施用后
H组中的所有动物3-7次施用后
I组中的所有动物3次施用后
J组中平均肿瘤体积相对于开始施用之前的体积的百分比增加(↑)或减少(↓)
K出于人道主义原因，该组中的所有小鼠都被处死
结果表明，包裹在葡聚糖纳米颗粒(NPs-EPI)中的表柔比星比EPI具有更大的抗肿瘤功效和较不明显的不良反应。EPI具有更高的毒性也被以下事实所证明：在3次施用后，体重平均降低了22.55％，而在整个NPs-EPI治疗(3-7次剂量)中，动物的体重平均减少了11.37％。
因此，NPs-EPI的施用改善并延长了总生存时间。
对肿瘤体积的平均变化的分析表明，在接受NPs-EPI治疗的动物中，首次施用后，肿瘤平均下降了4.31％，而在同期接受EPI的动物中观察到肿瘤平均增长3.63％。在NPs-EPI的施用过程中，随着时间的推移观察到效力增加，这可以确认药物从葡聚糖纳米颗粒中逐渐释放。内部器官的显微图像表明，与等效剂量的EPI相比，剂量为10mg/kg bw的NPs-EPI毒性更低(表18)。
表18.
Figure BDA0002669802860000271
NPs-EPI的施用可观察到导致小鼠存活率的提高，允许延长药物的施用时间，这表明将EPI包裹在多糖纳米颗粒中可改善治疗效果，并降低毒性。
以多糖包裹的纳米颗粒形式使用蒽环霉素的药物，优选表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星，特别是用葡聚糖包裹的表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星的纳米颗粒降低了这些化合物的毒性。这些蒽环霉素用葡聚糖的包裹允许施用更高的静脉注射剂量的药物，例如表柔比星，如在各种肿瘤的组织培养物以及在小鼠卵巢肿瘤模型中使用这些蒽环霉素进行治疗证明的那样。
由于对葡聚糖包裹的表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星和其他多糖包裹表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星获得的乳腺肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、胰腺肿瘤，肾肿瘤、肺肿瘤、大肠肿瘤癌组织的作用曲线相似，所述药物以新的形式降低其对人体的毒性(其机理尚不清楚，因为这些是未附着靶向颗粒的颗粒)，所以对于葡聚糖和其他多糖：纤维素及其衍生物、直链淀粉、淀粉和肝素包裹的药物有表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星是可以获得药物功效增强，全身毒性降低，并可能施用更高药物剂量的类似结果。
令人惊讶地发现，以多糖包裹表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星，特别是用葡聚糖包裹表柔比星，以蒽环霉素的新形式可以实现治疗效果，同时使用较低剂量的药物。此外，由于它们对身体的毒性降低，还允许给予更高剂量的药物，更长的治疗时间，从而提高了肿瘤治疗的效率。
如在动物模型中所观察到的，纯药物导致对局部血管的显著损害，肝脏损害，因为在示例性EPI研究中，由于恶病质有必要比施用NPs-EPI更早地处死动物。
非常有前途的不仅是药物毒性降低效果的出乎意料的成就，而且还有可能使用包裹的表柔比星，特别是用葡聚糖包裹的胰腺癌来治疗胰腺肿瘤(观察到PNAC1细胞的毒性显著增加-图3G)。根据现有技术，尽管进行了尝试，但是在这种治疗中该化学治疗剂完全无效。
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Claims (15)

1.用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述蒽环霉素选自表柔比星、柔红霉素、阿霉素、伊达比星，
其中所述肿瘤选自小儿实体瘤、威尔姆氏肿瘤、肉瘤、软组织肉瘤、尤因肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、急性白血病、淋巴母细胞性白血病、粒细胞性白血病、髓样白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、乳腺肿瘤、乳腺癌、肺肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、胃肿瘤、胃癌、膀胱癌、来自移行上皮细胞的乳头状膀胱癌、甲状腺肿瘤、甲状腺癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、胰腺肿瘤、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、大肠癌，
其中所述多糖选自葡聚糖、淀粉及其衍生物、直链淀粉及其衍生物、纤维素衍生物、糖原、透明质酸、肝素、海藻酸、角叉菜胶。
2.根据权利要求1所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述多糖选自葡聚糖、纤维素及其衍生物、直链淀粉、淀粉和肝素。
3.根据权利要求1-2所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述肿瘤选自乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌。
4.根据权利要求1-3所述的多糖包裹蒽环霉素用于治疗肿瘤，其特征在于，将特定多糖包裹的特定蒽环霉素以高于未用多糖包裹的相同蒽环霉素确定的最大耐受剂量(MTD)的剂量和低于所述用特定多糖包裹的特定蒽环霉素确定的最大耐受剂量的剂量施用于被治疗的受试者，其中所述受试者优选为哺乳动物，更优选地，受试者为人类。
5.根据权利要求1-4所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述用多糖包裹的蒽环霉素是表柔比星，并且其用于治疗选自乳腺肿瘤、乳腺癌、淋巴瘤包括恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤包括软组织肉瘤、卵巢癌、宫颈癌、白血病、肺肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、大肠癌的肿瘤。
6.根据权利要求5所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，表柔比星被葡聚糖包裹。
7.根据权利要求6所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，葡聚糖包裹的表柔比星用于治疗乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌。
8.根据权利要求6-7所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，用葡聚糖包裹的表柔比星旨在用于治疗卵巢癌。
9.根据权利要求6-7所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，用葡聚糖包裹的表柔比星用于胰腺癌的治疗。
10.根据权利要求1-4所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述用多糖包裹的蒽环霉素是柔红霉素，并且其用于治疗选自白血病、特别是急性淋巴细胞白血病和髓样白血病、乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌的肿瘤。
11.根据权利要求10所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述柔红霉素被葡聚糖包裹。
12.根据权利要求10-11所述的用于治疗肿瘤的多糖包囊蒽环霉素，其特征在于，用葡聚糖包囊的柔红霉素用于治疗选自骨髓恶性肿瘤、特别是急性淋巴细胞白血病和髓样白血病、卵巢癌、乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌的肿瘤。
13.根据权利要求1-4所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，所述多糖包裹蒽环霉素是阿霉素，并且其用于治疗选自小儿实体瘤、威尔姆氏肿瘤、肉瘤、软组织肉瘤、尤因肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、粒细胞性白血病、急性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、乳腺肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、肺肿瘤、小细胞肺癌癌、胃癌、甲状腺癌、乳头状或滤泡性甲状腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、大肠癌的肿瘤，其中优选阿霉素被葡聚糖包裹。
14.根据权利要求1-4所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，多糖包裹的蒽环霉素是柔红霉素，并且用于治疗选自白血病、特别是急性淋巴细胞白血病和髓样白血病、乳腺肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、大肠癌的肿瘤。
15.根据权利要求1至14所述的用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素，其特征在于，用于治疗肿瘤的多糖包裹蒽环霉素的颗粒的水合状态的平均粒径在10-500nm，更优选50-200nm，最优选70-160nm的范围内。
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